Bước đầu khảo sát bệnh johnes paratuberculosis trên đàn bò sữa thuộc huyện củ chi tphcm

ỦY BAN NHÂN DÂN TP.HCM SỞ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ THÀNH ĐỒN TP HỒ CHÍ MINH BÁO CÁO NGHIỆM THU BƯỚC ĐẦU KHẢO SÁT BỆNH JOHNE’S (PARATUBERCULOSIS) TRÊN ĐÀN BỊ SỮA HUYỆN CỦ CHI – TP HỒ CHÍ MINH ThS HỒ QUẾ ANH CƠ QUAN CHỦ TRÌ: TRUNG TÂM PHÁT TRIỂN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ TRẺ THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH THÁNG 04/ 2014 ỦY BAN NHÂN DÂN TP.HCM SỞ KHOA HỌC VÀ CƠNG NGHỆ THÀNH ĐỒN TP HỒ CHÍ MINH BÁO CÁO NGHIỆM THU BƢỚC ĐẦU KHẢO SÁT BỆNH JOHNE’S (PARATUBERCULOSIS) TRÊN ĐÀN BÕ SỮA HUYỆN CỦ CHI – TP HỒ CHÍ MINH CHỦ NHIỆM ĐỀ TÀI CHỦ TỊCH HỘI ĐỒNG ThS Hồ Quế Anh PGS.TS Lê Xuân Cƣơng CƠ QUAN QUẢN LÝ CƠ QUAN CHỦ TRÌ (Ký tên/đóng dấu xác nhận) (Ký tên/đóng dấu xác nhận) THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH THÁNG 04/ 2014 MỤC LỤC Trang TÓM TẮT ABSTRACT DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ PHẦN MỞ ĐẦU 10 Tên đề tài/dự án 10 Chủ nhiệm đề tài/dự án: Cơ quan chủ trì: Thời gian thực hiện: Kinh phí duyệt: Kinh phí cấp: theo Thông báo số /TB-SKHCN Mục tiêu 10 Nội dung 10 CHƢƠNG I- TỔNG QUAN 11 1.1- Những nghiên cứu nước 11 1.1.1 – Đặc điểm chung bệnh 11 1.1.2.- Phương pháp chẩn đốn bệnh phát bệnh Johne’s 12 1.1.3.- Tình hình nhiễm bệnh Johne’s bị sữa số nước 14 1.2- Những nghiên cứu nước 15 1.3- Tính cấp thiết đề tài 15 CHƢƠNG II NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP 15 2.1 Nội dung 1: Xác định trạng nhiễm MAP đàn bò 15 sữa huyện Củ Chi, TPHCM 2.1.1 Mô tả nội dung 15 2.1.2 Phương pháp nghiên cứu 16 2.1.3 Thiết bị vật liệu sử dụng 17 2.1.4 Qui trình kỹ thuật Elisa phát kháng thể kháng 18 bệnh paratuberculosis 2.1.5 Các tiêu theo dõi 19 2.2 Nội dung 2: Đánh giá sơ số yếu tố lây lan 19 nguy gây bệnh paratuberculosis bị sữa khu vực điều tra tồn huyện Củ Chi, TPHCM CHƢƠNG III KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 20 3.1 Kết điều tra tình hình chăn ni bị sữa nơng 20 hộ thuộc xã khảo sát bệnh Johne's 3.2 Kết kiểm tra kháng thể kháng MAP yếu 25 tố lây lan, gây bệnh bò sữa khu vực khảo sát 3.2.1 Nội dung 1: Xác định trạng nhiễm bệnh 25 Mycobacterium paratuberculosis đàn bò sữa huyện Củ Chi, TPHCM 3.2.2 Nội dung 2: Đánh giá sơ số yếu tố lây lan 29 nguy gây bệnh paratuberculosis bò sữa khu vực điều tra huyện Củ Chi, TPHCM CHƢƠNG IV KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 37 4.1 Kết luận 37 4.2 Đề nghị 37 PHỤ LỤC 38 Phụ lục chuyên môn 38 Phụ lục sản phẩm 41 TÀI LIỆU THAM KHẢO 46 TĨM TẮT Thu thập 386 mẫu máu bị cho sữa, 67 nông hộ 03 xã có lượng bị sữa nhiều huyện Củ Chi (số liệu tháng 10/2012): Tân Thạnh Đông (tổng đàn: 16.850 con), Tân Thạnh Tây (tổng đàn: 4.236 con), Trung An (tổng đàn: 3.905con) Kết kiểm tra