Thiết lập chất đối chiếu hypophyllanthin, niranthin và xác định một số thông số dược động học của cao chuẩn hóa điều chế từ diệp hạ châu đắng (phyllanthus amarus schum et thonn , euphorbiaceae)

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƯỢC TP HỒ CHÍ MINH PHẠM VĂN SƠN THIẾT LẬP CHẤT ĐỐI CHIẾU HYPOPHYLLANTHIN, NIRANTHIN VÀ XÁC ĐỊNH MỘT SỐ THÔNG SỐ DƯỢC ĐỘNG HỌC CỦA CAO CHUẨN HÓA ĐIỀU CHẾ TỪ DIỆP HẠ CHÂU ĐẮNG (PHYLLANTHUS AMARUS SCHUM ET THONN., EUPHORBIACEAE) LUẬN ÁN TIẾN SĨ DƯỢC HỌC TP HỒ CHÍ MINH, Năm 2021 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƯỢC TP HỒ CHÍ MINH PHẠM VĂN SƠN THIẾT LẬP CHẤT ĐỐI CHIẾU HYPOPHYLLANTHIN, NIRANTHIN VÀ XÁC ĐỊNH MỘT SỐ THƠNG SỐ DƯỢC ĐỘNG HỌC CỦA CAO CHUẨN HĨA ĐIỀU CHẾ TỪ DIỆP HẠ CHÂU ĐẮNG (PHYLLANTHUS AMARUS SCHUM ET THONN., EUPHORBIACEAE) NGÀNH: KIỂM NGHIỆM THUỐC VÀ ĐỘC CHẤT MÃ SỐ: 62720410 LUẬN ÁN TIẾN SĨ DƯỢC HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS TS NGUYỄN NGỌC VINH TP HỒ CHÍ MINH, Năm 2021 LỜI CAM ĐOAN Tơi cam đoan cơng trình nghiên cứu riêng tơi, kết nghiên cứu trình bày luận án trung thực, khách quan chưa công bố nơi LỜI CẢM ƠN Trước tiên, em xin bày tỏ lòng tri ân sâu sắc đến Thầy PGS TS Nguyễn Ngọc Vinh đã tận tình hướng dẫn, giúp đỡ để em thực hiện hoàn thành luận án Em xin trân trọng cảm ơn đến quý Thầy Cô Ban Giám hiệu, Phòng Sau đại học, Ban Chủ nhiệm Khoa Dược – Đại học Y Dược Tp Hồ Chí Minh tạo điều kiện thuận lợi để em hoàn tất chương trình học Em chân hành cảm ơn đến quý Thầy Cơ, Anh Chị Em ở Bợ Mơn Hóa Phân tích kiểm nghiệm – Khoa Dược giảng dạy, hướng dẫn, đợng viên đóng góp ý kiến q báu để em hồn thành luận án Đặc biệt, tơi cảm ơn nhiều đến Ban Lãnh đạo Viện Kiểm nghiệm thuốc Tp Hồ Chí Minh Anh Chị Em ở Khoa Kiểm nghiệm Đông dược - dược liệu, Khoa Thiết lập chất đối chiếu - chất chuẩn, Khoa Vật lý đo lường, Khoa Dược lý, Khoa Vi sinh, Trung tâm Đánh giá tương đương sinh học tạo điều kiện thuận lợi, giúp đỡ nhiều suốt trình thực hiện đề tài ở Viện Và xin cảm ơn đến quý Lãnh đạo Sở Y tế, Ban Quản lý An toàn thực phẩm Tp Hồ Chí Minh tạo điều kiện thuận lợi, Anh Chị Em đồng nghiệp bạn bè gần xa giúp đỡ, hỗ trợ để hồn thành chương trình học Cuối xin nói lời tri ân đến Ba Má vất vả nuôi dưỡng với mong muốn lớn lên học hành thành người, cảm ơn đến Anh Chị giúp đỡ, chia sẻ, động viên học hành Sau lời cảm ơn đến em Chương Ngọc Nãi động viên giúp đỡ để hoàn thành luận án MỤC LỤC MỤC LỤC i DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT iii DANH MỤC BẢNG vii DANH MỤC HÌNH, ĐỒ THỊ x DANH MỤC SƠ ĐỒ xii MỞ ĐẦU CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 TỔNG QUAN DIỆP HẠ CHÂU ĐẮNG 1.2 CÁC PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU VỀ CHIẾT XUẤT, PHÂN LẬP, TINH CHẾ HỢP CHẤT LIGNAN TỪ DIỆP HẠ CHÂU ĐẮNG 1.3 CÁC PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG CÁC HỢP CHẤT LIGNAN TRONG DIỆP HẠ CHÂU 17 1.4 CAO ĐỐI CHIẾU 26 1.5 TỔNG QUAN VỀ ĐÁNH GIÁ SINH KHẢ DỤNG CỦA THUỐC 26 CHƯƠNG ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 36 2.1 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU 36 2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 38 CHƯƠNG KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 64 3.1 CHIẾT XUẤT, PHÂN LẬP, TINH CHẾ VÀ XÁC ĐỊNH CẤU TRÚC, ĐỘ TINH KHIẾT CỦA CÁC CHẤT PHÂN LẬP ĐƯỢC 64 3.2 XÁC ĐỊNH CHẤT LƯỢNG VÀ THIẾT LẬP CHẤT ĐỐI CHIẾU 78 3.3 ĐIỀU CHẾ VÀ TIÊU CHUẨN HÓA CAO DIỆP HẠ CHÂU ĐẮNG 83 3.4 ĐÁNH GIÁ MỘT SỐ THÔNG SỐ DƯỢC ĐỘNG HỌC CỦA CAO CHUẨN HÓA ĐIỀU CHẾ TỪ DIỆP HẠ CHÂU ĐẮNG 98 CHƯƠNG BÀN LUẬN 113 4.1 CHIẾT