Nghiên cứu đặc điểm di truyền, sinh học và sinh thái học của cá bống Glossogobius aureus và Glossogobius sparsipapillus phân bố một số tỉnh Đồng bằng sông Cửu Long

Nghiên cứu đặc điểm di truyền, sinh học và sinh thái học của cá bống Glossogobius aureus và Glossogobius sparsipapillus phân bố một số tỉnh Đồng bằng sông Cửu Long.Nghiên cứu đặc điểm di truyền, sinh học và sinh thái học của cá bống Glossogobius aureus và Glossogobius sparsipapillus phân bố một số tỉnh Đồng bằng sông Cửu Long.Nghiên cứu đặc điểm di truyền, sinh học và sinh thái học của cá bống Glossogobius aureus và Glossogobius sparsipapillus phân bố một số tỉnh Đồng bằng sông Cửu Long.Nghiên cứu đặc điểm di truyền, sinh học và sinh thái học của cá bống Glossogobius aureus và Glossogobius sparsipapillus phân bố một số tỉnh Đồng bằng sông Cửu Long.Nghiên cứu đặc điểm di truyền, sinh học và sinh thái học của cá bống Glossogobius aureus và Glossogobius sparsipapillus phân bố một số tỉnh Đồng bằng sông Cửu Long.Nghiên cứu đặc điểm di truyền, sinh học và sinh thái học của cá bống Glossogobius aureus và Glossogobius sparsipapillus phân bố một số tỉnh Đồng bằng sông Cửu Long.Nghiên cứu đặc điểm di truyền, sinh học và sinh thái học của cá bống Glossogobius aureus và Glossogobius sparsipapillus phân bố một số tỉnh Đồng bằng sông Cửu Long.Nghiên cứu đặc điểm di truyền, sinh học và sinh thái học của cá bống Glossogobius aureus và Glossogobius sparsipapillus phân bố một số tỉnh Đồng bằng sông Cửu Long.Nghiên cứu đặc điểm di truyền, sinh học và sinh thái học của cá bống Glossogobius aureus và Glossogobius sparsipapillus phân bố một số tỉnh Đồng bằng sông Cửu Long.Nghiên cứu đặc điểm di truyền, sinh học và sinh thái học của cá bống Glossogobius aureus và Glossogobius sparsipapillus phân bố một số tỉnh Đồng bằng sông Cửu Long.Nghiên cứu đặc điểm di truyền, sinh học và sinh thái học của cá bống Glossogobius aureus và Glossogobius sparsipapillus phân bố một số tỉnh Đồng bằng sông Cửu Long.Nghiên cứu đặc điểm di truyền, sinh học và sinh thái học của cá bống Glossogobius aureus và Glossogobius sparsipapillus phân bố một số tỉnh Đồng bằng sông Cửu Long.Nghiên cứu đặc điểm di truyền, sinh học và sinh thái học của cá bống Glossogobius aureus và Glossogobius sparsipapillus phân bố một số tỉnh Đồng bằng sông Cửu Long.Nghiên cứu đặc điểm di truyền, sinh học và sinh thái học của cá bống Glossogobius aureus và Glossogobius sparsipapillus phân bố một số tỉnh Đồng bằng sông Cửu Long.Nghiên cứu đặc điểm di truyền, sinh học và sinh thái học của cá bống Glossogobius aureus và Glossogobius sparsipapillus phân bố một số tỉnh Đồng bằng sông Cửu Long.Nghiên cứu đặc điểm di truyền, sinh học và sinh thái học của cá bống Glossogobius aureus và Glossogobius sparsipapillus phân bố một số tỉnh Đồng bằng sông Cửu Long.Nghiên cứu đặc điểm di truyền, sinh học và sinh thái học của cá bống Glossogobius aureus và Glossogobius sparsipapillus phân bố một số tỉnh Đồng bằng sông Cửu Long.Nghiên cứu đặc điểm di truyền, sinh học và sinh thái học của cá bống Glossogobius aureus và Glossogobius sparsipapillus phân bố một số tỉnh Đồng bằng sông Cửu Long.Nghiên cứu đặc điểm di truyền, sinh học và sinh thái học của cá bống Glossogobius aureus và Glossogobius sparsipapillus phân bố một số tỉnh Đồng bằng sông Cửu Long.Nghiên cứu đặc điểm di truyền, sinh học và sinh thái học của cá bống Glossogobius aureus và Glossogobius sparsipapillus phân bố một số tỉnh Đồng bằng sông Cửu Long.Nghiên cứu đặc điểm di truyền, sinh học và sinh thái học của cá bống Glossogobius aureus và Glossogobius sparsipapillus phân bố một số tỉnh Đồng bằng sông Cửu Long.Nghiên cứu đặc điểm di truyền, sinh học và sinh thái học của cá bống Glossogobius aureus và Glossogobius sparsipapillus phân bố một số tỉnh Đồng bằng sông Cửu Long.