kháng thể kháng Mycobacterium paratuberculosis (MAP) phương pháp ELISA có 16 mẫu dương tính (16/386 mẫu), chiếm 4,15% Tân Thạnh Đơng có số mẫu dương tính cao (13/16 mẫu dương tính) Sự lưu hành MAP nông hộ mức cao, 21,54% (14/67 hộ) Đặc biệt Tân Thanh Đông, nơi chăn ni bị sữa cao TPHCM số hộ khảo sát có kết dương tính với MAP chiếm 30,56% (11/36 hộ), Tân Thạnh Tây 7,14% (1/14 hộ) Trung An 13,33% (2/15 hộ) Có mối tương quan thuận dương tính MAP với triệu chứng lâm sàng tiêu chảy, viêm vú sinh sản thấp Có 08 có dấu hiệu lâm sàng dương tính với MAP (chiếm 50,0%), có 04 bị tiêu chảy cho kết dương tính với MAP, chiếm 25% nhóm dương tính 5,97% so với nhóm khảo sát Mối nguy lây lan đến từ việc không phân khu nuôi dưỡng riêng biệt cho nhóm bị dẫn đến lây nhiễm MAP dễ dàng hệ thống dẫn nước thải nằm hẳn chuồng tạo điều kiện cho MAP diện liên tục chuồng dễ dàng xâm nhập vào thể ABSTRACT Survey of paratuberculosis in dairy cattle at Cu Chi province – Ho Chi Minh City A total of 386 cross-bred Holland Friesian cattles at the milking period, from 67 farms was studied The blood samples were collected in 36 farms located at Tan Thanh Dong, 14 farms located at Tan Thanh Tay and 15 farms in Trung An Commune Cu Chi Distrist, Ho Chi Minh City Sixteen of 386 (4,15%) animals were positive for ELISA test and Tan Thanh Dong showed the highest positive (13/16 positive cattles) Prevalence of Mycobacterium avium subspecies paratuberculosis (MAP) in farms was 21,54% (14/67 farms) in which Tan Thanh Dong also exhibited the highest value with 30,56% (11/36 farms), followed by Tan Thanh Tay with 7,14% (1/14 farms) and Trung An with 13,33% (2/15 farms) There was positive correlation between positive value and clinical signs, such as diarrhoea, mastitis and low reproduce Eight in sixteen positive cattles displayed clinical signs Diarrhea was observed as the typical symptom as the four in sixteen infected cattles were positive with MAP (25,0%) The great risk factors in spreading Johne’s are no distribution area for each group of cows and wastewater systems located in the barn so that pathogens was created good conditions for their existence Keywords: Mycobacterium paratuberculoisis, cattle, ELISA DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT VIẾT TẮT THUẬT NGỮ TIẾNG VIẾT AGID Agar Gel Immunodiffusion ELISA Enzyme-Linked Immuno Sorbent Assay MAP Mycobacteriurn Avium Subspecies Paratuberculosis PCR Polymerase Chain Reaction TPHCM Thành phố Hồ Chí Minh XN Xét nghiệm DANH MỤC CÁC BẢNG SỐ TÊN BẢNG SỐ LIỆU Bảng 1.- Quy mô điều tra khảo sát 16 Bảng 2: Phân bổ số lượng mẫu thu thập 16 Bảng 3.- Tình hình chung 20 Bảng 4.- Phương thức chăn nuôi 21 Bảng 5.- Biện pháp vệ sinh chuồng trại 22 Bảng 6.- Biện pháp phòng bệnh 13 Bảng 7.- Các dấu hiệu lâm sàng bệnh Johne's 24 TRANG thường có trại Bảng 8.