(Luận văn) phân lập và tuyển chọn một số chủng nấm trichoderma có hoạt tính kháng nấm từ đất trồng cây hoa màu tại tỉnh thái nguyên

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM ĐÀM THỊ THU GIANG Tên đề tài: PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN MỘT SỐ CHỦNG NẤM TRICHODERMA CĨ HOẠT TÍNH KHÁNG NẤM TỪ ĐẤT TRỒNG CÂY HOA MÀU TẠI TỈNH THÁI NGUYÊN n a lu va n KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC p ie gh tn to : CNSH Khoa : CNSH - CNTP : 2013 – 2017 lu Ngành an d oa nl w Hệ đào tạo : Chính quy ll fu n va Khóa học m tz n oi z @ om l.c gm Thái Nguyên – năm 2017 ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM ĐÀM THỊ THU GIANG Tên đề tài: PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN MỘT SỐ CHỦNG NẤM TRICHODERMA CĨ HOẠT TÍNH KHÁNG NẤM TỪ ĐẤT TRỒNG CÂY HOA MÀU TẠI TỈNH THÁI NGUYÊN a lu n KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC n va p ie gh tn to : Chính quy Ngành : CNSH d oa nl w Hệ đào tạo Lớp : K45 - Công nghệ Sinh học lu : CNSH - CNTP n va an Khoa : 2013 – 2017 Khóa học ll fu m Ngƣời hƣớng dẫn : ThS Bùi Đình Lãm tz n oi z om l.c gm @ Thái Nguyên – năm 2017 i LỜI CẢM ƠN Được sự đ ồng ý Khoa CNSH-CNTP, Trường Đại học Nông lâm Thái Ngun Em được thực tập phịng thí nghiệm Khoa CNSHCNTP, Trường Đại học Nông lâm Thái Nguyên với đề tài : “Phân lập tuyển chọn số chủng nấm Trichoderma có hoạt tính kháng nấm từ đất trồng hoa màu tỉnh Thái Nguyên” Để hoàn thành khóa luận này ngoài sự nỗ lực thân em nhận được nhiều sự giúp đỡ Ban giám hiệu trường, Ban chủ nhiệm khoa CNSH-CNTP, thầy giáo tận tình giảng dạy em suốt năm Đại học Trước hết em xin gửi lời cảm ơn tới Ban giám hiê ̣u nhà trường , Ban chủ nhiệm khoa CNSH-CNTP thầ y cô giáo Khoa đã ta ̣o điề u kiê ̣n thuâ ̣n lơ ̣i cho em hoàn thành đề tài nghiên cứu này Đặc biệt, em xin bày tỏ lịng kính t rọng, lịng biế t ơn sâu sắ c tới ThS a lu n Bùi Đình Lãm giảng viên khoa CNSH-CNTP Người đã tâ ̣n tiǹ h chỉ bảo , giúp n va đỡ và hướng dẫn em suốt trình thực hiê ̣n đề tài tn to Em xin gửi lời cảm ơn tới gia đình, bạn bè, người thân đã quan tâm ủng gh hộ và là chỗ dựa tinh thần cho em suốt thời gian thực tập , cảm ơn p ie bạn bè hết lòng động viên, giúp đỡ em suố t thời gian qua nl w Do điều kiện thời gian có ̣n , trình độ và kỹ thân cịn d oa nhiề u ̣n chế nên đề tài khó tránh khỏi những thi ếu sót Kính mong thầy n va an hồn thiện lu giáo bạn sinh viên đóng góp ý kiến xây dựng để đề tài em được ll fu Em xin chân thành cảm ơn! m Thái Nguyên, ngày 04 tháng 06 năm 2017 n oi Sinh viên tz z Đàm Thị Thu Giang om l.c gm @ ii DANH MỤC CÁC BẢNG Trang Bảng 3.1: Thành phần môi trường PGA 24 Bảng 3.2: Thành phần môi trường nhân sinh khối Trichoderma [5] 25 Bảng 3.3: Các thiết bị sử dụng nghiên cứu 25 Bảng 3.4: Các trang thiết bị máy móc dùng thí nghiệm 26 Bảng 3.5 Trình tự mồi ITS4 ITS5 31 Bảng 3.6 Thành phần phản ứng PCR liều lượng dùng cho phản ứng 31 Bảng 3.7 Chu trình nhiệt phản ứng PCR 32 Bảng 4.1 Kết phân lập mẫu đất 36 Bảng 4.2 Đặc điểm hình thái chủng phân lập được 39 Bảng 4.3 Hoạt tính đối kháng Trichoderma Fusarium môi trường PGA 41 a lu n Bảng 4.4 Hoạt tính đối kháng Trichoderma Phytophthora môi va n trường PGA 44 p ie gh tn to d oa nl w ll fu n va an lu m tz n oi z om l.c gm @ 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.2237.