Nghiên cứu đặc điểm di truyền, thành phần hóa học và một số hoạt tính sinh học của loài curcuma xanthella thuộc họ gừng (zingiberaceae)

Nghiên cứu đặc điểm di truyền, thành phần hóa học và một số hoạt tính sinh học của loài curcuma xanthella thuộc họ gừng (zingiberaceae) Nghiên cứu đặc điểm di truyền, thành phần hóa học và một số hoạt tính sinh học của loài curcuma xanthella thuộc họ gừng (zingiberaceae)

BỘ CÔNG THƯƠNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BÁO CÁO TỔNG KẾT ĐỀ TÀI KHOA HỌC KẾT QUẢ THỰC HIỆN ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU KHOA HỌC CẤP TRƯỜNG Tên đề tài: Nghiên cứu đặc điểm di truyền, thành phần hóa học số hoạt tính sinh học loài Curcuma xanthella thuộc họ Gừng (Zingiberaceae) Mã số đề tài: 21.2SHTP02 Chủ nhiệm đề tài: Văn Hồng Thiện Đơn vị thực hiện: Viện Công nghệ Sinh học Thực phẩm Tp Hồ Chí Minh, … LỜI CÁM ƠN Chúng xin chân thành cảm ơn: - Trường Đại học Công Nghiệp Tp HCM hỗ trợ kinh phí cho đề tài - Phịng Quản lý Khoa học Hợp tác Quốc tế hỗ trợ chúng tơi việc hồn thành hộ sơ đề cương nghiệm thu đề tài - Ban lãnh đạo phận quản lý Phịng thí nghiệm Viện Công nghệ Sinh học Thực phẩm, Trường Đại học Công Nghiệp Tp HCM tạo điều kiện để thí nghiệm thực - Phịng thí nghiệm Vi sinh vật học, Viện Công nghệ Sinh học Thực phẩm, Trường Đại học Công Nghiệp Tp HCM cung cấp giống vi khuẩn cho nghiên cứu - TS Nguyễn Phi Ngà, Bộ môn Sinh thái học-Tiến hóa, Khoa Sinh học-Cơng nghệ Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên Tp HCM hỗ trợ cơng tác chụp ảnh mẫu lồi nghiên cứu cung cấp hình ảnh nghiên cứu - TS Nguyễn Quốc Hùng, Trung tâm dịch vụ phân tích thí nghiệm TP HCM (CASE) thực phần phân tích sắc kí khối phổ (GC/MS) PHẦN I THƠNG TIN CHUNG I Thơng tin tổng qt 1.1 Tên đề tài: 1.2 Mã số: 1.3 Danh sách chủ trì, thành viên tham gia thực đề tài Họ tên (học hàm, học vị) TS Văn Hồng Thiện TT Đơn vị cơng tác Vai trị thực đề tài Viện Công nghệ Sinh học Chủ nhiệm Thực phẩm Thành viên GS TS Trần Đình Thắng Viện Công nghệ Sinh học Thực phẩm KS Lê Văn Sơn Khu bảo tồn thiên nhiên Bình Thành viên Châu-Phước Bửu 1.4 Đơn vị chủ trì: 1.5 Thời gian thực hiện: 1.5.1 Theo hợp đồng: 30/HĐ-DHCN từ tháng 03 năm 2022 đến tháng 03 năm 2023 1.5.2 Gia hạn (nếu có): Khơng 1.5.3 Thực thực tế: từ tháng 03 năm 2022 đến tháng 11 năm 2022 1.6 Những thay đổi so với thuyết minh ban đầu (nếu có): Khơng Thay đổi (Về mục tiêu, nội dung, phương pháp, kết nghiên cứu tổ chức thực hiện; Nguyên nhân; Ý kiến Cơ quan quản lý) 1.7 Tổng kinh phí phê duyệt đề tài: 20.000.000 triệu đồng II Kết nghiên cứu Đặt vấn đề Họ Gừng (Zingiberaceae) họ lớn Zingiberales với khoảng 53 chi 1400 loài phân bố rộng khắp vùng nhiệt đới giới [1,2] Các loài họ Gừng sử dụng nhiều y học cổ truyền nhiều nước Châu Á để chữa bệnh