GIỚI THIỆU

Đặt vấn đề

Trên thế giới có hơn 30.000 loài cá được mô tả ở cả nước ngọt, nước lợ và nước mặn (Ward et al., 2005), trong đó họ cá bống trắng Gobiidae được coi là một trong những họ cá có số lượng loài rất đa dạng, chỉ đứng sau họ cá chép (Cyprinidae) với 5.840 loài (Eschmeyer et al., 2018) Các nghiên cứu đã thống kê được 2.836 loài thuộc họ cá bống trắng (Gobiidae) trên toàn thế giới, phân bộ cá bống trên toàn thế giới có 6 họ, bao gồm 270 giống, 1500 – 2000 loài và phần lớn các loài cá bống sống ở biển thuộc họ Gobiidae (Myers, 1991), trong phân họ Gobiinae của họ Gobiidae thì giống

Glossogobius là một trong những giống có nhiều loài nhất (Hoese & Allen, 2009). Theo Thi (2000) đã thống kê được trên thế giới có rất nhiều công trình nghiên cứu về cá bống như: Herre (1953) đã công bố danh mục cá biển Philippines, trong đó có 221 loài cá bống; Koumans (1953) đã mô tả 287 loài cá bống ở vùng biển Indo – Australian và Giống Glossogobius khá phổ biến và được tìm thấy ở nhiều quốc gia, vùng lãnh thổ, nhiều châu lục trên thế giới và ở Việt Nam (Froese & Pauly, 2022; Truong et al., 2021) Loài Glossogobius sparsipapillus và loài Glossogobius aureus có sự phân bố rộng rãi từ nước mặn đến nước ngọt ở các khu vực Nam Phi, Châu Á và Châu Đại Dương (Froese & Pauly, 2022; Rainboth, 1996) và ở Việt Nam (Nguyen & Dinh, 2020; Định và ctv., 2013) Lưu vực sông Mê Kông ghi nhận có 7 loài: Glossogobius biocellatus; Glossogobius celebius; Glossogobius circumspectus; Glossogobius giuris; Glossogobius aureus; Glossogobius bicirrhosus và Glossogobius sparsipapillus (Rainboth et al., 2012) Ở Việt Nam, giống Glossogobius được ghi nhận có 5 loài (G aureus, G giuris, G circumspectus, G sparsipapillus và G biocellatus) (Hảo, 2005; Rainboth et al., 2012; Định và ctv., 2013) Theo nghiên cứu giữa tổ chức bảo vệ tài nguyên môi trường của Nhật (Nagao) với Khoa Thủy sản trường Đại học Cần Thơ về nguồn lợi thủy sản tại ĐBSCL cho thấy có hơn 183 loài cá được ghi nhận, họ cá bống (Gobiidae) có 54 loài chiếm 19% và có 03 loài thuộc giống Glossogobius là G aureus, G giuris và G sparsipapillus được mô tả (Tuấn và ctv., 2014; Định và ctv., 2013) Giống Glossogobius gồm những loài có giá trị dinh dưỡng nên được sử dụng làm thực phẩm (Tuấn và ctv., 2014) Tuy nhiên, theo nghiên cứu trong tự nhiên sản lượng cá giảm đáng kể do việc khai thác quá mức bằng nhiều phương tiện mang tính chất hủy diệt (Nhiên & Định, 2012) Vì loài cá bống phân bố rộng rãi ở các vùng ven biển và vùng cửa sông (Quang và ctv., 2009; Định và ctv., 2013), nên sự thay đổi của môi trường sống do tác động của biến đổi khí hậu cũng ảnh hưởng đến sự sinh trưởng và phát triển bình thường của giống cá này Vì vậy, cần phải xác định mối quan hệ giữa chiều dài và khối lượng, tốc độ tăng trưởng của cá và yếu tố tình trạng cơ thể thay đổi theo địa điểm lấy mẫu, giới tính, kích thước cá và mùa, hệ số điều kiện (CF) và sự dao động của hình thức tăng trưởng và Hệ số điều kiện theo giới tính, nhóm chiều dài cá, mùa vụ và điểm thu mẫu của hai loài cá bống G aureus và G. sparsipapillus chưa được nghiên cứu đầy đủ Hình thức tăng trưởng của loài G.sparsipapillus chưa có nhiều nghiên cứu Thêm vào đó, đặc điểm sinh thái học dinh dưỡng như mối tương quan chiều dài ruột và chiều dài cơ thể hay còn gọi là chỉ số RGL; sự dao động của RGL, thành phần thức ăn, hệ số no và cường độ bắt mồi theo giới tính, nhóm chiều dài, mùa vụ và điểm thu mẫu của hai loài này chưa được nghiên cứu đầy đủ (Tran et al., 2021) Vì vậy, Nghiên cứu đặc điểm di truyền, sinh học và sinh thái học của hai loài cá bống Glossogobius aureus và Glossogobius sparsipapillus phân bố một số tỉnh Đồng bằng sông Cửu Long sẽ góp phần bổ sung dẫn liệu về phân loại học, đánh giá đa dạng di truyền, nuôi nhân tạo và khai thác hợp lý nguồn lợi của các loài thuộc giống Glossogobius.

