nghiên cứu đánh giá sinh khả dụng và tương đương sinh học trên chế phẩm sản xuất trong nước, góp phần hoàn thiện hướng dẫn thử babe

BỘ Y TẾ =====O===== BÁO CÁO KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ĐỀ TÀI CẤP BỘ Tên đề tài: NGHIÊN CỨU ĐÁNH GIÁ SINH KHẢ DỤNG VÀ TƯƠNG ĐƯƠNG SINH HỌC TRÊN CHẾ PHẨM SẢN XUẤT TRONG NƯỚC, GĨP PHẦN HỒN THIỆN HƯỚNG DẪN THỬ BA/BE Chủ nhiệm đề tài: PGS.TS Trịnh Văn Lẩu Đồng chủ nhiệm: TS Phùng Thị Vinh Cơ quan chủ trì: Viện Kiểm nghiệm thuốc TW, Bộ Y tế 7096 16/02/2009 HÀ NỘI - 2008 BỘ Y TẾ BÁO CÁO KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ĐỀ TÀI CẤP BỘ Tên đề tài: NGHIÊN CỨU ĐÁNH GIÁ SINH KHẢ DỤNG VÀ TƯƠNG ĐƯƠNG SINH HỌC TRÊN CHẾ PHẨM SẢN XUẤT TRONG NƯỚC, GĨP PHẦN HỒN THIỆN HƯỚNG DẪN THỬ BA/BE Chủ nhiệm đề tài: PGS.TS Trịnh Văn Lẩu Đồng chủ nhiệm: TS Phùng Thị Vinh Cơ quan chủ trì: Viện Kiểm nghiệm thuốc TW, Bộ Y tế Cấp quản lý: Bộ Y tế Thời gian thực hiện: Từ tháng 01/ 2006 đến tháng 12/ 2008 Tổng kinh phí thực đề tài: 670 triệu đồng Trong đó: Kinh phí nghiệp: 670 triệu đồng HÀ NỘI - 2008 BÁO CÁO KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ĐỀ TÀI CẤP BỘ Tên đề tài: Nghiên cứu đánh giá sinh khả dụng tương đương sinh học chế phẩm sản xuất nước, góp phần hồn thiện hướng dẫn thử BA/BE Chủ nhiệm đề tài: PGS.TS Trịnh Văn Lẩu; TS Phùng Thị Vinh Cơ quan chủ trì đề tài: Viện Kiểm nghiệm thuốc TW, Bộ Y tế Địa chỉ: 48 - Hai Bà Trưng, Hà Nội Điện thoại: (84 – 4) 363 114 Fax: (84 – 4) 356 911 Cơ quan quản lý: Bộ Y tế Thư ký đề tài: Ths Tạ Mạnh Hùng Danh sách người thực Ths Tạ Mạnh Hùng DS Lê Thị Thu Huyền DS Trần Hoàng DS Ths Nguyễn Thị Thanh Thảo DS Hà Minh Hiền DS Phan Thị Nghĩa DSTH Trần Thị Nga TS BS Phạm Duệ Thời gian thực hiện: Từ tháng 01/ 2006 đến tháng 12/ 2008 MỤC LỤC STT Nội dung PHẦN A: TÓM TẮT CÁC KẾT QUẢ TÓM TẮT CỦA ĐỀ TÀI Số trang Kết bật đề tài a Đóng góp đề tài b, Kết cụ thể c, Hiệu đào tạo d, Hiệu kinh tế e, Hiệu xã hội f, Các hiệu khác Áp dụng vào thực tiễn sản xuất đời sống xã hội Đánh giá thực đề tài đối chiếu với đề cương nghiên cứu phê duyệt a, Tiến độ b, Thực mục tiêu nghiên cứu c, Các sản phẩm tạo so với dự kiến đề cương d, Đánh giá việc sử dụng kinh phí Các ý kiến đề xuất 4 PHẦN B: NỘI DUNG BÁO CÁO CHI TIẾT KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ĐỀ TÀI CẤP BỘ ĐẶT VẤN ĐỀ 1.1 Tính cấp thiết đề tài 1.2 Giả thiết nghiên cứu đề tài 1.3 Mục tiêu nghiên cứu TỔNG QUAN ĐỀ TÀI 2.1 Tình hình nghiên cứu ban hành hướng dẫn sinh khả dụng tương đương sinh học 2.1.1 Ngoài nước 2.1.2 Trong nước 2.2 Tổng quan số chế phẩm dùng nghiên cứu thực 10 2.2.1 nghiệm Chế phẩm phóng thích (thuốc qui ước) 10 2.2.2 Chế phẩm phóng thích chậm 12 2.3 Phương pháp đánh giá tương đương sinh học 14 2.4 Điều kiện hoạt động sở vật chất 17 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 18 3.1 Nghiên cứu thực nghiệm 18 3.1.1 Hóa chất, thiết bị 18 3.1.2 Thuốc nghiên cứu 18 3.1.3 Thiết kế nghiên cứu 20 3.1.4 Đảm bảo nguyên tắc đạo đức nghiên cứu 20 3.1.5 Người tình nguyện 20 3.1.6 Phương pháp cho uống thuốc lấy mẫu 21 3.1.7 Phương pháp phân tích 22 3.1.8 Phân tích mẫu huyết tương NTN sau uống thuốc 23 3.1.9 Xác định thông số dược động học đánh giá tương đương 23 sinh học 3.2 Nghiên cứu xây dựng Hướng dẫn 24 3.2.1 Phân tích tài liệu tham khảo 24 3.2.2 Dự thảo hướng dẫn 24 3.2.3 Lấy ý kiến chuyên gia 25 3.2.4 Hoàn thiện thảo 25 3.2.5 Xây dựng quy trình đánh giá tương đương sinh học cho chế 25 phẩm KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 26 4.1 Kết nghiên cứu thực nghiệm 26 4.1.1 Đánh giá tương đương sinh học chế phẩm phóng thích chậm 26 4.1.1.1 Phương pháp phân tích 26 4.1.1.2 Kết giai đoạn lâm sàng 27 4.1.1.3 Kết phân tích, thống kê, đánh giá tương đương sinh học 27 4.1.2 Đánh giá tương đương sinh học chế phẩm phóng thích 28 4.1.2.1 Phương pháp phân tích 28 4.1.2.2 Kết giai đoạn lâm sàng 30 4.1.2.3 Kết phân tích, thống kê, đánh giá tương đương sinh học 30 4.2 Phân tích tài liệu tham khảo 32 4.2.1 Hướng dẫn ASEAN 32 4.2.2 Hướng dẫn Tổ chức Y tế giới 33 4.2.3 Hướng dẫn Mỹ 35 4.2.4 Hướng dẫn Châu Âu 36 4.2.5 Hướng dẫn Trung Quốc 36 4.3 Xây dựng hướng dẫn 41 4.3.1 Xây dựng thảo lần 41 4.3.2 Lấy ý kiến đóng góp 41 4.3.3 Xây dựng thảo lần 43 4.3.4 Hội thảo 43 4.3.5 Hoàn thiện thảo 43 4.4 Xây dựng qui trình thử 44 BÀN LUẬN 45 5.1 Nghiên cứu thực nghiệm 45 5.1.1 Điều kiện nghiên cứu chung 45 5.1.2 Nghiên cứu thuốc phóng thích chậm 46 5.1.3 Nghiên cứu thuốc phóng thích (thuốc qui ước) 47 5.2 Nghiên cứu xây dựng hướng dẫn 47 KẾT LUẬN 49 6.1 Nghiên cứu thực nghiệm 49 6.2 Nghiên cứu