XUẤT, PHÂN LẬP, TINH CHẾ VÀ XÁC ĐỊNH CẤU TRÚC, ĐỘ TINH KHIẾT CỦA CÁC CHẤT PHÂN LẬP ĐƯỢC 113 4.2 XÁC ĐỊNH CHẤT LƯỢNG VÀ THIẾT LẬP CHẤT ĐỐI CHIẾU 121 4.3 ĐIỀU CHẾ VÀ TIÊU CHUẨN HÓA CAO DIỆP HẠ CHÂU ĐẮNG 122 4.4 ĐÁNH GIÁ MỘT SỐ THÔNG SỐ DƯỢC ĐỘNG HỌC CỦA CAO CHUẨN HÓA ĐIỀU CHẾ TỪ DIỆP HẠ CHÂU ĐẮNG 133 ĐIỂM MỚI CỦA ĐỀ TÀI 145 KẾT LUẬN 146 KIẾN NGHỊ 148 DANH MỤC CÁC CƠNG TRÌNH LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC .i DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT Chữ viết tắt Từ nguyên Nghĩa tiếng Việt ACN Acetonitrile Acetonitril AOAC Association of Official Hiệp hội nhà hóa học Analytical Chemists phân tích thức As Asymetry Hệ số đối xứng AUC Area under curve Diện tích đường cong Cmax Maximum plasma concentration Nồng độ đỉnh huyết tương COSY Correlated Spectroscopy Phổ tương quan proton proton CV Coefficient of Variation Hệ số phân tán d Doublet Đỉnh đôi DCM Dichloromethan Dicloromethan dd Doublets of doublet Đỉnh đôi kép DĐVN Dược điển Việt Nam DEPT Distortionless Enhancement by Polarization Transfer DHCĐ Diệp hạ châu đắng DNA Deoxyribonucleic acid Acid deoxyribonucleic DSC Differential Scanning Phân tích nhiệt vi sai Calorimetry EA Ethyl acetate Ethyl acetat ECD Electrochemical detection Đầu dị điện hóa EMA European Medicines Agency Cơ quan Dược phẩm Châu Âu ESI Electrospray ionization Ion hóa phun điện EtOAc Ethyl acetate Ethyl acetat EtOH Ethanol FL Fluorescence Huỳnh quang GC Gas chromatography Sắc ký khí GC-MS Gas chromatography–mass Sắc ký khí khối phổ spectrometry GLP Good Laboratory Practices Thực hành tốt phòng kiểm nghiệm thuốc GMP Good Manufacturing Practices Thực hành tốt sản xuất thuốc HMBC Heteronuclear multiple bond Phổ tương tác dị nhân qua correlation nhiều nối HPL Hypophyllanthin HPTLC High Performance Thin Layer Sắc ký lớp mỏng hiệu chromatography cao High quality control Mẫu kiểm chứng nồng độ HQC cao HSQC ICH Heteronuclear Single Quantum Phổ tương tác dị nhân qua Correlation lượng tử The International Council for Hội nghị quốc tế hòa hợp Harmonisation IR Infrared Hồng ngoại IS Internal standard Chuẩn nội ISO International Organization for Tổ chức quốc tế tiêu Standardization chuẩn hóa J Coupling constant Hằng số ghép LC-MS/MS Liquid chromatography - Sắc ký lỏng khối phổ hai lần Tandem mass spectrometry LLOQ Lower limit of quantitation Giới hạn định lượng LOD Limit of detection Giới hạn phát LOQ Limit of quantitation Giới hạn định lượng LQC Low quality control Mẫu kiểm chứng nồng độ thấp m Multiplet Đỉnh đa MAE Microwave Assisted Extraction Chiết xuất với hỗ trợ vi sóng MeOH Methanol MF Matrix factor Hệ số ảnh hưởng mẫu MQC Medium quality control Mẫu kiểm chứng nồng độ trung bình MRM Multiple Reaction Monitoring MS Mass Spectrum Phổ khối NCBI National Center for Trung tâm Thông tin Công Biotechnology Information nghệ sinh học Quốc gia NLĐC Nguyên liệu đối chiếu NMR Nuclear Magnetic Resonance Cộng hưởng từ hạt nhân NOESY Nuclear overhauser effect Phổ hiệu ứng hạt nhân spectrocopy overhauser NRT Niranthin NTT Nirtetralin PA Purify analysis Tinh khiết phân tích PCR Polymerase Chain Reaction Phản ứng chuỗi polymerase PDA Photo Diode Array Dãy diod quang PLE Pressurized Liquid Extraction Chiết áp suất cao PLT Phyllanthin ppm Parts per million Một phần triệu Phòng thí nghiệm PTN PTT Phyltetralin QC Quality Control Mẫu kiểm chứng Rs Resolution Độ phân giải i RSD Relative standard deviation Độ lệch chuẩn tương đối SD Standard deviation Độ lệch chuẩn SFE Super-critical Fluid Extraction Chiết xuất chất lỏng siêu tới hạn SKC Sắc