Đồ án tốt nghiệp tổng quan về các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình tạo hạt nhân tạo lan hồ điệp (phalaenopsis sp )

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP HỒ CHÍ MINH H o C ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP hi in M h TỔNG QUAN VỀ CÁC YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG ĐẾN QUÁ TRÌNH TẠO HẠT NHÂN TẠO LAN HỒ ĐIỆP (Phalaenopsis sp.) ity C rs ve ni U CÔNG NGHỆ SINH HỌC ity Ngành: Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC of ch Te l no MSSV: 106111004 : QUÁCH VĂN HẢO Lớp: 07DSH1 TP Hồ Chí Minh, 2014 y Sinh viên thực og Giảng viên hướng dẫn : NGUYỄN THỊ THU HƯƠNG LỜI CẢM ƠN Trong q trình học tập trường, có khó khăn em gặp phải mà tự thân em thấy gần sụp đổ Khi đó, bên cạnh bao bọc gia đình cịn có hướng dẫn giúp đỡ tận tình nhà trường, thầy giúp em vượt qua H khó khăn để hồn thành khóa học ngày hơm Em xin chân thành o biết ơn sâu sắc đến tất người cố gắng để đạt thành cơng C hi sống M Cảm ơn cha mẹ - người sinh thành, nuôi nấng hi sinh cho ăn in học có vấp ngã cha mẹ bao dung trở che cho bước h tiếp đường học vấn trường đời C ity Cảm ơn ban lãnh đạo nhà trường tạo điều kiện giúp đỡ cho e có hội sửa sai hồn thành khóa học Cảm ơn thầy phịng tư vấn U ni giải học vụ tận tình hướng dẫn giúp đỡ em thủ tục học vụ ve Cảm ơn ban lãnh đạo khoa, thầy cô khoa CNSH – TP – MT ity rs thầy cô môn liên quan khác nỗ lực giảng dạy giúp đỡ chúng em học tốt, tiếp thu kiến thức để trang bị cho thân đời làm việc of Em cảm ơn nhiều giúp đỡ tận tình hai cô thư ký khoa : cô Yến Ly ch khăn việc học Te Vân hướng dẫn giúp đỡ em cách giải em gặp phải khó og việc chọn đề tài làm đồ án tốt nghiệp l no Cảm ơn Nguyễn Thị Thu Hương tận tình hướng dẫn, giúp đỡ em Cảm ơn người bạn, người anh em giúp đỡ, động viên tiếp y thêm sức mạnh tinh thần để em tự tin thân sống để tiếp tục học tập TP.HCM, ngày 28 tháng 07 năm 2014 Sinh viên Quách Văn Hảo Đồ án tốt nghiệp MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN Trang MỤC LỤC i DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT iv H o DANH MỤC CÁC BẢNG v C DANH MỤC CÁC HÌNH vi hi M PHẦN I: MỞ ĐẦU in h Lý chọn đề tài ity C Đối tượng nghiên cứu Phạm vi nghiên cứu U Mục tiêu nghiên cứu ni ve Phương pháp nghiên cứu rs Các kết đạt đề tài ity Kết cấu ĐATN (Đồ án tốt nghiệp) of PHẦN II: NỘI DUNG Te CHƯƠNG 1: CƠ SỞ LÝ THUYẾT 1.1 Tổng quan đối tượng nghiên cứu ch 1.1.1 Tổng quan lan Hồ Điệp l no 1.1.1.1 Vị trí phân loại og 1.1.1.2 Đặc điểm hình thái - sinh lý y 1.1.1.3 Các điều kiện thích hợp cho lan Hồ Điệp 10 1.1.2 Tình hình sản xuất lan Hồ Điệp giới Việt Nam 11 1.1.2.1 Tình hình sản xuất hoa Lan giới 11 1.1.2.2 Tình hình sản xuất hoa Lan Việt Nam 12 1.2 Tổng quan vấn đề nghiên cứu 13 1.2.1 Lịch sử nghiên cứu hạt nhân tạo 13 i Đồ án tốt nghiệp 1.2.1.1 Trên giới 13 1.2.1.2 Trong nước 14 1.2.2 Tình hình nghiên cứu hạt nhân tạo 14 1.2.3 Tổng quan quy trình tạo hạt nhân tạo 16 1.2.3.1 Các nguồn mẫu làm hạt nhân tạo 16 1.2.3.2 Vật liệu làm vỏ bọc cho hạt nhân tạo 18 H o 1.2.4 Ưu nhược điểm hạt nhân tạo 19 C 1.2.5 Ứng dụng hạt nhân tạo 20 hi 1.2.6 Giới thiệu số công nghệ vi nhân giống khác 20 M 1.2.6.1 Công nghệ vi nhân giống quang tự dưỡng 21 in h 1.2.6.2 Công nghệ nuôi cấy lỏng lắc 21 ity C 1.2.6.3 Hệ thống bình ni cấy Bioreactor 22 1.2.6.4 Hệ thống ni cấy ngập chìm tạm thời TIS (Temporary ni U Immersion System) 23 ve CHƯƠNG 2: QUY TRÌNH TẠO HẠT NHÂN TẠO LAN HỒ ĐIỆP 25 rs 2.1 Kỹ thuật phát sinh phôi soma, PLB chuẩn bị mẫu cho tạo hạt nhân tạo 25 ity 2.1.1 Kỹ thuật phát sinh phôi soma 25 of 2.1.1.1 Phát sinh tăng sinh mô sẹo 25 Te 2.1.1.2 Phát sinh phôi soma 27 2.1.2 Kỹ thuật phát sinh PLB 28 ch 2.2 Quy trình tạo hạt nhân tạo lan Hồ Điệp 30 l no 2.2.1 Sơ đồ quy trình 30 og 2.2.2 Thuyết minh quy trình 31 y 2.2.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến quy trình tạo hạt nhân tạo 35 CHƯƠNG 3: CÁC KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU KHẢO SÁT ẢNH HƯỞNG CỦA CÁC YẾU TỐ ĐẾN QUY TRÌNH TẠO HẠT NHÂN TẠO LAN HỒ ĐIỆP 36 3.1 Các kết nghiên cứu tạo mơ sẹo tạo phơi vơ tính 36 3.2 Các kết nghiên cứu tạo PLB 42 3.3 Các kết nghiên cứu tạo chồi 42 ii Đồ án tốt nghiệp 3.4 Các kết nghiên cứu tạo hạt nhân tạo 44 PHẦN III: KẾT LUẬN, KIẾN NGHỊ 47 Kết luận quy trình tạo hạt nhân tạo lan Hồ Điệp 47 Những nhân tố ảnh hưởng đến trình tạo hạt nhân tạo lan Hồ Điệp 48 Kiến nghị 48 TÀI LIỆU THAM KHẢO 50 H o C hi h in M ity C ity rs ve ni U of ch Te y og l no iii Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT 2,4-D: 2,4-Dichlorophenoxyacetic BAP (BA): 6-benzylaminopurine benzyladenine ĐHST: Chất điều hòa sinh trưởng thực vật GA3: Giberellin H o Kinetin: 6-furfurylaminopurine N-(2-furanylmethyl)-1H-purine-6-amine C MS: (Murashige Skoog, 1962) hi NAA: α-Naphthaleneacetic acid M NSC: Thời gian hình thành mơ sẹo, tính từ ngày cấy chuyền đến có 50% mẫu in h cấy xuất mô sẹo ity C PLB: Protocorm like body TDZ: (Thidiazuron [1-phenyl-3-(1,2,3-thidiazol-5-yl)urea]) U VW: (Vacin Went, 1949) ni 4-hydroxy-3-methyl-trans-2-butenylaminopurine ve Zeatin: 6-(4-hydro-3- ity ol) rs methylbut-2-enyl)-aminopurine 2-methyl-4(-1H-purine-6-ylamino)-2-buten-1- of ch Te y og l no iv Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC CÁC BẢNG Trang Bảng 2.1: Thành phần khống mơi trường MS 29 Bảng 2.2: Thành phần khống mơi trường VW 29 H o C hi h in M ity C ity rs ve ni U of ch Te y og l no v Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC CÁC HÌNH Trang Hình 1: Một số hình ảnh lồi hoa lan Hồ Điệp Hình 1.1: Một số loài hoa lan Hồ Điệp Hình 1.2: Cấu tạo hạt nhân tạo 16 H o Hình 1.3: Phơi hình cầu, hình tim, hình thủy lơi 17 C Hình 1.4: Hình dạng PLB quan sát kính hiển vi soi 18 hi Hình 1.5: Cơng thức hóa học alginate 19 M Hình 1.6: Hệ thống vi nhân giống quang tự dưỡng 21 in h Hình 1.7: Hệ thống Bioreactor 23 ity C Hình 2.1: Quy trình nhân giống lan Hồ Điệp nuôi cấy phát hoa 25 Hình 2.2: Sơ đồ quy trình tạo hạt nhân tạo lan Hồ Điệp 30 ni U Hình 2.3: Mơ sẹo lan Hồ Điệp 31 ve Hình 2.4: Phơi vơ tình hình thành từ mô sẹo lan Hồ Điệp 32 rs Hình 2.5: PLB lan Hồ Điệp 32 ity Hình 2.6: Mẫu alginate hút đồng thời vào pipette 33 of Hình 2.7: Cho alginate nhỏ giọt thêm mẫu vào 34 Te Hình 2.8: Hạt nhân tạo 34 Hình 3.1: Màu sắc mơ sẹo mơi trường có 2,4-D BA 37 ch Hình 3.2: Mơ sẹo lan Hồ Điệp môi trường TDZ 2mg/l 38 l no Hình 3.3: Phơi lan Hồ Điệp hình thành mơi trường đặc ½VW 39 og Hình 3.4: Chồi hình thành từ PLB lan Hồ Điệp 43 y Hình 3.5: Chồi lan Hồ Điệp tái sinh từ mô sẹo 43 Hình 3.6: Hạt nhân tạo lan Hồ Điệp nồng độ alginate 44 Hình 3.7: Hạt nhân tạo nảy mầm 45 vi Đồ án tốt nghiệp PHẦN I: MỞ ĐẦU Lý chọn đề tài Từ lâu hoa Lan tôn vinh “Mỹ Nữ Sơn Lâm” loài hoa Hoa Lan đẹp trang nhã màu sắc, kiểu dáng, sức sống độ bền hoa Có lẽ mà hoa Lan trở thành biểu tượng cao quý, lịch lãm, phong H o lưu đẹp khiết C Trong dân gian lưu truyền nhiều câu chuyện có liên quan đến lồi hoa hi Người ca ngợi hoa Lan đức Khổng Phu Tử (Trung Quốc - 551 B.C), M ví hoa Lan loài hoa quân tử… Tương truyền nước ta có kể rằng: vua in h Trần Nhân Tơng rời kinh thành Yên Tử, Quảng Ninh đêm ngủ mộng ngài ity C