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.66 iii DANH MỤC HÌNH Trang Hình 2.1 Đặc điểm hình thái nấm Trichoderma Hình 2.2 Bào tử nấm Trichoderma Hình 3.1: Các bước tạo chế phẩm nấm đối kháng Trichoderma 35 Hình 4.1 Nấm mốc phân lập môi trường PGA chủng C1 chủng C2 37 Hình 4.2 Hình thái nấm Trichoderma mơi trường PGA 38 Hình 4.3 Hình ảnh cấy trải chủng C1, chủng C2 chủng C3 39 Hình 4.4 Hình thái khuẩn lạc (A) hình thái tế bào (B), (C) chủng C1 39 Hình 4.5 Hình thái khuẩn lạc (A) hình thái tế bào (B) chủng C2 40 Hình 4.6 Đối kháng Trichoderma chủng C1 (A), C2 (B), C3 (C) với Fusarium đối chứng (D) Fusarium sau ngày cấy 42 Hình 4.7 Đối kháng Trichoderma chủng C1 (A), C2 (B), C3 (C) với a lu n Fusarium đối chứng (D) Fusarium sau ngày cấy 42 n va Hình 4.8 Đối kháng Trichoderma chủng C1 (A) với Fusarium đối chứng tn to (B) Fusarium sau ngày cấy 43 p ie gh Hình 4.9 Đối kháng Trichoderma chủng C1 với Phytophthroza (a) và đối chứng Phytophthroza (b) 45 nl w Hình 4.10 Kết tách chiết DNA tổng số 46 d oa Hình 4.11 Kết điện di gel agarose 47 an lu Hình 4.12 Kết tinh sản phẩm PCR 47 Hình 4.13 Kết so sánh trình tự gen sản phẩm PCR BLAST với mồi n va với mồi ITS4-ITS5 từ mẫu đất (từ Xã Quyết Thắng TP Thái ll fu m Nguyên, Tỉnh Thái Nguyên) 48 tz n oi Hình 4.14 Hình ảnh chế phẩm nấm đối kháng Trichoderma 50 z gm @ 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.99 om l.c 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.2237.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.66 iv DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT Tên đầy đủ Ký hiệu µg Microgram µl Microlit dNTP Deoxyribonucleotide triphosphate DNA Deoxyribonucleotide acid EDTA Ethylene diamin tetracetic acid PCR CTAB Cetyl Trimethyl Ammonium Bromide RNA Ribonucleic acid Taq Thermus aquaticus 10 TAE Tris-Acetate- EDTA 11 TE Tris- EDTA 12 ĐC Đối chứng n a lu STT Polymerase chain reaction n va p ie gh tn to d oa nl w ll fu n va an lu m tz n oi z gm @ 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.99 om l.c 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.2237.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.66 v MỤC LỤC Trang LỜI CẢM ƠN i DANH MỤC CÁC BẢNG ii DANH MỤC HÌNH iii DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT iv MỤC LỤC v PHẦN I MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề 1.2 Mục đích đề tài 1.3.Yêu cầu đề tài 1.4 Ý nghĩa đề tài 1.4.1 Ý nghĩa khoa học a lu n 1.4.2 Ý nghĩa thực tiễn va PHẦN TỔNG QUAN TÀI LIỆU n tn to 2.1 Đại cương về Trichoderma p ie gh 2.2 Đặc điểm cấu tạo, hình thái tế bào nấm 2.2.1 Cấu tạo nl w 2.2.2 Đặc điểm hình thái d oa 2.2.3 Đặc điểm sinh lý, sinh hóa nấm Trichoderma lu 2.3 Phân loại nấm Trichoderma n va an 2.4 Khả kiểm soát sinh học Trichoderma 2.4.1 Tương tác với nấm bệnh ll fu m 2.4.2 Cơ chế cạnh tranh dinh dưỡng với nấm bệnh 11 n oi 2.5 Nấm Trichoderma với khả tạo chế phẩm đối kháng 11 tz 2.5.1 Đất kháng nấm 12 z 2.5.2 Thiết lập quần thể tượng mầm đất 12 gm @ 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.99 om l.c 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.2237.