ký cột SKD Sinh khả dụng SKĐ Sắc ký đồ SKĐC Sắc ký điều chế SKLM Sắc ký lớp mỏng t Triplet Đỉnh ba T1/2 Half-life time Thời gian bán thải TB Trung bình TLC Thin Layer Chromatography Sắc ký lớp mỏng Tài liệu tham khảo TLTK Tmax tR Time to maximum plasma Thời gian nồng độ concentration huyết tương đạt mức tối đa Retention time Thời gian lưu Thuốc thử TT ULOQ Upper limit of quantitation Giới hạn định lượng US-FDA United States - Food and drug Cơ quan Quản lý Thuốc administration Thực phẩm Hoa Kỳ USP United States Pharmacopeia Dược điển Mỹ UV Ultraviolet Tử ngoại UV-Vis Ultraviolet - Visible Tử ngoại - Khả kiến VLC Vacuum liquid chromatography Sắc ký lỏng chân không Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PL-129 lần cho độ xác khoảng  20 % độ 80-120 % 2.7 Độ ổn định mẫu thử a Độ ổn định dung dịch chuẩn gốc Pha lô mẫu, mỗi lô chứa PLT, HPL, NRT dung môi nồng độ MQC, mỡi lơ mẫu Phân tích lô theo phương pháp xây dựng - Độ ổn định ngắn hạn: Lô thứ để nhiệt độ phịng phân tích - Độ ổn định dài hạn: Lô thứ bảo quản nhiệt độ -20 oC phân tích sau 30 ngày b Độ ổn định huyết tương Pha lô mẫu, mỗi lô chứa PLT, HPL, NRT huyết tương nồng độ LQC, HQC, mỗi nồng độ mẫu Phân tích lơ theo phương pháp xây dựng - Độ ổn định ngắn hạn: Lô thứ để nhiệt độ phịng phân tích - Độ ổn định mẫu sau chu kỳ đông - rã đông: Lô thứ bảo quản -70 oC 12 giờ, lấy để nhiệt độ phòng rã đơng, lặp lại chu trình thêm lần Phân tích mẫu sau chu trình đơng - rã đơng - Độ ổn định dài hạn: Lô thứ bảo quản nhiệt độ -70 oC phân tích sau 30 ngày - Độ ổn định sau xử lý mẫu (trong buồng tiêm mẫu): Tiêm lại lô mẫu nồng độ LQC, HQC, mỡi nồng độ mẫu, sau 24 xử lý bảo quản buồng tiêm mẫu oC Yêu cầu: Mẫu xem ổn định giá trị tìm lại hoạt chất nằm khoảng 85-115 % nồng độ lý thuyết mức nồng độ c Độ ổn định dung dịch chuẩn nội gốc Pha lô mẫu, mỗi lô chứa IS dung môi nồng độ 1000 ng/mL, mỡi lơ mẫu Phân tích lô theo phương pháp xây dựng - Độ ổn định ngắn hạn: Lô thứ để nhiệt độ phịng phân tích - Độ ổn định dài hạn: Lô thứ bảo quản nhiệt độ -20 oC phân tích sau 30 ngày Pha loãng dung dịch chuẩn gốc sau điều kiện bảo quản dung mơi hịa mẫu để nồng độ thích hợp tiến hành phân tích với dung dịch chuẩn pha có nồng độ tương ứng Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PL-130 - Độ ổn định sau xử lý mẫu (trong buồng tiêm mẫu): Tiêm lại lô mẫu nồng độ LQC, HQC, mỗi nồng độ mẫu, sau 24 xử lý bảo quản buồng tiêm mẫu oC Yêu cầu: Mẫu xem tổn định giá trị tìm lại chất phân tích chuẩn nội nằm khoảng 90-110 % (dung dịch gốc  10 %, huyết tương  15 %) nồng độ ban đầu mức nồng độ 2.8 Ảnh hưởng mẫu (Matrix effects) Chuẩn bị lô huyết tương trắng khác nhau, mỗi lô mẫu, tiến hành phân tích mẫu theo qui trình xử lý mẫu, mẫu sau xử lý thêm chất phân tích nồng độ LQC, HQC chuẩn nội vào mẫu mỡi lơ Tiến hành phân tích mẫu song song với mẫu LQC HQC có chuẩn nội pha động để xác định ảnh hưởng mẫu MFAS = Area MAS / Area MPAS MFIS = Area MIS / Area MPIS IS-normalized MF = MFAS / MFIS Trong đó: Area MAS (IS): diện tích pic chất phân tích (chuẩn nội) huyết tương trắng Area MPAS (IS): diện tích pic chất phân tích (chuẩn nội) pha động Yêu cầu: CV IS-normalized MF ≤ 15 % 2.9 Ảnh hưởng lượng mẫu tồn dư (Carry over) Tiến hành tiêm mẫu có nồng độ cao huyết tương (ULOQ) vào hệ thống sắc ký, sau phân tích xong, tiêm mẫu trắng (Blank) vào hệ thống Thực qui trình lần Tiêm lần mẫu có nồng độ LLOQ huyết tương để đánh giá kết Yêu cầu: Ảnh hưởng lượng mẫu tồn dư mẫu trắng theo nồng độ không lớn 20 % so với giới hạn định lượng (LLOQ) chất phân tích % chất chuẩn nội BÁO CÁO KẾT QUẢ THẨM ĐỊNH QUY TRÌNH PHÂN TÍCH 3.1 Tính phù hợp hệ thống Tính phù hợp hệ thống khảo sát với thông số sắc ký thời gian lưu, diện tích pic, tỷ số diện tích pic tỷ số thời gian lưu chất phân tích so với chuẩn nội Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PL-131 Thực mẫu giả lập mức nồng độ trung bình (MQC) có thêm chuẩn nội, tiêm lặp lại lần Kết trình bày Bảng 3.1 Bảng 3.1 Kết kiểm tra tính phù hợp hệ thống (n = 6) Thông số sắc ký Thời gian lưu (tR-phút) Giá trị thống kê PLT HPL NRT IS TB CV (%) TB CV (%) TB CV (%) TB CV (%) 6,735 0,06 4399145 0,89 1,3933 1,85 1,766 0,05 6,145 0,09 1374632 2,58 0,4355 3,99 1,611 0,10 9,048 0,05 3637761 2,20 1,1522 3,07 2,373 0,05 3,813 0,10 3158095 1,53 - Diện tích pic (S) Tỷ số S/SIS Tỷ số tR/tR (IS) Nhận xét: Kết cho thấy thông số thời gian lưu, diện tích pic, tỷ số diện tích pic tỷ số thời gian lưu chất phân tích chuẩn nội tiêm lặp lại lần có CV < % Vậy phương pháp đạt tính phù hợp hệ thống 3.2 Tính đặc hiệu (Độ chọn lọc) Tiến hành sắc ký mẫu huyết tương trắng từ lô huyết tương khác mẫu kiểm chứng mức nồng độ LLOQ Kết khảo sát cho thấy sắc ký đồ mẫu LLOQ có đỉnh PLT (6,735 phút); HPL (6,145 phút), NRT (9,048 phút) đỉnh IS (3,813 phút) Mẫu huyết tương trắng khơng xuất đỉnh vị trí PLT, HPL NRT Tín hiệu đáp ứng mẫu trắng thời điểm trùng với thời gian lưu PLT, HPL NRT khơng vượt q 20 % tín hiệu đáp ứng chất phân tích nồng độ LLOQ Tín hiệu đáp ứng mẫu trắng thời điểm trùng với thời gian lưu chuẩn nội không vượt % tín hiệu đáp ứng chuẩn nội mẫu LLOQ Kết xác định độ chọn lọc trình bày Bảng 3.2 Vậy, quy trình phân tích đạt yêu cầu tính đặc hiệu Bảng 3.2 Kết xác định tính đặc hiệu Lơ huyết Mẫu trắng tương PLT HPL NRT 0 0 0 0 0 0 TB 0 CV (%) IS 0 0 0 Diện tích pic Mẫu LLOQ PLT HPL 19251 18288 19667 20223 23421 20686 20698 19123 18482 17475 18938 18541 20076 18556 8,98 5,93 Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Tỉ lệ ảnh hưởng (%) NRT 17456 20493 21181 20781 20812 20633 20226 6,81 IS 3011105 2989826 3052979 3053127 3025983 3040300 3028887 0,83 PLT 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 HPL 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 NRT 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 IS 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PL-132 3.3 Tỉ lệ thu hồi (Hiệu suất chiết) Tiến hành sắc ký mẫu huyết tương giả lập có PLT, HPL NRT nồng độ LQC, MQC, HQC IS với mẫu chuẩn có nồng độ tương ứng pha dung mơi hịa cắn So sánh diện tích pic chất phân tích chuẩn nội mẫu Kết tóm tắt Bảng 3.3 cho thấy hiệu suất chiết chất ổn định mức nồng độ Bảng 3.3 Hiệu suất chiết PLT, HPL, NRT IS (n = 6) Mức nồng độ LQC PLT HPL Hiệu Hiệu suất suất CV (%) CV (%) chiết chiết TB (%) TB (%) 94,30 2,49 91,54 1,64 NRT IS Hiệu Hiệu suất suất CV (%) CV (%) chiết chiết TB (%) TB (%) 97,53 2,37 96,55 2,74 MQC 96,27 2,33 94,81 3,22 98,63 2,82 98,78 2,66 HQC 94,62 1,84 96,11 2,74 98,43 2,10 97,55 2,83 TB 95,06 1,12 94,15 2,50 98,20 0,60 97,63 1,14 Yêu cầu H  110 %, CV  15 % Kết luận Đạt Nhận xét: Ở nồng độ LQC, MQC, HQC hiệu suất chiết trung bình PLT, HPL, NRT IS 95,06 %; 94,15 %, 98,20 % 97,63 % Các giá trị CV hiệu suất chiết mức nồng độ PLT, HPL, NRT IS 1,12 %; 2,50 %; 0,60 % 1,14 % (CV ≤ 15 %) Vậy quy trình xử lý mẫu xây dựng phù hợp, có hiệu suất chiết cao ổn định mức nồng độ 3.4 Tính tuyến tính đường chuẩn Tiến hành sắc ký mẫu huyết tương giả lập chứa PLT, HPL NRT có khoảng nồng độ khảo sát từ 0,1-50 ng/mL (PLT), 0,1-50 ng/mL (HPL) 0,1-50 ng/mL (NRT) Sự tương quan nồng độ PLT, HPL