Mục tiêu nghiên cứu

1.2.1 Mục tiêu chung Đánh giá đa dạng di truyền của giống cá bống Glossogobius và cung cấp được dẫn liệu về đặc điểm sinh học; sinh thái học hai loài cá bống G aureus và G. sparsipapillus phân bố ở khu vực nghiên cứu, từ đó góp phần khai thác bền vững nguồn lợi của những loài cá này.

Xác định được chỉ thị phân tử DNA ở ty thể (vùng gen COI và vùng gen Cytb) của giống cá bống Glossogobius phục vụ cho công tác đánh giá đa dạng di truyền và phân loại học.

Bổ sung được dẫn liệu về đặc điểm sinh học như hình thức tăng tưởng, hệ số điều kiện, cấu trúc và mối quan hệ của đá tai với kích cỡ cá của hai loài cá bống G. aureus và G sparsipapillus ở khu vực nghiên cứu.

Cung cấp được dẫn liệu về sinh thái học dinh dưỡng và quần thể của hai loài cá bống G aureus và G sparsipapillus ở khu vực nghiên cứu.

Ý nghĩa của nghiên cứu

Kết quả của đề tài góp phần bổ sung dẫn liệu cho phân loại học và đánh giá đa dạng di truyền của các loài cá thuộc giống Glossogobius.

Kết quả của đề tài sẽ góp phần đánh giá được sự thích nghi sinh thái của hai loài cá bống G aureus và G sparsipapillus ở khu vực nghiên cứu thông qua dẫn liệu về đặc điểm sinh học và sinh thái học của chúng như: hình thức tăng trưởng, hệ số điều kiện, mối quan hệ giữa đá tai và kích cỡ cá cùng đặc điểm dinh dưỡng và cấu trúc quần thể.

Dẫn liệu về tính ăn và đặc điểm dinh dưỡng là cơ sở để nghiên cứu nuôi nhân tạo hai loài cá bống G aureus và G sparsipapillus ở khu vực nghiên cứu, từ đó đa dạng hóa đối tượng nuôi, thích ứng với sự xâm nhập mặn do tác động của biến đổi khí hậu ảnh hưởng đến vùng ĐBSCL.

Kết quả của đề tài góp phần bổ sung đề xuất giải pháp khai thác hợp lý nguồn lợi của hai loài cá bống G aureus và G sparsipapillus thông qua dẫn liệu về hệ số điều kiện, hình thức tăng trưởng và các thông số sinh học quần thể của hai loài.