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.66 vi 2.5.3 Thiết lập quần thể vùng rễ 12 2.6 Cơ chế hoạt động Trichoderma 13 2.6.1 Khả phịng trừ nấm Trichoderma lồi nấm gây bệnh trồng 14 2.6.2 Hiện tượng giao thoa 15 2.6.3 Hoạt động tiết enzyme 15 2.6.3.1 Hệ enzyme thủy phân chitin 15 2.6.3.2 Hệ enzyme thủy phân celluose 16 2.7 Các dạng thuốc chế phẩm Trichoderma trừ nấm bệnh 17 2.8 Tình hình nghiên cứu ứng dụng Trichoderma 18 PHẦN ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 24 3.1 Đối tượng, vật liệu phạm vi nghiên cứu 24 3.1.1 Đối tượng 24 a lu n 3.1.2 Vật liệu hóa chất, thiết bị dụng cụ nghiên cứu 24 n va 3.1.2.1 Môi trường cần thiết trình nghiên cứu 24 tn to 3.1.2.2 Thiết bị, máy móc, dụng cụ hóa chất dùng phịng thí nghiệm 25 gh 3.1.3 Phạm vi nghiên cứu 26 p ie 3.2 Địa điểm thời gian nghiên cứu 26 nl w 3.2.1 Địa điểm thu thập phân tích mẫu 26 d oa 3.2.2 Thời gian 26 lu 3.3 Nội dung nghiên cứu 26 n va an 3.4 Các phương pháp tiến hành thí nghiệm 27 3.4.1 Phương pháp thu thập mẫu đất 27 ll fu m 3.4.2 Phương pháp phân lập nấm Trichoderma 27 n oi 3.4.3 Phương pháp xác định hình thái tế bào, hình thái khuẩn lạc 28 tz 3.4.4 Phương pháp thử hoạt tính đối kháng Trichoderma 28 z 3.4.5 Phương pháp định danh nấm Trichoderma sinh học phân tử 29 gm @ 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.99 om l.c 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.2237.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.66 vii 3.4.5.1 Nhân thu sinh khối Trichoderma 29 3.4.5.2 Tách chiết DNA tổng số Trichoderma 30 3.4.5.3 Phản ứng PCR 31 3.4.5.4 Điện di kiểm tra sản phẩm PCR 32 3.4.5.5 Phương pháp tinh sản phẩm PCR 33 3.6 Phương pháp tạo chế phẩm nấm đối kháng 34 PHẦN KẾT QỦA VÀ THẢO LUẬN 36 4.1 Kết phân lập chủng nấm Trichoderma 36 4.2 Kết nghiên cứu đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa nấm Trichoderma 37 4.3 Kết thử hoạt tính đối kháng nấm Trichoderma 41 4.3.1 Kết khả ký sinh nấm Trichoderma nấm Fusarium gây bệnh vàng thối rễ 41 a lu n 4.3.2 Kết khả ký sinh nấm Trichoderma nấm Phytophthora n va gấy bệnh thối gốc 44 tn to 4.4 Kết Định danh 45 p ie gh 4.4.1 Kết tách chiết DNA tổng số Trichoderma 45 4.4.2 Kết PCR 46 nl w 4.4.3 Kết giải trình tự gen 47 d oa 4.5 Bước đầu sản xuất chế phẩm nấm đối kháng 49 an lu PHẦN KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 51 5.1 Kết luận 51 n va 5.2 Kiến nghị 51 ll fu m TÀI LIỆU THAM KHẢO 52 tz n oi z gm @ 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.99 om l.c 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.2237.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.66 PHẦN I MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề Cây hoa màu như: rau, lạc, đậu, lúa… loại trờng có giá trị kinh tế cao được phát triển quy mô lớn nhiều nơi giới có Việt Nam Là nguồn nguyên liệu cần thiết cho ngành sản xuất lương thực, thực phẩm , đồng thời tăng cường bảo vệ môi trường sinh thái, cải thiện kinh tế xã hội, tạo công ăn việc làm ổn định cho người dân nước, đặc biệt vùng miền núi Với lợi về đất đai và khí hậu, Thái Nguyên là vùng phát triển nhiều loại hoa màu Tuy nhiên loại lại mẫn cảm với bệnh nấm Ở đây, người dân tập trung đầu tư, thâm canh cao, lượng phân bón, hóa chất bảo vệ thực vật hàng năm sử dụng nhiều Trong việc áp dụng a lu n kỹ thuật tiến về công nghệ sinh học công nghệ vi sinh n va trồng trọt hạn chế tn to Trong những năm gần Việt Nam có cơng trình nghiên cứu gh sử dụng nấm đối kháng Trichoderma phòng trừ bệnh hại p ie trờng Tuy nhiên lồi nấm Trichoderma