- Kết kiểm tra kháng thể MAP/máu bò sinh 25 sản cho sữa Bảng 9.- Mức độ nhiễm bệnh Johne's địa bàn điều 27 tra 10 Bảng 10.- Mối liên hệ dấu hiệu lâm sàng 28 kết xét nghiệm kháng thể MAP 11 Bảng 11.- Quy mơ đàn bị (con/hộ) nguồn gốc đàn bò 29 sữa liên quan tới bệnh Johne's vùng điều tra 12 Bảng 12.- Phương thức chăn nuôi liên quan tới bệnh 31 Johne's vùng điều tra 13 Bảng 13.- Phương thức vệ sinh chuồng trại liên quan tới 34 bệnh Johne's vùng điều tra 14 Bảng 14.- Biện pháp phòng bệnh liên quan tới bệnh Johne's vùng điều tra 36 DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ SỐ TÊN HÌNH ẢNH Hình 1: Bộ KIT ELISA dùng để phát kháng thể TRANG 17 kháng MAP Hình 2: Hộ có quy mơ chăn ni 30 30 Hình 3: Hộ có quy mơ chăn ni từ 10-30 30 Hình 4: Hộ có quy mơ chăn ni 10 30 Hình : Dạng kiểu chuồng có sử dụng chất lót 32 Hình 6: Phương thức chăn ni cầm cột với máng ăn 33 uống riêng lẻ Hình 7: Phương thức chăn ni khơng cầm cột, khơng 33 có máng ăn uống riêng lẻ Hình 8: Kiểu chuồng có hệ thống nước thải nằm hẳn chuồng Hình 9: Kiểu chuồng có hệ thống nước thải nằm ngồi chuồng 35 35 PHẦN MỞ ĐẦU Tên đề tài: Bước đầu khảo sát bệnh Johne’s (paratuberculosis) đàn bò sữa huyện Củ Chi - Thành phố Hồ Chí Minh Chủ nhiệm đề tài: ThS Hồ Quế Anh Cơ quan chủ trì: Trung tâm Phát triển Khoa học Cơng nghệ Trẻ Thời gian thực đề tài: 12/2012 đến tháng 12/2013 Kinh phí đƣợc duyệt: 80.000.000 đồng Kinh phí cấp: theo TB số : TB-SKHCN ngày / / Mục tiêu: Xác định trạng nhiễm Mycobacterium paratuberculosis địa bàn chăn ni bị sữa chủ yếu khu vực TPHCM Mục tiêu cụ thể - Xác định trạng nhiễm MAP đàn bò sữa huyện Củ Chi, TPHCM - Đánh giá sơ số yếu tố lây lan nguy gây bệnh paratuberculosis bò sữa khu vực điều tra Nội dung: Công việc dự kiến Công việc thực Xác định trạng nhiễm MAP đàn bò sữa huyện Củ Chi, TPHCM Điều tra thu thập số thông tin liên quan đến - 80 phiếu bệnh Johne’s: 80 phiếu Lấy mẫu tiến hành phân tích xác định tình trạng - 400 mẫu máu nhiễm MAP phương pháp ELISA: 400 mẫu máu Đánh giá sơ số yếu tố lây lan nguy - 01 báo cáo gây bệnh paratuberculosis bò sữa khu vực điều tra huyện Củ Chi, TPHCM: 01 báo cáo 10 Hình 8: Kiểu chuồng có hệ thống nước thải nằm hẳn chuồng Hình 9: Kiểu chuồng có hệ thống nước thải nằm ngồi chuồng 35 Bảng 14.- Biện pháp phòng bệnh liên quan tới bệnh Johne's vùng điều tra Chỉ tiêu ∑ xã Các hộ có bị Các hộ có bị (*) (+) tính MAP (-) tính MAP Tổng số hộ điều tra (hộ) 80 Số hộ lấy mẫu máu XN MAP (hộ) 65 14 51 10,0 14,29 5,88 44 11 26 55,0 78,57 50,98 64 11 32 80,0 78,57 62,75 76 14 50 95,0 100,0 98,04 Có cách ly bị nhập trại: * n (hộ) *% Có cách ly bò bệnh: * n (hộ) * % Chuồng cách ly khu ni dưỡng: * n (hộ) *% Có tiêm phòng: * n (hộ) *% (*) Ghi : số liệu lấy từ bảng 6, trang 23 Số liệu bảng 14 lại cho ta thấy người