Nội dung nghiên cứu

- Nội dung 1: Nghiên cứu đặc điểm hình thái và chỉ thị phân tử DNA trong ty thể (gen COI và Cytb) làm cơ sở xác định loài và phân tích quan hệ di truyền giữa ba loài thuộc giống cá bống Glossogobius phân bố ở khu vực nghiên cứu.

- Nội dung 2: Nghiên cứu đặc điểm sinh học về (1) các chỉ số hình thái và đặc điểm sinh học tăng trưởng của hai loài thuộc giống cá bống Glossogobius ở khu vực nghiên cứu như: chiều dài tổng, khối lượng, tương quan giữa chiều dài và khối lượng cá (LWR), hình thức tăng trưởng dựa trên hệ số b, hệ số điều kiện (CF) và sự biến động của các thông số trên theo giới tính, kích thước cá, mùa vụ và điểm thu mẫu; (2) hình dạng, khối lượng, kích thước đá tai và mối tương quan giữa khối lượng đá tai với kích thước cơ thể của hai loài G aureus và G sparsipapillus ở khu vực nghiên cứu.

- Nội dung 3: Nghiên cứu đặc điểm sinh thái học dinh dưỡng và quần thể gồm

(1) dinh dưỡng của hai loài thuộc giống cá bống Glossogobius ở khu vực nghiên cứu như: tính ăn dựa trên tương quan chiều dài ruột cá với chiều dài cơ thể (RGL), cường độ bắt mồi dựa trên chỉ số sinh trắc dạ dày (GI), hệ số béo Clark, phổ thức ăn và sự biến động của các thông số trên theo giới tính, kích thước cá, mùa vụ và điểm thu mẫu;

(2) quần thể của hai loài thuộc giống cá bống Glossogobius như chiều dài tối đa (L ∞ ), hệ số tăng trưởng tổng hợp (’), tuổi thọ tối đa (t max ), hệ số khai thác (E), hệ số chết tổng (Z), hệ số chết do khai thác (F) và chiều dài đánh bắt đầu tiên (L c ) làm cơ sở đánh giá tình trạng khai thác nguồn lợi của hai loài G aureus và G sparsipapillus ở khu vực nghiên cứu.

Điểm mới của luận án

(1) Xác định được chỉ thị phân tử DNA trong ty thể của những loài cá thuộc giống Glossogobius Đã đăng ký được 12 trình tự vùng gen COI và 12 trình tự vùng gen Cytb của ba loài G giuris, G aureus và G sparsipapillus, đặc biệt đã bổ sung dẫn liệu về 8 trình tự vùng gen COI và Cytb của loài G sparsipapillus vào Ngân hàng gen NCBI.

2) Bổ sung được hình thức tăng trưởng và hệ số điều kiện cũng như sự biến động của những yếu tố này theo giới tính, mùa với kích cỡ của 2 loài G aureus và

3) Dẫn liệu về đá tai cung cấp mối quan hệ giữa một số chỉ tiêu hình thái của đá tai với kích cỡ của 2 loài G aureus và G sparsipapillus.

4) Xác định được dẫn liệu về tính ăn và phổ thức ăn cũng như sự biến động của tính ăn và phổ thức ăn theo giới tính, mùa và kích cỡ của hai loài G aureus và

5) Thông qua các thông số quần thể đã bổ sung được dẫn liệu về hiện trạng khai thác của hai loài G aureus và G sparsipapillus ở khu vực nghiên cứu.

PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Thời gian và địa điểm nghiên cứu

Nghiên cứu được thực hiện từ tháng 01 năm 2020 đến tháng 06 năm 2021.

Quá trình thu mẫu được diễn ra liên tục vào vào mỗi tháng trong thời gian nghiên cứu, trong đó mùa khô diễn ra từ tháng 01 đến tháng 5, mùa mưa bắt đầu từ tháng 6 đến tháng 12 (Dinh & Nguyen, 2022).

Nghiên cứu được thực hiện tại 4 địa điểm (Hình 3.1) gồm vùng nước ngọt quanh năm (Cái Răng, Cần Thơ), vùng nước bị nhiễm mặn vào mùa khô (Long Phú, Sóc Trăng), vùng nước lợ ở kênh chảy ra biển (Hoà Bình, Bạc Liêu) và vùng nước lợ ở nhánh sông tự nhiên (Đầm Dơi, Cà Mau).