thấy có người đến yết kiến dâng tặng giò hoa đẹp Sáng nghi nghi hoặc nhà vua sâu vào núi bắt gặp khe sâu có lồi hoa lạ, đẹp ni U vơ khiết Đời sau người ta gọi loài hoa lan Trần Mộng (giấc ve mộng vua Trần) để điển tích rũ bụi trần bước vào cõi khiết rs ngài ity Khi đời sống kinh tế người dân dần nâng cao, việc chăm sóc cho of đời sống tinh thần quan tâm Đối với gia đình, cá nhân nơi Te đô thị chật hẹp mong muốn đưa chút màu xanh, chút khơng khí thiên nhiên việc trưng bày trang trí vào khơng gian sống lựa ch chọn trồng hoa Lan quan tâm Ngày nay, thấy hoa Lan l no khắp nơi dễ bị choáng ngợp trước vẻ đẹp quyến rũ, biến hóa mn màu og mn vẻ loài hoa Lan như: Hồ Điệp, Mokara, Vanda, Cymbidium, y Oncidium, Địa Lan, Vũ nữ… Ở Việt Nam nghề trồng Lan phát triển chậm so với nước khác nhiều Việc trồng Lan lâu chủ yếu tự phát nên diện tích trồng cịn nhỏ trình độ tay nghề người nơng dân chưa đồng đều, người trồng Lan chưa chủ động nguồn giống việc trồng Lan gặp nhiều khó khăn đặc biệt trồng lan Hồ Điệp Loại Lan trồng khó phải đầu tư lớn, từ việc Đồ án tốt nghiệp cung cấp dưỡng chất giữ ẩm thiết bị nhà ươm, chăm sóc… phải nhập ngoại chịu thuế cao Đặc biệt, lan Hồ Điệp cần hai năm cho thu hoạch Trước xu hướng phát triển thị trường nước trồng Lan sản phẩm hoa Lan sản xuất ngày nhiều dẫn đến bão hịa thị trường lợi nhuận thu không tương xứng với công sức bỏ Trước tình hình đó, năm gần đây, với phát triển H o công nghệ sinh học, ngành vi nhân giống đặc biệt đối tượng hoa Lan C bước phát triển Nhiều đơn vị nhà nước tư nhân mạnh hi dạn đầu tư để sản xuất giống phục vụ cho nông dân Đã có nhiều cơng trình M nghiên cứu ni cấy in vitro lan Hồ Điệp nhằm tạo nguồn hoa ổn định Từ in h nuôi cấy mô, nguồn gene từ dòng Lan sưu tập lưu giữ lại để nâng cao ity C chất lượng giống đồng thời tổ chức nhân nhanh để cung cấp giống cho nhu cầu thị trường ngồi nước Quy trình nuôi cấy in vitro từ đỉnh sinh trưởng hay ni U điểm sinh trưởng tạo đồng tính trạng, có tăng trưởng chất ve lượng hoa đồng Tuy có số thành tựu đáng kể thực tế rs nhiều hạn chế thực quy mô lớn, việc vận chuyển tới tay ity người nông dân nơi gieo trồng cịn nhiều khó khăn of Các nghiên cứu “Kỹ thuật phát sinh phôi soma tạo hạt nhân tạo Te lan Hồ Điệp (Phalaenopsis sp.)” khắc phục số hạn chế ni cấy in vitro nói Đề tài “Tổng quan yếu tố ảnh hưởng đến trình tạo hạt ch nhân tạo lan Hồ Điệp (Phalaenopsis sp.)” với mong muốn hồn thiện cho quy l no trình tạo hạt nhân tạo, góp phần vào cơng nghiệp sản xuất hoa lan Hồ Điệp og Đối tượng nghiên cứu y Hoa Lan quà tạo hóa, khơng lồi hoa đẹp có giá trị mặt tinh thần mà cịn có giá trị kinh tế cao có thị trường tiêu thụ mạnh nước xuất Trong lan Hồ Điệp ưa chuộng trồng phổ biến đặc điểm màu sắc hoa, cấu trúc hoa, nhánh hoa, vòi hoa gần giống có hương thơm Đặc biệt, hoa lan Hồ Điệp có độ bền cao nên thu hoạch dạng cắt cành, việc đóng góp Đồ án tốt nghiệp ➢ Ảnh hưởng chất kích thích sinh trưởng TDZ điều kiện môi trường đặc, lỏng lắc đến khả hình thành phơi soma từ mơ sẹo lan Hồ Điệp in vitro (45NSC) (Liêu Hồng Phú, 2005) TDZ chất kích thích sinh trưởng đặc biệt thuộc nhóm cytokinin Ngồi tính chất tạo chồi cytokinin cịn có khả tăng sinh mơ sẹo auxin TDZ dùng thay cho auxin tổ hợp auxin cytokinin H o hình thành phơi nhiều lồi khác C Q trình trải qua bước: hi Bước 1: Tăng sinh mô sẹo M ✓ Nuôi cấy môi trường đặc in h Sau 30 - 45 ngày, mô sẹo nuôi cấy môi trường đặc phát triển tốt, sinh ity C khối tăng nhanh phát triển mô sẹo nghiệm thức ✓ Nuôi cấy mơi trường lỏng lắc (100 vịng/phút) ni U Khi nuôi cấy môi trường lỏng lắc, lượng