ho, đau họng, cải thiện tiêu hóa, giảm đau, chữa lành vết thâm sẹo, … [3] Ngồi ra, nhiều lồi họ Gừng cịn sử dụng lĩnh vực y học, dược, thực phẩm thành phần sản phẩm tự nhiên khác [3,4] Nghệ (Curcuma L.) chi có số lượng lồi lớn họ Gừng Chi ghi nhận với khoảng 108 loài phân bố rộng khắp khu vực nhiệt đới Đơng Nam Á, phía nam Trung Quốc, Ấn Độ, Tân Ghi Nê, Úc số nước Châu Phi Trung Mỹ [5] Ở Việt Nam, có khoảng 29 loài Curcuma nghi nhận nhiều nhà thực vật học [6,7] Ở nhiều nước châu Á Bangladesh, Malaysia, Ấn Độ, Nepal, Thái Lan Việt Nam, số loài Curcuma sử dụng để điều trị bệnh phế quản, tiêu chảy, viêm phổi, côn trùng cắn hay điều trị vết thương nhiễm trùng [8] Ngồi ra, thành phần hóa học nhiều hoạt tính sinh học loài thuộc chi Curcuma khảo sát nhiều nghiên cứu trước [3,4,9] Curcuma xanthella Škorničk lần đầu phát A Krempf Gần đây, Leong-Škorničková, nhà nghiên cứu chuyên khảo họ Gừng phát vẽ sơn màu loài lưu bảo tàng mẫu vật Paris với ngày tháng ghi vẽ 18 tháng 06 năm 1908 [10] Tuy nhiên, theo Leong-Škorničková Tran, không rõ ngày tháng thời điểm mẫu vật loài thu thập hay ngày tháng năm mà vẽ thực Hơn nữa, khơng có thơng tin vị trí thu mẫu vẽ mẫu vật lồi thu Việt Nam Krempf biết người thu mẫu An Nam [10] Đến năm 2013, C xanthella thức mô tả Leong-Škorničková and Tran với mẫu chuẩn thu Khu bảo tồn Thiên nhiên (KBTTN) Takou, tỉnh Bình Thuận [10] Gần đây, chúng tơi phát lồi C xanthella cịn có KBTTN Bình Châu-Phước Bửu, tỉnh Bà rịa-Vũng Tàu, khu vực gần với KBTTN Takou Trong nghiên cứu này, đặc điểm di truyền, thành phần hóa học số hoạt tính sinh học loài C xanthella lần đầu thực Mục tiêu: Xác định đặc điểm di truyền thành phần hóa học hoạt tính sinh học lồi C xanthella, từ hướng tới đưa vào ứng dụng thực tiễn loài lĩnh vực dược phẩm số lĩnh vực khác có liên quan Phương pháp nghiên cứu 3.1 Phương pháp định loại lồi Phương pháp hình thái so sánh sử dụng để xác định tên khoa học loài nghiên cứu Dựa đặc điểm hình thái quan sinh dưỡng, sinh sản so sánh với công bố trước đây, tiến hành xác định xác tên khoa học lồi nghiên cứu [10,11] 3.2 Phương pháp tách chiết DNA PCR Quá trình tách chiết tinh DNA thực theo Kit (Gene JET Plant Genomic DNA Purification Mini Kit) Hãng Thermo Scientific (Hoa Kỳ) theo quy trình nhà sản xuất cung cấp Phản ứng PCR thực với thành phần gồm 12,5 µL Gotaq Green Master Mix (Promega, Mỹ); 1,25 µL mồi xi ngược (nồng độ 10 µM) (Bảng 2); 9,5 µL nước khử ion; 0,5 µL DNA mẫu Chu kỳ nhiệt cho phản ứng PCR gồm: phút 95oC; 35 chu kỳ gồm: biến tính (1 phút 94oC), bắt cặp mồi (1 phút 30 giây 55oC) tổng hợp mạch (1 phút 30 giây 72oC); hoàn thiện phản ứng 72oC 10 phút Kết điện di sản phẩm PCR kiểm tra gel agarose 0.8% Sản phẩm PCR tinh giải trình tự máy ABI 3130 XL Sequencer Bảng Trình tự mồi sử dụng nghiên