Hình 3.1: Bản đồ khu vực thu mẫu (1: Cái Răng; 2: Long Phú; 3: Hòa Bình; 4: Đầm Dơi; Nguồn: Dinh (2018a))

Bảng 3.1: Toạ độ các điểm nghiên cứu thực địa Điểm thu mẫu Ký hiệu Tọa độ các điểm thu mẫu

Cái Răng, Cần Thơ CRCT 9°59’59,3″N 105°48′26,8″E Long Phú, Sóc Trăng LPST 9°37′35,9″N 106°08′23,4″E Hòa Bình, Bạc Liêu HBBL 9°12′09,5″N 105°43′00,2″E Đầm Dơi, Cà Mau ĐDCM 8°58′17,5″N 105°22′51,8″E

Phương tiện nghiên cứu

3.2.1 Thiết bị phục vụ nghiên cứu

Thiết bị: Tủ lạnh -20 o C (Electrolux, Thụy Điển) để trữ mẫu DNA sau ly trích; máy nghiền mẫu (Retsch, Đức), máy Vortex (Labnet Vx100, Đức), máy sấy chân không (Eppendorf concentrator 5301, Đức), máy ly tâm mini (E – Centrifuge, Mỹ) và bể ủ nhiệt (Grant, Anh) bộ micropipette Bio-Rad P10, P20, P200, P1000 (Hoa Kỳ), các loại ống tube dùng để trích mẫu DNA và để thực hiện phản ứng PCR; máy PCR (GeneAmp PCR system 9700, Mỹ), hệ thống chụp hình gel (Bio – Rad UV 200, Mỹ), bộ điện di Run’s One (Embitec, Mỹ) sử dụng để khuếch đại DNA và chụp hình gel; cân kỹ thuật (0,01 gam), cân phân tích (0,1 mg), tủ sấy, tủ lạnh, kính hiển vi (Olympus, Nhật), Kính lúp (Motic), máy cắt Microstome (Sakura, Nhật) và máy ảnh kỹ thuật số (Canon).

Dụng cụ: bộ đồ giải phẫu, cồn kế, ống đong, đèn cồn, thùng nhựa, keo nhựa để lưu trữ mẫu, khay nhựa, bàn đo cá và pen.

Hóa chất ly trích DNA: Nitơ lỏng, CTAB (Merck, Đức), TE 1X, TE 0.1X, Isopropanol (Merck, Đức), EB + PVP 40 (tỷ lệ 10:7), chloroform (Merck, Đức) (pha hỗn hợp chloroform với Isoamyl alcohol theo tỷ lệ 24:1, ethanol tuyệt đối 95% (Merck, Đức), cồn 70%.

Hóa chất PCR và điện di: BiH2O, PCR buffer (Invitrogen) gồm dNTPs, MgCl2 và dung dịch đệm , Taq-polymerase (Invitrogen), DNA của cá, cặp mồi FishF1 và Fish F2 của Ward et al (2005) để khuếch đại gen COI của ty thể, cặp mồi GCytbL và GCytbH (Ju et al., 2016); cặp mồi GluMug-1F và MixCytob 937-2R (Durand et al.,

2012) để khuếch đại gen Cytb, Agarose điện di (Merck), TAE buffer (Bio-Rad), loading buffer (hóa chất chạy gel), Safe View, thang chuẩn để ước lượng kích thước các trình tự nucleic acid trong gel agarose (Invitrogen) Dung dịch formalin 5% dùng để bảo quản mẫu cá từ khi thu được cho đến khi phân tích mẫu.