dân biết việc phải cách ly bò bệnh với bò khỏe mạnh để tránh lây lan nhiên việc cách ly bò bệnh lại thực không với quy định cách ly Khơng có khu vực cách ly bị bệnh riêng lẻ, mà lại nằm hẳn khu nuôi dưỡng, việc lây lan mầm bệnh đến bò khác dễ dàng xảy Ở nhóm bị dương tính MAP, tỉ lệ chuồng cách ly khu nuôi dưỡng chiếm 78,57% cao nhóm âm tính, có 62,75% 36 CHƢƠNG IV- KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 4.1- Kết luận Qua kết điều tra ban đầu, rút số kết luận sau: - Kết kiểm tra kháng thể kháng (MAP) phương pháp ELISA có 16 mẫu dương tính (16/386 mẫu), chiếm 4,15% Tân Thạnh Đơng có số mẫu dương tính cao (13/16 mẫu dương tính = 81,25 %) - Sự lưu hành MAP nông hộ mức cao, 21,54% (14/67 hộ) Đặc biệt Tân Thanh Đông, nơi chăn nuôi bị sữa cao TPHCM số hộ khảo sát có kết dương tính với MAP chiếm 30,56% (11/36 hộ) - Có mối tương quan thuận dương tính MAP với triệu chứng lâm sàng Có 04 bị tiêu chảy cho kết dương tính với MAP, chiếm 25% nhóm dương tính 5,97% so với nhóm khảo sát - Việc khơng phân khu ni dưỡng riêng biệt cho nhóm bị dẫn đến lây nhiễm MAP dễ dàng - Hệ thống dẫn nước thải nằm hẳn chuồng tạo điều kiện cho MAP diện liên tục chuồng dễ dàng xâm nhập vào thể 4.2- Đề nghị - Cần thực việc khảo sát bệnh Jonhe’s diện rộng hơn, với nhiều đối tượng bị khảo sát nhóm bê, nhóm bị tơ nhóm bị sinh sản - Biện pháp chẩn đốn, ngồi sử dụng kỹ thuật ELISA, cần áp dụng nhiều kỹ thuật khác kết mức xác thuyết phục hơn, PCR, nuôi cấy vi khuẩn… - Áp dụng biện pháp dịch tễ học phân tử để xác định xác nhóm MAP lưu hành Việt Nam; xây dựng đồ dịch tễ học phục vụ cho việc quản lý bệnh Jonh’s đàn bò sữa, bò thịt TP - Vì vậy, cần có Đề tài tiếp tục nghiên cứu sâu rộng bệnh 37 PHỤ LỤC Phụ lục chuyên môn PHIẾU ĐIỀU TRA LIÊN QUAN ĐẾN BỆNH PARATUBERCULOSIS A TÌNH HÌNH CHUNG CỦA NÔNG HỘ Chủ hộ: Địa chỉ: Ấp:…………….phường/xã .huyện Củ Chi, TPHCM Tổng đàn:…… Bò sinh sản………con Bê bò tơ:…….con Đàn tạo từ: Mua từ nguồn Từ nhiều nguồn Tăng đàn cách: Mua nơi khác Từ đàn gốc sinh B PHƢƠNG THỨC CHĂN NUÔI Chuồng trại Phân khu ni dưỡng nhóm bị sữa: Có Khơng Mái chuồng bằng: Lá Tơn Ngói Khác: …… Nền chuồng bằng: Xi măng Đất Gỗ Khác: ……… Sử dụng chất lót nền: Có Khơng Ngun liệu: ……… Phƣơng thức nuôi Cầm cột chuồng Nuôi nhốt không cầm cột Kết hợp chăn thả Hệ thống máng ăn, uống: Riêng cho Chung cho tất Thức ăn thừa sau ăn: Cho bò khác ăn Hốt bỏ C VỆ SINH Vệ sinh chuồng trại: Số lần dọn phân chuồng/ngày: lần lần lần Số lần rửa chuồng ngày: lần lần lần Rửa chuồng nước Giếng Hố chứa phân: Có Máy Khơng 38 Sơng Ao Khác Hố chứa nước thải: Có khơng Hầm biogas: Có Khơng Khoảng cách hố chứa chất thải - chuồng: (Nếu sát bên chuồng ghi 0m) Rảnh nước thải: Trong chuồng Định kỳ sát trùng chuồng trại: Có Ngồi chuồng Khơng Thời gian hai lần sát trùng chuồng trại: ………… ngày Sát trùng