cứu Tên mồi Trình tự mồi (5’- 3’) Tài liệu tham khảo matK1 ACCCAGTCCATCTGGAAATCTTGGTTC [12] matK2 CGTACAGTACTTTTGTGTTTACGAG [12] trnL-F1 CGAAATCGGTAGACGCTACG [12] trnL-F2 ATTTGAACTGGTGACACGAG [12] ITS1 TCCGTAGGTGAACCTGCGG [13] ITS4 TCCTCCGCTTATTGATATGC [13] 3.3 Phương pháp hiệu chỉnh so sánh trình tự lồi nghiên cứu Kết giải trình tự chiều mẫu nghiên cứu hiệu chỉnh phần mềm FinchTV Seaview Trình tự mẫu nghiên cứu so sánh phần mềm Bioedit với phương pháp gióng tồn cục (global Alignment) 3.4 Phương pháp tạo cao tổng acetone Sấy khô mẫu C xanthella nhiệt độ 50°C đến khối lượng không đổi sau xay thành bột Cân 100g bột ngâm với 300 mL acetone ngày nhiệt độ phòng Lọc thu dịch chiết, lặp lại thêm lần với mẫu bã (sau lọc lần 1) thu tổng cộng khoảng 900 mL dịch lọc Sau tiến hành quay dịch chiết áp suất chân không 45°C để thu dạng cao sệt Để nhiệt độ phòng 24-48 để bay hồn tồn lượng acetone cịn lại mẫu đến khối lượng khơng đổi thu cao tổng acetone [14] 3.5 Tách chiết cao phân đoạn từ cao tổng acetone Cân 3g cao tổng hòa tan 30 mL nước cất Sau đem trộn với 30 mL n-hexane bình chiết lắc sau để yên phân lớp hoàn toàn Thu thập phân lớp n-hexane Quá trình lặp lại ba lần để thu 90 mL dịch chiết hexane, đem cô quay chân không (khoảng 50°C) để thu cao hexane Sau đó, thu thập phân lớp vừa rồi, sử dụng tương tự quy trình để thu 90 mL dịch chiết cao phân đoạn chloroform ethyl acetate [14] 3.6 Khảo sát thành phần hóa học cao acetone tổng Dịch chiết acetone ly trích từ Curcuma xanthella thu sau đem gửi phân tích Trung tâm dịch vụ phân tích thí nghiệm TP HCM (CASE) Máy sắc ký khí TRACETM 1310 (Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA) kết hợp với máy quang phổ khối bốn cực đơn ISQ 7000 sử dụng để xác định thành phần hóa học mẫu nghiên cứu Cột DB-5MS (30 m x 0,25 mm X 0,25 µm) sử dụng làm pha tĩnh Heli tốc độ dòng 1,2 mL/phút sử dụng làm khí mang Mẫu tiêm vào hệ thống GC phương pháp tách mẫu với tỷ lệ phân chia 30:1, thời gian khơng tách dịng phút, 250oC với tốc độ dòng 36 mL/phút Nhiệt độ tiêm cài đặt 250oC nhiệt độ lò lập trình để tiến hành từ 80oC phút, tăng 20oC/phút đạt 280oC, sau lị giữ 280oC 10 phút Sự ion hóa tác động điện tử đặt 70 eV nhiệt độ nguồn dây tóc đặt 250oC Phạm vi khối lượng quét thu MS 29-650 m/z với tần số quét lần quét/giây Thành phần hóa học mẫu nghiên cứu xác định so sánh khối phổ chúng với thư viện NIST 2017 [15] 3.7 Phương pháp xác định hoạt tính kháng khuẩn Phương pháp xác định hoạt tính kháng khuẩn từ cao chiết acetone cao phân đoạn (n-hexan, chloroform, ethyl acetat) thực sau: môi trường Mueller Hinton Agar (MHA) hấp tiệt trùng 121oC 30 phút sau tiến hành đổ đĩa để nhiệt độ phòng ngày Chủng vi khuẩn nuôi cấy môi trường Mueller Hinton Borth (MHB) tăng sinh đạt độ đục 0.5 McFarland Dịch