Nghiên cứu đặc điểm di truyền và tính kháng thuốc của vibrio cholerae phân lập tại tỉnh trà vinh

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ NGUYỄN THỊ ĐẤU NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM DI TRUYỀN VÀ TÍNH KHÁNG THUỐC CỦA VIBRIO CHOLERAE PHÂN LẬP TẠI TỈNH TRÀ VINH Tai Lieu Chat Luong LUẬN ÁN TIẾN SĨ Chuyên ngành: VI SINH VẬT HỌC 2015 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ NGUYỄN THỊ ĐẤU NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM DI TRUYỀN VÀ TÍNH KHÁNG THUỐC CỦA VIBRIO CHOLERAE PHÂN LẬP TẠI TỈNH TRÀ VINH LUẬN ÁN TIẾN SĨ Chuyên ngành: VI SINH VẬT HỌC Mã ngành: 6242 0107 Hướng dẫn khoa học PGS.TS HỒ THỊ VIỆT THU 2015 LỜI CẢM ƠN Xin chân thành cảm ơn Ban Giám hiệu Trường Đại học Cần Thơ, Ban Giám hiệu Trường Đại học Trà Vinh, Ban Lãnh đạo Viện Nghiên cứu Phát triển Công nghệ Sinh học, Phòng Đào tạo, Phòng Quản lý Khoa học, Phòng Quản lý Sau Đại học thuộc Trường Viện tạo điều kiện tốt thực nghiên cứu khoa học học phần nghiên cứu sinh Xin chân thành cảm ơn PGS.TS Hồ Thị Việt Thu, PGS.TS Trần Nhân Dũng tạo điều kiện, giúp đỡ tơi hồn thành luận án Do nhận hướng dẫn thời gian năm sau luận án nên PGS.TS Hồ Thị Việt Thu gặp nhiều khó khăn, thời gian tơi chưa định hướng đắn cho nghiên cứu, PGS.TS Hồ Thị Việt Thu tận tình giúp đỡ, tìm hướng cho phù hợp với nghiên cứu thực tế để tơi hồn thành luận án Chân thành cảm ơn Ban lãnh đạo Chi cục Thú y tỉnh Trà Vinh tạo điều kiện cho tham gia lấy mẫu sở giết mổ địa bàn Tỉnh Chân thành cảm ơn anh chị em Bộ môn Vi sinh Khoa Nông nghiệp & Sinh học Ứng dụng, Trường Đại học Cần Thơ; Trường Đại học Y Dược Cần Thơ; Khoa xét nghiệm bệnh viện Đa khoa Trung ương Cần Thơ; Khoa Nông nghiệp Thuỷ sản Trường Đại học Trà Vinh tạo điều kiện, giúp đỡ tơi hồn thành nghiên cứu đề tài Chân thành cảm ơn gia đình đồng nghiệp tạo điều kiện động viên tơi hồn thành nghiên cứu Xin chân thành cảm ơn! NGUYỄN THỊ ĐẤU i TÓM TẮT Vibrio cholerae loại vi khuẩn Gram âm có hình dấu phẩy với chủng không gây bệnh gây bệnh Chủng gây bệnh lây lan mạnh từ năm 1816 đến năm 1923 thuộc V cholerae O1 type sinh học cổ điển Những năm sau đó, chủng vi khuẩn khác thuộc type sinh học El Tor gây trận đại dịch kéo dài thập niên 1970s, chủng gây bệnh xác định vào năm 1992 thuộc type sinh học O139, chủng với chủng thuộc type sinh học O1 xem nguyên nhân vụ dịch xảy gần Hiện nay, có nhiều kháng sinh điều trị bệnh, hiệu kháng sinh có phần hạn chế tình hình đa kháng thuốc gia tăng quần thể vi khuẩn (CDC, 2005) Xuất phát từ vấn đề trên, đề tài: “Nghiên cứu đặc điểm di truyền tính kháng thuốc V cholerae phân lập tỉnh Trà Vinh” thực với mục đích cung cấp thơng tin cần thiết chiến lược sử dụng kháng sinh phù hợp nhằm làm giảm tỉ lệ tử vong, giảm tượng kháng thuốc giảm chi phí điều trị bệnh Nghiên cứu thực qua việc phân lập vi khuẩn Vibrio spp từ 160 mẫu nghêu, 150 mẫu nước (50 mẫu nước biển, 50 mẫu nước sông, 50 mẫu nước ao nuôi tôm), 100 mẫu huyết heo 40 mẫu phân bệnh nhân tiêu chảy thu thập bệnh viện đa khoa tỉnh Trà Vinh từ tháng năm 2012 đến tháng năm 2014 Kỹ thuật PCR test sinh hoá (theo tiêu chuẩn ISO/TS 21872-1:2007) sử dụng để định danh mức loài vi khuẩn Vibrio, phản ứng ngưng kết sử dụng để định type huyết V cholerae Kết nghiên cứu phân lập 25 chủng vi khuẩn thuộc Vibrio spp bao gồm chủng V cholerae (24%) (3 chủng từ nghêu, chủng từ mẫu huyết heo chủng từ mẫu nước sơng), chủng thuộc lồi V paraheamolyticus (32%), chủng thuộc loài V vulnificus (16%), chủng thuộc loài V fluvialis (20%) chủng thuộc loài V alginolyticus (8%) Kết định type huyết học chủng V cholerae thuộc type O1, với 50% (3/6) dương tính với Inaba, 50% (3/6) dương tính Ogawa Khơng có chủng thuộc type O139 Kết so sánh tỉ lệ tương đồng trình tự nucleotide gene 16S rRNA chủng V cholerae phân lập với chủng MS6 (Thái Lan), O395 (Ấn Độ), M66-62 (Indonesia), LMA 3894-4 (Brazil) N16961 (Ấn Độ) Kết cho thấy chủng chủng 100% tương đồng với 56 chủng; 99% tương đồng với 32 chủng 99% tương đồng với 12 chủng gần Riêng chủng mang gene kháng kháng sinh nghiên cứu có trình tự nucleotide tương đồng 97% với 10 chủng; 96% với 01 chủng 94% với 02 chủng ii Tính kháng kháng sinh loại (streptomycin, norfloxacine, ampicillin, tetracycline, azithromycin, amoxillin/clavulanic acid, trimethotrime/sulfamethazol vancomycin) chủng Vibrio cholerae xác định phương pháp Kirby-Bauer (CLSI, 2010), kết cho thấy có 50% (3/6) chủng kháng streptomycin, 33% (2/6) chủng kháng tetracycline trimethoprim-sulfamethoxazole Với kỹ thuật PCR cho thấy có chủng tổng số chủng kiểm tra chứa gene kháng kháng sinh tetA (gene mã hóa cho yếu tố kháng tetracycline), chưa phát gene kháng kháng sinh blaSHV, aac(3)-IV dhfrI mã hố yếu tố cho nhóm kháng sinh β-lactam, aminoglycosid, trimethoprim tương ứng So sánh trình tự nucleotide gene tetA chủng T1 T3 so với chủng hoang dại (N16961) cho thấy có tượng thêm từ 1- nucleotide 10 vị trí codon gene tetA chủng T1 vị trí codon chủng T3 Kết thử nghiệm thỏ chứng minh số bám dính vi khuẩn V cholerae T1 T3 vào niêm mạc ruột thỏ khơng uống vaccine phịng bệnh tả thời điểm sau cho uống vi khuẩn 55,7±13,9 59,3±4,2 cao thỏ có uống vaccine phòng bệnh tả (12,4±0,6 7,41±1,9) Tại thời điểm 16 sau cho uống vi khuẩn, khơng có tượng vi khuẩn bám dính vào niêm mạc ruột tất thỏ thí nghiệm Thí nghiệm cho thấy chủng phân lập có tính kháng ngun giống với kháng nguyên vi khuẩn sử dụng làm vaccine phòng bệnh tả (moORCVAX) sử dụng nước Từ khoá: Vibrio, V cholerae, đề kháng kháng sinh iii STUDY ON GENETIC CHARACTERISTICS AND ANTIBIOTICS RESISTANCE OF VIBRIO CHOLERAE ISOLATES IN TRA VINH ABSTRACT Vibrio cholerae is a "comma" shaped Gram-negative bacteria, some of which are pathogenic and some of which are not The pathogenic strains which caused the most pandemic cholera from 1816 to 1293 are the Vibrio choleraes classical biotype O1 Later, other strains belong to biotype El Tor which was active in the seventh of 20th century The latest pathogenic biotype O139 was discovered in 1992, this strain and strain O1 have been considered to be the pathogenic agents of recent cholera outbreaks Although, there are antibiotics which can cure the disease now, but it is limited in therapy because of V choleraes are resistant to multiple drugs (Ingole et al., 1994) Hence, we carried out “the study on genitical characteristic and antibiotic resistance of Vibrio cholerae isolated in Tra Vinh province” with purpose of providing essential information for appropriate antibotic using in order to reduce mortality, decrease antibiotic resistance and cost of treatment The study was conducted by isolation of Vibrio spp from 160 clams, 150 water samples (50 samples of sea water, 50 samples of estuarine water, and 50 samples of shrimp pond water), 100 samples of pig blood and 40 diarrheic stool samples collected from general hospital of Tra Vinh province during April 2012 to April 2014 Polymerase chain reaction and biochemical tests (standard ISO/TS 21872-1:2007) were used to indentificate Vibrio into species, and agglutination test was used for characterization of Vibrio cholerae serotype The results showed that there were 25 Vibrio spp isolates including strains of Vibrio cholerae (24%) (3 isolates were from clams, isolates from pig blood samples and from estuary water), strains of Vibrio paraheamolyticus (32%), strains of Vibrio vulnificus (16%), strains of Vibrio fluvialis (20%) and strains of Vibrio alginolyticus (8%) The serotyping results showed that all of Vibrio cholerae belong to biotype O1, with 50% (3/6) positive to Inaba, and 50% (3/6) positive to Ogawa No strain belongs to biotype O139 Nucleotide sequence comparison of gene16S rRNA of Vibrio cholerae strains with that of MS6 strain (Thailand), O395 strain (India), M66-62 strain (Indonesia), LMA 3894-4 strain (Brazil) and N16961 strain (India) The results showed that one out of strains were 100% homogeneous with 56 strains, 99% homogeneous with 32 strains and 99% homogeneous with 12 close strains Separately, strains (T1 and T3) containing antibiotic iv resistance gene were 97% homogeneous with 10 strains, 96% homogeneous with 01 strain and 94% homogeneous with 02 strains Antibiotic resistance to antibiotics (streptomycin, norfloxacine, ampicillin, tetracycline, azithromycin, amoxillin/clavulanic acid, trimethotrime/sulfamethazol and vancomycin) of Vibrio cholerae