NRT huyết tương, tỷ số diện tích pic chất phân tích với chuẩn nội huyết tương trình bày Bảng 3.4 Đường chuẩn bao gồm: mẫu huyết tương trắng (blank), mẫu huyết tương trắng có chuẩn nội (zero) mẫu huyết tương đường chuẩn Tiến hành phân tích lặp lại đường chuẩn Đánh giá tương quan nồng độ chất phân tích huyết tương Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PL-133 với tỷ số diện tích pic đo khoảng nồng độ khảo sát Sử dụng mơ hình hồi qui tuyến tính ŷ = ax + b với trọng số 1/x2 Bảng 3.4 Sự tương quan nồng độ PLT, HPL NRT tỷ số diện tích pic chất phân tích với chuẩn nội huyết tương Phyllanthin Nồng độ lý thuyết Tỉ lệ diện tích pic Nồng độ tìm lại Độ (ng/mL) PLT/IS (ng/mL) (%) L1 0,100 0,0067 0,105 5,42 L2 0,199 0,011 0,186 -6,53 L3 0,498 0,027 0,483 -3,01 L4 0,995 0,0486 0,883 -11,26 L5 4,977 0,256 4,716 -5,24 L6 9,954 9,955 10,114 1,61 L7 19,908 19,910 22,054 10,78 L8 49,771 49,549 53,076 6,64 Phương trình hồi quy: y = 0,0534x + 0,00099; R2 = 0,9920 Có 75 % số điểm đường chuẩn đạt yêu cầu: Yêu cầu độ 85-115 %, ngoại trừ LLOQ: 80-120 %; R2 ≥ 0,980 Kết luận Đạt Hypophyllanthin Mẫu Nồng độ lý thuyết Tỉ lệ diện tích pic Nồng độ tìm lại Độ (ng/mL) HPL/IS (ng/mL) (%) L1 0,100 0,0015 0,096 -3,99 L2 0,199 0,0032 0,214 7,54 L3 0,498 0,0081 0,546 9,64 L4 0,997 0,0135 0,918 -7,92 L5 4,984 0,067 4,569 -8,33 L6 9,968 0,1453 9,915 -0,53 L7 19,937 0,3185 21,730 8,99 L8 49,841 0,7723 52,703 5,74 Phương trình hồi quy: y = 0,0146x + 0,00006; R2 = 0,9917 Có 75 % số điểm đường chuẩn đạt yêu cầu: Yêu cầu độ 85-115 %, ngoại trừ LLOQ: 80-120 %; R2 ≥ 0,980 Kết luận Đạt Niranthin Mẫu Nồng độ lý thuyết Tỉ lệ diện tích pic Nồng độ tìm lại Độ (ng/mL) HPL/IS (ng/mL) (%) L1 0,097 0,0046 0,107 10,31 L2 0,194 0,007 0,166 -14,43 L3 0,485 0,0183 0,438 -9,69 L4 0,969 0,0357 0,861 -11,15 L5 4,846 0,1908 4,611 -4,85 L6 9,692 0,422 10,205 5,29 L7 19,385 0,9072 21,944 13,2 L8 48,461 22,443 54,292 12,03 Phương trình hồi quy: y = 0,0413x + 0,00017; R2 = 0,9851 Mẫu Yêu cầu độ Kết luận Có 75 % số điểm đường chuẩn đạt yêu cầu: 85-115 %, ngoại trừ LLOQ: 80-120 %; R2 ≥ 0,980 Đạt Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PL-134 3.5 Độ độ xác ngày ngày Chuẩn bị lô mẫu gồm mức nồng độ LLOQ, LQC, MQC HQC, mỗi nồng độ mẫu Xử lý phân tích theo phương pháp xây dựng Tiến hành sắc ký mẫu huyết tương giả lập chứa chất phân tích mức nồng độ trên, lặp lại vào ngày khác Kết thẩm định cho thấy phương pháp đạt độ ngày khác ngày với độ nằm khoảng 85-115 % (trừ LLOQ có độ từ 80-120 %) đạt độ xác với CV nhỏ 15 % (trừ LLOQ có CV  20 %) Kết trình bày Bảng 3.5 Bảng 3.5 Kết xác định độ đúng, độ xác ngày khác ngày Hoạt Chất Mức nồng độ (ng/mL) Trong ngày (n = 6) LLOQ LQC PLT MQC HQC LLOQ LQC HPL MQC HQC LLOQ LQC NRT Tỉ lệ hồi phục trung bình (%) – CV (%) MQC HQC TB CV (%) TB CV (%) TB CV (%) TB CV (%) TB CV (%) TB CV (%) TB CV (%) TB CV (%) TB CV (%) TB CV (%) TB CV (%) TB CV (%) Ngày 01 Ngày 02 Ngày 03 Khác ngày (n = 18) 106,03 13,25 100,01 9,31 111,41 2,72 101,19 3,30 100,98 12,87 97,33 11,03 102,83 5,81 104,32 7,74 98,75 12,32 101,23 9,13 105,48 3,19 104,44 5,63 107,89 9,19 100,37 9,01 102,28 1,62 100,69 6,32 100,03 10,56 100,96 7,24 108,57 2,24 108,37 2,74 99,28 15,78 105,40 8,69 110,27 2,17 107,76 3,77 98,55 9,57 98,27 8,40 108,15 2,31 108,14 3,13 100,61 13,14 97,62 5,96 102,33 7,71 98,65 5,87 97,19 6,86 100,78 7,58 109,22 2,54 109,92 2,84 104,16 10,96 99,55 8,43 107,28 5,27 105,98 5,46 100,54 11,52 98,63 8,01 104,57 5,97 103,78 6,71 98,41 11,57 102,47 8,26 108,32 3,17 107,37 4,49 Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PL-135 3.6 Giới hạn định lượng Tiến hành sắc ký mẫu huyết tương trắng mẫu kiểm chứng mức nồng độ LLOQ Ở nồng độ 0,1 ng/mL với phyllanthin, hypophyllanthin niranthin, kết sau phân tích cho tỷ số S/N lớn 5, đạt độ xác độ theo qui định, diện tích chất phân tích lớn lần so với mẫu trắng thời điểm, nồng độ chấp nhận giới hạn định lượng (LLOQ) phương pháp Kết xác định giới hạn định lượng trình bày Bảng 3.6 Bảng 3.6 Kết xác định giới hạn đinh lượng Lô huyết tương TB CV (%) PLT 89,08 118,02 92,15 99,54 118,03 119,35 106,03 13,25 Độ (%) HPL NRT 118,66 86,33 116,25 88,68 95,14 116,32 88,45 99,94 93,14 91,49 94,23 109,76 100,98 98,75 12,87 12,32 Giá trị S/N PLT HPL 10,6 6,9 15,3 7,8 12,8 8,7 11,6 10,1 15,9 5,5 13,7 6,7 13,32 7,62 15,52 21,34 NRT 8,7 9,8 10,3 8,4 10,9 7,8 9,32 12,91 3.7 Độ ổn định mẫu thử 3.7.1 Độ ổn định dung dịch chuẩn gốc Kết đánh giá độ ổn định hoạt chất dung dịch chuẩn gốc trình bày Bảng 3.7 Bảng 3.7 Độ ổn định PLT, HPL NRT dung dịch chuẩn gốc (n = 6) Điều kiện bảo quản Sau nhiệt độ phòng Sau 30 ngày -20 oC TB CV (%) TB CV (%) Độ % (CV %) PLT HPL NRT 100,91 99,64 100,91 2,04 2,62 1,98 99,79 98,95 99,58 3,76 3,03 2,50 IS 101,47 2,11 100,74 2,03 Nhận xét: Giá trị tìm lại chất nằm khoảng 90 % - 110 % nồng độ lý thuyết với giá trị CV không 15 % sau bảo quản nhiệt độ phòng sau 30 ngày bảo quản -20 oC Như vậy, dung dịch chuẩn gốc PLT, HPL, NRT IS ổn định điều kiện nhiệt độ phòng sau -20 oC sau 30 ngày Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PL-136 3.7.2 Độ ổn định hoạt chất huyết tương - Độ ổn định ngắn hạn: Bảo quản ngắn hạn nhiệt độ phòng - Độ ổn định dài hạn: Bảo quản dài hạn -70 oC thời gian 30 ngày - Độ ổn định chu kỳ đông-rã đông: Bảo quản sau chu kỳ đông - rã đông - Độ ổn định sau xử lý mẫu (trong phận tiêm mẫu): Bảo quản sau xử lý mẫu 24 buồng tiêm mẫu oC Kết đánh giá độ ổn định PLT, HPL NRT huyết tương trình bày Bảng 3.8 Bảng 3.8 Độ ổn định PLT, HPL NRT huyết tương (n = 6) Phần trăm giá trị tìm lại so với nồng độ lý thuyết (CV %) Điều kiện bảo quản Điều kiện ngắn hạn TB Sau nhiệt độ phòng CV (%) Sau xử lý TB mẫu buồng tiêm mẫu 24 CV (%) oC TB Sau chu kỳ đông - rã đông CV (%) PLT LQC HQC HPL LQC HQC NRT LQC HQC IS 106,31 99,03 103,09 102,16 102,78 99,88 5,64 3,89 4,95 2,21 4,28 4,39 105,98 99,84 101,14 100,10 103,04 99,08 101,02 4,07 4,61 5,05 3,34 3,06 3,48 2,49 100,45 101,64 102,96 103,81 102,13 100,18 - 4,71 5,08 3,74 4,06 3,77 3,91 103,81 101,81 99,36 102,19 103,26 101,57 4,58 3,93 4,57 3,61 4,01 2,94 - Điều kiện dài hạn Sau 30 ngày -70 oC TB CV (%) - Nhận xét: Giá trị tìm lại chất nằm khoảng 85-115 % nồng độ lý thuyết với giá trị CV không 15 % Như vậy, mẫu huyết tương giả lập chứa PLT, HPL, NRT IS đạt tiêu ổn định theo hướng dẫn US-FDA, EMA DĐVN V, cụ thể sau: ổn định sau bảo quản nhiệt độ phòng, 24 phận tiêm mẫu sắc ký oC, sau chu kỳ đông - rã đông sau 30 ngày bảo quản -70 oC 3.8 Ảnh hưởng mẫu (Matrix effects) Tiến hành phân tích song song lô mẫu huyết tương trắng xử lý thêm IS chất phân tích nồng độ LQC HQC, với mẫu LQC HQC có chuẩn nội Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PL-137 dung mơi hịa cắn để tính ảnh hưởng mẫu Ảnh hưởng mẫu chất phân tích trình bày Bảng 3.9 Bảng 3.9 Kết đánh giá ảnh hưởng mẫu (n = 6) Mức nồng độ LQC TB CV (%) HQC TB CV (%) MFPLT MFHPL MFNRT 75,25 88,02 78,84 78,12 93,82 79,45 74,95 78,76 85,06 76,13 75,93 83,45 73,07 77,27 76,49 75,88 89,22 72,04 75,57 83,84 79,22 99,18 91,54 93,57 98,19 99,44 96,18 96,35 102,74 99,28 96,04 98,08 101,07 99,36 99,43 103,85 101,73 