Định lượng đồng thời glutathion và acid alpha lipoic trong thực phẩm chức năng dạng viên nén và viên nang bằng phương pháp sắc ký lỏng với đầu dò dãy diod quang và đầu dò khối phổ

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH TƠ TRẦN BẢO NGỌC ĐỊNH LƯỢNG ĐỒNG THỜI GLUTATHION VÀ ACID ALPHA-LIPOIC TRONG THỰC PHẨM CHỨC NĂNG DẠNG VIÊN NÉN VÀ VIÊN NANG BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG VỚI ĐẦU DÒ DÃY DIOD QUANG VÀ ĐẦU DÒ KHỐI PHỔ LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH, NĂM 2022 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH TƠ TRẦN BẢO NGỌC ĐỊNH LƯỢNG ĐỒNG THỜI GLUTATHION VÀ ACID ALPHA-LIPOIC TRONG THỰC PHẨM CHỨC NĂNG DẠNG VIÊN NÉN VÀ VIÊN NANG BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG VỚI ĐẦU DÒ DÃY DIOD QUANG VÀ ĐẦU DÒ KHỐI PHỔ CHUYÊN NGÀNH: KIỂM NGHIỆM THUỐC VÀ ĐỘC CHẤT MÃ SỐ: 8720210 LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC GIẢNG VIÊN HƯỚNG DẪN: TS NGUYỄN THỊ NGỌC DUNG THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH, NĂM 2022 LỜI CAM ĐOAN Tơi xin cam đoan danh dự cơng trình nghiên cứu khoa học mình, kết nghiên cứu thực trình bày luận văn trung thực, khách quan tôn trọng tác giả cơng trình nghiên cứu sử dụng đề tài Đề tài nghiên cứu không thử nghiệm, không gây tổn hại cho người động vật Tuân thủ quy định đề ra, không gian lận, ngụy tạo số liệu, không sử dụng ý tưởng kết nghiên cứu người khác Công khai minh bạch nội dung kết nghiên cứu Tác giả luận văn Tô Trần Bảo Ngọc Luận văn thạc sĩ Dược học 2020-2022 ĐỊNH LƯỢNG ĐỒNG THỜI GLUTATHION VÀ ACID ALPHALIPOIC TRONG THỰC PHẨM CHỨC NĂNG DẠNG VIÊN NÉN VÀ VIÊN NANG BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG VỚI ĐẦU DÒ DÃY DIOD QUANG VÀ ĐẦU DÒ KHỐI PHỔ Tô Trần Bảo Ngọc Giảng viên hướng dẫn: TS Nguyễn Thị Ngọc Dung Đặt vấn đề: Glutathion (GSH) acid alpha-lipoic (ALA) hai thành phần làm trắng da chống lão hóa chính, phổ biến sản phẩm làm đẹp Việc phát triển quy trình định lượng đồng thời hai hoạt chất chế phẩm cần thiết Đối tượng phương pháp: Đối tượng nghiên cứu: GSH ALA thực phẩm chức dạng viên nén viên nang Phương pháp nghiên cứu: Xây dựng thẩm định quy trình định lượng đồng thời GSH ALA phương pháp HPLC-PDA HPLC-MS Kết quả: Đã xác định điều kiện sắc ký tối ưu cho phương pháp HPLC-PDA; điều kiện khối phổ tối ưu, điều kiện sắc ký chuẩn nội cho phương pháp HPLC-MS Cả hai quy trình có tính đặc hiệu, đạt độ xác (RSD ≤ 2%), đạt độ với tỷ lệ thu hồi từ 98 – 102 % (RSD ≤ 2%) Với phương pháp HPLC-PDA, khoảng tuyến tính GSH từ 100 – 600 µg/mL (r = 0,9998), ALA từ 10 – 100 µg/mL (r = 0,9995) Với phương pháp HPLC-MS, khoảng tuyến tính GSH từ 30 – 350 µg/mL (r = 0,9997), ALA từ – 35 µg/mL (r = 0,9997) Đã ứng dụng quy trình để xác định GSH ALA chế phẩm viên nén viên nang thị trường Kết hàm lượng GSH ALA xác định từ hai quy trình khác khơng có ý nghĩa thống kê Kết luận: Đã xây dựng thẩm định thành công quy trình định lượng đồng thời GSH ALA phương pháp HPLC-PDA HPLC-MS thực phẩm chức dạng viên nén viên nang Từ khóa: HPLC, PDA, MS, glutathion, acid alpha-lipoic, thực phẩm chức Master's Thesis in Pharmacology 2020-2022 SIMULTANEOUS QUANTIFICATION OF GLUTATHION AND ALPHA-LIPOIC ACID IN FUNCTIONAL FOODS ON TABLETS AND CAPSULES BY LIQUID CHROMATOGRAPHY WITH PHOTO DIODE ARRAY DETECTOR AND MASS SPECTROMETRY To Tran Bao Ngoc Supervisor: Dr Nguyen Thi Ngoc Dung Introduction: Glutathion (GSH) and alpha-lipoic acid (ALA) are two major skin-whitening and anti-aging ingredients that are popular in beauty products It is necessary to develop a procedure for simultaneous quantification of of these two