0977 nghiên cứu đặc điểm di truyền và tính kháng thuốc của vibrio cholerae phân lập tại tỉnh trà vinh luận văn tốt nghiệp

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ NGUYỄN THỊ ĐẤU NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM DI TRUYỀN VÀ TÍNH KHÁNG THUỐC CỦA VIBRIO CHOLERAE PHÂN LẬP TẠI TỈNH TRÀ VINH LUẬN ÁN TIẾN SĨ Chuyên ngành: VI SINH VẬT HỌC 2015 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ NGUYỄN THỊ ĐẤU NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM DI TRUYỀN VÀ TÍNH KHÁNG THUỐC CỦA VIBRIO CHOLERAE PHÂN LẬP TẠI TỈNH TRÀ VINH LUẬN ÁN TIẾN SĨ Chuyên ngành: VI SINH VẬT HỌC Mã ngành: 6242 0107 Hướng dẫn khoa học PGS.TS HỒ THỊ VIỆT THU 20 LỜI CẢM ƠN Xin chân thành cảm ơn Ban Giám hiệu Trường Đại học Cần Thơ, Ban Giám hiệu Trường Đại học Trà Vinh, Ban Lãnh đạo Viện Nghiên cứu Phát triển Cơng nghệ Sinh học, Phịng Đào tạo, Phòng Quản lý Khoa học, Phòng Quản lý Sau Đại học thuộc Trường Viện tạo điều kiện tốt thực nghiên cứu khoa học học phần nghiên cứu sinh Xin chân thành cảm ơn PGS.TS Hồ Thị Việt Thu, PGS.TS Trần Nhân Dũng tạo điều kiện, giúp đỡ tơi hồn thành luận án Do nhận hướng dẫn thời gian năm sau luận án nên PGS.TS Hồ Thị Việt Thu gặp nhiều khó khăn, thời gian chưa định hướng đắn cho nghiên cứu, PGS.TS Hồ Thị Việt Thu tận tình giúp đỡ, tìm hướng cho phù hợp với nghiên cứu thực tế để tơi hoàn thành luận án Chân thành cảm ơn Ban lãnh đạo Chi cục Thú y tỉnh Trà Vinh tạo điều kiện cho tham gia lấy mẫu sở giết mổ địa bàn Tỉnh Chân thành cảm ơn anh chị em Bộ môn Vi sinh Khoa Nông nghiệp & Sinh học Ứng dụng, Trường Đại học Cần Thơ; Trường Đại học Y Dược Cần Thơ; Khoa xét nghiệm bệnh viện Đa khoa Trung ương Cần Thơ; Khoa Nông nghiệp Thuỷ sản Trường Đại học Trà Vinh tạo điều kiện, giúp đỡ tơi hồn thành nghiên cứu đề tài Chân thành cảm ơn gia đình đồng nghiệp tạo điều kiện động viên tơi hồn thành nghiên cứu Xin chân thành cảm ơn! NGUYỄN THỊ ĐẤU i TÓM TẮT Vibrio cholerae loại vi khuẩn Gram âm có hình dấu phẩy với chủng khơng gây bệnh gây bệnh Chủng gây bệnh lây lan mạnh từ năm 1816 đến năm 1923 thuộc V cholerae O1 type sinh học cổ điển Những năm sau đó, chủng vi khuẩn khác thuộc type sinh học El Tor gây trận đại dịch kéo dài thập niên 1970s, chủng gây bệnh xác định vào năm 1992 thuộc type sinh học O139, chủng với chủng thuộc type sinh học O1 xem nguyên nhân vụ dịch xảy gần Hiện nay, có nhiều kháng sinh điều trị bệnh, hiệu kháng sinh có phần hạn chế tình hình đa kháng thuốc gia tăng quần thể vi khuẩn (CDC, 2005) Xuất phát từ vấn đề trên, đề tài: “Nghiên cứu đặc điểm di truyền tính kháng thuốc V cholerae phân lập tỉnh Trà Vinh” thực với mục đích cung cấp thơng tin cần thiết chiến lược sử dụng kháng sinh phù hợp nhằm làm giảm tỉ lệ tử vong, giảm tượng kháng thuốc giảm chi phí điều trị bệnh Nghiên cứu thực qua việc phân lập vi khuẩn Vibrio spp từ 160 mẫu nghêu, 150 mẫu nước (50 mẫu nước biển, 50 mẫu nước sông, 50 mẫu nước ao nuôi tôm), 100 mẫu huyết heo 40 mẫu phân bệnh nhân tiêu chảy thu thập bệnh viện đa khoa tỉnh Trà Vinh từ tháng năm 2012 đến tháng năm 2014 Kỹ thuật PCR test sinh hoá (theo tiêu chuẩn ISO/TS 21872-1:2007) sử dụng để định danh mức loài vi khuẩn Vibrio, phản ứng ngưng kết sử dụng để định type huyết V cholerae Kết nghiên cứu phân lập 25 chủng vi khuẩn thuộc Vibrio spp bao gồm chủng V cholerae (24%) (3 chủng từ nghêu, chủng từ mẫu huyết heo chủng từ mẫu nước sơng), chủng thuộc lồi V paraheamolyticus (32%), chủng thuộc loài V vulnificus (16%), chủng thuộc loài V fluvialis (20%) chủng thuộc loài V alginolyticus (8%) Kết định type huyết học chủng V cholerae thuộc type O1, với 50% (3/6) dương tính với Inaba, 50% (3/6) dương tính Ogawa Khơng có chủng thuộc type O139 Kết so sánh tỉ lệ tương đồng trình tự nucleotide gene 16S rRNA chủng V cholerae phân lập với chủng MS6 (Thái Lan), O395 (Ấn Độ), M66-62 (Indonesia), LMA 3894-4 (Brazil) N16961 (Ấn Độ) Kết cho thấy chủng chủng 100% tương đồng với 56 chủng; 