sinh khối tạo so với ve ni cấy mơi trường đặc, phần lớn có màu tối Trong đó, mơi rs trường VW bổ sung mg/l TDZ có lượng sinh khối cao màu sáng ity mơi trường cịn lại, đặc biệt xuất số mơ sẹo có màu xanh of ch Te y og l no Môi trường đặc Mơi trường lỏng lắc Hình 3.2: Mơ sẹo lan Hồ Điệp môi trường TDZ mg/l 38 Đồ án tốt nghiệp Bước 2: Phát sinh phôi soma Mô sẹo từ bình ni cấy tăng sinh tách thành cụm nhỏ cấy chuyền sang môi trường đặc ½VW Sự phát sinh phơi vơ tính có khác biệt đáng kể mẫu cấy chuyền từ bình ni cấy tăng sinh Mơ sẹo từ bình ni cấy đặc ban đầu tiếp tục gia tăng sinh khối, có H o số phơi vơ tính xuất C Mơ sẹo từ bình ni cấy lỏng lắc có kết cấu tạo lượng hi phơi vơ tính nhiều M Số phơi hình thành từ mẫu cấy cảm ứng môi trường in h lỏng lắc với nồng độ TDZ mg/l nhiều (39,67 phôi) ity C Vậy việc thêm vào môi trường ni cấy TDZ nồng độ mg/l thích hợp cho việc cảm ứng tạo phơi vơ tính lan Hồ Điệp Thêm vào đó, giai đoạn ni U nuôi cấy mô sẹo điều kiện lỏng lắc cần thiết cho việc cảm ứng tạo phôi, ve phơi vơ tính hình thành nhiều dễ nhận biết Môi trường nuôi cấy đặc rs ban đầu tạo phơi vơ tính, nhiên tỉ lệ phơi vơ tính tạo thành khơng cao ity nên phương pháp không cho kết tốt of ch Te y og l no A: Từ mô sẹo nuôi môi trường đặc bổ sung mg/l TDZ B: Từ mô sẹo nuôi môi trường lỏng lắc bổ sung mg/l TDZ Hình 3.3: Phơi lan Hồ Điệp hình thành mơi trường đặc ½VW 39 Đồ án tốt nghiệp ➢ Phương pháp nuôi cấy tạo phôi lan Hồ Điệp từ mô sẹo (Nguyễn Bá Hùng, Hồng Ngọc Trâm, 2005) Phơi vơ tính hình thành nuôi cấy mô sẹo môi trường MS bổ sung NAA 0,5 mg/l + BA mg/l + đường 30 g/l sau 11 tuần nuôi cấy ➢ Tạo phôi thông qua nuôi cấy Protocorm lan Hồ Điệp (Jen Tsung Chen Wei Chin Chang, Đài Loan) H o Jen-Tsung Chen Wei-Chin Chang hai nhà nghiên cứu Lan tiếng C Châu Á Hai ông tiến hành ni cấy Protocorm lan Hồ Điệp mơi trường ½MS hi khơng bổ sung chất điều hịa sinh trưởng Sau 45 ngày nuôi cấy (45NSC), 28,1% M mẫu nuôi cấy hình thành phơi, trung bình mẫu hình thành phôi in h Khi nuôi cấy thử nghiệm Protocorm lan Hồ Điệp môi trường MS bổ ity C sung TDZ (Thidiazuron) (0,45M; 4,54M; 13.62M), hai ông thấy TDZ có ảnh hưởng trực tiếp đến hình thành phơi vơ tính Trong đó, mơi trường bổ sung TDZ ni U nồng độ 13.62M cho hiệu tạo phôi cao nhất: gần 100% mẫu Protocorm hình ve thành phơi (45NSC) Trung bình 13.5 phơi/mẫu cấy… Ngược lại, bổ sung thêm rs NAA (nồng độ 0,54M 57,37M) ức chế tạo phôi ity ➢ Ảnh hưởng nước dừa sucroza lên tăng sinh mô sẹo hình of thành phơi vơ tính lan Hồ Điệp [Phalaenopsis Amabilis (L.) Blume] Te (Dương Tấn Nhựt csv, 2009) Môi trường nuôi cấy bản: môi trường MS có bổ sung mg/l BA, kết hợp ch với 0,5 mg/l NAA, g/l than hoạt tính l no ✓ Sự tăng sinh mô sẹo lan Hồ Điệp y og • Ảnh hưởng nước dừa lên tăng sinh mô sẹo lan Hồ Điệp Trong nước dừa có chứa chất dinh dưỡng như: acid amin, acid hữu cơ, glucoza, fructoza, sucroza số chất điều hòa sinh trưởng biết đến nhiều Zeatin Nước dừa bổ sung vào môi trường nuôi cấy mô sẹo nồng độ 20% (v/v), giúp tăng sinh mô sẹo hiệu nhất: từ 70 mg mô sẹo ban đầu tạo 1286 mg sau tuần nuôi cấy 40 Đồ án tốt nghiệp Khi không bổ sung nước dừa vào môi trường, mô sẹo lan Hồ Điệp tăng sinh chậm, số hóa nâu chết • Ảnh hưởng sucroza lên tăng sinh biệt hóa mơ sẹo lan Hồ Điệp Trong nuôi cấy mô thực vật, bổ sung nguồn cacbon dạng đường vào môi trường, giúp mô tế bào thực vật tổng hợp nên chất hữu cơ, giúp tế bào phân chia tăng sinh khối mà không cần quang hợp H o Trên môi trường có bổ sung 30 g/l sucroza, mơ sẹo có khả tăng sinh tốt C nhất: từ 70 mg mô sẹo ban đầu thu 