chuồng trại bằng: Vôi Thuốc sát trùng Khác ……… Sát trùng thể, phương tiện trước vào khu n.dưỡng: Có Vệ sinh bị sữa: Số lần tắm bị ngày: lần lần Không lần D PHÕNG BỆNH Bò sữa nhập vào trại: Cách ly kiểm tra: Có Khơng Thời gian cách ly: ………………… ngày Bị sữa bệnh: Cách ly: Có Khơng Vị trí chuồng cách ly: Riêng biệt ngồi khu ni dưỡng Trong khu ni dưỡng Tiêm phịng : Có tiêm đầy đủ vac xin theo quy định khơng : Có Khơng TÌNH HÌNH BỆNH PARATUBERCULOSIS TRÊN BÕ SỮA TRONG QUÁ TRÌNH NI DƢỠNG Tiêu chảy kéo dài khơng giảm dẫn đến loại thải: Có Khơng Tiêu chảy đợt, hết lại tái phát lại: Có Khơng Giảm cân, tiêu chảy ăn uống bình thường: Có Khơng Suy nhược, giảm cân: Có Khơng Sinh sản kém: Có Khơng Giảm sữa: Có Khơng 39 SỐ LIỆU MẪU MÁU THU THẬP [Đánh dấu vào tương ứng, Số = bị bệnh; Số = bò mắc bệnh] Số tai bò lấy mẫu máu Tiêu chảy Giảm cân, suy nhược Sinh sản Viêm vú tái phát nhiều lần Mua từ nơi khác Ngày tháng năm 20 Điều tra viên ký tên 40 Phụ lục sản phẩm 2.1 Phƣơng pháp chẩn đoán bệnh Johne’s (Trong khn khổ đề tài) 2.1.1 Chẩn đốn lâm sàng Xác định mặt như: - Dấu hiệu chung đàn - Trạng thái vật - Tính chất đặc biệt bệnh tiêu chảy a) Dấu hiệu chung đàn nghi ngờ nhiễm Mycobacterium paratuberculoisis Do chất bệnh tiềm ẩn, bệnh Johne’s thường bắt đầu bệnh nhiễm trùng bê thường không thấy dấu hiệu bị 2-5 năm tuổi (đơi nhiều tuổi hơn) Việc nhiễm bệnh khó phát giai đoạn đầu Một số bị nhiễm bệnh, trạng thái bình thường bị loại thải ngun nhân trước có dấu hiệu lâm sàng Trong trường hợp này, người ni khơng nhận đàn họ bị nhiễm Dù chưa có triệu chứng lâm sàng rõ ràng bò bệnh thường sản xuất sữa giảm, tỷ lệ loại thải cao, khả sinh sản bệnh viêm vú tăng cao Trong đàn mà có nhiều bị bị tiêu chảy giảm cân nên xem xét bệnh Johne’s nguyên nhân Ngoài dấu hiệu bệnh tiêu chảy giảm cân, nhà chăn nuôi nên ý việc sản xuất đàn xuống khơng cao phải được, đặc biệt nhóm bó - tuổi Tình trạng viêm vú đàn thường xảy ra, sản lượng sữa đàn giảm đến 10% đàn chưa có triệu chứng lâm sàng bệnh Riêng vật có dấu hiệu lâm sàng việc sản xuất sữa giảm đến 25% sữa so với sản lượng tiềm b) Trạng thái chung vật Dấu hiệu lâm sàng rõ ràng Johne’s bao gồm giảm cân, ốm yếu, tiêu chảy sản lượng sữa giảm Một số ăn uống bình thường Tiêu chảy có 41 thể bắt đầu sau xảy liên tục tiến triển thành mạn tính, thường khơng có sốt Một số xuất tình trạng sưng hàm, tích tụ dịch hàm gây áp-xe Dấu hiệu Johne’s dễ dàng bị nhầm lẫn với số bệnh khác Các triệu chứng thường bắt đầu bò hai năm tuổi, dấu hiệu thường xảy bò vòng vài tuần sau sinh bê Tuy nhiên, dấu hiệu Johne’s khơng xuất 10 năm nhiều Tuổi động vật thời điểm nhiễm bệnh số lượng vi khuẩn nhiễm vào thể ảnh hưởng đến thời gian phát triển bệnh Nghiên cứu cho thấy có chế độ thức ăn điều kiện chăn nuôi tốt chống chịu với nhiễm trùng tốt c) Tính chất đặc biệt bệnh tiêu chảy Dấu hiệu tiêu chảy kéo dài giảm cân bị ăn uống bình thường Bị bị nhiễm Mycobacterium paratuberculoisis thường khơng bị sốt Một số động vật bị nhiễm xuất suy dinh dưỡng yếu; khác bị tiêu chảy mãn tính Mycobacterium paratuberculoisis nhiễm vào thể nằm yên tĩnh tế bào phần cuối ruột non (gọi hồi tràng) bắt đầu để nhân rộng, sâu vào mô Lúc này, hệ thống miễn dịch thể phản ứng để cố gắng loại bỏ lượng vi khuẩn gây tình trạng viêm u hạt Viêm làm thành ruột dày lên, ngăn khơng cho hoạt động bình thường Có nghĩa vật khơng thể hấp thụ chất dinh dưỡng cần thiết thể trạng vật sút giảm, sản lượng sữa giảm tiêu chảy xảy Trong thực tế, bị nhiễm bệnh Johne’s đói thèm ăn ăn uống tốt Khi dấu hiệu tiêu chảy xuất mạnh, vật khó hồi phục tiếp tục xấu chết 2.1.2 Chẩn đốn phi lâm sàng phƣơng pháp ELISA kháng thể Trong hầu hết trường hợp, dấu hiệu bệnh Johne’s thường không xuất động vật trưởng thành Mặc dù, ăn uống tốt 42 bò trở nên hốc hác yếu Cũng tương tự số bệnh khác, từ dấu hiệu bệnh Johne’s xuất việc kiểm tra phịng thí nghiệm cần thiết để xác định chẩn đoán a) Cách lấy mẫu Dùng ống tiêm nhựa vô trùng số 10 kim tiêm số 20 để lấy máu Có thể lấy mẫu máu từ tĩnh mạch cổ động mạch đuôi Mỗi lấy khoảng 5ml máu Bò cố định trước lấy mẫu máu Sau lấy máu ống tiêm để ổn định thùng trữ lạnh để máu đơng tự nhiên Sau đó, mẫu máu tách lấy huyết điều kiện vô trùng phịng thí nghiệm Mẫu huyết đánh số bảo quản nhiệt độ -300C đến dùng làm xét nghiệm b) Phương pháp ELISA-kháng thể: Sử dụng để kiểm tra diện kháng thể paratuberculosis máu Thiết bị vật liệu sử dụng: - Máy ELISA model 680 Bio-RAD - Bộ kít đặc hiệu cho việc phát kháng thể kháng bệnh paratuberculosis (IDEXX Paratuberculosis Screening Ab Test) Qui trình kỹ thuật Elisa phát kháng thể kháng bệnh paratuberculosis Pha dung dịch rửa (1:20) 15 ml ―wash solution‖ + 285 ml nước cất Để ngày to 2-8oC Pha dung dịch tiếp hợp Anti- 150µl ―Conjugate concentrate‖ + 14.850µl ruminant HRPO (1/100) ―Dilution buffer N1‖ Pha lỗng mẫu huyết - 100µl mẫu * 100µl ―Dilution Buffer thí nghiệm 1:20 N12‖ 43 Pha lỗng mẫu đối chứng âm - 15µl ―Negative control‖ + 285µl ―Dilution Buffer N12 Pha lỗng đối chứng dương - 15µl ―Postitive control‖ + 285µl ―Dilution Buffer N12‖ - Rung lắc cho mẫu trộn với dung dịch pha loãng - Ủ 15 phút – 120 phút to 18-26oC - 100µl mẫu pha lỗng vào giếng riêng lẻ (mẫu đối chứng dương cho vào giếng) - Rung lắc cho mẫu trộn - Bọc microplate miếng nhôm mỏng - Ủ 45 phút to 18-26oC Rửa giếng - Cho 300µl dung dịch rửa vào giếng ngâm phút trước bắt đầu quy trình rửa - Sử dụng 300µl dung dịch rửa cho giếng - Rửa lần - 100µl dung dịch tiếp hợp (đã pha bước 2) vào giếng - Bọc microplate miếng nhôm mỏng - Ủ 30 phút to 18-26oC 10 Rửa giếng Như bước 11 - Cho 100µl ―TMB substrate N9‖ vào giếng - Ủ 10 phút phịng