phát huy được hiểu nl w số môi trường định Thái Nguyên chủ yếu là đất đồi, chứa lồi d oa nấm Trichoderma địa có khả đối kháng cao với loài nấm gây lu bệnh, dễ phân lập n va an Nấm Trichoderma diện gần tất loại đất và số môi trường sống khác Chúng là loại nấm được nuôi cấy thông dụng ll fu m nhất, diện với mật độ cao và phát triển mạnh vùng rễ cây, số n oi giống có khả phát triển rễ Ngoài sự hình thành khuẩn lạc tz rễ, nấm Trichoderma cịn cơng, ký sinh và lấy chất dinh dưỡng từ loài z nấm khác Bởi nơi Trichoderma phát triển tốt là nơi có nhiều rễ khỏe gm @ 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.99 om l.c 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.2237.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.66 41 4.3 Kết thử hoạt tính đối kháng nấm Trichoderma 4.3.1 Kết khả ký sinh nấm Trichoderma nấm Fusarium gây bệnh vàng thối rễ Sử dụng chủng nấm Trichoderma được phân lập, cấy đối xứng môi trường PGA, theo dõi sự phát triển sợi nấm sau nuôi cấy 3,6,9 ngày, kết trình bày bảng 4.3 Bảng 4.3 Hoạt tính đối kháng Trichoderma Fusarium mơi trƣờng PGA Đƣờng kính tản nấm (cm) ngày Chủng Trichod Fusa rma rium 2,4 9,1 1,1 7,5 2,5 9,0 1,3 2,7 6,6 2,5 8,4 1,5 4,1 3,1 6,7 2,9 8,2 1,6 C5 5,0 3,0 7,0 2,8 8,8 1,4 C6 2,0 6,0 2,2 8,1 1,4 C7 4,0 2,0 6,2 2,4 7,8 2,0 C8 4,0 an 6,9 2,3 8,0 2,0 C9 3,4 2,1 6,3 2,5 8,2 1,6 C10 4,6 2,2 7,4 2,3 8,5 1,7 C11 3,8 2,6 n oi rma rium 5,8 2,8 7,8 C2 5,0 3,0 C3 4,2 Trichode Fusa Đ/c nl w C1 Trichde Fusa Đ/c gh rium ngày 2,8 7,9 1,8 Đ/c n a lu erma ngày n va tn to C4 p ie 3,0 2,8 d oa lu 2,5 ll fu n va m 6,4 tz z gm @ 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.99 om l.c 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.2237.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.66 42 Trong thí nghiệm nấm bệnh (Fusarium) nấm Trichoderma được cấy chung đĩa petri Nếu Trichoderma có hoạt tính đối kháng với nấm bệnh sự phát triển nấm bệnh bị hạn chế, thể qua đường kính khuẩn lạc nấm Đường kính khuẩn lạc nấm bệnh phát triển thời gian cấy chung với Trichoderma Kết cho thấy Trichoderma có khả đối kháng cao với nấm bệnh Fusarium , thể qua đường kính khuẩn lạc nấm bệnh Fusarium nhỏ dần, không tăng lên A B C D n a lu n va Fusarium đối chứng (D) Fusarium sau ngày cấy p ie gh tn to Hình 4.6 Đối kháng Trichoderma chủng C1 (A), C2 (B), C3 (C) với Sau ngày cấy, nấm bệnh Fusarium nấm Trichoderma phát triển tốt B C D ll fu n va an lu A d oa nl w chậm, bào tử Trchoderma mọc chậm (hình 4.6) m n oi Hình 4.7 Đối kháng Trichoderma chủng C1 (A), C2 (B), C3 (C) với tz z Fusarium đối chứng (D) Fusarium sau ngày cấy gm @ 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.99 om l.c 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.2237.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.66 43 Sau ngày cấy, thấy dấu hiệu sự ức chế nấm bệnh Fusarium chế phẩm Trichoderma Nấm bệnh phát triển chậm lại, tơ nấm co lại, chế phẩm mọc nhiều (hình 4.7) A B Hình 4.8 Đối kháng Trichoderma chủng C1 (A) với Fusarium đối chứng a lu n (B) Fusarium sau ngày cấy n va Sau ngày nuôi cấy, nấm bệnh không phát triển nữa, tơ nấm lụi tn to dần So với đối chứng đường kính khuẩn lạc nấm bệnh Fusarium nhỏ dần, gh khơng tăng lên, kìm hãm được sự phát triển nấm bệnh, tiêu diệt p ie chúng chất kháng sinh enzyme, thưa dần, lại sự phát triển d oa nl w nấm Trichoderma (hình 4.8) ll fu n va an lu m tz n oi z gm @ 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.99 om l.c 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.2237.