1455 mg sau tuần nuôi cấy Trọng lượng hi tươi mô sẹo tiếp tục tăng sau 11 tuần, mô sẹo môi trường tơi xốp có màu M vàng sáng, xuất nhiều cụm lông in h Trên môi trường bổ sung 60 g/l sucroza, mô sẹo tăng sinh yếu, nhiều mô sẹo ity C thâm tím hóa đen chết Ngun nhân nồng độ sucroza cao làm tăng áp suất thẩm thấu môi trường ni U ✓ Sự phát sinh phơi vơ tính mơ sẹo lan Hồ Điệp rs Điệp ve • Ảnh hưởng nước dừa lên phát sinh phơi vơ tính mơ sẹo lan Hồ ity Nguồn đạm có ảnh hưởng đặc biệt đến phát sinh phôi, nồng độ đạm of mơi trường giảm, phơi vơ tính hình thành Nguồn đạm thường sử Te dụng nước dừa nước dừa giàu acid amin Trên môi trường bổ sung 40% (v/v) nước dừa, mô sẹo tăng sinh chậm ch không chuyển thành phôi sau 15 tuần nuôi cấy Trên môi trường không bổ sung l no nước dừa, phơi hình thành sau 11 tuần ni cấy Cịn với mơi trường bổ sung 20% y og (v/v) nước dừa phải 15 tuần phơi hình thành • Ảnh hưởng sucroza lên phát sinh phơi vơ tính mơ sẹo lan Hồ Điệp Trên mơi trường khơng bổ sung sucroza tồn mơ sẹo chuyển thành màu xanh hình thành PLB sau tuần nuôi cấy 41 Đồ án tốt nghiệp Trên môi trường chứa 30 g/l sucroza 60 g/l sucroza, mơ sẹo có màu vàng sáng khơng phát sinh hình thái Phải 11 tuần ni cấy số mơ sẹo phía ngồi khối mơ sẹo mơi trường chứa 30 g/l sucroza chuyển màu xanh Trong nhiều trường hợp, sucroza có tác dụng ức chế tổng hợp diệp lục tố mô nuôi cấy 3.2 Các kết nghiên cứu tạo PLB H o ➢ Tái sinh PLB từ mắt ngủ phát hoa lan Hồ Điệp (Nguyễn Thanh C Phong, 2010) hi Sự tái sinh PLB địi hỏi mơi trường ni cấy phải có cytokinin M auxin Mơi trường MS bổ sung Kinetin 2,2 mg/l, IAA mg/l Các cấu trúc tương tự in h PLB hình thành từ mắt ngủ đoạn phát hoa vịng 50 ngày ni cấy ity C ➢ Khảo sát môi trường nhân nhanh PLB lan hồ điệp Mãn Thiên Hồng (Doritaenopsis sp.) (Trần Xn Ngọc Huy, 2010) ni U Trên mơi trường ½MS bổ sung mg/l BA 0,5 mg/l NAA cho kết tăng ve trọng lượng PLB cao Môi trường ½MS bổ sung mg/l BA 0,3 mg/l NAA 3.3 Các kết nghiên cứu tạo chồi ity rs cho kết tạo số lượng PLB nhiều Te vitro (Lê Tấn Thành csv, 2013) of ➢ Xác định mơi trường thích hợp tạo chồi từ PLB lan Hồ Điệp in Môi trường tạo chồi từ PLB thích hợp cho giống lan Hồ Điệp mơi trường ch ½MS có bổ sung 1,5 mg/l kinetin Môi trường cho tỉ lệ tạo chồi cao, chất lượng l no chồi tốt og Như vậy, cytokinin có vai trị quan trọng hình thành phát triển y chồi lan Hồ Điệp 42 Đồ án tốt nghiệp H o C hi Hình 3.4: Chồi hình thành từ PLB lan Hồ Điệp M in ➢ Tái sinh chồi từ mô sẹo: Theo Thomas Davey (1975) (trích dẫn h Trần Văn Minh, 2003) hình thành chồi từ mơ sẹo kích thích bởi: C ity · Các chất điều hịa sinh trưởng đưa vào môi trường · Chất sản sinh nuôi cấy mô sẹo U ni · Các chất có chứa sẵn mẫu ni cấy ve Khả hình thành chồi từ mơ sẹo phụ thuộc vào số lần cấy chuyền mà ity rs chất có mẫu khơng có khả tổng hợp thời gian dài (Gautheret, 1959) hình thành tế bào xốp (Trần Văn Minh, 2003) of ch Te y og l no Hình 3.5: Chồi lan Hồ Điệp tái sinh từ mô sẹo 43 Đồ án tốt nghiệp 3.4 Các kết nghiên cứu tạo hạt nhân tạo ➢ Khảo sát nồng độ sodium alginate đến hình thành hạt nhân tạo (Nguyễn Hoàng Quân, 2007; Lê Tấn Thành csv, 2013) Ở nồng độ 20 g/l vỏ hạt nhân tạo mềm, dễ vỡ, khơng hình thành vỏ hạt rõ ràng Ở nồng độ 30 g/l, 40 g/l, 50 g/l vỏ hạt nhân tạo cứng bọc tồn phơi Trong đó, nồng độ 30 g/l làm cho hạt nhân tạo tròn đẹp H o C hi h in M ity C ity rs ve ni U of Te B: Nồng độ alginate 30 g/l C: Nồng độ alginate 40 g/l D: Nồng độ alginate 50 g/l ch A: Nồng độ alginate 20 g/l og l no Hình 3.6: Hạt nhân tạo lan Hồ Điệp nồng độ alginate y Ở nồng độ alginate 20 g/l 30 g/l, tỉ lệ hạt nhân tạo sống sót nảy mầm cao so với 40 g/l 50 g/l Vậy nên sử dụng nồng độ alginate 30 g/l để tạo hạt nhân tạo, để hạt vừa có hình thái đẹp vừa có tỉ lệ sống sót nảy mầm cao 44 Đồ án tốt nghiệp ➢ Khảo sát ảnh hưởng môi trường dinh dưỡng tạo hạt nhân tạo (Nguyễn Hoàng Quân, 2007; Lê Tấn Thành csv, 2013) Hạt nhân tạo có vỏ bọc mơi trường MS, ½MS có tỉ lệ sống sót cao mơi trường ¼MS 1/8MS Ở mơi trường ½MS tỉ lệ nảy mầm hạt nhân tạo cao (>71%), thích hợp cho việc tạo hạt nhân tạo H o Vậy nên bổ sung môi trường dinh dưỡng ½MS tiến hành tạo hạt nhân tạo C để nâng cao tỉ lệ sống tỉ lệ nảy mầm hạt hi h in M ity C ity rs ve ni U Hình 3.7: Hạt nhân tạo nảy mầm of Te ➢ Khảo sát môi trường bảo quản hạt nhân tạo (Nguyễn Hoàng Quân, 2007; ch Lê Tấn Thành csv, 2013) vỡ ra, không bao phôi y Trong môi trường khô, vỏ hạt bị khô bám chặt vào phôi og l no Trong môi trường lỏng (nước cất nước đường), vỏ hạt bị thẩm thấu mềm Trong môi trường agar agar có đường, hạt bị chuyển sang màu vàng nâu đen Trong môi trường MS, hạt giữ nguyên hình thái ban đầu, màu sắc hình dạng không đổi Hạt nhân tạo sau bảo quản tuần đem cấy nảy mầm môi trường MS 45 Đồ án tốt nghiệp Kết cho thấy hạt nhân tạo bảo quản môi trường MS có tỉ lệ nảy mầm cao Vậy mơi trường MS môi trường tốt cho việc bảo quản hạt nhân tạo Hạt nhân tạo giữ hình dạng, màu sắc ban đầu tỉ lệ nảy mầm hạt cao ➢ Khảo sát môi trường bảo quản hạt nhân tạo lan Phalaenopsis Amabilis H o (Dương Tấn Nhựt, 2007) C Hạt nhân tạo từ PLB chứa 30 g/l sodium alginate vỏ hạt môi hi trường SA (3 g/l Hyponex, ml/l vitamin MS, 30 g/l khoai tây nấu chín) với hàm M lượng khống đa lượng, vi lượng giảm ½ có bổ sung đường Hạt bảo in h quản điều kiện phòng thời gian tháng, hạt có tỉ lệ sống sót 100% ity C Hạt nhân tạo từ mô sẹo chứa 30 g/l sodium alginate vỏ hạt mơi trường SA với hàm lượng khống đa lượng, vi lượng giảm ½ khơng bổ sung ve sống sót 100% ni U đường Hạt dược bảo quản điều kiện phòng thời gian tháng có tỉ lệ rs Thời gian bảo quản hạt nhân tạo lâu có ý nghĩa quan trọng nhân giống ity bảo quản hạt nhân tạo giảm chi phí nhân cơng of ➢ Khảo sát nảy mầm hạt nhân tạo giá thể khác Te (Nguyễn Hoàng Quân, 2007; Lê Tấn Thành csv, 2013) Trên giá thể bơng gịn hạt nhân tạo có tỉ lệ nảy mầm cao (88,63) so với ch cầu giấy (68,64) môi trường MS đặc (53,65) y og l no 46 Đồ án tốt nghiệp PHẦN III: KẾT LUẬN, KIẾN NGHỊ Kết luận quy trình tạo hạt nhân tạo lan Hồ Điệp ✓ Nguồn mẫu làm hạt nhân tạo Theo Dương Tấn Nhựt csv (2007), với nguồn mẫu (mơ sẹo, phơi vơ tính, PLB) phơi vơ tính nguồn mẫu lý tưởng cho tạo hạt nhân tạo đối H o tượng lan Hồ Điệp C Mẫu mơ sẹo: Mơ sẹo tạo từ nuôi cấy nguồn mẫu ban hi đầu từ PLB lan Hồ Điệp Sử dụng mơ sẹo có kích thước đủ lớn, riêng M rẽ khơng bị dính chùm, có màu vàng xanh rắn Việc sử dụng mô sẹo làm mẫu in h có hạn chế như: kích thước q nhỏ, khả dính cụm mơ sẹo cao ity C dẫn đến có nhiều nảy mầm hạt Mẫu phơi vơ tính: Phơi vơ tính tạo từ mơ sẹo lan Hồ Điệp ni U Sử dụng phơi hình tim phơi hình thủy lơi để làm hạt nhân tạo ve Mẫu PLB: Các PLB tạo từ nuôi cấy nguồn mẫu ban đầu rs (đỉnh sinh trưởng, non in vitro… phương pháp vết thương) PLB ity tái sinh từ mô sẹo Tuy nhiên, PLB có nguồn gốc từ mơ sẹo tốt Sử dụng of PLB giai đoạn (giai đoạn chuẩn bị phát sinh chồi) để làm hạt nhân tạo Te ✓ Môi trường tạo vỏ hạt nhân tạo Môi trường sử dụng phổ biến dung dịch sodium alginate Hạt nhân ch tạo có hình dạng đẹp, tỉ lệ sống sót nảy mầm cao nồng độ alginate 30 g/l y og ✓ Môi trường bảo quản hạt nhân tạo l no bổ sung thêm mơi trường dinh