vi khuẩn sử dụng để kiểm tra hoạt tính kháng khuẩn dung dịch nghiên cứu dung môi khác Dùng tăm vô trùng để trải vi khuẩn đĩa petri có chứa mơi trường MHA theo phương pháp trãi đĩa, đặt khoanh giấy vô trùng đường kính mm lên mặt đĩa thạch theo vị trí đánh dấu Cao chiết acetone cao phân đoạn (n-hexan, chloroform, ethyl acetat) pha DMSO 10% nồng độ 100 mg/mL 200 mg/mL Hút 10 µL dung dịch cao pha loãng bơm lên khoanh giấy để yên tủ lạnh oC để dung dịch nghiên cứu thấm vào môi trường thạch, đem ủ nhiệt độ 37oC 18 Đĩa kháng sinh Gentamycin nồng độ 10µg (Nam Khoa, Việt Nam) sử dụng làm đối chứng dương dung mơi hịa tan dịch chiết (DMSO 10%) làm đối chứng âm Hoạt tính kháng khuẩn cao chiết tính đường kính vịng kháng quanh khoanh giấy lọc đĩa Đường kính vùng ức chế (vòng kháng) đo thước đơn vị mm Thí nghiệm tiến hành ba lần kết biểu thị giá trị trung bình ± độ lệch chuẩn [14] 3.8 Phương pháp xác định hoạt tính kháng oxi hóa Hoạt tính kháng oxy hóa cao tổng acetone cao phân đoạn (n-hexan, chloroform, ethyl acetate) xác định thơng qua khả trung hịa gốc 2,2-diphenyl2picryl-hydrazil (DPPH) sử dụng để nghiên cứu hoạt động trung hòa gốc tự DPPH dịch chiết [14] Kết so sánh với vitamin C mẫu đối chứng dương Hoạt động trung hòa gốc tự DPPH (DPPHRSA) dịch chiết tính theo cơng thức sau: %DPPH= Trong đó: Ao độ hấp thụ gốc DPPH metanol A1 độ hấp thụ dung dịch gốc DPPH trộn với dịch chiết mẫu Giá trị IC50 ước tính từ đường cong hoạt tính chống oxy hóa thu dịch chiết có nồng độ khác Quy trình thử nghiệm Các ống nghiệm bọc kín giấy bạc để tránh ánh sáng Mẫu thử 300 µL dung dịch cao chiết dung dịch chất đối chứng pha lỗng phân phối vào ống nghiệm sau thêm 2700 µL DPPH nồng độ 0,1 mM để thu thể tích cuối 3000 µL Vortex hỗn hợp ủ tối nhiệt độ phòng 30 phút, sau hỗn hợp đo mật độ quang 517 nm Mỗi thử nghiệm lặp lại lần Kết hoạt tính kháng oxi hóa loại cao chiết biểu diễn giá trị IC50 [14] 3.9 Phương pháp xử lý số liệu Các thực nghiệm lặp lại lần ngẫu nhiên Để kết luận sai khác trung bình nghiệm thức tiến hành sử dụng phương pháp phân tích phương sai (ANOVA) theo kiểm định LSD Sử dụng phần mềm Excel 2019 để tính tốn giá trị trung bình độ lệch chuẩn từ số liệu thu thập thực nghiệm Tổng kết kết nghiên cứu 4.1 Kết định loại loài Dựa phương pháp hình thái so sánh, chúng tơi xác định mẫu nghiên cứu với số hiệu Van HT 132a Curcuma xanthella với thơng tin cụ thể Curcuma xanthella Škorničk., 2013 Gardens’ Bulletin Singapore 65: 169 Mẫu chuẩn: Lý 348 (SING, VNMN), thu KBTTN Takou, huyện Hàm Thuận Nam, tỉnh Bình Thuận, Việt Nam Mẫu nghiên cứu: Van HT 132a (SGN, PHH), thu ngày 25 tháng năm 2021, thu KBTTN Bình Châu-Phước Bửu, huyện Xuyên Mộc, tỉnh Bà Rịa-Vũng Tàu (Hình 1) Phân bố: Hàm Thuận Nam, Bình Thuận; Bảo Lộc, Lâm Đồng; Xuyên Mộc, Bà RịaVũng