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.66 44 4.3.2 Kết khả ký sinh nấm Trichoderma nấm Phytophthora gấy bệnh thối gốc Bảng 4.4 Hoạt tính đối kháng Trichoderma Phytophthora môi trƣờng PGA Đƣờng kính tản nấm (cm) Chủng Tricho Phyto derma phthroza C1 5,0 2,6 7,8 C2 4,9 3,0 C3 4,2 C4 ngày Phyto derma phthroza 2,4 9,1 1,1 7,5 2,6 8,9 1,4 2,8 6,6 2,5 8,4 1,2 4,1 3,0 6,7 2,9 8,2 1,6 C5 4,5 3,2 7,2 2,7 8,8 1,4 C6 4,0 2,2 6,0 2,2 8,1 1,4 C7 4,3 2,3 6,2 2,4 7,8 2,0 C8 4,0 2,6 6,9 2,3 8,0 2,0 C9 3,4 2,4 6,3 2,5 8,2 1,6 C10 3,6 2,2 7,4 2,3 8,5 1,7 C11 3.8 2,7 6,4 2,8 7,9 1,8 2,5 Phyto phthroza Đ/c 5,4 n a lu Tricho Đ/c Trichoderma n va p ie gh tn to d oa nl w ll fu n va an lu m tz n oi z gm @ 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.99 Đ/c 7,6 om l.c 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.2237.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.66 45 a b Hình 4.9 Đối kháng Trichoderma chủng C1 với Phytophthroza (a) đối chứng Phytophthroza (b) Nấm Phytophthroza phát triển nhanh mọc phần thạch mà a lu Trichoderma khơng mọc Sau Phytophthroza bị Trichoderma vây kín n n va ký sinh làm nấm bệnh thu nhỏ lại, thưa dần, tơ nấm lụi dần, cuối bị gh tn to tiêu diệt Ở công thức đối chứng, nấm bệnh sinh trưởng phát triển tốt sau p ie ngày đạt đường kính tối đa Hiệu ức chế dòng nấm Trichoderma nấm bệnh cao d oa nl w Một số dịng nấm Trichoderma cịn có khả sinh chất kháng sinh bay có khả tiêu diệt nấm bệnh, khơng có sự tiếp xúc trực an lu tiếp với nhau.Qua thí nghiệm cạnh tranh với Fusarium Phytophthoza ta n va thấy 11 chủng phân lập được chủng C1 chủng C2 (chủng lấy m 4.4 Kết Định danh ll fu từ viện Bảo vệ Thực vật) có hoạt tính đối kháng cao n oi 4.4.1 Kết tách chiết DNA tổng số Trichoderma tz Một khó khăn gặp phải tách chiết DNA từ nấm mốc là thành tế z bào nấm mốc tương đối dày, việc phá hủy thành tế bào gm @ 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.99 om l.c 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.2237.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.66 46 enzyme thường cho hiệu suất tách chiết DNA thấp Mặt khác, tế bào nấm mốc nhiều Polysaccharide, polysaccharide kết tủa DNA trình tách chiết và ảnh hưởng đến phản ứng PCR được thực về sau Do lựa chọn sử dụng phương pháp CTAB kết hợp sóng siêu âm để phá vỡ thành tế bào Saghai maroof, 1984 (Jame.C, 2008) [18] n a lu n va tn to Hình 4.10 Kết tách chiết DNA tổng số p ie gh Giếng 1: Chủng C1 (mẫu đất Xã Quyết Thắng, TP Thái Nguyên), Giếng 2: Chủng C2 (Viện bảo vệ Thực vật) nl w Kết DNA tổng số thu được nhìn chung loại được hoàn toàn RNA, d oa band rõ nét, gọn DNA tổng số đạt chất lượng nồng độ tốt để thực an lu cho thí nghiệm 4.4.2 Kết PCR n va Dựa vào thang ladder cho thấy qui trình PCR khuếch đại vùng ITS – ll fu m rDNA với cặp primer ITS4/ ITS5 cho kết thể điện di gel n oi agarose % 110V, 400A 20 phút, có kích thước khoảng 600bp Mẫu xuất band mong muốn hoàn toàn khơng có band phụ tz z gm @ 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.99 om l.c 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.2237.