99% tương đồng với 32 chủng 99% tương đồng với 12 chủng gần Riêng chủng mang gene kháng kháng sinh nghiên cứu có trình tự nucleotide tương đồng 97% với 10 chủng; 96% với 01 chủng 94% ii với 02 chủng ii Tính kháng kháng sinh loại (streptomycin, norfloxacine, ampicillin, tetracycline, azithromycin, amoxillin/clavulanic acid, trimethotrime/sulfamethazol vancomycin) chủng Vibrio cholerae xác định phương pháp Kirby-Bauer (CLSI, 2010), kết cho thấy có 50% (3/6) chủng kháng streptomycin, 33% (2/6) chủng kháng tetracycline trimethoprim-sulfamethoxazole Với kỹ thuật PCR cho thấy có chủng tổng số chủng kiểm tra chứa gene kháng kháng sinh tetA (gene mã hóa cho yếu tố kháng tetracycline), chưa phát gene kháng kháng sinh blaSHV, aac(3)-IV dhfrI mã hố yếu tố cho nhóm kháng sinh β-lactam, aminoglycosid, trimethoprim tương ứng So sánh trình tự nucleotide gene tetA chủng T1 T3 so với chủng hoang dại (N16961) cho thấy có tượng thêm từ 1- nucleotide 10 vị trí codon gene tetA chủng T1 vị trí codon chủng T3 Kết thử nghiệm thỏ chứng minh số bám dính vi khuẩn V cholerae T1 T3 vào niêm mạc ruột thỏ không uống vaccine phòng bệnh tả thời điểm sau cho uống vi khuẩn 55,7±13,9 59,3±4,2 cao thỏ có uống vaccine phịng bệnh tả (12,4±0,6 7,41±1,9) Tại thời điểm 16 sau cho uống vi khuẩn, khơng có tượng vi khuẩn bám dính vào niêm mạc ruột tất thỏ thí nghiệm Thí nghiệm cho thấy chủng phân lập có tính kháng ngun giống với kháng ngun vi khuẩn sử dụng làm vaccine phòng bệnh tả (moORCVAX) sử dụng nước Từ khoá: Vibrio, V cholerae, đề kháng kháng sinh i STUDY ON GENETIC CHARACTERISTICS AND ANTIBIOTICS RESISTANCE OF VIBRIO CHOLERAE ISOLATES IN TRA VINH ABSTRACT Vibrio cholerae is a "comma" shaped Gram-negative bacteria, some of which are pathogenic and some of which are not The pathogenic strains which caused the most pandemic cholera from 1816 to 1293 are the Vibrio choleraes classical biotype O1 Later, other strains belong to biotype El Tor which was active in the seventh of 20 th century The latest pathogenic biotype O139 was discovered in 1992, this strain and strain O1 have been considered to be the pathogenic agents of recent cholera outbreaks Although, there are antibiotics which can cure the disease now, but it is limited in therapy because of V choleraes are resistant to multiple drugs (Ingole et al., 1994) Hence, we carried out “the study on genitical characteristic and antibiotic resistance of Vibrio cholerae isolated in Tra Vinh province” with purpose of providing essential information for appropriate antibotic using in order to reduce mortality, decrease antibiotic resistance and cost of treatment The study was conducted by isolation of Vibrio spp from 160 clams, 150 water samples (50 samples of sea water, 50 samples of estuarine water, and 50 samples of shrimp pond water), 100 samples of pig blood and 40 diarrheic stool samples collected from general hospital of Tra Vinh province during April 2012 to April 2014 Polymerase chain reaction and biochemical tests (standard ISO/TS 21872-1:2007) were used to indentificate Vibrio into species, and agglutination test was used for characterization of Vibrio cholerae serotype The results showed that there were 25 Vibrio spp isolates including strains of Vibrio cholerae (24%) (3 isolates were from clams, isolates from pig blood samples and from estuary water), strains of Vibrio paraheamolyticus (32%), strains of Vibrio vulnificus (16%), strains of Vibrio fluvialis (20%) and strains of Vibrio alginolyticus (8%) The serotyping results showed that all of Vibrio cholerae belong to biotype O1, with 50% (3/6) positive to Inaba, and 50% (3/6) positive to Ogawa No strain belongs to biotype O139 Nucleotide sequence comparison of gene16S rRNA of Vibrio cholerae strains with that of MS6 strain (Thailand), O395 strain (India), M6662 strain (Indonesia), LMA 3894-4 strain (Brazil) and N16961 strain (India) The results showed that one out of