xây dựng dự thảo Hướng dẫn 49 6.3 Xây dựng quy trình 49 TÀI LIỆU THAM KHẢO 50 PHỤ LỤC DANH MỤC CÁC BẢNG KẾT QUẢ Bảng 1.1 Tóm tắt nghiên cứu thự nghiệm đánh giá TĐSH Bảng 4.1 Tóm tắt kết thẩm định phương pháp xác định Nifedipin huyết tương Bảng 4.2 Thời gian bố trí cho NTN uống thuốc Nifedipin Bảng 4.3 Nồng độ thuốc nghiên cứu trung bình –thời gian sau uống Nifedipin Bảng 4.4 Thông số dược động học trung bình sau uống Nifedipin Bảng 4.5 Tóm tắt kết thẩm định phương pháp xác định Rosiglitazon huyết tương Bảng 4.6 Thời gian bố trí cho NTN uống thuốc Rosiglitazon Bảng 4.7 Nồng độ thuốc nghiên cứu trung bình –thời gian sau uống Rosiglitazon Bảng 4.8 Thơng số dược động học trung bình sau uống Rosiglitazon Bảng 4.9 Phân tích số hướng dẫn tham khảo DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ Hình 4.1: Đường cong nồng độ thuốc trung bình – thời gian 12 NTN sau uống viên nén Nifedipin 20mg Hình 4.2 : Đường cong nồng độ thuốc trung bình – thời gian 24 NTN sau uống viên nén Rosiglitazon 4mg DANH MỤC CÁC PHỤ LỤC: - Phụ lục I: Bản thảo Hướng dẫn - Phụ lục II: Báo cáo kết thực nghiệm - Phụ lục III: Qui trình đánh giá TĐSH chế phẩm CÁC CHỮ VIẾT TẮT Chữ viết tắt Nội dung AUC Diện tích đường cong AUC0-t Diện tích đường cong từ thời điểm đến t AUC0-∞ Diện tích đường cong từ thời điểm đến vô BCS Hệ thống phân loại sinh dược Cmax Nồng độ thuốc tối đa CV Hệ số biến thiên ĐHT Độ hoà tan GCP Thực hành lâm sàng tốt GLP Thực hành phịng thí nghiệm tốt MeCN Acetonitril MeOH Methanol NTN Người tình nguyện SD Độ lệch chuẩn SKD Sinh khả dụng T1/2 Thời gian bán thải TB Trung bình TĐSH Tương đương sinh học Tmax Thời gian đạt nồng độ thuốc tối đa TW Trung ương US - FDA Cơ quan Quản lý thuốc - thực phẩm Mỹ USP Dược điển Mỹ VKNTTW Viện Kiểm nghiệm thuốc trung ương WHO Tổ chức y tế giới PHẦN A: TÓM TẮT CÁC KẾT QUẢ NỔI BẬT CỦA ĐỀ TÀI 1.Kết bật đề tài a Đóng góp đề tài - Lần triển khai thực nghiệm đánh giá tương đương sinh học cách hệ thống, tuân thủ yêu cầu thực hành tốt thử nghiệm lâm sàng (GCP) thực hành tốt phịng thí nghiệm (GLP) Việt Nam - Xây dựng hoàn thiện Hướng dẫn nghiên cứu sinh khả dụng tương đương sinh học Việt Nam - Đề xuất tiêu chí đánh giá cho sở nghiên cứu sinh khả dụng (SKD) tương đương sinh học (TĐSH) giúp cho quan quản lý xem xét thẩm định đơn vị muốn xây dựng để thực nghiên cứu lĩnh vực - Đào tạo đội ngũ cán chuyên môn kỹ thuật làm công tác nghiên cứu sinh khả dụng tương đương sinh học Đề xuất ý kiến tham luận cho quan quản lý hội thảo nước, quốc tế khu vực b, Kết cụ thể - Kết nghiên cứu thực nghiệm: + Đã đánh giá tương đương sinh học 01 chế phẩm phóng thích kéo dài (giải phóng chậm): viên nén Nifedipin Hasan 20mg so với Nefehexal 20mg Kết nghiên cứu cho thấy hai chế phẩm tương đương sinh học in vivo (xem bảng 1) Mặc dù hạn chế mặt phương pháp, kết đánh giá chấp nhận cho phép chế phẩm lưu hành nước + Đã đánh giá tương đương sinh học 01 chế phẩm qui ước (giải phóng ngay): viên nén Rosiglitazon 4mg so với Avandia 4mg Kết nghiên cứu cho thấy hai chế phẩm tương đương sinh học in vivo Nghiên cứu thực vào cuối năm 2007, sở nghiên cứu trang bị thiết bị phân tích máy sắc ký lỏng hiệu cao với detector huỳnh quang Do vậy, mẫu nghiên cứu có hàm lượng thấp (4mg), nhờ có thiết bị phân tích với detector huỳnh quang, phương pháp xây dựng đáp ứng yêu cầu phân tích mẫu thử - Xây dựng hồn thiện Hướng dẫn Việt Nam: + Nghiên cứu, phân tích hướng dẫn nước tổ chức giới + Dự thảo Hướng dẫn nghiên cứu sinh khả dụng tương đương sinh học: Đã dự thảo Bản Hướng dẫn phụ lục kèm theo, lấy ý kiến đóng góp chuyên gia tổ chức hội thảo để thảo luận nội dung Hướng dẫn nói riêng vấn đề nghiên cứu lĩnh vực nói chung Kết thực nghiệm tóm tắt bảng 1.1 Bảng 1.1 Tóm tắt nghiên cứu thực nghiệm đánh giá TĐSH Nội dung Nifedipin Hasan so với Nifehexal 20mg (n = 14) Thử Chứng Dorosi so với Avandia (n= 24) Thử Chứng Cmax (ng/ml) 65 ± 17 65 ± 399 ± 18 403 ± 17 AUC0-∞ 363 ± 127 342 ± 91 1772 ± 17 1796 ± 19 2,3 ± 0,7 2,5 ± 0,5 0,62 ± 0,25 0,67 ± 0,28 (ng.giờ/ml) Tmax (giờ) Cmax: 86,8 % - 112,1% Cmax: 92,4% - 105,6% AUC0-∞: 88,3% - 121,9% AUC0-∞: 93,6% - 105,0% So sánh Tmax Khác khơng có ý nghĩa Khác khơng có ý nghĩa Đánh giá tương đương Hai chế phẩm tương đương sinh học Hai chế phẩm tương đương sinh học Khoảng tin cậy 90% - Xây dựng qui trình phân tích Nifedipin Rosiglitazon huyết tương qui trình chung cho đánh giá TĐSH chế phẩm viên nén có chứa dược chất Qui trình đơn giản khả thi với điều kiện trang thiết bị có số trung tâm đánh giá TĐSH nước c, Hiệu đào tạo - Đánh giá tương đương sinh học