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.66 47 Hình 4.11 Kết điện di gel agarose Giếng 1: Chủng C1 (mẫu đất Xã Quyết Thắng, TP Thái Nguyên), Giếng (chủng T5 phân lập từ đất trồng công nghiệp) n a lu n va gh tn to 600bp p ie d oa nl w an lu Hình 4.12 Kết tinh sản phẩm PCR n va Giếng 1: Chủng C1 (mẫu đất Xã Quyết Thắng, TP Thái Nguyên), Giếng ll fu (chủng T5 phân lập từ đất trồng cơng nghiệp) m 4.4.3 Kết giải trình tự gen n oi Sản phẩm PCR sau được tinh được gửi giải trình tự z sau: tz chiều hãng First Base Singapore và được thu được kết gm @ 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.99 om l.c 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.2237.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.66 48 CGTTGGTGAACCAGCGGAGGGATCATTACCGAGTTTACAACT CCCAAACCCAATGTGAACGTTACCAAACTGTTGCCTCGGCGGGGTC ACGCCCCGGGTGCGTCGCAGCCCCGGAACCAGGCGCCCGCCGGAGG AACCAACCAAACTCTTTCTGTAGTCCCCTCGCGGACGTATTTCTTTA CAGCTCTGAGCAAAAATTCAAAATGAATCAAAACTTTCAACAACGG ATCTCTTGGTTCTGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAA GTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGC ACATTGCGCCCGCCAGTATTCTGGCGGGCATGCCTGTCCGAGCGTCA TTTCAACCCTCGAACCCCTCCGGGGGATCGGCGTTGGGGATCGGGA CCCCTCACACGGGTGCCGGCCCCTAAATACAGTGGCGGTCTCGCCG CAGCCTCTCCTGCGCAGTAGTTTGCACAACTCGCACCGGGAGCGCG GCGCGTCCACGTCCGTAAAACACCCAACTTTCTGAAATGTTGACCTC GGATCAGGTAGGAATACCCGCTGAACTTAAGCATA Từ kết giải trình tự gen thu được tiến hành so sánh Blast a lu n NCBI, kết được thể hình 4.13 n va p ie gh tn to d oa nl w an lu n va Hình 4.13 Kết so sánh trình tự gen sản phẩm PCR BLAST với ll fu mồi với mồi ITS4-ITS5 từ mẫu đất (từ Xã Quyết Thắng m TP Thái Nguyên, Tỉnh Thái Nguyên) n oi Dựa vào độ tương đồng di truyền 99% đến 100% so với lồi tz NCBI, khẳng định là chủng Trichoderma asperellum Trichoderma z asperellum vài lồi Trichoderma có hoạt tính đối kháng mạnh gm @ 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.99 om l.c 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.2237.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.66 49 với nhiều loài nấm đất gây bệnh Pythium, Phytophthora, Sclerotinia, Sclerotium, Thielaviopsis basicola, Rhizoctonia, Verticillium Mức độ an tồn chúng thuộc nhóm 1, khơng gây độc cho người gia súc, không gây ô nhiễm môi trường Nấm Trichoderma asperellum có chế đối kháng gờm ký sinh trực tiếp, tiết enzyme phân hủy vách tế bào nấm gây bệnh, cải thiện chất lượng đất hình thành số hợp chất có khả cảm ứng tạo tính kháng tập nhiễm hệ thống 4.5 Bƣớc đầu sản xuất chế phẩm nấm đối kháng Chủng nấm Trichoderma sau định danh được sử dụng để nghiên cứu tạo chế phẩm nấm đối kháng Quy trình tạo chế phẩm Nấm đối kháng Trichoderma được để cập phần vật liệu và phương pháp nghiên cứu: Chủng nấm Trichoderma được cấy môi trường PGA sau 6-8 ngày được trộn với thóc được khử trùng nhiệt độ 121ºC 20 phút, nuôi a lu n điều kiện ánh sáng xen kẽ 12 sáng 12 tối nhiệt độ phòng n va vòng 15 ngày Kết bước đầu tạo chế phẩm nấm đối kháng Trichoderma gh tn to được thể hình 4.14 Thơng qua hình 4.14 ta thấy nấm Trichoderma sinh trưởng phát p ie triển tốt chất thóc bền màu đặc trưng Trichoderma sau d oa nl w tháng nghiên cứu ll fu n va an lu m tz n oi z gm @ 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.99 om l.c 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.2237.