strains was tested by Kirby-Bauer method (CLSI, 2010) The results showed that there 50% (3/6) of isolates which was resistant to streptomycin, 33% (2/6) was resistant to tetracycline and trimethoprim-sulfamethoxazole Two out of strains had antibitotic resistance gene (gene tetA) encoding for tetracycline resistant factor Gene blaSHV, gene aac(3)-IV and gene dhfrI which encode for β-lactam, aminoglycosid, trimethoprim resistant factors were not detected Nucleotide sequence comparison of gene tetA of T1 T3 with that of wild strain (N16961) showed that there were 1- nucleotide more or less in 10 codon positions of gene tetA in T1 strain and codon positions in T3 strain Results of experiments on rabbits demonstrated that adhesion indexes of V cholerae T1 and T3 strains in the intestinal mucosa of rabbits which were not orally used cholera vaccine after hours of oral administration of these bacteria were 55,7±13,9 and 59,3±4,2, respectively These indexes were higher than those of rabbits with cholera vaccination were 12,4±0,6 and 1,9±7,41, respectively After 16 hours of bacteria administration, there was no bacterial adhesion in the intestinal mucosa of all the rabbits It showed that T1 and T3 strains shared the same antigens with bacteria used to produce cholera vaccine (MicroVAX) which is available in Vietnam Keyword: Vibrio, V cholerae , antibiotic resistance v CỘNG HOÀ XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM Độc lập – Tự – Hạnh phúc CAM KẾT KẾT QUẢ Tôi xin cam kết luận án: “Nghiên cứu đặc điểm di truyền tính kháng thuốc Vibrio cholerae phân lập tỉnh Trà Vinh” hoàn thành dựa kết nghiên cứu kết nghiên cứu chưa sử dụng công bố cho luận án khác Tác giả luận án Nguyễn Thị Đấu vi MỤC LỤC TT 1.1 1.2 1.2.1 1.2.2 1.3 1.4 1.5 1.6 2.1 2.2 2.2.1 2.2.2 2.2.3 2.2.4 2.2.5 2.3 2.3.1 2.3.2 2.3.3 2.4 2.4.1 2.4.2 2.4.3 2.5 2.6 2.6.1 2.6.2 2.6.3 2.6.4 2.6.5 2.6.6 2.7 TÓM TẮT …………………………………………………… ABSTRACT ………………………………………………… CHƯƠNG I: GIỚI THIỆU ………………………………… Tính cấp thiết đề tài ……………………………………… Mục tiêu nhiệm vụ nghiên cứu …………………………… Mục tiêu nghiên cứu ………………………………………… Nhiệm vụ nghiên cứu ……………………………………… Đối tượng phạm vi nghiên cứu ………………………… Thời gian địa điểm nghiên cứu ………………………… Những đóng góp luận án ………………………………… Ý nghĩa khoa học ý nghĩa thực tiễn luận án ………… CHƯƠNG II: TỔNG QUAN TÀI LIỆU ………………… Lịch sử bệnh vi khuẩn tả ………………………………… Tổng quan Vibrio ………………………………………… Đặc điểm loài thuộc giống Vibrio Phân loại vi khuẩn V cholerae ………………………… Đặc điểm hình dạng V cholerae ………………………… Đặc điểm sinh thái V cholerae ……………………………… Sức đề kháng V cholerae …………………………………… Tình hình dịch tễ học bệnh tả V cholerae …………… Tình hình dịch tễ V cholerae nước giới … Tình hình dịch tễ V cholerae Việt Nam ……………… Nguồn truyền nhiễm phương thức truyền lây V cholerae……………………………………………………… Đặc điểm di truyền V cholerae ………………………… Độc lực V cholerae Đặc tính di truyền độc lực V cholerae ……………… Các yếu tố độc lực ………………………………………… Cơ chế gây bệnh V cholerae …………………………… Tình hình kháng kháng sinh vi khuẩn …………………… Khái niệm …………………………………………………… Cơ chế kháng kháng sinh …………………………………… Sự kháng kháng sinh V cholerae nước giới Sự kháng kháng sinh V cholerae Việt Nam Cơ chế kháng kháng sinh V cholerae …………………… Sự kháng kháng sinh vi khuẩn tetracycline ……… Tính miễn dịch vaccine phịng bệnh tả người…… vii Trang ii vi 1 3 3 4 5 11 11 15 15 15 20 22 25 26 27 29 31 33 33 33 35 37 39 41 45 2.7.1 2.7.2 3.1 3.2 3.2.1 3.2.2 4.1 4.1.1 4.1.2 4.1.3 4.1.4 4.1.5 4.1.6 4.1.7 4.2 4.3 4.4 4.4.1 4.4.2 4.4.3 4.4.4 4.4.5 4.4.6 4.5 4.5.1 4.5.2 Nguyên lý sử dụng vaccine ………………………………… Cơ chế hoạt động vaccine ……………………… CHƯƠNG III: NỘI DUNG, PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ………………………… Nội dung nghiên cứu ……………………………………… Phương tiện phương pháp nghiên cứu …………………… Phương tiện nghiên cứu……………………………………… Phương pháp nghiên cứu……………………………………… CHƯƠNG IV: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN …………… Kết phân lập định danh Vibrio spp …………………… Kết phân lập Vibrio spp … Kết định danh Vibrio spp phản ứng sinh hóa Kết định danh Vibrio spp máy định danh tự động … Kết định danh Vibrio spp kỹ thuật PCR ………… Tỉ lệ phát Vibrio spp loại mẫu phân lập ……… Tỉ lệ nhiễm Vibrio spp nghêu huyện Cầu Ngang Duyên Hải…………………………………………………… Tỉ lệ nhiễm Vibrio spp huyết heo số huyện …… Kết định type huyết học …………………………… Kết tính tương đồng lồi thuộc Vibrio Genbank công cụ BLAST ……………………………… Sự kháng kháng sinh V cholerae …………………… Kết khảo sát kháng kháng sinh V cholerae phương pháp Kirby Bauer (CLSI, 2010) …………………… Nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) ……………………………… Sự diện số gene kháng kháng sinh vi khuẩn phân lập …………………………………………………………… Kết giải trình tự đoạn gen kháng kháng sinh……… So sánh trình tự nucleotid chủng V cholerae T1, T3 với chủng V cholerae hoang dại N16961……………………… Quan hệ di truyền chủng V cholerae dựa vào gene kháng kháng sinh tetA………………………………………… Thử nghiệm độc lực chủng V cholerae đánh giá đáp ứng miễn dịch thỏ … Kết đánh giá chủng V cholerae khơng uống vaccine phịng bệnh tả ………… Kết đánh giá tính đáp ứng miễn dịch thỏ uống vaccine phòng bệnh tả viii 45 46 47 47 47 47 49 66 66 66 67 69 70 71 74 75 76 77 84 84 87 89 90 92 96 100 100 103 Zimbabwe (miền Nam C Phi) O1 El Tor Ogawa and Inaba O1 El Tor Inaba Non-agglutinating (NAG) strains O1 El Tor Ogawa Iran (Ba Tư) Nepal (Nam Á) O1 El Tor O1 El Tor Inaba Namibia (Tây Nam Phi) Ấn Độ O1 Thủ đô Accra, Ghana (Tây Châu Phi) Fz, SXT Không xác định Islam et al (2009) Karki et al (2010) Ranjbar et al (2010) Jain et al (2008) Gen SXT (88.9) Opintan et Đoạn gen nhảy al (2008) (81.5) Đoạn gen nhảy (7.4) Không xác định Smith et al (2008) Amp, coĐoạn gen nhảy amoxiclav,aztreonam, Gen SXT Co, Ery, metronidazole, NA, Neo, nitrofurantoin, oxacillin, PB, Spe, Sm, Tri, Vanc Inaba: NA (100), Amo (100), SXT (95.7), Fz (91.3) NAG: Ery (77.4) Không xác định Fz (100), NA, Co SXT, Sm SXT (nguồn: Maya Kitaoka et al, 2011) tetracycline; Tri: trimethoprim; Vanc: vancomycin 165 PB: polymyxin B; Qu: quinolone; Sm: streptomycin; Spec: spectinomycin; SXT: sulfamethoxazole–trimethoprim; Su: sulphonamides; Tet: erythromycin; FQ: fluoroquinolone; Fz: furazolidone; Gent, gentamicin; Kan, kanamycin; NA, nalidixic acid; Neo: neomycin; Nf: norfloxacin; Ghi chú: Amo: amoxicillin; Amp: ampicillin; Cm: chloramphenicol; Co: cotrimoxazole; Cpr: ciprofloxacin; Dox: doxycycline; Ery: Jan 2009 Jan 2009 Jun 2008– 2008 Aug–Sep 2007 2007 Dec 2006–Feb 2006 PHỤ LỤC 11 CÁC ACID AMIN TRÌNH TỰ CHỦNG T1 (gen đề kháng kháng sinh tetracycline) 1 GAA TTA CTT AGC GAT GCA GCA GCG AAG TCA AAA CCT ACG CTG AAA Glu Leu Leu Ser Asp Ala Ala Ala Lys Ser Lys Pro Thr Leu Lys 45 15 46 16 CAT ATT TCT ACC TTC GTG CTT GGA GTG CTC CAG CCG CAC TCC TTA His Ile Ser Thr Phe Val Leu Gly Val Leu Gln Pro His Ser Leu 90 30 91 31 ACT TTG TGC TAT TGG GCT GGT TAC TCG GTA CGC AAA ATG CCC GCG Thr Leu Cys Tyr Trp Ala Gly Tyr Ser Val Arg Lys Met Pro Ala 135 45 136 46 CCC CGA TGT GGA TGG TGA TCA TCA CCA ACC TCA CCA ATA TTG TGC Pro Arg Cys Gly Trp End Ser Ser Pro Thr Ser Pro Ile Leu Cys 180 60 181 61 TCG ATC TAC TAC TCG TAC TCG GAC TAG GGC TAA AAG TCG AAG GAG Ser Ile Tyr Tyr Ser Tyr Ser Asp End Gly End Lys Ser Lys Glu 225 75 226 76 CCG CCA TTG CGT CGG TTA TCG CCG ATT ATG CTG GTC TCT TGT TTG Pro Pro Leu Arg Arg Leu Ser Pro Ile Met Leu Val Ser Cys Leu 170 90 271 91 GTC TGC TGT GCG TGG TGC GTT ACT GGC GGC AGC ATC AGC TCC CAG Val Cys Cys Ala Trp Cys Val Thr Gly Gly Ser Ile Ser Ser Gln 315 105 316 106 CGC CCT TCT CTT TCA TCC CCT CTC TCA CCA AAG AGC TTT CCC GTT Arg Pro Ser Leu Ser Ser Pro Leu Ser Pro Lys Ser Phe Pro Val 360 120 361 121 TAG TGG CGC TCA ATC GTG ATA TCT TCC TGC GCT CAC TCT GTC TGC End Trp Arg Ser Ile Val Ile Ser Ser Cys Ala His Ser Val Cys 405 135 406 136 AAG CCG TAT TTA GCT TTA TGA CCT TTC AAG GCG CAG CGT TGG GAG Lys Pro Tyr Leu Ala Leu End Pro Phe Lys Ala Gln Arg Trp Glu 450 150 451 151 ATG ACA TCG TCG CCG CTA ATG CGG TGC TGA TGA GCT TTT TGA TGA Met Thr Ser Ser Pro Leu Met Arg Cys End End Ala Phe End End 495 165 496 166 TGA TTT CCT ACG GTA TGG ATG GAT TTG CCT ACG CGA TGG AAG CCA End Phe Pro Thr Val Trp Met Asp Leu Pro Thr Arg Trp Lys Pro 540 180 541 181 TGG TCG GTA AAG CAA TGT TGT CCA GGC AGA CTT GCG ACG GAT TCA Trp Ser Val Lys Gln Cys Cys Pro Gly Arg Leu Ala Thr Asp Ser 585 195 586 196 CCG CAT CAT TTT CAC CTA TCT CCG GCT GGA AAG TGC CGG GGG CAA Pro His His Phe His Leu Ser Pro Ala Gly Lys Cys Arg Gly Gln 630 210 631 211 GAT CTT CCA TAC TGG AGA CAC TCA CGG GAA GAA TCA CAT TCG ATT Asp Leu Pro Tyr Trp Arg His Ser Arg Glu Glu Ser His Ser Ile 675 225 676 226 TAA GAC ACC TCA CCT CCA GAT GGC GGT TGA TTG GGC GAA CCT CTT End Asp Thr Ser Pro Pro Asp Gly Gly End Leu Gly Glu Pro Leu 720 240 721 241 GAC TAC GAT TCA TGT GGT AAA GCT GAC CAG GGG TAG ACG GAA CAA Asp Tyr Asp Ser Cys Gly Lys Ala Asp Gln Gly End Thr Glu Gln 765 255 166 PHỤ LỤC 12 CÁC ACID AMIN TRÌNH TỰ CHỦNG T3 (gen đề kháng kháng sinh tetracycline) 1 GCG TGT ATC TGC GTT TGA ACC TCG GAT AAA CCG CTG CCA CTG GAG Ala Cys Ile Cys Val End Thr Ser Asp Lys Pro Leu Pro Leu Glu 45 15 46 16 CAT ATC GAG CCC GCG AGC GAT CTC TAC AAA CGC TTT GAC TCC GCC His Ile Glu Pro Ala Ser Asp Leu Tyr Lys Arg Phe Asp Ser Ala 90 30 91 31 GCC ATG TCG ATT GGC GCG TTA AGC CCA GAA GCC CAT GAA GCG TTA Ala Met Ser Ile Gly Ala Leu Ser Pro Glu Ala His Glu Ala Leu 135 45 136 46 GCC ACC GCG ATG AAC CGC CTA GGC GGC TAT TCC AAC TCA GGT GAA Ala Thr Ala Met Asn Arg Leu Gly Gly Tyr Ser Asn Ser Gly Glu 180 60 181 61 GGT GGT GAA GAT CCA CGC CGT TTT GGC ACT GAG CGT AAC TCA CGT Gly Gly Glu Asp Pro Arg Arg Phe Gly Thr Glu Arg Asn Ser Arg 225 75 226 76 ATC AAG CAA TGT TGT CCA GGC AGA CAT GGC CAG CGC CCC ACC CTT Ile Lys Gln Cys Cys Pro Gly Arg His Gly Gln Arg Pro Thr Leu 270 90 271 91 TGC CCG ACC GGC TGA GAT GCC GAA GCT TGA CGA CCT GTA CAA TCG Cys Pro Thr Gly End Asp Ala Glu Ala End Arg Pro Val Gln Ser 315 105 316 106 TAA TCA ATC TGG CTG GAT CTT GCT GAT AGA ACC AAG AGG GGG GGG End Ser Ile Trp Leu Asp Leu Ala Asp Arg Thr Lys Arg Gly Gly 360 120 361 121 GCA AGA TGG TAA AAG GGA TGT GGG CCT CGT AGA GAC ACC AGA CGT Ala Arg Trp End Lys Gly Cys Gly Pro Arg Arg Asp Thr Arg Arg 405 135 406 136 AAT CCA CCA CAT TGG TGT AAT TTG CAA TGG CCG CTT GTA CTT CTT Asn Pro Pro His Trp Cys Asn Leu Gln Trp Pro Leu Val Leu Leu 450 150 451 151 CCA AAG GGA ATG GGT ACA ACT GTT CGA TAC TAA CAA TCT CCA CGT Pro Lys Gly Met Gly Thr Thr Val Arg Tyr End Gln Ser Pro Arg 495 165 496 166 CTT GCT GTT CAT TGG CTC GGC GCT GTT CAA GGA GAT CGT AAT AAA Leu Ala Val His Trp Leu Gly Ala Val Gln Gly Asp Arg Asn Lys 540 180 541 181 CCT TAC CAG AAC AGA ACA CAA CGC GTT TTA CTT GCG ACG GAT TCA Pro Tyr Gln Asn Arg Thr Gln Arg Val Leu Leu Ala Thr Asp Ser 585 195 586 196 GCG CAT CAA TTT CAC CAA TCG CCG GCT GGA AAG TAC CGT GGG CAA Ala His Gln Phe His Gln Ser Pro Ala Gly Lys Tyr Arg Gly Gln 630 210 631 211 GAT CTT CCA TAC TGG AGA CAC ACA GTG GAT GAC GCA GCA GCG ATT Asp Leu Pro Tyr Trp Arg His Thr Val Asp Asp Ala Ala Ala Ile 675 225 676 226 TAG GAG ACA TCA CCA CCA GAG GGC GGC GCA TTG GGC GAA CCA CTT End Glu Thr Ser Pro Pro Glu Gly Gly Ala Leu Gly Glu Pro Leu 720 240 721 241 GAC GAC GAA TCA TGT GGT AAA CCT GAG CAG GGG TAG ACG GAA CAA Asp Asp Glu Ser Cys Gly Lys Pro Glu Gln Gly End Thr Glu Gln 765 255 167 PHỤ LỤC 13 CÁC ACID AMIN CHỦNG HOANG DẠI Vibrio_cholerae_O1_biovar_eltor_str_N16961_chromosome_I 1 TAT TAG ATC TAC TAT TAA GGA GCA GGA TCT TTG TGG ATA AGT GAA Tyr End Ile Tyr Tyr End Gly Ala Gly Ser Leu Trp Ile Ser Glu 45 15 46 16 AAA TGA TCA ACA AGA TCA TGC GAT TCA GAA GGA TCA GAT CGT GTG Lys End Ser Thr Arg Ser Cys Asp Ser Glu Gly Ser Asp Arg Val 90 30 91 31 ATC AAC CAC TGA TCT GTT CAA GGA TTA GCT GGG ATC AAA AAC CTA Ile Asn His End Ser Val Gln Gly Leu Ala Gly Ile Lys Asn Leu 135 45 136 46 TGT TAT ACA CAG CCA CCT TGG GAT CTA AAA CTT GTT ATA TGG ATA Cys Tyr Thr Gln Pro Pro Trp Asp Leu Lys Leu Val Ile Trp Ile 180 60 181 61 ACT ATA GGA AGA TCA CCG GAT AAT CGT ATA GTT ATC CAC ATG AGA Thr Ile Gly Arg Ser Pro Asp Asn Arg Ile Val Ile His Met Arg 225 75 226 76 TTT GAT TGA AAA AGC ATC AAT CAA TTT TTT CAC TAC CGT TAA ATT Phe Asp End Lys Ser Ile Asn Gln Phe Phe His Tyr Arg End Ile 270 90 271 91 TAT CCA CAA TCC AAA AAA AAG AGC GGC ATT AAG CCG CTC TGC ATG Tyr Pro Gln Ser Lys Lys Lys Ser Gly Ile Lys Pro Leu Cys Met 315 105 316 106 GAA TAG GTC ATT ATT TAG AAG CGA TTG ATG ACG CGT TTG AGC CAA Glu End Val Ile Ile End Lys Arg Leu Met Thr Arg Leu Ser Gln 360 120 361 121 GCT TCA GCG GCA TCT TCA GGC ACT GGG TGC TCT TGT ACA TCG ATG Ala Ser Ala Ala Ser Ser Gly Thr Gly Cys Ser Cys Thr Ser Met 405 135 406 136 GTA AAG CAG TTG GCC AGA GGT TTA GCA CCA ATA TCC CCC AGC AGC Val Lys Gln Leu Ala Arg Gly Leu Ala Pro Ile Ser Pro Ser Ser 450 150 451 151 TGA TAG GCA TGT TTA CCT GCC GCG CAG AAA GTA TCG TAG CTT GAA End End Ala Cys Leu Pro Ala Ala Gln Lys Val Ser End Leu Glu 495 165 496 166 TCA CCA ATC GCG ACC ACG GCA TAA CGT AGT GCA GAG GTA TTC GGT Ser Pro Ile Ala Thr Thr Ala End Arg Ser Ala Glu Val Phe Gly 540 180 541 181 GGT GTA TTC TGC AGA GCC TGA ATA AAG GGC TGG ATA TTA TCC GGG Gly Val Phe Cys Arg Ala End Ile Lys Gly Trp Ile Leu Ser Gly 585 195 586 196 TAC TCA CCA GCC CCG TGG GTT GAG GTG ATG ATC AGC CAA GTC CCT Tyr Ser Pro Ala Pro Trp Val Glu Val Met Ile Ser Gln Val Pro 630 210 631 211 TTA GCA GGG ATC TCA CTC ATG TTG GGC TGG TTA TGA ATT TTG GTG Leu Ala Gly Ile Ser Leu Met Leu Gly Trp Leu End Ile Leu Val 675 225 676 226 TCA AAG CCT TGT TCT TGC AGT AAA TCA CTC AGG TGG TCA CCC ACA Ser Lys Pro Cys Ser Cys Ser Lys Ser Leu Arg Trp Ser Pro Thr 720 240 721 241 TAT TCC GCA CCG CCT AGG GTG CTG CCA GTA ATG ATA TGA ATC ATA Tyr Ser Ala Pro Pro Arg Val Leu Pro Val Met Ile End Ile Ile 765 255 168 PHỤ LỤC 14: XỬ LÝ THỐNG KÊ Lượng FA thỏ không uống vaccine So sánh chủng hoang dại N16961 với chủng N8 (T1) O3.2 (T3) One-way ANOVA: A, B, C Source DF SS MS F P Factor 3.436 1.718 14.07 0.030 Error 0.366 0.122 Total 3.802 S = 0.3494 R-Sq = 90.37% R-Sq(adj) = 83.95% Individual 95% CIs For Mean Based on Pooled StDev Level N Mean StDev + -+ -+ -+ A 1.8750 0.6010 ( -* -) B 0.3500 0.0707 ( -* ) C 0.2000 0.0000 ( -* -) + -+ -+ -+ 0.0 1.0 2.0 3.0 Pooled StDev = 0.3494 Lượng FA thỏ không uống vaccine So sánh chủng N8 (T1) O3.2 (T3) với chủng O1.2, Ng3, 85V1 81V1 One-way ANOVA: A, B, C, D, E, F Source DF SS MS F P Factor 3.154 0.631 4.53 0.047 Error 0.835 0.139 Total 11 3.989 S = 0.3731 R-Sq = 79.07% R-Sq(adj) = 61.63% Individual 95% CIs For Mean Based on Pooled StDev Level N Mean StDev + -+ -+ -+ A 0.2500 0.0707 ( -* ) B 0.3000 0.1414 ( * -) C 1.3500 0.2121 ( * -) D 1.2500 0.6364 ( * ) E 1.3000 0.4243 ( -* ) F 1.5000 0.4243 ( * -) + -+ -+ -+ 0.00 0.70 1.40 2.10 Pooled StDev = 0.3731 169 Lượng FA thỏ có uống vaccine So sánh chủng N8 (T1), O3.2 (T3), O1.2, Ng3, 85V1 81V1 One-way ANOVA: A1, B1, C1, D1, E1, F1 Source DF SS MS F P Factor 0.1643 0.0329 1.42 0.263 Error 18 0.4156 0.0231 Total 23 0.5799 S = 0.1520 R-Sq = 28.33% R-Sq(adj) = 8.42% Individual 95% CIs For Mean Based on Pooled StDev Level N Mean StDev + -+ -+ -+ A1 0.2250 0.1555 ( * ) B1 0.2125 0.1652 ( -* ) C1 0.4000 0.1826 ( * -) D1 0.4375 0.1493 ( -* ) E1 0.3375 0.1493 ( * -) F1 0.3250 0.0957 ( * -) + -+ -+ -+ 0.15 0.30 0.45 0.60 Pooled StDev = 0.1520 170 ————— 12/3/2014 9:39:52 AM ———————————————————— Welcome to Minitab, press F1 for help Descriptive Statistics: 3h, 6h, 9h, 16h (chủng T1/Thỏ không uống vaccine) Variable 3h 6h 9h 16h N 2 2 Variable 3h 6h 9h 16h N* 0 0 Mean 600 550000 450000 1500 SE Mean 600 100000 50000 1500 StDev 849 141421 70711 2121 Minimum 0.000000000 450000 400000 0.000000000 Q1 * * * * Median 600 550000 450000 1500 Q3 * * * * Maximum 1200 650000 500000 3000 Welcome to Minitab, press F1 for help ————— 12/3/2014 2:42:41 PM ———————————————————— Welcome to Minitab, press F1 for help Descriptive Statistics: 3h, 6h, 9h, 16h (chủng T3/Thỏ không uống vaccine) Variable 3h 6h 9h 16h N 2 2 N* 0 0 Mean 0.000000000 420000 300000 6000 Variable 3h 6h 9h 16h Median 0.000000000 420000 300000 6000 Q3 * * * * SE Mean 0.000000000 80000 50000 6000 StDev 0.000000000 113137 70711 8485 Minimum 0.000000000 340000 250000 0.000000000 Q1 * * * * Maximum 0.000000000 500000 350000 12000 ————— 12/3/2014 2:46:24 PM ———————————————————— Welcome to Minitab, press F1 for help Descriptive Statistics: 3h, 6h, 9h, 16h (chủng O1.2/Thỏ không uống vaccine) Variable 3h 6h 9h 16h N 2 2 N* 0 0 Variable 3h 6h 9h 16h Maximum 9000 1200000 1700000 100000 Mean 4500 1050000 1625000 80000 SE Mean 4500 150000 75000 20000 StDev 6364 212132 106066 28284 171 Minimum 0.000000000 900000 1550000 60000 Q1 * * * * Median 4500 1050000 1625000 80000 Q3 * * * * ————— 12/3/2014 2:52:57 PM ———————————————————— Welcome to Minitab, press F1 for help Descriptive Statistics: 3h, 6h, 9h, 16h (chủng Ng3/Thỏ không uống vaccine) Variable 3h 6h 9h 16h N 2 2 N* 0 0 Mean 7500 1200000 1325000 890000 SE Mean 7500 100000 325000 90000 StDev 10607 141421 459619 127279 Minimum 0.000000000 1100000 1000000 800000 Q1 * * * * Median 7500 1200000 1325000 890000 Q3 * * * * Variable Maximum 3h 15000 6h 1300000 9h 1650000 16h 980000 ————— 12/3/2014 2:58:13 PM ———————————————————— Welcome to Minitab, press F1 for help Descriptive Statistics: 3h, 6h, 9h, 16h (chủng 85V1/Thỏ không uống vaccine) Variable 3h 6h 9h 16h N 2 2 N* 0 0 Mean 0.000000000 1280000 1700000 1350000 Variable 3h 6h 9h 16h Median 0.000000000 1280000 1700000 1350000 Q3 * * * * SE Mean 0.000000000 280000 100000 150000 StDev 0.000000000 395980 141421 212132 Minimum 0.000000000 1000000 1600000 1200000 Q1 * * * * Maximum 0.000000000 1560000 1800000 1500000 ————— 12/3/2014 3:08:44 PM ———————————————————— Welcome to Minitab, press F1 for help Descriptive Statistics: 3h, 6h, 9h, 16h (chủng 81V1/Thỏ không uống vaccine) Variable 3h 6h 9h 16h N 2 2 N* 0 0 Mean 0.000000000 1525000 1910000 1500000 Variable 3h 6h 9h 16h Median 0.000000000 1525000 1910000 1500000 Q3 * * * * SE Mean 0.000000000 125000 90000 500000 Maximum 0.000000000 1650000 2000000 2000000 172 StDev 0.000000000 176777 127279 707107 Minimum 0.000000000 1400000 1820000 1000000 Q1 * * * * ————— 12/3/2014 3:28:26 PM ———————————————————— Welcome to Minitab, press F1 for help Descriptive Statistics: 3h, 6h, 9h, 16h (chủng T1/Thỏ có uống vaccine) Variable 3h 6h 9h 16h N 2 2 N* 0 0 Mean 0.000000000 45000 42500 0.000000000 Variable 3h 6h 9h 16h Median 0.000000000 45000 42500 0.000000000 Q3 * * * * SE Mean 0.000000000 5000 2500 0.000000000 StDev 0.000000000 7071 3536 0.000000000 Minimum 0.000000000 40000 40000 0.000000000 Q1 * * * * Maximum 0.000000000 50000 45000 0.000000000 ————— 12/3/2014 3:34:03 PM ———————————————————— Descriptive Statistics: 3h, 6h, 9h, 16h (chủng T3/Thỏ có uống vaccine) Variable 3h 6h 9h 16h N 2 2 N* 0 0 Mean 0.000000000 36000 50000 0.000000000 Variable 3h 6h 9h 16h Median 0.000000000 36000 50000 0.000000000 Q3 * * * * SE Mean 0.000000000 4000 10000 0.000000000 StDev 0.000000000 5657 14142 0.000000000 Minimum 0.000000000 32000 40000 0.000000000 Q1 * * * * Maximum 0.000000000 40000 60000 0.000000000 ————— 12/3/2014 3:38:08 PM ———————————————————— Welcome to Minitab, press F1 for help Descriptive Statistics: 3h, 6h, 9h, 16h (chủng O3.2/Thỏ có uống vaccine) Variable 3h 6h 9h 16h N 2 2 N* 0 0 Mean 500 42500 61500 10000 SE Mean 500 7500 18500 10000 StDev 707 10607 26163 14142 Minimum 0.000000000 35000 43000 0.000000000 173 Q1 * * * * Median 500 42500 61500 10000 Q3 * * * * Maximum 1000 50000 80000 20000 ————— 12/3/2014 3:41:19 PM ———————————————————— Welcome to Minitab, press F1 for help Descriptive Statistics: 3h, 6h, 9h, 16h (chủng Ng3/Thỏ có uống vaccine) Variable 3h 6h 9h 16h N 2 2 N* 0 0 Mean 0.000000000 34000 41000 0.000000000 Variable 3h 6h 9h 16h Median 0.000000000 34000 41000 0.000000000 Q3 * * * * SE Mean 0.000000000 14000 11000 0.000000000 StDev 0.000000000 19799 15556 0.000000000 Minimum 0.000000000 20000 30000 0.000000000 Q1 * * * * Maximum 0.000000000 48000 52000 0.000000000 ————— 12/3/2014 3:43:27 PM ———————————————————— Welcome to Minitab, press F1 for help Descriptive Statistics: 3h, 6h, 9h, 16h (chủng 85V1/Thỏ có uống vaccine) Variable 3h 6h 9h 16h N 2 2 N* 0 0 Mean 0.000000000 25000 45000 7500 Variable 3h 6h 9h 16h Median 0.000000000 25000 45000 7500 Q3 * * * * SE Mean 0.000000000 5000 10000 7500 StDev 0.000000000 7071 14142 10607 Minimum 0.000000000 20000 35000 0.000000000 Q1 * * * * Maximum 0.000000000 30000 55000 15000 ————— 12/3/2014 3:45:44 PM ———————————————————— Welcome to Minitab, press F1 for help Descriptive Statistics: 3h, 6h, 9h, 16h (chủng 81V1/Thỏ có uống vaccine) Variable 3h 6h 9h 16h N 2 2 N* 0 0 Mean 0.000000000 35000 53000 15000 Variable 3h 6h 9h 16h Median 0.000000000 35000 53000 15000 Q3 * * * * SE Mean 0.000000000 5000 7000 15000 Maximum 0.000000000 40000 60000 30000 174 StDev 0.000000000 7071 9899 21213 Minimum 0.000000000 30000 46000 0.000000000 Q1 * * * * PHỤ LỤC 15 THÀNH PHẦN MƠI TRƯỜNG, HĨA CHẤT DÙNG TRONG THÍ NGHIỆM ASPW: Ankalin Peptone Water (Nước peptone kiềm) Pepton : 20,00 g Natri clorua (NaCl) : 20,00 g Nước cất vơ trùng : 1,00 lít Hồ tan thành phần, chỉnh pH theo yêu cầu chia vào bình chứa thích hợp Hấp nhiệt độ 1210C 10 phút Khi bảo quản phải vặn chặt nắp bình, để tránh bay nước pH bị thay đổi TCBS: Thạch thiosunfat-citrat-bile-muối-sacaroza Pepton : 10,00 g Cao nấm men : 5,00 g Natri citrat : 10,00 g Natri thiosunphat (Na2S2O3) : 10,00 g Sắt (III) citrat (FeC6H5O7) : 1,00 g Natri clorua (NaCl) : 10,00 g Mật bò : 5,00 g Sucrose : 20,00 g Natri cholate : 3,00 g Xanh bromthymol : 0,04 g Xanh thymol : 0,04 g Thạch : 15,00 g Nước cất vơ trùng : 1,00 lít Ðun sơi để hồ tan hoàn toàn thành phần làm nguội tới nhiệt độ khoảng 500C Rót 15 - 20 ml vào đĩa petri vô trùng Trước sử dụng phải làm khô đĩa môi trường cách để qua đêm nhiệt độ phòng đặt đĩa tủ ấm nhiệt độ khoảng 370C - 450C Chú thích: khơng hấp khử trùng mơi trường NA: nutrient agar Cao thịt bò : 5,0 g Pepton : 3,0 g Thạch : 15,00 g Nước cất vô trùng : 1,00 lít SNA: Saline Nutrient agar (thạch dinh dưỡng có muối) Cao thịt bị : 5,0 g Pepton : 3,0 g 175 Natri clorua (NaCl) : 10,0 g Thạch : 15,00 g Nước cất vơ trùng : 1,00 lít MHA: Mueller Hinton agar Approximate formula : 20g Beef extract : 20g Axid hydrolysate : 17.5g Starch : 1.5g Agar : 17.5g TSI saline: Saline triple Sugar Iron agar (Thạch sắt ba có đường) Pepton : 20,00 g Cao thịt bò : 3,00 g Cao nấm men : 3,00 g Natri clorua (NaCl) : 10,00 g Lactose : 10,00 g Sacarose : 10,00 g Glucose : 1,00 g Sắt (III) citrat : 0,30 g Ðỏ phenol : 0,024 g Thạch : 12,00 g Nước cất vô trùng : 1,00 lít Hồ tan thành phần, chia vào ống nghiệm khoảng ml Hấp nhiệt độ 1210C 15 phút Trước môi trường đông, đặt ống nằm nghiêng cho phần thạch đứng cao khoảng - cm phần thạch nghiêng khoảng - cm LDC: Lysine decarboxylase l-Lysine monohydrochloride : 5,0 g Cao nấm men : 3,0 g Glucose : 1,0 g Bromocresol purple : 0,015 g Natri clorua (NaCl) : 10,0 g Nước cất vơ trùng : 1,00 lít Chú thích: Trong nghiên cứu ống LDC sản xuất sẵn thay cho dung dịch LDC ONGP: Ortho-Nitrophenyl-β-D-galactopyranoside (dùng phát βgalactosidase) 2-ortho-Nitrophenyl-β-D-galactopyranoside (ONPG): 0,08 g 176 Nước cất vô trùng : 15ml Dung dịch đệm : 5,00 ml Dung dịch đệm: + Natri dihydro phosphat ngậm phân tử nước (NaH2PO4.H2O): 6,90 g + Nước cất : 45,00 ml + Dung dịch hydroxit natri (NaOH) 30 % (w/v) : 3,00 ml Chú thích: Trong nghiên cứu đĩa ONPG sản xuất sẵn thay cho dung dịch ONPG Tryptophan (dùng phát Indole) Enzymatic digest of casein : 10,0 g DL-tryptophan ; 1,0 g Natri clorua (NaCl) : 10,0 g Nước cất vơ trùng : 1,00 lít 10 Thuốc thử Kovacs 4-Dimethylaminobenzaldehyde :5g Acid chlohyric (HCl) : 25 ml 2-Methylbutanol : 75 ml Việc phát indole thực phản ứng phân tử tryptophan với thuốc thử Kovacs (para dimethylaminobenzaldehyde, p-DMABA) tạo nên phức chất dạng quinone có màu đỏ 11 Urease urê : 20,00 g Dinatri hydro phosphat (Na2HPO4) : 9,50 g Dikali hydro phosphat (K2HPO4) : 9,10 g Cao nấm men : 0,10 g Ðỏ phenol : 0,01 g Nước cất vô trùng : 1,00 lít Hồ tan thành phần Khơng hấp khử trùng, lọc vô trùng màng lọc có đường kính lỗ 0,45 l Sau đó, rót khoảng 1,5 - 3,0 ml vào ống nghiệm đĩa petri sấy vô trùng 13 Muối peptone Water (Nước peptone có nhiều nồng độ muối) Pepton : 10,00 g Natri clorua (NaCl) : 0, 20, 60, 80, 100 g Nước cất vơ trùng : 1,00 lít 177 Hoà tan thành phần, chỉnh pH theo yêu cầu chia vào bình chứa thích hợp Hấp nhiệt độ 1210C 10 phút Khi bảo quản phải vặn chặt nắp bình, để tránh bay nước pH bị thay đổi 14 Thuốc thử Oxidase N, N, N, N’-Tetramethyl-p-phenylenediamine dihydrochloride: 1,0 g Nước cất vô trùng : 1,00 lít Chú thích: Trong nghiên cứu đĩa Oxidase sản xuất sẵn thay cho dung dịch Oxidase Lưu ý: Tất môi trường phân lập (trừ TCBS) đun sơi để hồ tan hồn tồn thành phần, hấp nhiệt độ 1210C 15 phút, làm nguội tới nhiệt độ khoảng 500C Rót 15 - 20 ml vào đĩa petri vô trùng Trước sử dụng phải làm khô đĩa môi trường cách để qua đêm nhiệt độ phòng đặt đĩa tủ ấm nhiệt độ khoảng 370C - 450C 178 PHỤ LỤC 16: Bộ môi trường thuốc thử dùng định danh vi khuẩn Gram âm PHỤ LỤC 17: Vaccine tả dùng thí nghiệm 179