dưỡng ½MS Môi trường bảo quản hạt nhân tạo tốt mụi trng MS so vi cỏc mụi trng ẵMS, ẳMS, 1/8MS nước cất (Nguyễn Hoàng Quân, 2007) Theo Dương Tấn Nhựt (2007), hạt nhân tạo từ PLB bảo quản mơi trường SA với hàm lượng khống đa lượng, vi lượng giảm ½, có bổ sung đường điều kiện phòng thời gian tháng, hạt có tỉ lệ sống sót 100% Hạt nhân tạo từ mô sẹo bảo quản môi trường SA với hàm lượng khoáng đa lượng, vi 47 Đồ án tốt nghiệp lượng giảm ½, khơng có đường điều kiện phịng thời gian tháng, hạt có tỉ lệ sống sót 100% ✓ Giá thể cho hạt nhân tạo nảy mầm Trên giá thể bơng gịn hạt nhân tạo có tỉ lệ nảy mầm cao (88,63) so với cầu giấy (68,64) môi trường MS đặc (53,65) Những nhân tố ảnh hưởng đến trình tạo hạt nhân tạo lan Hồ Điệp H o Nguồn mẫu để làm hạt nhân tạo (mô sẹo, phơi vơ tính, PLB) chất lượng tốt, C đồng yếu tố định chất lượng hạt nhân tạo tạo có chất lượng hi cao M Nồng độ chất làm vỏ bọc cho hạt nhân tạo sodium alginate ảnh hưởng trực in h tiếp đến khả tạo vỏ bọc, tỉ lệ sống sót nảy mầm hạt nhân tạo Nồng độ ity C thích hợp khảo sát nồng độ alginate 30 g/l cho hạt nhân tạo vừa có hình thái đẹp vừa có tỉ lệ sống sót nảy mầm cao ni U Do phơi vơ tính khơng có lớp nội nhũ phơi hữu tính nên việc bổ sung ve môi trường dinh dưỡng vào dung dịch chất tạo vỏ hạt nhân tạo giúp nâng cao tỉ lệ rs sống sót tỉ lệ nảy mầm cho hạt nhân tạo Mơi trường tạo vỏ có bổ sung mơi of có tỉ lệ sống sót tỉ lệ nảy mầm cao ity trường dinh dưỡng ½MS mơi trường thích hợp để tạo hạt nhân tạo Te Chất điều hịa sinh trưởng giúp kích thích sinh trưởng nảy mầm phơi, than hoạt tính giúp tăng khả hô hấp giữ lại chất dinh dưỡng ch bổ sung vào mơi trường dùng làm vỏ bọc cho hạt nhân tạo l no Kiến nghị og Thử nghiệm nuôi cấy phát sinh mô sẹo từ nhiều nguồn mẫu khác như: y thân, lá, rễ… lan Hồ Điệp mơi trường, nồng độ chất kích thích sinh trưởng khác nhằm tạo số lượng mô sẹo lớn, chất lượng tốt thời gian ngắn Nuôi cấy tăng sinh mô sẹo môi trường khác với chất kích thích sinh trưởng khác với nồng độ khác để tìm phương pháp 48 Đồ án tốt nghiệp tốt cho mục đích như: tạo nhiều mơ sẹo, mơ sẹo tạo có khả cảm biến tạo phôi soma cho kết tốt Thử nghiệm nuôi cấy mô sẹo môi trường khác với nồng độ TDZ khác bổ sung thêm NAA (như thực chuối, hoa lily…) để tìm phương pháp cảm ứng tạo phơi soma hiệu Thử nghiệm nuôi cấy phát sinh phơi soma từ hệ thống bình ni cấy H o Bioreactor với công nghệ đại tự động hóa cho suất cao C Nghiên cứu tìm mơi trường thích hợp cho hạt nhân tạo nảy mầm Đặc hi biệt, nghiên cứu tạo hạt nhân tạo có khả nảy mầm tốt M gieo trực tiếp đất trồng in h Tiếp tục mở rộng hồn thiện quy trình nhân giống in vitro, phát sinh phôi tế cao ity C soma tạo hạt nhân tạo cho giống Lan hay loại khác có giá trị kinh ity rs ve ni U of ch Te y og l no 49 Đồ án tốt nghiệp TÀI LIỆU THAM KHẢO TIẾNG VIỆT Trần Xuân Ngọc Huy (2010) Nhân nhanh PLB Mãn Thiên Hồng (Doritaenopsis sp.) số hệ thống nuôi cấy khác nhau, Đồ án tốt nghiệp, Đại Học Công Nghệ, tp.HCM H o Lê Văn Hướng (2005) Tạo phôi từ vài quan Phalaenopsis sp nuôi C cấy in vitro, Luận văn thạc sĩ, Đại Học Khoa Học Tự Nhiên, tp.HCM hi Đào Thị Lý (2009) Nghiên cứu ảnh hưởng nồng độ khống đa lượng đến hình M thành phát triển chồi lan Hổ Điệp (Phalaenopsis Yubidan) lan in h Dendrobium Sonia hệ thống nuôi cấy ngập tạm thời TIS (Temporary ity C Immersion System), Đồ án tốt nghiệp, Đại Học Công Nghệ, tp.HCM Dương Tấn Nhựt csv (2007) Tái sinh bảo quản hạt nhân tạo lan ni U Hồ Điệp (Phalaenopsis Amabilis), Tạp chí Cơng nghệ Sinh học, (1), 85 - 95 ve Dương Tấn Nhựt csv (2009) Ảnh hưởng nước dừa sucroza lên tăng rs sinh mơ sẹo hình thành phơi vơ tính loài lan Hồ Điệp [Phalaenopsis ity Amabilis (L.) Blume], tạp chí Sinh Học, 31 (1), 77 - 84 of Liêu Hồng Phú (2005) Nghiên cứu kỹ thuật phát sinh phôi soma tạo hạt nhân Te tạo lan Hồ Điệp (Phalaenopsis sp.), Khóa luận tốt nghiệp, Đại Học Nơng Lâm, tp.HCM ch Nguyễn Hồng Qn (2007) Nghiên cứu kỹ thuật tạo hạt nhân tạo từ phơi l no lan Vanda., Khóa luận tốt nghiệp, Đại Học Nông Lâm, tp.HCM og Lê Tấn Thành, Huỳnh Minh Trí, Phan Hồng Thảo, Trần Quang Khương, Phạm y Minh Tấn, Trần Phan Nhân (2013) Nghiên cứu tạo hạt nhân tạo từ lan Hồ Điệp (Phalaenopsis sp.), Đồ án thực vật, Đại Học Công Nghệ, tp.HCM Ưng Thị Mỹ Tiên (2011) Nhân giống lan Hồ Điệp Phalaenopsis sp kỹ thuật ni cấy ngập chìm tạm thời (TIS - Temporary Immersion System), Khóa luận tốt nghiệp, Đại Học Công Nghệ, tp.HCM 50 Đồ án tốt nghiệp TIẾNG NƯỚC NGOÀI 10 Broly H (1982) Contribution a la multiplication clonale des Orchidées: Phalaenopsis, Paphiopedilum et Cymbidium, Thèse Docteur Inggenieur en Biologie et Physiologie végétale, Université de sciences et techniques de Lille 11 De Vries J.T (1953) On the flowering of Phalaenopsis schilleranna, Rchb Ann Bogor, 1, 61 - 67 H o 12 Grossmann K (1991) Induction of leaf abscission in cotton is a common effect C of urea and adenin type cytokinins, Plant Physiol, 95, 234 - 237 hi 13 Hare, P.D.; Staden, J (1994) Inhibitory effect of TDZ on the activity of M cytokinin oxidase isolated from soybean callus, Plant cell Physiol, 35, 1121 - h in 1125 ity C 14 Hackett W.P et al (1973) Adventitious bud formation on Phalaenopsis nodes as a propagation method, Univ Calif Ext Serv Floer Rep March, - ni U 15 Young So Park, H N Murthy & Paek Kee Yoeup (2000) Mass Multiplication ve of protocorm - like bodies using Bioreactor system and subsequent plant of INTERNET ity rs regeneration in Phalaenopsis, Chungbuk National University, Korea Phương pháp tạo hạt nhân tạo, 7/2014, ch Te 16 Nguyễn Phan Thị Hoàng Kim, Nguyễn Thị Thùy Linh, Phạm Thị Điểm http://vi.scribd.com/doc/167336662/hat-nhan-tao-hc l no 17 Nguyễn Hiền Nhơn Nghiên cứu xác định mơi trường thích hợp nhân PLB og tạo chồi từ PLB giống lan Phalaenopsis amabilis Yubidan phục vụ sản xuất y giống, 7/2014, http://doc.edu.vn/tai-lieu/do-an-nghien-cuu-xac-dinh-moi-truong-thich-hopnhan-plb-va-tao-choi-tu-plb-giong-lan-phalaenopsis-amabilis-yubidan-phuc52384/ 18 TS Dương Tấn Nhựt Ứng dụng công nghệ nuôi cấy mô tế bào thực vật việc nhân nhanh lan Hài lan Hồ Điệp, Phân viện sinh học Đà Lạt, 7/2014, 51 Đồ án tốt nghiệp http://www.lamdong.gov.vn/viVN/a/book/Pages/books/TonghopHoiThaoNam2004/ung%20dung%20cn%20 ncm%20te%20bao%20thuc%20vat%20torng%20viec%20nhan%20nhanh%20 lan%20hai%20va%20hai%20hodiep.htm 19 Nguyễn Thanh Phong Rút ngắn thời gian vi nhân giống lan Hồ Điệp, Trung tâm công nghệ sinh học TP HCM, 7/2014, H o http://www.hcmbiotech.com.vn/technology_detail.php?cateid=3&id=95 C 20 Nguyễn Thị Tân, Nông Kim Ngọc, Phạm Thị Lan Hương, Nông Thị Quỳnh hi Anh, Nguyễn Văn Du Nhân giống vơ tính in vitro, 7/2014, M http://doc.edu.vn/tai-lieu/de-tai-nhan-giong-vo-tinh-invitro-slide-10059/ in h 21 Truy cập tháng 7/2014, 573763.html ity C http://tailieu.vn/doc/chuong-iii-cong-nghe-phoi-vo-tinh-hat-nhan-tao- ni U 22 Truy cập tháng 7/2014, rs 23 Truy cập tháng 7/2014, ve http://vi.wikipedia.org/wiki/Chi_%28sinh_h%E1%BB%8Dc%29 ity http://vi.wikipedia.org/wiki/Th%E1%BB%83_lo%E1%BA%A1i:Chi_Lan_h Te 24 Truy cập tháng 7/2014, of %E1%BB%93_%C4%91i%E1%BB%87p http://www.orchidweb.com/phalaenopsiscare.html ch y og l no 52