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.66 50 Hình 4.14 Hình ảnh chế phẩm nấm đối kháng Trichoderma n a lu n va p ie gh tn to d oa nl w ll fu n va an lu m tz n oi z gm @ 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.99 om l.c 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.2237.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.66 51 PHẦN KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 5.1 Kết luận Đã phân lập được 11 chủng, tuyển chọn được chủng Trichoderma có hiệu đối kháng cao với nấm gây bệnh Fusarium Phytophthora Nấm Trichoderma phát triển mơi trường PGA có khuẩn lạc lúc đầu màu trắng hoặc lục trắng sau chuyển sang màu xanh đậm hoặc xanh lục, tế bào hình cầu hoặc hình trứng, màu xanh lục hoặc xanh trắng đính sợi nấm Từ 11 chủng trên, thu được chủng có hoạt tính đối kháng mạnh là chủng C1 và chủng C2 (trong chủng C2 là Viện Bảo vệ Thực vật) Các chủng này được sử dụng để tạo chế phẩm nấm đối kháng a lu n Đã định danh được chủng C1 là Trichoderma asperellum với mức độ n va tương đồng lên đến 99-100% tn to Bước đầu tạo được chế phẩm nấm đối kháng sử dụng chất là thóc p ie gh khử trùng 5.2 Kiến nghị nl w Tiếp tục phân lập và tuyển chọn chủng Trichoderma có hoạt tính d oa kháng nấm bệnh những vùng sinh thái khác lu Kiểm tra khả đối kháng Chủng Trichoderma asperellum C1 n va an số loại nấm bệnh khác Đánh giá ngoài đồng ruộng khả diệt nấm bệnh chế phẩm ll fu m nấm Trichoderma tạo tz n oi z gm @ 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.99 om l.c 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.2237.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.66 52 TÀI LIỆU THAM KHẢO I Tiếng Việt Tô Minh Châu, Vương Thị Việt Hoa, Vũ Thị Lâm An, Lâm Thanh Hiền, Nguyễn Thị Ngọc Diệp, Nguyễn Thúy Hương (1999), Vi sinh vật học đại cương, NXB Đại học Nông Lâm Tp Hờ Chí Minh Đỗ Thu Hà (2004), Nghiên cứu xạ khuẩn sinh chất kháng sinh chống nấm phân lập từ đất Quảng Nam-Đà Nẵng, Luận án tiến sĩ Khoa Học, ĐHSP Hà Nội Trần Thu Hà, Phạm Thanh Hòa (2012), “Khả đối kháng nấm Trichoderma với nấm bệnh hại trồng Scleroitum rolfsii điều kiện invitro”, Tạp chí khoa học, Đại học Huế, tập 75A, số 6, (2012) Hoàng Thị Thu Hoài (2013), Phân lập tuyển chọn số chủng nấm sợi có hoạt tính kháng khuẩn từ đất quận Cái Răng, thành phố Cần Thơ, n a lu Khoa Sư Phạm, ĐH Cần Thơ n va Bùi Đình Lãm (2009), Nghiên cứu phân lập chủng Aspergillus Flavus Trường ĐH Bách khoa Hà Nội gh tn to không sinh độc tố nhằm tạo chế phẩm nấm đối kháng, Luận văn Thạc sĩ, p ie Hứa Võ Thành Long (2010), Sản xuất bào tử nấm Trichoderma spp Làm thuốc trừ nấm bệnh trồng Khóa luận cử nhân khoa Môi trường và d oa nl w CNSH, Đại học Kỹ thuật công nghệ TP.HCM Nguyễn Xuân Thành (2003), Giáo trình cơng nghệ vi sinh vật sản n va Hà Nội an lu xuất nông nghiệp xử lý ô nhiễm môi trường Nhà xuất Nông nghiệp ll fu Nguyễn Thị Thuần (1998), “Hiệu đối kháng nấm Trichoderma đối m với nấm gây bệnh hại trờng” Tạp chí Bảo vệ Thực vật 4: 35-38 n oi Nguyễn Thị Thuần (1999), “Phương pháp sản xuất và sử dụng nấm tz Trichoderma để phịng trừ bệnh hại trờng” Tạp chí Bảo vệ Thực vật 4: z gm @ 33-34 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.99 om l.c 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.2237.