tối 12 - 100µl ―Stop solution N3‖ - Lắc nhẹ khay thí nghiệm lau phần đáy khay 13 Đưa vào máy ELISA model 680 đọc kết bước sóng 450nm 14 Tính kết quả: PCtb = (PC1 + PC2) : S/P (%) = 100 * [(Mẫu – NC) : (PCtb-NC)] 44 15 - S/P (%) < = 60  âm tính - 60 > S/P > 70  nghi ngờ cần làm lại - S/P > = 70  dương tính 2.2 Minh chứng ấn phẩm khoa học 45 Tài liệu tham khảo Từ điển bách khoa toàn thư Việt Nam, ngày 20/06/2011 Viêm ruột phó lao http://dictionary.bachkhoatoanthu.gov.vn/default.aspx?param=1456aWQ9NDEw MCZncm91cGlkPTMwJmtpbmQ9JmtleXdvcmQ9&page=23 Johne’s information central, ngày 20/06/2011 http://www.johnesdisease.org/ United States Department Of Argiculture, 08/06/2011 Johne's Disease Information http://www.aphis.usda.gov/animal_health/animal_diseases/johnes/index.shtml Milner, A.R., et al., The sensitivity and specificity of a modified ELISA for the diagnosis of Johne's disease from a field trial in cattle Veterinary Microbiology, 1990 25(2-3): p 193-198 Turnquist, S.E., et al., Serologic evidence of paratuberculosis in Louisiana beef cattle herds as detected by ELISA Preventive Veterinary Medicine, 1991 11(2): p 125-130 Thomas, T.J., R.E Andrews Jr, and C.O Thoen, Molecular cloning and characterization of Mycobacterium paratuberculosis promoters in Escherichia coli Veterinary Microbiology, 1992 32(3-4): p 351-362 NAHMS, 1997 Johne’s Disease on U.S Dairy Operations USDA:APHIS:VS, CEAH, National Animal Health Monitoring System Nordlund KV, Goodger WJ, Pelletier J, and Collins MT 1996 Associations between subclinical paratuberculosis and milk production, milk components, and somatic cell counts in dairy herds Journal of the American Veterinary Medical Association, 208(11):1872-1876 M A Villarino, H M Scott and E R Jordan, 2011 Influence of parity at time of detection of serologic antibodies to Mycobacterium avium subspecies paratuberculosis on reduction in daily and lifetime milk production in Holstein 46 cows J Anim Sci 2011 89:267–276 doi:10.2527/jas.2009-2776 originally published online Sep 24, 2010 10 Sweeney RW, Whitlock RH, and Rosenberger AE 1992 Mycobacterium paratuberculosis cultured from milk and supramammary lymph nodes of infected asymptomatic cows Journal of Clinical Microbiology, 30(1):166-171 11 Streeter RN, Hoffsis GF, Bech-Nielsen S, Shulaw WP, and Rings DM 1995 Isolation of Mycobacterium paratuberculosis from colostrum and milk of subclinically infected cows American Journal of Veterinary Research, 56(10):1322-1324 12 OIE Terrestrial Manual, 2008 Chapter 2.1.11 Paratuberculosis (Johne’s disease) 13 White Oak Conservation Center, 1998 Proceedings of the Workshop on Diagnosis, Prevention, and Control of Johne’s Disease in Non-Domestic Hoofstock Yulee, Florida June 26-28, 1998 14 Voluntary Bovine Johne’s Disease Control