thuốc nội dung hoạt động chuyên môn Viện Kiểm nghiệm Hầu hết cán chưa đào tạo chưa có kinh nghiệm lĩnh vực Do vậy, đề tài nghiên cứu tạo hội cho số cán Viện tiếp cận thực nghiên cứu đánh giá tương đương sinh học tương đối hồn chỉnh Nhờ đó, tạo nguồn nhân lực cho việc thành lập Trung tâm đánh giá tương đương sinh học Viện (3/2007) - Thực chương trình hợp tác với Tổ chức Y tế Thế giới, hai cán tham gia đào tạo nước (Malaysia), với hỗ trợ kinh phí WHO Ngồi ra, Viện tổ chức tham gia 03 lớp tập huấn kỹ thuật TĐSH cho cán thuộc hệ thống Kiểm nghiệm số doanh nghiệp + Một lớp chuyên gia WHO hướng dẫn với cán Viện Kiểm nghiệm thuốc TW đại diện Viện Kiểm nghiệm thuốc Thành phố Hồ Chí Minh: tháng 12/ 2006 Thời gian đạt nồng độ thuốc tối đa (Tmax) Bảng 9: So sánh giá trị Tmax theo phương pháp thống kê không tham số Tmax (giờ) Chênh lệch Thứ tự Mã số Thuốc NTN Thuốc thử (+) (-) (+) chứng 01 0,50 0,75 -0,25 02 0,50 0,50 - (-) -4 03 0,50 0,75 -0,25 -4 04 0,75 1,50 -0,75 -9,5 05 0,75 0,50 0,25 06 0,50 0,50 - - 07 0,50 0,50 - - 08 0,33 0,33 - - 09 0,50 0,50 - - 10 1,00 0,75 0,25 11 0,50 0,50 - - 12 0,50 0,50 - - 13 0,50 0,75 14 0,50 0,50 - 15 1,25 0,75 0,5 16 1,25 1,00 0,25 17 0,50 0,50 - - 18 0,50 0,50 - - 19 0,50 0,75 20 0,50 0,50 - - 21 1,00 1,00 - - 22 0,50 0,50 - - 23 0,50 1,25 24 TB 0,50 0,62 0,50 0,67 SD 0,25 0,28 4 -0,25 -4 - -0,25 -4 -0,75 - Tổng -9,5 - 20 35 Giá trị tổng thứ tự xếp hạng dương/ âm lớn – giá trị biểu thị cho mức độ sai khác phương pháp với số cặp sai khác n =10; P>0,05 cho thấy giá trị Tmax thuốc thử thuốc chứng khác khơng có ý nghĩa thống kê với độ tin cậy > 95%, 12 6, KẾT LUẬN Thử nghiệm đánh giá tương đương sinh học in vivo chế phẩm Dorosi (Viên nén bao phim Rosiglitazon maleat, tương ứng Rosiglitazon mg), lô số 010206, hạn dùng 02/2008 so với Avandia (Viên nén bao phim Rosiglitazon maleat, tương ứng Rosiglitazon mg), lô số 12656A59, sản xuất 05/2006, hạn dùng 05/2008 24 người Việt Nam tình nguyện khoẻ mạnh có kết sau: Các thơng số dược động học trung bình: Chế phẩm Cmax ± SD (ng/mL) n = 24 AUC0 - ∞ ± SD (ng.giờ/mL) n = 24 Tmax ± SD (giờ) n = 24 Thuốc thử (Dorosi) 399,1 ± 18,1 1771,9 ± 17,3 0,62 ± 0,25 Thuốc đối chứng (Avandia) 402,9 ± 17,1 1795,9 ± 18,7 0,67 ± 0,28 Đánh giá tương đương sinh học: - Khoảng tin cậy 90% tỷ số giá trị trung bình thuốc thử so với thuốc chứng, tính số liệu chuyển logarit: Cmax: 92,4% - 105,6% AUC0-∞: 93,6% - 105,0% - Giá trị Tmax thuốc khác khơng có ý nghĩa thống kê với độ tin cậy lớn 95% (phương pháp thống kê không tham số) Hai chế phẩm Dorosi Avandia tương đương sinh học in vivo theo qui định US–FDA, 7, TÀI LIỆU THAM KHẢO 1, ASEAN guidelines for the conduct of bioavailability and bioequivalence studies, final draft, 2004, 2, Peter G, Welling, Pharmaceutical Bioequivalence, Marcel Dekker INC, 1991, 3, Sanford Bolton, Pharmaceutical Statistics, Third edition, Marcel Dekker INC, 1997, 4, The United States of Pharmacopeia XXX: In vitro and in vivo evaluation of dosage forms; In vivo bioequivalence guidelines 5, World Health Organization, WHO guidelines for good clinical practice (GCP) for trials on pharmaceutical products, Division of drug management & policies, 6, US Food and Drug Administration, Bioanalytical method validation, Guidance for industry, May 2001, 7, US Food and Drug administration, Bioavailability and Bioequivalence studies for oral administered drug products – General considerations, Guidance for industry, May 2003, 8, PHỤ LỤC (bản kèm theo) 13 PHỤ LỤC III QUI TRÌNH ĐÁNH GIÁ TƯƠNG ĐƯƠNG SINH HỌC CHẾ PHẨM PHỤ LỤC III QUY TRÌNH ĐÁNH GIÁ TƯƠNG ĐƯƠNG SINH HỌC CỦA HAI CHẾ PHẨM Phụ lục IIIa - Qui trình đánh giá TĐSH chế phẩm Nifedipin QUI TRÌNH ĐÁNH GIÁ TƯƠNG ĐƯƠNG SINH HỌC VIÊN NÉN NIFEDIPIN PHẠM VI ÁP DỤNG - Qui trình áp dụng cần thực nghiên cứu dược động học, sinh khả dụng, tương đương sinh học, theo dõi điều trị, nghiên cứu lâm sàng chế phẩm có chứa Nifedipin dạng viên nén giải phóng chậm dùng đường uống - Thực kỹ thuật viên, nghiên cứu viên đào tạo GCP phân tích mẫu dịch sinh học - Thực đơn vị có đủ sở lâm sàng đáp ứng yêu cầu GCP sở phân tích trang bị đủ thiết bị xử lý phân tích mẫu, hoạt động tuân thủ theo GLP NỘI DUNG 2.1 Thông tin thuốc nghiên cứu Nifedipin thuốc chẹn kênh calci thuộc nhóm dihydropyridin, dùng phổ biến giới Việt Nam nhiều năm qua dự phòng đau thắt ngực, chống tăng huyết áp điều trị bệnh Raynaud Theo tài liệu, thuốc hấp thu nhanh gần hồn tồn qua đường tiêu hố, chuyển hoá lần đầu qua gan mạnh nên sinh khả dụng sau uống đạt 45 – 75% Với dạng viên nén, thuốc đạt nồng độ tối đa máu sau – giờ; Thời gian bán thải huyết tương khoảng – 11 Thức ăn làm chậm không giảm mức độ hấp thu Một số tác dụng phụ xảy giai đoạn đầu dùng thuốc Nếu thuốc hấp thu nhanh, mạnh gây hạ huyết áp mức, gây tim đập nhanh nên gây thiếu máu cục tim não Các phản ứng phụ thấy dùng thuốc như: đánh trống ngực, tim đập nhanh, buồn nơn, ỉa chảy táo bón; đau đầu, mệt mỏi, chóng mặt, nóng đỏ bừng mặt; gặp hạ huyết áp, ban, mày đay Tuy nhiên sử dụng dạng viên giải phóng chậm hạn chế phản ứng bất lợi xảy hoạt chất giải phóng hấp thu từ từ Liều thường dùng cho người lớn, dạng thuốc giải phóng chậm viên 20mg/ lần x lần/ ngày Có thể dùng liều cao viên 20mg/ lần x lần/ ngày Liều lần tối đa không nên vượt 30mg/ lần Theo kết nghiên cứu thực 12 người tình nguyện Việt Nam khoẻ mạnh, uống liều đơn viên Nifedipin 20mg giải phóng chậm, nồng độ đỉnh huyết tương khoảng 65ng/ml, đạt sau - 2,5 Thời gian bán thải huyết tương trung bình khoảng 3,4 Khơng có trường hợp xảy phản ứng bất lợi 2.2.Yêu cầu sở nghiên cứu 2.2.1 Cơ sở lấy mẫu: Cơ sở lấy mẫu phải có đủ diện tích, phân chia thành khu vực riêng để thực việc cho uống thuốc lấy mẫu thích hợp đáp ứng yêu cầu Phải có khu vực cho người tình nguyện nghỉ ngơi qua đêm ngày lấy mẫu, khu vực để sinh hoạt, giải trí cần, khu ăn uống vệ sinh - Khu vực lấy mẫu: đủ diện tích để tập kết dụng cụ lấy mẫu, nghiên cứu viên người tình nguyện tập trung lấy mẫu 1- PL3a Phụ lục IIIa - Qui trình đánh giá TĐSH chế phẩm Nifedipin - Phải có trang bị tủ thuốc dụng cụ cấp cứu kịp thời trường hợp xảy cố thuốc phản ứng khác nguy hại cho NTN Đồng thời có giường bác sĩ xử trí cấp cứu cần thiết 2.2.2 Cơ sở phân tích: - Trang bị đủ thiết bị, hố chất dụng cụ cho phân tích Hố chất thiết bị Chất chuẩn: - Nifedipin chất đối chiếu chuẩn làm việc - Diazepam, chất đối chiếu chuẩn làm việc (chuẩn nội) Dung mơi, hố chất: - Acetonitril, methanol, dicloromethan loại dùng cho HPLC - Dichloromethan, n – hexan, isopropanol hố chất, dung mơi khác đạt tiêu chuẩn tinh khiết phân tích (P.A.) dùng chiết tách chạy sắc ký Huyết tương: dùng huyết tương trắng người tình nguyện khoẻ mạnh Thiết bị: hiệu chuẩn theo qui định, đáp ứng yêu cầu ISO IEC 17025 GLP - Hệ thống sắc ký lỏng hiệu cao Merck - Hitachi, L-7455, D-7000, DAD tương đương - Máy ly tâm lạnh, máy lắc - Thiết bị bốc dung mơi có gắn phận cấp khí - Tủ bảo quản mẫu sinh học âm sâu (- 200C đến – 800C) Các loại dụng cụ phân tích: - Micropipet, pipet, bình định mức có độ xác thích hợp - Ống ly tâm chịu dung mơi tốc độ cao, có nắp đậy, tránh ánh sáng - Các loại dụng cụ dùng chiết tách khác: cốc có mỏ, pipet, buret sử dụng loại thuỷ tinh màu, tránh ánh sáng 2.3 Khảo sát độ hồ tan in vitro Khảo sát độ hịa tan chế phẩm thử so với chế phẩm đối chứng điều kiện, có nhu cầu Tuy nhiên, kết mang tính chất tham khảo để biết mức độ hòa tan chế phẩm Thiết bị : + Thiết bị thử độ hoà tan loại (cánh khuấy) + Tốc độ : 100 vịng/ phút - Mơi trường: 900ml, mơi trường có pH khác nhau: + Mơi trường pH 1,2: Lấy 3,73g kali clorid, hịa tan khoảng 900ml nước Điều chỉnh đến pH 1,2 dung dịch HCl 0,2N Thêm nước vừa đủ 1000 ml + Mơi trường đệm acetat pH 4,5: Hồ tan 2,99 gam natri acetat trihydrat khoảng 900ml nước, điều chỉnh đến pH 4,5 acid acetic 2N Thêm nước vừa đủ 1000 ml + Môi trường đệm phosphat pH 6,8: Hoà tan 6,805 gam kali dihydrophosphat khảong 900 ml nước, điều chỉnh đến pH 6,8 dung dịch NaOH 0,2M Thêm nước vừa đủ 1000 ml - Nhiệt độ mơi trường hồ tan : 370C ± 0,50C 2- PL3a Phụ lục IIIa - Qui trình đánh giá TĐSH chế phẩm Nifedipin - Tiến hành: Mẫu thử mẫu đối chứng thử độ hòa tan đồng thời, thời điểm thiết bị, với điều kiện nêu trên, thử môi trường pH khác Với mẫu thử , thử 12 viên / mơi trường Lấy dịch hịa tan để định lượng Nifedipin sau vận hành thiết bị thời điểm cho thu đường biểu diễn độ hoà tan phù hợp Tức là, đường biểu diễn phải có điểm; Độ hồ tan điểm cuối đạt tới 85% Tuy nhiên, tuỳ đặc tính hồ tan chế phẩm mơi trường pH, mà thời gian lấy mẫu ngừng trước đạt tới 85% (ví dụ, khoảng - môi trường pH 1,2, – môi trường pH 4,5, khoảng – 12 môi trường pH 6,8 Với viên nén Nifedipin Hasan đối chứng với Nifehexal 20mg giải phóng chậm, thời điểm lấy mẫu bố trí sau: - Môi trường pH 1,2: thời điểm 1, 2, 3, sau vận hành thiết bị - Môi trường pH 4,5: Tại thời điểm 1, 2, 4, 6, sau vận hành - Môi trường pH 6,8: Tại thời điểm 1, 2, 4, 6, 8, 10, 12 sau vận hành Định lượng Nifedipin Tại thời điểm định lượng, hút 5ml dịch hồ tan từ bình Lọc qua giấy lọc 0,45 µm, bù thể tích 5ml mơi trường tương ứng vào bình hồ tan sau lần lấy mẫu Xác định lượng