Tàu Đặc điểm Sinh thái: Curcuma xanthella thường mọc tán rừng hỗn giao rụng thường xanh Ra hoa: hoa vào khoảng tháng đến tháng Hình Curcuma xanthella A) Dạng cây; B) Phát hoa dạng bao gồm thân củ; C) Cắt ngang thân ngầm; D, E, F) Chi tiết hoa với góc nhìn; G, H) Giải phẫu phận hoa; I) Nhị đực Ảnh: Nguyễn Phi Ngà 4.2 Kết khuếch đại vùng trình tự nghiên cứu Kết PCR vùng trình tự nghiên cứu thể Hình Kết điện di cho thấy, sản phẩm PCR sáng rõ, khơng bị đứt gãy, kích thước vùng trình tự tương ứng với kích thước chuẩn tham chiếu đoạn mồi tương ứng [13] Kích thước sau hiệu chỉnh vùng trình tự ITS, matK trnL-F loài C xanthella tương ứng 571, 648 754 bp Ba vùng gen loài nghiên cứu đăng ký thành công sỡ liệu NCBI Theo đó, mã số NCBI vùng trình tự ITS, matK trnL-F lồi C xanthella tương ứng ON545840, ON600880 ON564475 Hình Kết điện di sản phẩm PCR vùng trình tự nghiên cứu Giếng 2, 3, 5, 7: vùng trình tự ITS cá thể 1, ITS cá thể 2, trnL-F matK loài C xanthella; M) thang chuẩn Ghi chú: Giếng 1, 4, tương ứng vùng trình tự ITS2, trnL-F matK loài Curcuma khác C cotuana thực đồng thời với nghiên cứu 4.3 Kết so sánh vùng trình tự loài nghiên cứu Sản phẩm PCR vùng trình tự nghiên cứu lồi C xanthella giải trình tự thành cơng kỹ thuật Sanger Dựa kết này, tiến hành so sánh chi tiết đặc điểm di truyền của loài nghiên cứu với lồi có đặc điểm hình thái tương tự sở liệu NCBI Kết trình bày Như trình bày phần mở đầu, C xanthella loài đặc hữu Việt Nam Cho đến thời điểm này, có thơng tin đặc điểm di truyền vùng trình tự ITS mẫu chuẩn lồi C xanthella (số hiệu mẫu: Lý 348-mã số NCBI: JQ409875) công bố sở liệu NCBI Tuy nhiên, đoạn gen cơng bố có số nucleotide chưa nhận biết cách rõ ràng ký hiệu ký tự khác với ký tự thường dùng cho purin pyrimidine A, T, G C [16] Chẳng hạn, ký tự R (Adenine Guanine) sử dụng cho vị trí nucleotide thứ 67, 184, 401, 515, 518 545; Y (Thymine Cytosine) vị trí nucleotide thứ 78, 436, 516 562; M (Adenine Cytosine) vị trí 402 558; S (Guanine Cytosine) vị trí 438 442 (Hình 3) Trong nghiên cứu này, vùng trình tự ITS cá thể lồi C xanthella thu KBTTN Bình Châu-Phước Bửu giải trình tự thành cơng Kết so sánh cho thấy, vùng trình tự ITS cá thể có độ tương đồng 100% Quá trình so sánh acetate B cereus 9.3 ± 0.6a - 9.0 ± 1.0a 10.0 ± 1.0a 19.7 ± 0.6b S aureus 9.0 ± 1.7a - 10.7 ± 2.5a 11.0 ± 1.0a 24.0 ± 0.5b E coli 11.3 ± 1.5b - 9.0 ± 1.0a 12.3 ± 1.2b 24.0 ± 0.5c K pneumoniae 9.3 ± 1.5a - 8.3 ± 0.6a 9.0 ± 1.0a 21.7 ± 0.6b S flexneri 10.7 ± 0.6a - 10.0 ± 1.0a 11.0 ± 1.0a 22.0 ± 0.5b S enteritidis 13.0 ± 1.0c - 8.3 ± 0.6a 11.0 ± 1.0b 15.0 ± 0.5d S typhimurium 10.7 ± 1.2a - 10.0 ± 2.6a 9.7 ± 1.5a 21.7 ± 0.6b P aeruginosa 10.0 ± 1.0a - 10.3 ± 1.2ab 12.0 ± 1.0b 21.0 ± 1.0c a,b,c Các chữ viết khác hàng biểu thị khác biệt có ý nghĩa (p