Program Revised, Has Components: Education, Management, Classification, 2010 JOHNE’S DISEASE – DAIRY, Volume 2, Number Fall 2010 15 Animal Health Australia, 2003 Bovine Johne’s Disease (BJD) Risk Assessment Protocol for Beef Cattle Herds Final report AU1-228 16 G Sharma, S.V Singh, I Sevilla, A.V Singh , R.J Whittington, R.A Juste, S Kumar, V.K Gupta, P.K Singh, J.S Sohal, V.S Vihan, 2007 Evaluation of indigenous milk ELISA with m-culture and m-PCR for the diagnosis of Bovine Johne’s disease (BJD) in lactating Indian dairy cattle Vet.Sci (2007), doi:10.1016/j.rvsc.2007.03.014 17 Policap K, Victor N , Samuel T , Patricia M, 2011 Paratuberculosis and route in cattle in the three (3) northern regions of Cameroon Proceedings 11ICP - Diagnostics and detection of Mycobacterium avium subsp Paratuberculosis 47 18 J A Fernandez-Silva, A Abdulmawjood, M Bulte, 2011 Diagnosis and molecular characterization of mycobacterium avium subsp paratuberculosis from dairy cows in Colombia AGE-Hindawi Access to Research Veterinary Medicine International Volume 2011, Article ID 352561, 12 pages doi:10.4061/2011/352561 19 Christine Rossiter, Don Hansen, 2000 Johne’s Disease Diagnostic Tests the ELISA http://nyschap.vet.cornell.edu/module/johnes/section4/johnes4.asp 20 Ekgatat M,Thammasart S, Kanitpun R, Wongkasemjit S, Nokdhes C, Kongkrong C, Narongsak W, Trenuntawan U, Srikawkheaw N, Kanameda M, 2007 Paratuberculosis diagnosis and control in Thailand Proceedings of 9ICP – 2007 21 Johne’s Disease in Cattle Adapted from the New York State Cattle Health Assurance Program Vermont Department of Agriculture, Food and Markets Animal Health Section 22 Nicolai Denzin, Bernd Gehrmann, Benno Ewert, Holger Rohde, 2011 Estimation of the prevalence at animal level of paratuberculosis in female cattle of Saxony-Anhalt (Germany) Veterinary Science Development 2011; volume 1:e10 23 K.B Mohammed, 2011 Paratuberculosis in cattle in Khartoum and AlJazeera States, Sudan; Clinicopathological and epizootiological studies The Paratuberculosis Newsletter – March 2011 Short Scientific Reports 24 Fathi, R Sarkarati, F Eslami, M rezavand3, B Nourizadeh, 2011 Detection of Mycobacterium avium subsp Paratuberculosis in Cow Milk Using Culture and PCR methods Archives of Razi Institute, Vol 66, No 2, December (2011) 95-100 25 The National Johne’s Educational Initiative funded by USDA/APHIS/VS and managed by the National Institute for Animal Agriculture, 2011 Johne’s 48 Disease — What You Need to Know, Part I JOHNE’S DISEASE – DAIRY Volume 2, Number Winter 2011 26 Caldow G.L, Burns F and Mackay E, 2009 Results of serological screening of the sample herds SB4022: An Integrated Strategy to Determine the Herd Level Prevalence of Johne’s Disease in the UK Dairy Herd FINAL REPORT November 2009 49