Nifedipin giải phóng phương pháp đo phổ hấp thụ cực đại bước sóng 330 nm so với chất đối chiếu Nifedipin điều kiện Với mẫu, xác định phần trăm hòa tan trung bình thời điểm so với hàm lượng ghi nhãn khoảng tin cậy giá trị trung bình Chú ý: Nifedipin nhạy cảm với ánh sáng, nên dụng cụ điều kiện thí nghiệm phải tránh ánh sáng Đánh giá kết Lập bảng kết độ hòa tan theo thời gian loại thuốc Tính giá trị F2 theo cơng thức: F2 = 50 x log {100 x [ + (1/n) Σt=1n (Rt – Tt)2]-0,5 } đó: Rt % hoà tan thuốc chứng thời điểm t Tt % hoà tan thuốc thử thời điểm t Nếu F2 ≥ 50 hai chế phẩm coi có độ hồ tan tương đương mơi trường Kết độ hịa tan có tính chất tham khảo, không dùng để xem xét miễn thử TĐSH in vivo cho dạng bào chế 2.4 Thử tương đương sinh học in vivo 2.4.1 Thiết kế nghiên cứu Thiết kế chéo, thuốc, giai đoạn, tình trạng đói Cỡ mẫu thử tuỳ theo u cầu, 12 người Chọn ngẫu nhiên phần mềm excel để xác định thứ tự phân nhóm loại thuốc uống Mỗi người tình nguyện uống loại thuốc Người uống thuốc A giai đoạn uống thuốc B giai đoạn ngược lại Thời gian nghỉ giai đoạn ngày Trường hợp cần thiết phải thử đa liều (vì lý khoa học yêu cầu nhà quản lý), tiến hành cho uống thuốc liên tục ngày, thời gian nghỉ giai đoạn ngày 2.4.2 Người tình nguyện Tiêu chuẩn chấp nhận: - Tiêu chuẩn chung: nam giới khoẻ mạnh, tuổi 18 – 55 Chỉ số BMI cân nặng chiều cao phải khoảng từ 18 – 25kg/m2, theo cách tính chiều cao, cân nặng Metropolitan Index 1983 cho người lớn; 3- PL3a Phụ lục IIIa - Qui trình đánh giá TĐSH chế phẩm Nifedipin - Đánh giá chung tình hình sức khoẻ, khám tổng quát tim mạch, tiêu hoá, thần kinh, chiều cao, cân nặng, huyết áp, nhịp thở, tất phải giới hạn bình thường; - Các số xét nghiệm máu phải giới hạn bình thường Xét nghiệm bao gồm: hồng cầu, bạch cầu, tiểu cầu, haemoglobin, hematocrit; sinh hoá lâm sàng: AST(GOT), ALT(GPT), creatinine, glucose; - Xét nghiệm kháng thể HIV kháng nguyên viêm gan B phải âm tính Tiêu chuẩn loại trừ: - NTN nghiện ma tuý, rượu thuốc lá; - Người có rối loạn tim mạch, hơ hấp, thận, tiêu hóa, miễn dịch, huyết học, nội tiết, hệ thần kinh bệnh tâm thần ; - Người có giá trị xét nghiệm nằm ngồi khoảng bình thường ; - Người nghi ngờ có nhiễm HIV HbsAg (dương tính với phép thử nhanh) - Người có tiền sử dị ứng với Nìifedipin thuốc nhóm; - Người bị ốm vòng tuần trước uống thuốc giai đoạn I; - Người dùng loại thuốc gây cảm ứng ức chế chuyển hố thuốc gan vịng 28 ngày trước uống thuốc giai đoạn I; Qui trình kiểm tra NTN tuyển chọn: Tuyển chọn kiểm tra NTN theo tiêu vòng tháng trước bắt đầu uống thuốc giai đoạn Loại bỏ NTN phân tích, đánh giá: Khơng dùng mẫu NTN vào phân tích nếu: - NTN rút lui q trình nghiên cứu, khơng tham gia uống thuốc đủ ngày giai đoạn - Trong sau nghiên cứu, phát thấy NTN không tuân thủ qui định nghiên cứu - NTN bị nơn ỉa chảy vịng sau uống thuốc có phản ứng bất lợi nghiêm trọng uống thuốc lấy mẫu - Số mẫu máu lấy bị ≥ điểm Khơng dùng số liệu NTN vào tính thống kê nếu: Mất ≥ điểm lấy mẫu liên tiếp pha hấp thu xung quanh Tmax; 2.4.4 Uống thuốc lấy mẫu Quá trình lấy mẫu tuân thủ theo Hướng dẫn thực hành lâm sàng tốt (GCP) Liều dùng, cách dùng: giai đoạn, NTN uống viên 20mg thuốc thử thuốc đối chứng vào buổi sáng với 200ml nước tinh khiết NTN tập trung khu vực lấy mẫu từ tối hôm trước Bữa tối trước ngày lấy mẫu máu, NTN ăn nhẹ ăn trước 10 đêm, nước uống theo nhu cầu Trước uống thuốc, NTN khám lâm sàng, kiểm tra huyết áp, tim mạch, nhịp thở để đảm bảo họ tình trạng khỏe mạnh Trong vòng trước sau uống thuốc, NTN không uống nước Bữa ăn thực sau uống thuốc Khẩu phần ăn qui định nhóm nghiên cứu đồng NTN Trong suốt thời gian tiến hành lấy máu, NTN uống nước tinh khiết, không uống sữa, nước chè, cà phê, coca loại nước tăng lực Cách lấy máu: Dùng kim vô khuẩn luồn vào tĩnh mạch cẳng tay NTN cố định cho không cản trở hoạt động bình thường cẳng tay Lấy máu bơm tiêm vô khuẩn cho vào ống nghiệm có sẵn chất chống đơng Thời điểm lấy mẫu: 4- PL3a Phụ lục IIIa - Qui trình đánh giá TĐSH chế phẩm Nifedipin (ngay trước lúc uống thuốc) 0,5; 1; 1,5; 2; 2,5; 3; 3,5; 4; 6; 12 sau uống thuốc Mỗi lần lấy khoảng ml máu Các mẫu máu ly tâm lạnh, tách lấy phần huyết tương Huyết tương bảo quản - 400C tiến hành phân tích Q trình lấy mẫu xử lý mẫu tiến hành điều kiện tránh ánh sáng Chú ý: thời điểm lấy mẫu điều chỉnh phù hợp, dựa thơng tin tham khảo từ nghiên cứu khác Quá trình cho uống thuốc lấy mẫu máu thực phòng lấy mẫu có bác sĩ, y tá theo dõi chăm sóc y tế cho NTN 2.4.5 Phân tích xác định nồng độ thuốc huyết tương Qui trình phân tích: Áp dụng qui trình phân tích thẩm định với điều kiện sau: Chiết tách Nifedipin từ huyết tương phương pháp chiết lỏng - lỏng với hỗn hợp dung môi chiết n – hexan, isopropanol dicloromethan Định lượng nifedipin dịch chiết phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao, dùng chuẩn nội diazepam Điều kiện sắc ký sau: - Hệ thống HPLC, SHIMADZU – MCB20A; - Cột RP18 (250 mm x mm, µm), nhiệt độ cột: 40oC - Pha động: acetonitril : methanol : đệm acetic pH 4,0 theo tỷ lệ thích hợp - Tốc độ dịng: ml/phút - Thể tích tiêm mẫu: 100 µl - Detector: 238 nm Chất đối chiếu Nifedipin, chuẩn nội Diazepam Xử lý mẫu: Mẫu huyết tương để rã đông nhiệt độ phịng trước phân tích Lấy 1ml mẫu huyết tương (chuẩn/ thử), thêm thể tích dung dịch chuẩn nội thích hợp (khoảng 50µl), 2ml dung dịch đệm* Borat pH 9,0, lắc Chiết hỗn hợp dung môi dicloromethan: isopropanol: n-hexan (15:2,5:2,5) Lắc trộn kỹ, tách lấy lớp dung mơi, bốc thu cắn Hồ tan cắn pha động, lọc tiêm vào máy sắc ký Lưu ý: Q trình xử lý mẫu phân tích thực điều kiện tránh ánh sáng Điều chỉnh điều kiện phân tích cần để có đáp ứng tốt Tiến hành sắc ký mẫu chuẩn, mẫu trắng, mẫu thử theo điều kiện Ghi đáp ứng tính kết dựa nồng độ pha thực tế, thể tích dung mơi chiết đáp ứng thu Sắc ký đồ có giá trị để xem xét mẫu trắng khơng có pic có thời gian lưu xung quanh thời gian lưu mẫu chuẩn Nifedipin chuẩn nội Diazepam 2.4.6 Tính thống kê thơng số dược động học tương đương sinh học Xác định thông số dược động học NTN theo nồng độ thuốc xác định thời điểm, bao gồm: - Nồng độ thuốc tối đa (Cmax): xác định trực tiếp giá trị đo - Diện tích đường cong (AUC0 – t; AUC0 – ∞): xác định phương pháp hình thang, [AUC ]t0 = ∑ (C i + C i +1 ) × (t i +1 − t i ) n −1 i =0 đó: Ci nồng độ thuốc thời điểm lấy mẫu ti 5- PL3a Phụ lục IIIa - Qui trình đánh giá TĐSH chế phẩm Nifedipin AUC0-∞ = AUC0-t + Cn/λz đó: Cn nồng độ thuốc thời điểm lấy mẫu cuối λZ số tốc độ thải trừ - Thời gian đạt nồng độ thuốc tối đa (Tmax): xác định trực tiếp giá trị đo Tính thống kê đánh giá tương đương sinh học theo hướng dẫn qui định US - FDA: - Phân tích phương sai, xác định khoảng tin cậy 90% (CI) giá trị tỷ lệ LnCmax LnAUC0 – ∞ trung bình thuốc thử thuốc đối chứng: CI = ln( T MSE ) ± t ( ,1; N ' ) × R N đó: T: Giá trị Cmax AUC0-∞ thuốc thử R: Giá trị Cmax AUC0-∞ thuốc chứng N’: Bậc tự sai số xác định ANOVA MSE: Trung bình bình phương sai số xác định ANOVA N: Tổng số NTN tham gia đánh giá TĐSH - So sánh giá trị Tmax tính theo phương pháp phân tích khơng tham số Wilcoxon (Wilcoxon signed – rank test) Giá trị Tmax thuốc thử thuốc chứng khác khơng có ý nghĩa thống kê (P > 0,05) tổng thứ tự xếp hạng dương âm (sum of possitive/negative rank) lớn giá trị tra bảng với cỡ mẫu n (số lượng cặp Tmax thuốc thử thuốc chứng có sai khác) tương ứng Kết đánh giá Tmax mang tính chất thông tin không để so sánh đánh giá TĐSH Hai chế phẩm tương đương sinh học khoảng tin cậy 90% tỷ lệ Cmax AUC0–∞ trung bình, tính thống kê cho giá trị chuyển đổi logarit thuốc thử so với thuốc đối chứng nằm khoảng 80 – 125 % 2.5 Hồ sơ, báo cáo - Hồ sơ: Ghi chép chi tiết điều kiện thử nghiệm, trình thực hiện, kết nghiên cứu, sắc ký đồ đo Lưu hồ sơ gốc - Báo cáo kết theo mẫu qui định Trong đó, bao gồm tất hoạt động nghiên cứu theo đề cương đưa ra, bao gồm phương pháp tính tốn, xử lý số liệu kết nghiên cứu 6- PL3a Phụ lục IIIb - Qui trình đánh giá TĐSH chế phẩm Rosiglitazon QUI TRÌNH ĐÁNH GIÁ TƯƠNG ĐƯƠNG SINH HỌC VIÊN NÉN ROSIGLITAZON PHẠM VI ÁP DỤNG - Qui trình áp dụng cần thực nghiên cứu dược động học, sinh khả dụng, tương đương sinh học, theo dõi điều trị, nghiên cứu lâm sàng chế phẩm có chứa rosiglitazon dùng đường uống - Thực kỹ thuật viên, nghiên cứu viên đào tạo phân tích mẫu dịch sinh học - Thực sở có đủ sở lâm sàng đáp ứng yêu cầu GCP sở phân tích trang bị đủ thiết bị xử lý phân tích mẫu, hoạt động tuân thủ theo GLP NỘI DUNG 2.1 Thông tin thuốc nghiên cứu Rosiglitazon thuốc chữa đái tháo đường thuộc nhóm thiazolidinedion, có tác dụng hạ đường huyết cách tăng nhạy cảm thể với insulin Thuốc không gây hạ đường huyết người không bị đái tháo đường Ở người đái tháo đường, thuốc làm giảm tăng đường huyết không gây tai biến hạ đường huyết (trừ trường hợp nhịn đói phối hợp thuốc hiệp đồng tác dụng) Theo tài liệu, sau uống, thuốc hấp thu tốt qua đường tiêu hóa, sinh khả dụng đạt xấp xỉ 99% Nồng độ đỉnh huyết tương đạt khoảng 150ng/ml sau khoảng Thức ăn không ảnh hưởng nhiều đến AUC, làm giảm đáng kể tốc độ hấp thu (Cmax giảm khoảng 28%) làm chậm hấp thu (Tmax từ 1,0 kéo dài đến 1,75 giờ) Thuốc liên kết với protein