Đối tượng nghiên cứu

3.3.1 Sơ lược các nội dung nghiên cứu

3.3.2 Phạm vi nghiên cứu Đặc điểm hình thái, chỉ thị phân tử DNA của ty thể (vùng gen COI và vùng gen

Cytb) của giống cá Glossogobius thu được ở vùng nước ngọt quanh năm (Cái Răng, Cần Thơ), vùng nước bị nhiễm mặn vào mùa khô (Long Phú, Sóc Trăng), vùng nước lợ ở kênh chảy ra biển (Hòa Bình, Bạc Liêu) và vùng nước lợ ở nhánh sông tự nhiên (Đầm Dơi, Cà Mau). Đặc điểm sinh học gồm hình thức tăng trưởng, các hệ số tăng trưởng (b), hệ số điều kiện (CF) của cá bống G aureus và G sparsipapillus; sự biến động của hệ số tăng trưởng (b) và hệ số điều kiện (CF) theo nhóm chiều dài, mùa vụ và điểm thu mẫu; đá tai và sự tương quan của đá tai với kích thước cơ thể. Đặc điểm sinh thái học dinh dưỡng như tính ăn, phổ thức ăn, cường độ bắt mồi (GI) và khả năng tích lũy năng lượng (Clark) của hai loài G aureus và G. sparsipapillus; sự biến động của tính ăn, phổ thức ăn, chỉ số sinh trắc dạ dày (GI) và hệ số béo Clark theo nhóm chiều dài, mùa vụ và điểm thu mẫu.

Phương pháp thu mẫu

Hàng tháng mẫu cá đã được thu trực tiếp hoặc gián tiếp bằng nhiều loại ngư cụ của ngư dân như lưới đăng hoặc lưới đáy với kích thước mắt lưới 1 cm Tại mỗi điểm, cá được thu 2 lần/ngày (lúc 5:00 – 6:00 và 18:00 – 19:00) và thu tối thiểu 30 mẫu cá/loài/vùng sinh thái (tổng số mẫu tối thiểu cho mỗi loài 360 mẫu) Mẫu cá đã được thu ngẫu nhiên với nhiều kích cỡ khác nhau trong 48 giờ Sau đó, cá được gây mê bằng MS-222 trước khi được bảo quản trong formalin 5% Riêng mẫu dùng để phân tích chỉ thị phân tử DNA (2 mẫu/loài/vùng sinh thái  3 loài/vùng sinh thái  4 vùng sinh thái) được trữ trong cồn 95 o sau khi thu Mẫu cá sau đó được vận chuyển về phòng thí nghiệm Bộ môn Sinh học, Khoa Sư phạm, trường Đại học Cần Thơ để định loại Tại phòng thí nghiệm, thực hiện đo đếm các chỉ số có thể quan sát bằng mắt thường, đối với những cấu trúc có kích thước nhỏ thì quan sát bằng kính hiển vi, kính lúp để định loại mẫu cá.

Mẫu nước tại các địa điểm nghiên cứu được tiến hành lấy định kỳ mỗi tháng một lần Nhiệt độ nước của môi trường được đo ngay tại các điểm nghiên cứu bằng bút đo cầm tay HI98128 Sử dụng khúc xạ kế SLI – 10 được sử dụng để xác định độ mặn của nước tại các điểm lấy mẫu Việc khảo sát các chỉ tiêu môi trường góp phần vào việc giải thích các kết quả nghiên cứu chịu ảnh hưởng của các nhân tố môi trường đến đối tượng nghiên cứu tại các địa điểm được nghiên cứu.

Phương pháp phân tích mẫu

3.5.1 Sự biến động yếu tố môi trường ở khu vực nghiên cứu

Tiến hành đo và ghi nhận các nhân tố như: nhiệt độ và độ mặn của môi trường nước và ghi nhận hệ thực vật theo Dinh et al (2021c) ở 4 điểm Cái Răng, Cần Thơ;

Long Phú, Sóc Trăng; Hòa Bình, Bạc Liêu và Đầm Dơi, Cà Mau từ tháng 01/2020 đến tháng 12/2020.

Giá trị nhiệt độ và độ mặn của nước mỗi tháng ở khu vực nghiên cứu được đo bằng bút đo pH (Model: HI98127) và khúc xạ kế (Model: 950.0100 PPT-ATC) Sự khác biệt giá trị pH, nhiệt độ và độ mặn giữa hai mùa thu mẫu được xác định bằng t- test và giữa các điểm và tháng thu mẫu bằng One-way ANOVA (phân tích phương sai một chiều).