95,44 99,42 101,42 100,2 100,34 Ảnh hưởng mẫu MFIS MFPLT/MFIS MFHPL/MFIS MFNRT/MFIS 85,05 0,88 1,03 0,93 83,67 0,93 1,12 0,95 84,14 0,89 0,94 1,01 84,04 0,91 0,90 0,99 79,19 0,92 0,98 0,97 84,02 0,90 1,06 0,86 83,35 0,91 1,01 0,95 2,05 8,15 5,74 96,46 1,03 1,07 1,08 99,56 0,92 1,00 1,02 98,1 0,95 0,98 0,97 97,15 1,01 1,01 1,02 96,89 1,03 1,04 1,05 97,22 0,99 1,02 1,03 97,56 0,99 1,02 1,03 4,40 3,07 3,32 Nhận xét: Tỷ số MFPLT/ MFIS, MFHPL/ MFIS MFNRT/ MFIS mức nồng độ LQC HQC có giá trị CV < 15 % Như vậy, phương pháp phân tích có bị ảnh hưởng mẫu nằm giới hạn cho phép nên đạt yêu cầu ảnh hưởng mẫu 3.9 Ảnh hưởng lượng mẫu tồn dư (Carry over) Tiến hành thử nghiệm lượng mẫu tồn dư để kiểm tra có mặt chất phân tích từ lần tiêm trước (độ nhiễm chéo) Các mẫu tiêm theo thứ tự sau: mẫu có nồng độ cao (ULOQ) mẫu trắng, lặp lại lần Tiêm lần mẫu LLOQ để đánh giá kết Bảng 3.10 trình bày kết khảo sát ảnh hưởng lượng mẫu tồn dư Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PL-138 Bảng 3.10 Kết đánh giá ảnh hưởng lượng mẫu tồn dư (n = 6) Chất phân tích PLT HPT NRT IS Mức nồng độ LLOQ ULOQ Mẫu trắng LLOQ ULOQ Mẫu trắng LLOQ ULOQ Mẫu trắng LLOQ ULOQ Mẫu trắng Diện tích pic trung bình 12506 6598074 2071 1139249 8904 4072633 3055391 3060469 Lượng mẫu tồn dư (%) 0,00 0,00 0,00 0,00 Nhận xét: Kết Bảng 3.10 cho thấy, khơng có ảnh hưởng mẫu tồn dư PLT, HPL, NRT IS Kết luận: Kết thẩm định cho thấy quy trình định lượng đồng thời phyllanthin, hypophyllanthin niranthin huyết tương thỏ kỹ thuật LCMS/MS với khoảng tuyến tính nồng độ chất phân tích 0,1-50 ng/ml xây dựng thẩm định đáp ứng yêu cầu theo hướng dẫn US-FDA, EMA DĐVN V thẩm định phương pháp phân tích thuốc dịch sinh học Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PL-139 PHỤ LỤC 16 KẾT QUẢ ĐỊNH LƯỢNG ĐỒNG THỜI PHYLLANTHIN, HYPOPHYLLANTHIN VÀ NIRANTHIN TRONG HUYẾT TƯƠNG THỎ BẰNG KỸ THUẬT LC-MS/MS Tiến hành phân tích mẫu huyết tương thỏ theo quy trình thẩm định (Phụ lục 15) Phân tích dược động học dựa liệu 12 thỏ Kết nồng độ chất phân tích phyllanthin, hypophyllanthin, niranthin trình bày Bảng 1, Bảng Bảng Đồ thị biểu diễn nồng độ chất trung bình theo thời gian trình bày Hình 1, Hình Hình Đồ thị biểu diễn nồng độ chất phân tích phyllanthin, hypophyllanthin, niranthin theo thời gian cá thể trình bày Hình Từ nồng độ chất phân tích huyết tương thời điểm, tính tốn thông số dược động học Cmax, AUC0-t, AUC0-∞, Tmax, T1/2 cá thể dược động học trung bình, kết trình bày Bảng Bảng Nồng độ phyllanthin huyết tương cá thể (ng/mL) Thỏ 10 11 12 TB SD Nồng độ Phyllanthin (PLT) thời điểm (ng/mL) t0 t1 t2 t3 t4 t5 t6 t7 t8 t9 t10 t11 t12 t13 2h 3h 4h 5h 6h 8h 0 5 10 15 20 30 45 1h 9,054 11,575 14,056 7,787 5,447 3,720 2,742 1,054 0,591 0,373 0,261 0,132 0,098 10,139 8,635 8,399 7,564 6,740 2,775 2,294 1,153 0,500 0,492 0,116 8,241 10,255 16,063 11,590 6,652 2,110 1,204 1,138 0,453 0,328 0,227 0,200 0,123 5,041 9,001 13,701 11,066 6,235 2,553 2,003 1,027 0,789 0,473 0,172 0,132 0,100 8,294 10,670 14,342 10,860 6,322 4,638 2,474 1,350 0,349 0,271 0,126 0,105 9,588 10,496 14,177 9,792 6,363 4,538 2,880 1,096 0,789 0,234 0,184 0,132 6,208 7,302 16,941 8,575 5,396 2,621 2,334 0,852 0,673 0,467 0,060 8,753 10,857 16,780 9,759 6,178 4,557 2,016 1,480 0,520 0,472 0,160 0,121 7,067 9,651 16,650 9,529 6,987 4,932 2,841 0,846 0,534 0,312 0,234 0,108 5,282 9,392 14,730 11,063 7,065 4,074 1,356 0,988 0,734 0,351 0,077 5,472 9,713 13,532 9,459 5,108 2,568 2,026 1,177 0,534 0,574 0,224 0,189 0,136 9,131 10,417 14,383 11,596 5,082 2,241 1,551 1,203 0,513 