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.66 53 10 Trần Thị Thuần, Nguyễn Thị Ly, Phạm Ngọc Dung (2004), “Nghiên cứu và sử dụng nấm đối kháng Trichoderma để phịng trừ nhóm nấm tờn đất gây hại trờng”, Tạp chí bảo vệ thực vật 11 Trần Thị Thúy (2013), Nghiên cứu tuyển chọn và sản xuấ t chế phẩm đơn dòng nấm đối kháng Trichoderma phòng trừ tác nhân gây bệnh thối đen ca cao, Khoa môi trường, ĐH Khoa học Tự nhiên (Luận văn Thạc sĩ) 12 Trần Thị Thanh Tuyền (2004), Khảo sát trình đối kháng nấm gây bệnh nấm mốc Trichoderma harzianum, khóa luận cử nhân khoa học ngành công nghệ sinh học, Đại học Khoa học Tự nhiên, Tp HCM II Tiếng Anh 13.Clipson N., Landy E., Otte M (2001), European register of marine species: a check-list of the marine species in Europe and a bibliography of guides to their identification Collection Patrimoines Naturels, 50, 15-19 n a lu n va p ie gh tn to 14.Gary E Harman (2000), Trichoderma spp., including T harzianum, T viride, T koningii, T hamatum and other spp Deuteromycetes, Moniliales (asexual classification system) Cornel University, Geneve, NY 14456 http://www.nysaes.cornell.edu/ent/biocontrol/pathogens/trichoderma.html d oa nl w 15.Gary J Samuels (2004), Trichoderma a guide to identification and biology Unit States Deparment of Agriculture Agricultural Research service Systermatic Botany and Mycology Laboratory 304, B-011A Beltsville, MD 20705-2350, USA Blackwell Science,Ltd25 lu ll fu n va an 16.Gary J Samuels (9-2005), Trichoderma: Systematic, the Sexual State, and Ecology United States Department of Agriculture Agricultural Research Service Systematic Botany and Mycology Laboratory 304, B011A Beltsville, MD 20705 Acepted for publication m n oi tz 17.James c (2008) “ Global status of commercialized biotech/ GM Crop”, ISAAA Brief No, 37, International Service for the Acquisition of AgriBiotech application, Ithaca, NY, USA z gm @ 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.99 om l.c 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.2237.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.66 54 18.Prasun K Mukherjee and Kanthadai Raghu (1997), Effect of temperature on antagonistic and biocontrol pontential of Trichoderma sp on Sclerotium rolfsii Mycopathologia 139: 151-155 19.Siu-Wai Chiu Morphogenesis & David Moore (2001) Deciphering Fungal Website: http://ihome.cuhk.edu.hk/~b456741/jpeg/chitin.jpg 20 Turner D., Kovacs W., Kuhls K., Lieckfeldt E., Peter B., Arisan-Atac I., Strauss, J., Samuels G.J., Börner T., Kubicek C.P (1997), Biogeography and phenotypic variation in Trichoderma sect Longibrachiatum and associated Hypocrea species Mycol Res, 101:449-459 21.White T.J., Bruns T.M, Lee S and Taylor J (1989), Genetics and Evolution (part three) Amplication and direct sequencing of fungal ribosomal RNA genes for Phylogenetics pp.315 – 320 n a lu n va 22 White T.J., Bruns T., Lee S and Taylor J (1990), Amplification and direct sequencing of fungal ribosomal RNA genes for phylogenetics In: M.A., Innis et al (Eds) PCR Protocols A guide to Methods and Applications Academic Press, San Diego, pp 315-322 p ie gh tn to d oa nl w ll fu n va an lu m tz n oi z gm @ 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.99 om l.c 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.2237.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.66 37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.99