3.5.2.1 Lấy mẫu phân tích và ly trích DNA a) Tách chiết DNA

Tiến hành tách chiết DNA ty thể sử dụng bộ kit TopPURE® Genomic DNA Extraction Kit (ABT, Việt Nam) Quy trình thực hiện theo khuyến cáo của nhà sản xuất như sau:

- Bước 1: Lấy 100 mg vi bụng cá được cắt nhỏ cho vào ống Eppendorf cùng với

200 μL buffer và 20 μL Proteinase K Nghiền mẫu bằng chày cho đến khi nát mẫu, vortex đều và ủ ở 72 o C cho đến khi mẫu ly giải hoàn toàn.

- Bước 2: Thờm 200 àL CL buffer, vortex đều và ủ 72 o C trong 10 phỳt.

- Bước 3: Thờm 200 àL Ethanol (96 – 100%), trộn đều và chuyển hỗn hợp sang cột silica đặt sẵn trong tube 2 mL Ly tâm ở tốc độ 13,000 rpm trong 1 phút Giữ lại cột và loại bỏ phần chất lỏng bên dưới.

- Bước 4: Đặt lại cột vào tube 2 mL cũ Thờm 500 àL WB1 buffer và ly tõm ở tốc độ 13,000 rpm trong 1 phút Giữ lại cột và loại bỏ phần chất lỏng bên dưới.

- Bước 5: Đặt lại cột vào tube 2 mL cũ Thờm 500 àL WB2 buffer và ly tõm ở tốc độ 13,000 rpm trong 1 phút Giữ lại cột và loại bỏ phần chất lỏng bên dưới.

- Bước 6: Đặt lại cột vào tube 2 mL cũ Làm khô cột bằng cách ly tâm ở tốc độ 13,000 rpm trong 1 phút.

- Bước 7: Chuyển cột sang tube 1.5 mL mới Thờm 50 àL EB buffer và ủ một phút ở nhiệt độ phòng Ly tâm ở tốc độ 13,000 rpm trong 1 phút, thu phần dịch chứa DNA bên dưới.

- Bước 8: DNA thu được sử dụng ngay hoặc bảo quản ở -20 0 C. b) Khuếch đại chuỗi DNA

Quá trình khuếch đại DNA và giải trình tự được thực hiện dựa trên phương pháp nghiên cứu của Thảo & Yên (2015) và được tiến hành tại Phòng thí nghiệm Sinh học phân tử, Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học, Trường Đại học CầnThơ Trình tự đoạn mồi khuếch đại được thể hiện trong Bảng 3.2.

Bảng 3.2: Trình tự đoạn mồi khuếch đại một số gen trong ty thể

Gen Tên cặp mồi Trình tự mồi Sản phẩm khuếch đại Tác giả

CATAAAGATATCGGCAC3’ 650 bp Ward et al.

Cytb GcytbL 5’ GACTTGAAAAACCACCGTTG 3’ 1.300 bp Ju et al.

GluMug-1F 5′-GGCTTGAAAAACCACCGTTG-3′ 1.045 bp Durand et al.

Phương pháp PCR (Polymerase Chain Reaction) được sử dụng để lần lượt khuếch đại gen COI và gen Cytb Thành phần phản ứng PCR được thể hiện cụ thể (Bảng 3.3). Bảng 3.3: Thành phần phản ứng PCR

Thành phần Nồng độ ban đầu Thể tớch (àl)/phản ứng

EZ Mix (Phù Sa) - 1 tube

Chu kỳ nhiệt của phản ứng PCR có sự tương đồng và được thể hiện cụ thể đối với từng cặp mồi: cặp mồi Fish F/Fish R (Bảng 3.4), cặp mồi GcytbH/GcytbL (Bảng 3.5) và cặp mồi GluMuq1-F/Mixcyto937-2R (Bảng 3.6).