0,344 0,113 0,080 7,689 9,830 14,480 9,887 6,131 3,444 2,143 1,114 0,582 0,391 0,163 0,140 0,120 1,80 1,15 2,28 1,40 0,71 1,06 0,56 0,18 0,14 0,10 0,07 0,04 0,02 Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PL-140 Hình Đồ thị biểu diễn nồng độ phyllanthin trung bình theo thời gian Bảng Nồng độ hypophyllanthin huyết tương cá thể (ng/mL) Thỏ 10 11 12 TB SD t0 0 0 0 0 0 0 0 - t1 5 3,029 2,334 2,378 2,045 1,318 2,252 2,442 2,043 3,445 3,156 1,871 1,835 2,346 0,61 Nồng độ Hypophyllanthin (HPL) thời điểm (ng/mL) t2 t3 t4 t5 t6 t7 t8 t9 t10 2h 3h 4h 10 15 20 30 45 1h 4,784 4,027 3,027 4,241 2,623 2,834 3,462 4,655 3,381 3,662 3,321 3,719 3,645 0,68 5,183 6,098 6,189 5,055 4,073 4,935 7,131 6,14 5,872 6,503 7,007 6,265 5,871 0,90 3,37 4,426 3,849 4,845 4,58 3,544 4,31 4,954 4,367 3,961 4,666 4,697 4,297 0,51 2,714 1,223 1,753 1,8 1,815 2,491 1,678 1,705 1,183 2,365 2,277 1,928 1,911 0,47 1,709 1,58 1,243 1,178 1,482 1,668 1,254 1,574 1,084 1,687 1,973 1,32 1,479 0,27 1,109 0,997 1,098 0,748 1,094 0,813 1,159 0,922 0,985 0,904 1,161 1,168 1,013 0,14 0,638 0,717 0,603 0,512 0,552 0,694 0,798 0,5 0,74 0,687 0,86 0,76 0,672 0,11 0,509 0,521 0,435 0,338 0,344 0,525 0,38 0,356 0,407 0,611 0,77 0,582 0,482 0,13 0,249 0,196 0,188 0,271 0,093 0,196 0,142 0,08 0,229 0,227 0,155 0,176 0,184 0,06 t11 5h 0,095 0,071 0,084 0,073 0,042 0,089 0,098 0,021 0,052 0,069 0,03 t12 6h t 13 8h - - Hình Đồ thị biểu diễn nồng độ hypophyllanthin trung bình theo thời gian Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PL-141 Bảng Nồng độ niranthin huyết tương cá thể (ng/mL) Thỏ t0 0 10 11 12 TB SD 0 0 0 0 0 0 - t1 5 1,865 2,306 1,567 1,238 2,087 2,242 1,732 1,734 1,433 1,308 1,923 1,13 1,714 0,39 t2 10 3,118 4,298 2,58 4,432 2,908 2,677 3,474 4,379 2,367 3,68 4,101 4,242 3,521 0,77 Nồng độ Niranthin (NRT) thời điểm (ng/mL) t3 t4 t5 t6 t7 t8 t9 t10 2h 3h 4h 15 20 30 45 1h 3,942 4,819 4,426 4,021 4,019 3,682 3,96 4,705 4,959 4,581 5,129 3,638 4,323 0,51 2,31 1,949 1,889 2,024 1,191 1,814 1,761 2,042 1,967 1,975 2,415 1,584 1,91 0,32 1,824 1,666 1,489 1,957 1,801 1,531 1,184 1,841 1,523 1,236 1,643 1,036 1,561 0,29 1,179 1,085 1,101 0,994 1,016 1,051 1,09 1,048 1,051 0,983 1,026 0,982 1,051 0,06 0,899 0,557 0,69 0,881 0,767 0,511 0,685 0,694 0,725 0,804 0,717 0,882 0,734 0,12 0,335 0,387 0,315 0,713 0,552 0,796 0,46 0,412 0,689 0,61 0,317 0,585 0,514 0,17 0,259 0,247 0,26 0,421 0,471 0,259 0,378 0,433 0,293 0,500 0,435 0,342 0,358 0,09 0,26 0,154 0,109 0,232 0,268 0,133 0,174 0,292 0,152 0,115 0,292 0,149 0,194 0,07 t11 5h t12 6h t13 8h 0,181 0,112 0,092 0,082 0,051 0,092 0,114 0,118 0,09 0,118 0,098 0,090 0,100 0,102 0,112 0,03 - - Hình Đồ thị biểu diễn nồng độ niranthin trung bình theo thời gian Bảng Các thông số dược động học trung bình chất Thơng số Phyllanthin Hypophyllanthin Niranthin (Trung bình ± SD) (Trung bình ± SD) (Trung bình ± SD) 0,24 0,26 0,24 Cmax (ng/mL) 14,625 ± 1,88 5,913 ± 0,82 4,408 ± 0,45 AUC0-t (ng.giờ/mL) 9,694 ± 0,71 4,172 ± 0,39 3,135 ± 0,24 AUC0-∞ 10,150 ± 0,61 4,503 ± 0,42 3,497 ± 0,38 T1/2 (giờ) 1,78 1,17 1,41 AUC0-t/AUC0-∞ (%) 95,51 92,65 89,66 Tmax (giờ) (ng.giờ/mL) Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PL-142 Đồ thị biểu diễn nồng độ chất cá thể theo thời gian: Thỏ PLT Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn HPL NRT Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PL-143 10 11 12 Hình Đồ thị biểu diễn nồng độ phyllanthin, hypophyllanthin niranthin theo thời gian cá thể Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn