Đồ án tốt nghiệp khả năng sử dụng một số vi khuẩn lab phân lập trong khoang miệng ức chế sự tạo thành màng sinh học của lactobacillus fermentum

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP.HỒ CHÍ MINH ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Tà KHẢ NĂNG SỬ DỤNG MỘT SỐ VI KHUẨN LAB PHÂN il u iệ LẬP TRONG KHOANG MIỆNG ỨC CHẾ SỰ TẠO CH TE U H THÀNH MÀNG SINH HỌC CỦA Lactobacillus fermentum Ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Giảng viên hướng dẫn: TS Nguyễn Hoài Hương Sinh viên thực hiện: Nguyễn Đặng Vân Anh MSSV: 1311100138 Lớp: 13DSH02 TP.Hồ Chí Minh, 2017 Đồ án tốt nghiệp LỜI CAM ĐOAN Đồ án tốt nghiệp công trình nghiên cứu tơi hướng dẫn TS Nguyễn Hồi Hương Giảng viên Khoa Cơng Nghệ Sinh Học – Thực Phẩm – Môi trường trường Đại Học Cơng Nghệ Thành Phố Hồ Chí Minh Những kết hồn tồn khơng chép từ nghiên cứu khoa học khác hình thức Các số liệu trích dẫn đồ án hồn tồn trung thực Tơi xin chịu trách nhiệm tồn đồ án Tp.HCM, ngày tháng năm 2017 u iệ il Tà Sinh viên thực Nguyễn Đặng Vân Anh CH TE U H i Đồ án tốt nghiệp LỜI CÁM ƠN Để hoàn thành đồ án “Khả sử dụng số vi khuẩn LAB phân lập khoang miệng ức chế tạo thành màng sinh học Lactobacillus fermentum” suốt trình học tập, rèn luyện trau dồi kiến thức em gặp phải khơng lần khó khăn nhờ có quan tâm, giúp đỡ hướng dẫn tận tình TS Nguyễn Hồi Hương, Giảng viên Khoa Cơng nghệ Sinh học - Thực phẩm Môi trường trường Đại học Công nghệ TPHCM, kiến thức kỹ cần thiết Cơ truyền dạy mà em đạt thành ngày hôm Em xin chân thành cảm ơn Bên cạnh đó, em xin gửi lời cám ơn sâu sắc đến Thầy Cô giảng viên Tà Ban lãnh đạo Khoa Công nghệ Sinh học – Thực phẩm – Môi trường trường Đại học il Công nghệ TPHCM tạo điều kiện giúp em tiếp cận nhiều nguồn tài liệu để iệ u hoàn thành đồ án tốt nghiệp thời gian quy định H Dù đồ án hoàn thành khơng tránh khỏi sai sót định khả TE U hiểu biết hạn hẹp thông tin tài liệu không khả quan để phục vụ q trình thực đồ án Kính mong nhận góp ý dạy Thầy Cơ để em học CH hỏi thêm kinh nghiệm, tích lũy cho trình học tập rèn luyện chuẩn bị hành trang bước sang môi trường làm việc sau Ngoài ra, xin trân trọng gửi lời cảm ơn đến ba mẹ, gia đình, người bên tạo điều kiện tốt cho trình thực đồ án tốt nghiệp Em xin chân thành cảm ơn! TP.HCM, ngày tháng năm 2017 Sinh viên thực Nguyễn Đặng Vân Anh ii Đồ án tốt nghiệp MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN .i LỜI CÁM ƠN ii MỤC LỤC iii PHỤ LỤC THÀNH PHẦN MÔI TRƯỜNG v DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT ii DANH MỤC BẢNG iii DANH MỤC HÌNH ẢNH iv MỞ ĐẦU Tính cấp thiết đề tài Tình hình nghiên cứu Mục tiêu nghiên cứu Nhiệm vụ nghiên cứu Phương pháp nghiên cứu Các kết đạt Kết cấu đồ án u iệ il Tà CH TE U H CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan vi khuẩn Lactic (LAB) 1.2 Tổng quan Probiotic 19 1.3 Màng sinh học 31 1.4 Sâu 37 CHƯƠNG II: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 44 2.1 Địa điểm nghiên cứu 44 2.2 Thời gian thực 44 2.3 Vật liệu thiết bị 44 2.4 Phương pháp luận 45 2.5 Phương pháp thí nghiệm 47 iii Đồ án tốt nghiệp CHƯƠNG III: KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN 64 3.1 Kết thử nghiệm sinh lý 64 3.2 Kết thử nghiệm sinh hóa 67 3.3 Kết khả sinh enzyme 71 3.4 Kết khả kháng khuẩn 75 3.5 Kết khả kháng kháng sinh 77 3.6 Kết khảo sát khả ức chế màng sinh học vi khuẩn lactic sau qua xử lý nhiệt 81 CHƯƠNG IV: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 84 Kết luận 84 Kiến nghị 84 il Tà TÀI LIỆU THAM KHẢO 85 iệ u PHỤ LỤC XỬ LÝ SỐ LIỆU 94 CH TE U H iv Đồ án tốt nghiệp PHỤ LỤC THÀNH PHẦN MÔI TRƯỜNG  Thành phần môi trường de Man, Rogosa, Sharpe agar (MRS agar):  Tween 80 1ml  MgSO4.7H2O 0.2g  Cao thịt 10g  MgSO4.4H2O 0.2g  Pepton 5g  K2PO4 2g  Yest Extract 5g  Nước cất 1000ml  D-glucose 10g  Agar 2%  Diamonium Citrate 2g Tà  Điều chỉnh pH = 6.5 ± 0.2 25oC  Thành phần môi trường de Man, Rogosa, Sharpe broth (MRS broth): il 1ml  Diamonium Citrate 2g  Cao thịt 10g  MgSO4.7H2O 0.2g  Pepton 5g  MgSO4.4H2O 0.2g  Yest Extract 5g  K2PO4 2g  D-glucose 10g  Nước cất 1000ml u iệ  Tween 80 CH TE U H  Điều chỉnh pH = 6.5 ± 0.2 25oC  Thành phần nước muối sinh lí:  NaCl 9g  Nước cất 1000ml  Thành phần môi trường Glucose Phosphate broth (MR – VP broth):  Peptone 7g  Dextrose 5g  K2HPO4 5g  Nước cất 1000ml v Đồ án tốt nghiệp  Thành phần môi trường Simmon citrate agar (SCA)  MgSO4.7H2O 0,2g  NH4H2PO4 1g  K2HPO4 1g  Na3C6H5O7 2g  NaCl 5g  Bromothymol blue 0,08g  Agar 15g  Nước cất 1000ml Tà  Điều chỉnh pH = 6.8 ± 0.2 25oC  Thành phần môi trường canh tryptone: il 10g iệ  Tryptone 5g  Nước cất 1000ml u  NaCl U H TE  Điều chỉnh pH = 7.5 ± 0.2 25oC  Cao thịt 3g  Peptone CH  Thành phần môi trường Triple sugar iron agar (TSI):  NaCl 5g 20g  Na2S2O3 0,3g  Yeast extract 3g  Phenol red 0,024g  Lactose 10g  Agar 15g  Sucrose 10g  Nước cất 1000ml  Dextrose 1g  Điều chỉnh pH = 7.0 ± 0.2  FeSO4 0,2g 25oC ii Đồ án tốt nghiệp  Thành phần môi trường Blood agar:  Beef heart infusion 500g  Tryptose 10g  NaCl 5g  Agar 15g  Máu cừu 50ml  Nước cất 950ml  Điều chỉnh pH = 7.3 ± 0.2 25oC  Thành phần môi trường Skim milk agar:  Bột sữa gầy 28g Tà  Casein enzymic hydrolysate 2,5g u iệ  Dextrose il  Cao nấm men 5g 1g H  Agar U 15g TE  Điều chỉnh pH = 7.0 ± 0.2 25oC  Peptone 5g  Cao nấm men CH  Thành phần môi trường Lactobacillus biofilm medium (LBM):  CH3COONa.H2O 2,5g 2,5g  MgSO4 0,05g  K2HPO4 3g  MnSO4 0,025g  (NH4)3C6H5O7 1g  CaCl2 0,1g  Dextrose 10g  Nước cất 1000ml  Cao thịt 5g  Tween 80 0,5g  Điều chỉnh pH = 7.0 ± 0.2 25oC ii Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT LAB Lactic acid bacteria /Lactobacillales MRS de Man, Rogosa and Sharpe SCA Simmon citrate agar SAS Statistical Analysis Systems TSI Triple sugar iron TN Thí nghiệm VK Vi khuẩn VSV Vi sinh vật u iệ il Tà CH TE U H ii Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC BẢNG Bảng Tổng hợp nghiên cứu khảo sát số chủng probiotic việc bảo vệ miệng Bảng 1.1 Đặc điểm sinh lý số chủng vi khuẩn lactic 11 Bảng 1.2 Khả đối kháng sản phẩm biến dưỡng vi khuẩn LAB 19 Bảng 2.1 Phân loại khả kháng kháng sinh dựa vào đường kính vịng kháng 62 Bảng 3.1 Kết thử nghiệm sinh lý 64 Bảng 3.2 Kết thử nghiệm sinh hóa 67 Bảng 3.3 Kết thử nghiệm lên men carbohydrate 69 Tà Bảng 3.4 Kết khả sinh enzyme chủng lactic 71 il Bảng 3.5 Tỉ lệ kháng khuẩn chủng lactic (%) 76 iệ u Bảng 3.6 Kết kháng kháng sinh chủng lactic 77 U H Bảng 3.7 Kết ức chế khả tạo màng sinh học vi khuẩn lactic sau xử lý nhiệt 82 CH TE iii Đồ án tốt nghiệp UC CHE 1B O 0DO The ANOVA Procedure Duncan's Multiple Range Test for InhibitionAbility Note: This test controls the Type I comparisonwise error rate, not the experimentwise error rate Alpha 0.05 Error Degrees of Freedom 18 Error Mean Square Number of Means Critical Range 114.8551 18.38 19.29 19.86 20.26 20.54 20.76 20.93 21.06 Means with the same letter are not significantly different Tà Duncan Grouping il A Mean N NBG 23B1 32.900 21B2 iệ 35.659 A u B A H B C B C TE B C 14.149 7B2 11.871 21R2 0.000 16B 0.000 23B2 0.000 26R1 0.000 8R2 U B 14.260 CH C C 8B C C C C C C C C 103 Đồ án tốt nghiệp Ức chế 1B 800C UC CHE 1B O 80DO The ANOVA Procedure Class Level Information Class Levels Values NBG 16B 21B2 21R2 23B1 23B2 26R1 7B2 8B 8R2 Number of Observations Read 27 Number of Observations Used 27 UC CHE 1B O 80DO The ANOVA Procedure Dependent Variable: InhibitionAbility Source DF Sum of Squares Mean Square F Value Pr > F 1851.200732 231.400092 18 869.677465 48.315415 Tà Model Error il Corrected Total 26 4.79 0.0028 2720.878197 u iệ R-Square Coeff Var Root MSE InhibitionAbility Mean H 0.680369 DF 1851.200732 231.400092 CH Anova SS Mean Square F Value Pr > F TE NBG 5.025828 U Source 138.3042 6.950929 UC CHE 1B O 80DO 4.79 0.0028 The ANOVA Procedure Duncan's Multiple Range Test for InhibitionAbility Note: This test controls the Type I comparisonwise error rate, not the experimentwise error rate Alpha 0.05 Error Degrees of Freedom 18 Error Mean Square Number of Means Critical Range 48.31541 11.92 12.51 12.88 13.14 13.32 13.47 13.58 13.66 104 Đồ án tốt nghiệp Means with the same letter are not significantly different Duncan Grouping Mean N NBG A 26.282 21B2 B 11.482 8B B B 3.834 21R2 2.317 7B2 1.318 23B1 0.000 16B 0.000 23B2 0.000 26R1 B B B B Tà B B il B U H B u B iệ B TE B B 0.000 8R2 CH Ức chế 1B 1000C UC CHE 1B O 100DO The ANOVA Procedure Class Level Information Class NBG Levels Values 16B 21B2 21R2 23B1 23B2 26R1 7B2 8B 8R2 Number of Observations Read 27 Number of Observations Used 27 105 Đồ án tốt nghiệp UC CHE 1B O 100DO The ANOVA Procedure Dependent Variable: InhibitionAbility Source DF Sum of Squares Mean Square F Value Pr > F Model 93.5157741 11.6894718 Error 18 195.2819830 10.8489991 Corrected Total 26 288.7977571 1.08 0.4207 R-Square Coeff Var Root MSE InhibitionAbility Mean 0.323811 Source NBG 238.1836 3.293782 DF 1.382875 Anova SS Mean Square F Value 93.51577407 11.68947176 1.08 Pr > F 0.4207 UC CHE 1B O 100DO Alpha u iệ il Tà The ANOVA Procedure Duncan's Multiple Range Test for InhibitionAbility Note: This test controls the Type I comparisonwise error rate, not the experimentwise error rate 0.05 H Error Degrees of Freedom U Error Mean Square CH Critical Range 10.849 TE Number of Means 18 5.650 5.928 6.104 6.225 6.314 6.381 6.433 6.474 Means with the same letter are not significantly different Duncan Grouping A Mean N NBG 4.978 26R1 4.396 8B 1.918 23B2 0.695 8R2 0.300 21B2 A A A A A A A A 106 Đồ án tốt nghiệp Means with the same letter are not significantly different Duncan Grouping Mean N NBG 0.158 16B 0.000 21R2 0.000 23B1 0.000 7B2 A A A A A A A A Ức chế 12R2 00C The ANOVA Procedure il Tà UC CHE 12R2 O 0DO Class Level Information iệ Class Levels Values u NBG 16B 21B2 21R2 23B1 23B2 26R1 7B2 8B 8R2 H TE U Number of Observations Read Number of Observations Used 27 CH UC CHE 12R2 O 0DO 27 The ANOVA Procedure Dependent Variable: InhibitionAbility Source DF Sum of Squares Mean Square Model 7.66898483 0.95862310 Error 18 17.89930657 0.99440592 Corrected Total 26 25.56829140 F Value Pr > F 0.96 0.4927 R-Square Coeff Var Root MSE InhibitionAbility Mean 0.299941 Source NBG 272.5161 0.997199 DF Anova SS 7.66898483 0.365923 Mean Square F Value 0.95862310 107 0.96 Pr > F 0.4927 Đồ án tốt nghiệp UC CHE 12R2 O 0DO The ANOVA Procedure Duncan's Multiple Range Test for InhibitionAbility Note: This test controls the Type I comparisonwise error rate, not the experimentwise error rate Alpha 0.05 Error Degrees of Freedom 18 Error Mean Square Number of Means Critical Range 0.994406 1.711 1.795 1.848 1.885 1.912 1.932 1.948 1.960 Means with the same letter are not significantly different Tà Duncan Grouping A 0.9677 23B1 0.9171 8B 0.0000 16B 0.0000 21R2 0.0000 23B2 0.0000 7B2 0.0000 26R1 0.0000 8R2 CH A 21B2 TE A A A N NBG 1.4085 U A H A u A iệ il A Mean A A A A A A A A 108 Đồ án tốt nghiệp Ức chế 12R2 800C UC CHE 12R2 O 80DO The ANOVA Procedure Class Level Information Class Levels Values NBG 16B 21B2 21R2 23B1 23B2 26R1 7B2 8B 8R2 Number of Observations Read 27 Number of Observations Used 27 UC CHE 12R2 O 80DO The ANOVA Procedure Dependent Variable: InhibitionAbility Source DF Sum of Squares Mean Square F Value Pr > F 70.3853638 8.7981705 Error 18 78.9899259 4.3883292 26 149.3752897 Tà Model Corrected Total 2.00 0.1051 iệ il R-Square Coeff Var Root MSE InhibitionAbility Mean u 0.471198 366.9740 2.094834 0.570840 DF Anova SS 70.38536383 8.79817048 2.00 0.1051 CH UC CHE 12R2 O 80DO Mean Square F Value Pr > F TE NBG U H Source The ANOVA Procedure Duncan's Multiple Range Test for InhibitionAbility Note: This test controls the Type I comparisonwise error rate, not the experimentwise error rate Alpha 0.05 Error Degrees of Freedom 18 Error Mean Square Number of Means Critical Range 4.388329 3.593 3.770 3.882 3.959 4.016 4.059 4.092 4.117 109 Đồ án tốt nghiệp Means with the same letter are not significantly different Duncan Grouping Mean N NBG A 5.138 8B B 0.000 16B 0.000 21R2 0.000 21B2 0.000 23B2 0.000 26R1 0.000 7B2 0.000 23B1 B B B B B B Tà B B il B U H B u B iệ B TE B B 0.000 8R2 CH Ức chế 12R2 1000C UC CHE 12R2 O 100DO The ANOVA Procedure Class Level Information Class Levels Values NBG 16B 21B2 21R2 23B1 23B2 26R1 7B2 8B 8R2 Number of Observations Read 27 Number of Observations Used 27 110 Đồ án tốt nghiệp UC CHE 12R2 O 100DO The ANOVA Procedure Dependent Variable: InhibitionAbility Source DF Sum of Squares Mean Square F Value Pr > F Model 727.633897 90.954237 Error 18 637.074597 35.393033 Corrected Total 26 1364.708495 2.57 0.0459 R-Square Coeff Var Root MSE InhibitionAbility Mean 0.533179 Source NBG DF 2.550202 Anova SS Mean Square F Value 727.6338972 90.9542371 2.57 Pr > F 0.0459 Tà UC CHE 12R2 O 100DO 233.2837 5.949204 0.05 H Alpha u iệ il The ANOVA Procedure Duncan's Multiple Range Test for InhibitionAbility Note: This test controls the Type I comparisonwise error rate, not the experimentwise error rate U Error Degrees of Freedom Number of Means Critical Range 35.39303 CH TE Error Mean Square 18 10.20 10.71 11.02 11.24 11.40 11.53 11.62 11.69 Means with the same letter are not significantly different Duncan Grouping A Mean N NBG 16.117 26R1 6.414 23B2 0.421 16B 0.000 23B1 A B A B B B B B 111 Đồ án tốt nghiệp Means with the same letter are not significantly different Duncan Grouping B Mean N NBG 0.000 21R2 0.000 21B2 0.000 7B2 0.000 8B 0.000 8R2 B B B B B B B B il UC CHE 30B2 O 0DO Tà Ức chế 30B2 00C The ANOVA Procedure iệ Class Level Information u Class Levels Values H NBG 16B 21B2 21R2 23B1 23B2 26R1 7B2 8B 8R2 TE U 27 Number of Observations Used 27 CH Number of Observations Read UC CHE 30B2 O 0DO The ANOVA Procedure Dependent Variable: InhibitionAbility Source DF Sum of Squares Mean Square F Value Pr > F Model 16738.71301 2092.33913 Error 18 4458.11878 247.67327 Corrected Total 26 21196.83179 8.45 F 2092.33913 112 8.45 F Model 10561.68298 1320.21037 Error 18 985.01321 54.72296 Corrected Total 26 11546.69619 24.13 F 10561.68298 1320.21037 24.13