cao, khoảng 99%, thải trừ dạng không biến đổi qua đường nước tiểu (64%) phân (23%) Thời gian bán thải 3-4 Chỉ định: Rosiglitazon dùng điều trị bệnh đái tháo đường bệnh nhân khơng có đáp ứng với metformin Dùng riêng phối hợp với metformin Chống định: Mẫn cảm với thuốc, thận trọng với người có men gan tăng (cao gấp khoảng lần bình thường) Phản ứng bất lợi: số phản ứng thường gặp xảy điều trị với rosiglitazon đau đầu, đau lưng, tăng đường huyết, mệt mỏi, viêm mũi, viêm đường hô hấp Liều dùng cách dùng: Liều thường dùng cho người lớn 4mg/lần/ ngày Liều tối đa 8mg/ lần/ ngày Thuốc uống lúc đói no 2.2 Yêu cầu sở nghiên cứu 2.2.1 Cơ sở lấy mẫu: Cơ sở lấy mẫu phải có đủ diện tích, phân chia thành khu vực riêng để thực việc cho uống thuốc lấy mẫu thích hợp đáp ứng u cầu Phải có khu vực cho người tình nguyện nghỉ ngơi qua đêm ngày lấy mẫu, khu vực để sinh hoạt, giải trí cần, khu ăn uống vệ sinh - Khu vực lấy mẫu: đủ diện tích để tập kết dụng cụ lấy mẫu, nghiên cứu viên người tình nguyện tập trung lấy mẫu 1-PL3b Phụ lục IIIb - Qui trình đánh giá TĐSH chế phẩm Rosiglitazon - Phải có trang bị tủ thuốc dụng cụ cấp cứu kịp thời trường hợp xảy cố thuốc phản ứng khác nguy hại cho NTN Đồng thời có giường bác sĩ xử trí cấp cứu cần thiết 2.2.2 Cơ sở phân tích: - Trang bị đủ thiết bị, hố chất dụng cụ cho phân tích Hố chất thiết bị Chất chuẩn: - Rosiglitazon maleat chất đối chiếu chuẩn làm việc - Propylparaben, chất đối chiếu chuẩn làm việc (chuẩn nội) Dung mơi, hố chất: - Acetonitril, methanol loại dùng cho HPLC - Dicloromethan hố chất, dung mơi khác đạt tiêu chuẩn tinh khiết phân tích (P.A.) dùng chiết tách chạy sắc ký Huyết tương: dùng huyết tương trắng người tình nguyện khoẻ mạnh Thiết bị: hiệu chuẩn theo qui định, đáp ứng yêu cầu ISO IEC 17025 GLP - Hệ thống sắc ký lỏng hiệu cao Shimadzu, LC-20AT, SIL-20AC, CBM-20A, CTO tương đương - Máy ly tâm lạnh, máy lắc - Thiết bị bốc dung mơi có gắn phận cấp khí - Tủ bảo quản mẫu sinh học âm sâu (- 200C đến – 800C) Các loại dụng cụ phân tích: - Micropipet, pipet, bình định mức có độ xác thích hợp - Ống ly tâm chịu dung môi tốc độ cao, có nắp đậy - Các loại dụng cụ dùng chiết tách khác: cốc có mỏ, pipet, buret 2.3 Thử tương đương sinh học in vivo 2.3.1 Thiết kế nghiên cứu Thiết kế chéo, thuốc, giai đoạn, tình trạng đói Cỡ mẫu thử tuỳ theo yêu cầu, 12 người Chọn ngẫu nhiên phần mềm excel để xác định thứ tự phân nhóm loại thuốc uống Mỗi người tình nguyện uống loại thuốc Người uống thuốc A giai đoạn uống thuốc B giai đoạn ngược lại Thời gian nghỉ giai đoạn ngày 2.3.2 Người tình nguyện Tiêu chuẩn chấp nhận: - Tiêu chuẩn chung: nam giới khoẻ mạnh, tuổi 18 – 55 Chỉ số BMI cân nặng chiều cao phải khoảng từ 18 – 25kg/m2, theo cách tính chiều cao, cân nặng Metropolitan Index 1983 cho người lớn; - Đánh giá chung tình hình sức khoẻ, khám tổng quát tim mạch, tiêu hoá, thần kinh, chiều cao, cân nặng, huyết áp, nhịp thở, tất phải giới hạn bình thường; - Các số xét nghiệm máu phải giới hạn bình thường Xét nghiệm bao gồm: hồng cầu, bạch cầu, tiểu cầu, haemoglobin, hematocrit; sinh hoá lâm sàng: AST(GOT), ALT(GPT), creatinine, glucose; - Xét nghiệm kháng thể HIV kháng nguyên viêm gan B phải âm tính 2-PL3b Phụ lục IIIb - Qui trình đánh giá TĐSH chế phẩm Rosiglitazon Tiêu chuẩn loại trừ: - NTN nghiện ma tuý, rượu thuốc lá; - Người có rối loạn tim mạch, hơ hấp, thận, tiêu hóa, miễn dịch, huyết học, nội tiết, hệ thần kinh bệnh tâm thần ; - Người có giá trị xét nghiệm nằm ngồi khoảng bình thường ; - Người nghi ngờ có nhiễm HIV HbsAg (dương tính với phép thử nhanh) - Người có tiền sử dị ứng với rosiglitazon thuốc nhóm; - Người bị ốm vòng tuần trước uống thuốc giai đoạn I; - Người dùng loại thuốc gây cảm ứng ức chế chuyển hố thuốc gan vịng 28 ngày trước uống thuốc giai đoạn I; Qui trình kiểm tra NTN tuyển chọn: Tuyển chọn kiểm tra NTN theo tiêu vòng tháng trước bắt đầu uống thuốc giai đoạn Loại bỏ NTN phân tích, đánh giá: Khơng dùng mẫu NTN vào phân tích nếu: - NTN rút lui q trình nghiên cứu, khơng tham gia uống thuốc đủ ngày giai đoạn - Trong sau nghiên cứu, phát thấy NTN không tuân thủ qui định nghiên cứu - NTN bị nơn ỉa chảy vịng sau uống thuốc có phản ứng bất lợi nghiêm trọng uống thuốc lấy mẫu - Số mẫu máu lấy bị ≥ điểm Khơng dùng số liệu NTN vào tính thống kê nếu: Mất ≥ điểm lấy mẫu liên tiếp pha hấp thu xung quanh Tmax; 2.3.3 Uống thuốc lấy mẫu Quá trình lấy mẫu tuân thủ theo Hướng dẫn thực hành lâm sàng tốt (GCP) Liều dùng, cách dùng: giai đoạn, NTN uống viên 20mg thuốc thử thuốc đối chứng vào buổi sáng với 200ml nước tinh khiết NTN tập