compounds in a preparation Objects and methods: Objects: GSH and ALA in functional foods in form of tablets and capsules Methods: Developing and validating a process for simultaneous quantification of GSH and ALA by HPLC-PDA and HPLC-MS methods Results: The optimal chromatographic conditions for HPLC-PDA method; the optimal mass spectrometry parameters, the chromatographic conditions and the internal standard for HPLC-MS method were determined Both procedures were proved to have selectivity, high precision (RSD  2%), and high accuracy with a recovery rate of 98 – 102% (RSD  2%) With the HPLC-PDA method, the linear range of GSH was from 100 to 600 µg/mL (r = 0,998), ALA from 10 to 100 µg/mL (r = 0,9995) With the HPLC-MS method, the linear range of GSH is from 30 to 350 µg/mL (r = 0,9997), ALA is from to 35 µg/mL (r = 0,9997) The process has been applied to determine GSH and ALA in several commercially preparations available on the market The contents of GSH and ALA determined by HPLC-PDA and HPLC-MS methods are considered to be statistically non-significant Conclusion: Two procedures for simultaneous quantification of GSH and ALA in functional foods in form of tablets and capsules by HPLC-PDA and HPLC-MS methods was successfully etablished and validated Keywords: HPLC, PDA, MS, glutathion, alpha-lipoic acide, functional foods LỜI CẢM ƠN Trong sống người, muốn thành cơng dù hay nhiều, trực tiếp hay gián tiếp cần có giúp đỡ người xung quanh Đối với em, việc hoàn thành luận văn thạc sĩ Khoa Dược Đại học Y Dược thành công lớn Và để đạt em điều đó, em nhận nhiều giúp đỡ Trước hết, em xin gửi lời cảm ơn chân thành sâu sắc đến cô TS Nguyễn Thị Ngọc Dung tận tình hướng dẫn em suốt q trình thực đề tài Cơ ln nhiệt tình dạy kiến thức, chia sẻ kinh nghiệm nghiên cứu quý báu an ủi em gặp khó khăn Em chân thành cảm ơn Q Thầy Cơ mơn Phân tích – Kiểm nghiệm Quý anh chị Trung tâm Khoa học Công Nghệ Dược Sài Gòn hỗ trợ tạo điều kiện thuận lợi cho em trình học tập thực nghiên cứu Em xin gửi lời biết ơn đến Hội đồng phản biện, thầy PGS TS Trương Ngọc Tuyền cô TS Lê Thị Thu Cúc dành thời gian đọc, phản biện đóng góp ý kiến để đề tài em hoàn thiện Cảm ơn bạn Phạm Lê Ngọc Yến hỗ trợ, giúp đỡ, động viên vượt qua khó khăn chia sẻ kiến thức bổ ích Cảm ơn bạn Bùi Từ Kh ln đồng hành mình, đến phần nhờ bạn ln cạnh bên suốt nhiều năm qua Cảm ơn em Nguyễn Ái Vy, em Nguyễn Thanh Thy em Thân Thị Thùy Trang hỗ trợ chị suốt thời gian nghiên cứu đề tài Cuối cùng, xin cảm ơn mẹ, người ni nấng, dạy bảo, hết lịng u thương ủng hộ cho suốt năm học tập để có ngày hơm Trân trọng! MỤC LỤC Trang LỜI CAM ĐOAN LỜI CẢM ƠN DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT i DANH MỤC BẢNG iii DANH MỤC HÌNH v MỞ ĐẦU CHƯƠNG TỔNG QUAN 1.1 Glutathion 1.2 Acid alpha-lipoic 1.3 Chuẩn nội N-acetylcystein 10 1.4 Tổng quan cơng trình nghiên cứu 11 CHƯƠNG ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 15 2.1 Đối tượng nghiên cứu 15 2.2 Hóa chất, dung mơi, trang thiết bị 15 2.3 Phương pháp nghiên cứu 17 CHƯƠNG KẾT QUẢ 29 3.1 Khảo sát quy trình định lượng đồng thời glutathion acid alpha-lipoic phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao đầu dò dãy diod quang 29 3.2 Thẩm định quy trình định lượng đồng thời glutathion acid alpha-lipoic phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao đầu dò dãy diod quang 37 3.3 Khảo sát quy trình định lượng đồng thời glutathion acid alpha-lipoic phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao đầu dò khối phổ 52 3.4 Thẩm định quy trình định lượng đồng thời glutathion acid alpha-lipoic phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao đầu dò khối phổ 58 3.5 Ứng dụng quy trình số mẫu thực phẩm chức phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao đầu dò dãy diod quang đầu dò khối phổ 73 CHƯƠNG BÀN LUẬN 77 4.1 Giá trị khoa học đề tài 77 4.2 Đối với quy trình định lượng glutathion acid alpha-lipoic phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao đầu dò dãy diod quang 77 4.3 Đối với quy trình định lượng glutathion acid alpha-lipoic phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao đầu dò khối phổ 79 CHƯƠNG KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 83 5.1 Kết luận 83 5.2 Kiến nghị 83 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh Kết thẩm định tính tuyến tính Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh GSH SUMMARY OUTPUT Regression Statistics Multiple R 0.9997 R Square 0.999322 Adjusted R Square 0.999096 Standard Error 0.013087 Observations ANOVA df Regression Residual Total Intercept X Variable 1 SS MS F 0.757055 0.757055 4420.571571 0.000514 0.000171 0.757569 Coefficients 0.216 0.003 Standard Error t Stat P-value 0.009634 22.44163 0.00019374 5.1E-05 66.48738 7.49721E-06 Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Significance F 7.5E-06 Lower 95% 0.185541 0.00323 Upper 95% 0.24686 0.003554 Lower 95.0% 0.185541 0.00323 Upper 95.0% 0.24686 0.003554 Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh ALA SUMMARY OUTPUT Regression Statistics Multiple R 0.9997 R Square 0.999356 Adjusted R Square 0.999141 Standard Error 0.005395 Observations ANOVA df Regression Residual Total Intercept X Variable 1 SS MS F 0.135384 0.135384 4651.772245 8.73E-05 2.91E-05 0.135471 Coefficients 0.004 0.014 Standard Error t Stat P-value 0.003971 1.064941 0.36501128 0.00021 68.2039 6.94556E-06 Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Significance F 6.95E-06 Lower 95% -0.00841 0.013675 Upper 95% 0.016868 0.015013 Lower 95.0% -0.00841 0.013675 Upper 95.0% 0.016868 0.015013 Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh Kết thẩm định độ xác (viên nén) Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh GSH Anova: Single Factor SUMMARY Groups D1 D2 Count Sum Average Variance 546.3292 91.05487 0.252137 547.3617 91.22695 0.531638 ANOVA Source of Variation Between Groups Within Groups SS 0.088834 3.918873 Total 4.007706 df MS F P-value F crit 0.088834 0.226682 0.644226 4.964603 10 0.391887 11 ALA Anova: Single Factor SUMMARY Groups Count D1 D2 ANOVA Source of Variation Within Groups SS 0.87426 4.68578 Total 5.56004 Between Groups Sum 571.214 567.975 df 10 Average Variance 95.2023 0.47658 7 94.6625 0.46057 MS 0.87426 0.46857 11 Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn F 1.86577 P-value 0.20189 F crit 4.96460 Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh Phụ lục 5: Kết ứng dụng hai phương pháp Kết ứng dụng phương pháp PDA Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh Kết ứng dụng phương pháp MS Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh GSH SUMMARY Groups MS PDA Count Sum Average Variance 458.5359 91.70718 26.05495 460.7665 92.1533 23.77427 ANOVA Source of Variation Between Groups SS 0.497546 Within Groups 199.3169 24.91461 Total 199.8144 df MS 0.497546 F P-value F crit 0.01997 0.891114 5.317655 ALA Anova: Single Factor SUMMARY Groups MS PDA ANOVA Source of Variation Between Groups Within Groups Total Count Sum Average Variance 456.558 91.3116 1322.288 456.0912 91.21824 1330.356 SS 0.021791 10610.58 10610.6 df MS 0.021791 1326.322 Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn F P-value F crit 1.64E-05 0.996865 5.317655