strains were 100% homogeneous with 56 strains, 99% homogeneous with 32 strains and 99% homogeneous with 12 close strains Separately, strains (T1 and T3) containing antibiotic v resistance gene were 97% homogeneous with 10 strains, 96% homogeneous with 01 strain and 94% homogeneous with 02 strains Antibiotic resistance to antibiotics (streptomycin, norfloxacine, ampicillin, tetracycline, azithromycin, amoxillin/clavulanic acid, trimethotrime/sulfamethazol and vancomycin) of Vibrio cholerae strains was tested by Kirby-Bauer method (CLSI, 2010) The results showed that there 50% (3/6) of isolates which was resistant to streptomycin, 33% (2/6) was resistant to tetracycline and trimethoprim-sulfamethoxazole Two out of strains had antibitotic resistance gene (gene tetA) encoding for tetracycline resistant factor Gene blaSHV, gene aac(3)-IV and gene dhfrI which encode for β-lactam, aminoglycosid, trimethoprim resistant factors were not detected Nucleotide sequence comparison of gene tetA of T1 T3 with that of wild strain (N16961) showed that there were 1- nucleotide more or less in 10 codon positions of gene tetA in T1 strain and codon positions in T3 strain Results of experiments on rabbits demonstrated that adhesion indexes of V cholerae T1 and T3 strains in the intestinal mucosa of rabbits which were not orally used cholera vaccine after hours of oral administration of these bacteria were 55,7±13,9 and 59,3±4,2, respectively These indexes were higher than those of rabbits with cholera vaccination were 12,4±0,6 and 1,9±7,41, respectively After 16 hours of bacteria administration, there was no bacterial adhesion in the intestinal mucosa of all the rabbits It showed that T1 and T3 strains shared the same antigens with bacteria used to produce cholera vaccine (MicroVAX) which is available in Vietnam Keyword: Vibrio, V cholerae , antibiotic resistance v CỘNG HOÀ XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM Độc lập – Tự – Hạnh phúc CAM KẾT KẾT QUẢ Tôi xin cam kết luận án: “Nghiên cứu đặc điểm di truyền tính kháng thuốc Vibrio cholerae phân lập tỉnh Trà Vinh” hoàn thành dựa kết nghiên cứu kết nghiên cứu chưa sử dụng công bố cho luận án khác Tác giả luận án Nguyễn Thị Đấu v MỤC LỤC TT 1.1 1.2 1.2.1 1.2.2 1.3 1.4 1.5 1.6 2.1 2.2 2.2.1 2.2.2 2.2.3 2.2.4 2.2.5 2.3 2.3.1 2.3.2 2.3.3 2.4 2.4.1 2.4.2 2.4.3 2.5 2.6 2.6.1 2.6.2 2.6.3 2.6.4 2.6.5 2.6.6 2.7 TÓM TẮT …………………………………………………… ABSTRACT ………………………………………………… CHƯƠNG I: GIỚI THIỆU ………………………………… Tính cấp thiết đề tài ……………………………………… Mục tiêu nhiệm vụ nghiên cứu …………………………… Mục tiêu nghiên cứu ………………………………………… Nhiệm vụ nghiên cứu ……………………………………… Đối tượng phạm vi nghiên cứu ………………………… Thời gian địa điểm nghiên cứu ………………………… Những đóng góp luận án ………………………………… Ý nghĩa khoa học ý nghĩa thực tiễn luận án ………… CHƯƠNG II: TỔNG QUAN TÀI LIỆU ………………… Lịch sử bệnh vi khuẩn tả ………………………………… Tổng quan Vibrio ………………………………………… Đặc điểm loài thuộc giống Vibrio Phân loại vi khuẩn V cholerae ………………………… Đặc điểm hình dạng V cholerae ………………………… Đặc điểm sinh thái V cholerae ……………………………… Sức đề kháng V cholerae …………………………………… Tình hình dịch tễ học bệnh tả V cholerae …………… Tình hình dịch tễ V cholerae nước giới … Tình hình dịch tễ V cholerae Việt Nam ……………… Nguồn truyền nhiễm phương thức truyền lây V cholerae……………………………………………………… Đặc điểm di truyền V cholerae ………………………… Độc lực V cholerae Đặc tính di truyền độc lực V cholerae ……………… Các yếu tố độc lực ………………………………………… Cơ chế gây bệnh V cholerae …………………………… Tình hình kháng kháng sinh vi khuẩn …………………… Khái niệm …………………………………………………… Cơ chế kháng kháng sinh …………………………………… Sự kháng kháng sinh V cholerae nước giới Sự kháng kháng sinh V cholerae Việt Nam Cơ chế kháng kháng sinh V cholerae …………………… Sự kháng kháng sinh vi khuẩn tetracycline ……… Tính miễn dịch vaccine phịng bệnh tả người…… vii Trang ii vi 1 3 3 4 5 11 11 15 15 15 20 22 25 26 27 29 31 33 33 33 35 37 39 41 45