trung khu vực lấy mẫu từ tối hôm trước Bữa tối trước ngày lấy mẫu máu, NTN ăn nhẹ ăn trước 10 đêm, nước uống theo nhu cầu Trước uống thuốc, NTN khám lâm sàng, kiểm tra huyết áp, tim mạch, nhịp thở để đảm bảo họ tình trạng khỏe mạnh Trong vịng trước sau uống thuốc, NTN không uống nước Bữa ăn thực sau uống thuốc Khẩu phần ăn qui định nhóm nghiên cứu đồng NTN Trong suốt thời gian tiến hành lấy máu, NTN uống nước tinh khiết, không uống sữa, nước chè, cà phê, coca loại nước tăng lực Cách lấy máu: Dùng kim vô khuẩn luồn vào tĩnh mạch cẳng tay NTN cố định cho không cản trở hoạt động bình thường cẳng tay Lấy máu bơm tiêm vơ khuẩn cho vào ống nghiệm có sẵn chất chống đông Thời điểm lấy mẫu: 0h (ngay trước lúc uống thuốc) 10 phút, 20 phút, 30 phút, 45 phút, 1; 1,25; 1,5; 2; 3; 4; 6; 12 sau uống thuốc Mỗi lần lấy khoảng ml máu Các mẫu máu ly tâm lạnh, tách lấy phần huyết tương Huyết tương bảo quản - 400C tiến hành phân tích Chú ý: thời điểm lấy mẫu điều chỉnh phù hợp, dựa thơng tin tham khảo từ nghiên cứu khác 3-PL3b Phụ lục IIIb - Qui trình đánh giá TĐSH chế phẩm Rosiglitazon Quá trình cho uống thuốc lấy mẫu máu thực phịng lấy mẫu có bác sĩ, y tá theo dõi chăm sóc y tế cho NTN 2.3.4 Phân tích xác định nồng độ thuốc huyết tương Qui trình phân tích: Áp dụng qui trình phân tích thẩm định với điều kiện sau: Chiết tách rosiglitazon từ huyết tương phương pháp tủa protein acetonitril kết hợp với chiết lỏng - lỏng dung môi chiết dicloromethan Định lượng rosiglitazon dịch chiết phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao, dùng chuẩn nội propylparaben Điều kiện sắc ký sau: - Hệ thống HPLC, SHIMADZU – MCB20A; - Cột RP18 (250 mm x mm, µm), nhiệt độ cột: 400C - Pha động: Methanol : đệm acetat pH 5,0 theo tỷ lệ thích hợp - Tốc độ dịng: khoảng ml/phút - Thể tích tiêm mẫu: 50 µl - Detector huỳnh quang, Ex = 247nm ; Em = 367 nm Chất đối chiếu Rosiglitazon, chuẩn nội propylparaben Xử lý mẫu: Mẫu huyết tương để rã đơng nhiệt độ phịng trước phân tích Lấy 1ml mẫu huyết tương, thêm thể tích dung dịch chuẩn nội thích hợp (khoảng 50µl), tủa protein acetonitril Lắc, ly tâm lấy lớp dịch Chiết dung mơi dicloromethan Lắc xốy, tách lấy lớp dung mơi, bốc N2 50oC thu cắn Hoà tan cắn methanol, tiêm vào máy sắc ký Lưu ý: Điều chỉnh điều kiện phân tích cần để có đáp ứng tốt Tiến hành sắc ký mẫu chuẩn, mẫu trắng, mẫu thử theo điều kiện Ghi đáp ứng tính kết dựa nồng độ pha thực tế, thể tích dung mơi chiết đáp ứng thu Sắc ký đồ có giá trị để xem xét mẫu trắng khơng có pic có thời gian lưu xung quanh thời gian lưu mẫu chuẩn rosiglitazon chuẩn nội propylparaben 2.3.5 Tính thống kê thơng số dược động học tương đương sinh học Xác định thông số dược động học NTN theo nồng độ thuốc xác định thời điểm, bao gồm: - Nồng độ thuốc tối đa (Cmax): xác định trực tiếp giá trị đo - Diện tích đường cong (AUC0 – t; AUC0 – ∞): xác định phương pháp hình thang, [AUC ] t = n −1 (C i + C i +1 ) × (t i +1 − t i ) i =0 ∑ đó: Ci nồng độ thuốc thời điểm lấy mẫu ti AUC0-∞ = AUC0-t + Cn/λz đó: Cn nồng độ thuốc thời điểm lấy mẫu cuối λZ số tốc độ thải trừ - Thời gian đạt nồng độ thuốc tối đa (Tmax): xác định trực tiếp giá trị đo 4-PL3b Phụ lục IIIb - Qui trình đánh giá TĐSH chế phẩm Rosiglitazon Tính thống kê đánh giá tương đương sinh học theo hướng dẫn qui định US - FDA: - Phân tích phương sai, xác định khoảng tin cậy 90% (CI) giá trị tỷ lệ LnCmax LnAUC0 – ∞ trung bình thuốc thử thuốc đối chứng: CI = ln( T MSE ) ± t ( ,1; N ' ) × R N đó: T: Giá trị Cmax AUC0-∞ thuốc thử R: Giá trị Cmax AUC0-∞ thuốc chứng N’: Bậc tự sai số xác định ANOVA MSE: Trung bình bình phương sai số xác định ANOVA N: Tổng số NTN tham gia đánh giá TĐSH - So sánh giá trị Tmax tính theo phương pháp phân tích khơng tham số Wilcoxon (Wilcoxon signed – rank test) Giá trị Tmax thuốc thử thuốc chứng khác khơng có ý nghĩa thống kê (P > 0,05) tổng thứ tự xếp hạng dương âm (sum of possitive/negative rank) lớn giá trị tra bảng với cỡ mẫu n (số lượng cặp Tmax thuốc thử thuốc chứng có sai khác) tương ứng Kết đánh giá Tmax mang tính chất thông tin không để so sánh đánh giá TĐSH Hai chế phẩm tương đương sinh học khoảng tin cậy 90% tỷ lệ Cmax AUC0–∞ trung bình, tính thống kê cho giá trị chuyển đổi logarit thuốc thử so với thuốc đối chứng nằm khoảng 80 – 125 % 2.4 Hồ sơ, báo cáo - Hồ sơ: Ghi chép chi tiết điều kiện thử nghiệm, trình thực hiện, kết nghiên cứu, sắc ký đồ đo Lưu hồ sơ gốc - Báo cáo kết theo mẫu qui định Trong đó, bao gồm tất hoạt động nghiên cứu theo đề cương đưa ra, bao gồm phương pháp tính tốn, xử lý số liệu kết nghiên cứu 5-PL3b