Bảng 3.4: Chu kỳ nhiệt PCR sử dụng mồi Fish F/Fish R

Giai đoạn Nhiệt độ Thời gian Chu kỳ

Biến tính toàn bộ DNA khuôn 95 o C 5 phút 1

Kéo dài kết thúc 25 o C 2 phút 1

Bảng 3.5: Chu kỳ nhiệt PCR sử dụng mồi GcytbH/GcytbL

Giai đoạn Nhiệt độ Thời gian Chu kỳ

Biến tính toàn bộ DNA khuôn 95 o C 5 phút 1

Kéo dài kết thúc 25 o C 2 phút 1

Bảng 3.6: Chu kỳ nhiệt PCR sử dụng mồi GluMuq1-F/Mixcyto937-2R

Giai đoạn Nhiệt độ Thời gian Chu kỳ

Biến tính toàn bộ DNA khuôn 95 o C 5 phút 1

Kéo dài kết thúc 25 o C 2 phút 1

Bảo quản 4 o C lâu dài c) Điện di kiểm tra sản phẩm PCR

Sản phẩm được kiểm tra trên gel agarose 2%, trong buffer TBE 1X, hiệu điện thế 110V trong 40 phút. d) Tinh sạch sản phẩm PCR

Những mẫu cho band sản phẩm sáng rõ, đúng kích thước sẽ được tiến hành tinh sạch thu hồi sản phẩm, sử dụng bộ sinh phẩm PCR Purification Kit (Jena Bioscience). Quy trình thực hiện được áp dụng theo khuyến cáo của nhà sản xuất như sau:

- Bước 1: Trộn đều Binding Buffer và sản phẩm PCR theo tỷ lệ (5:1), trộn đều.

- Bước 2: Hút chuyển toàn bộ dung dịch cho lên cột Spin Column (đã được hoạt húa với 100 àl Activation Buffer) Ly tõm 10,000 g trong 30 giõy, đổ bỏ dung dịch qua cột.

- Bước 3: Rửa cột với 700 àl Washing Buffer, ly tõm 10,000 g trong 30 giõy, đổ bỏ dung dịch qua cột Tiến hành thực hiện lại Bước 3 thêm 1 lần nữa.

- Bước 4: Ly tâm 10,000 g trong 2 phút để loại bỏ hoàn toàn Washing Buffer còn dính trên cột.

- Bước 5: Chuyển Spin Column qua tube 1.5 ml mới, thờm 40 àl Elution Buffer vào trung tâm của Spin Column, để yên 1 phút, ly tâm 10,000 g trong 1 phút Sau đó thu lấy dung dịch qua cột Tiến hành đo Nanodrop (Denovix) xác định nồng độ và độ tinh sạch của sản phẩm Sản phẩm có tỷ lệ A260/280 trong khoảng 1.8-2.0 được xem là đủ chất lượng để tiến hành giải trình tự bằng Phương Pháp Sanger. e) Giải trình tự Sanger

Tiến hành giải trình tự sản phẩm với từng mồi riêng biệt cho sản phẩm bằng kĩ thuật giải trình tự Sanger bằng thiết bị ABI 3500 (Thermofisher) Kết quả giải trình tự thu được dưới dạng file.ab1 Lắp ráp kết quả giải trình tự của hai mồi, đối chiếu với dẫn liệu gen trên ngân hàng NCBI và lựa chọn những loài có trình tự tương đồng cao để xác định loài.

3.5.2.2 Phân tích trình tự DNA

Chuỗi trình tự DNA được gửi giải trình tự tại công ty Macrogen Ltd., Hàn Quốc đối với gen COI và công ty Cổ phần Phù Sa Genomics, Thành phố Cần Thơ, Việt Nam đối với gen Cytb Các chuỗi trình tự được kiểm tra chất lượng và căn chỉnh bằng phần mềm Finch TV 1.4.0 (Geospiza Inc http://www.geospiza.com/finchtv) Các trình tự nucleotit được xem là đáng tin cậy khi giá trị Q lớn hơn hoặc bằng 20 Thành phần các nucleotit được phân tích bằng phần mềm Bioedit v.7.2 (Hall, 1999) Các chuỗi trình tự được tham chiếu với cơ sở dẫn liệu bằng công cụ BLAST (Basic Logical Alignment Search Tool, http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/) trên NCBI để xác định loài dựa trên các thông số: Organism (tên sinh vật), Q-coverage (độ bao phủ theo chiều dài của trình tự so sánh), Per Ident (% tương đồng), Accession (mã truy cập) Độ tương đồng càng cao, kết quả càng đáng tin cậy.