0306 sàng lọc và nghiên cứu ảnh hưởng của đột biến điểm trên peptide tín hiệu đến khả năng tiết α amylase tái tổ hợp trong bacillus subtilis luận văn tốt n

VIỆNHÀNLÂMKHOAHỌC VÀCÔNGNGHỆVIỆTNAM VIỆNCÔNGNGHỆSINHHỌC NGUYỄNTHỊ ĐÀ LUẬNÁNTIẾNSĨ SINHHỌC SÀNG LỌC VÀ NGHIÊN CỨU ẢNH HƢỞNG CỦAĐỘTBIẾNĐIỂMTRÊNPEPTIDETÍN HIỆUĐẾNKHẢ NĂNGTIẾTα–AMYLASEAMYLASETÁI TỔHỢPTRONG BACILLUSSUBTILIS HàNội,2017 NGUYỄNTHỊ ĐÀ SÀNG LỌC VÀ NGHIÊN CỨU ẢNH HƢỞNG CỦAĐỘTBIẾNĐIỂMTRÊNPEPTIDETÍNHIỆUĐẾNKH Ả NĂNG TIẾT α –AMYLASE AMYLASE TÁI TỔ HỢP TRONGBACILLUSSUBTILIS Chuyênngành:Vi sinhvậthọc Mãsố:62 42 0107 LUẬNÁNTIẾNSĨ SINHHỌC Ngƣờihƣớngdẫnkhoahọc: PGS.TS.Trần ĐìnhMấn Viện Côngnghệsinhhọc Lờicảmơn Trƣớc tiên, xin gửi lời biết ơn chân thành sâu sắc tới PGS.TS TrầnĐình Mấn, Phịng Cơng nghệ vật liệu sinh học, Viện Công nghệ sinh học, Viện Hànlâm KH&CN Việt Nam tận tình hƣớng dẫn giúp đỡ tơi suốt q trìnhnghiêncứu Tơi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới TS.Nguyễn Kim Thoa toàn thể anhchị bạn đồng nghiệp phịng Cơng nghệ vật liệu sinh học động viên, giúp đỡvàtạođiềukiệnthuậnlợichotơitrongsuốtqtrìnhnghiêncứuđềtàinày Tơi xin trân trọng gửi lời cảm ơn tới Ban lãnh đạo Viện công nghệ sinh học,các anh chị phòng Vi sinh vật đất, phịng Cơng nghệ lên men, Trung tâm bảo tànggiống, phịng Vi sinh phân tử ThS Bùi Thị Hải Hà giúp đỡ, hợp tác tạo mọiđiềukiệnthuậnlợiđểtơihồnthànhluậnánnày Đây cơng trình đƣợc thực nhờ hỗ trợ kinh phí đề tài “Nghiên cứusản xuất enzyme-amylase bền nhiệt tái tổ hợp ứng dụng công nghiệpamylase bền nhiệt tái tổ hợp ứng dụng công nghiệp dệt”thuộc Đề án Phát triển Ứng dụng CNSH công nghiệp chế biến, Mã số:CNSHCB/2010-5 đề tài cán trẻ Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ ViệtNam:“Nghiên cứu ảnh hưởng trình tự peptide tín hiệu lên khả tiết -amylase bền nhiệt tái tổ hợp ứng dụng công nghiệp amylazangoạibào Bacillus” Cuối cùng, vơ biết ơn gia đình bạn bè, ngƣời bên tôi,quan tâm, động viên, tạo điều kiện giúp đỡ tơi lúc khó khăn nhấttrong suốt thời gian học tập nghiên cứu để tơi hồn thành nhiệm vụ đƣợcgiao HàNội,ngày1 t h n g n ă m 20 18 NCS.NguyễnThịĐà Lời camđoan Tôixincamđoan: Đây công trình nghiên cứu tơi số kết cộng tác với cáccộngsự khác; Các số liệu kết trình bày luận án trung thực, phần đƣợccơngbốtrêncáctạpchíkhoahọcchunngànhvớisựđồngývàchophépcủacácđồngtácgiả; Phầncịnlạichƣađƣợcaicơngbốtrongbấtkỳcơngtrìnhnàokhác HàNội,ngày1 t h n g n ă m 2018 Tácgiả NCS.NguyễnThịĐà MỤCLỤC DANHMỤCCÁCKÝHIỆUVÀCHỮVIẾTTẮT vii DANHMỤCBẢNG ix DANHMỤCHÌNH xi MỞĐẦU CHƢƠNG1.TỔNGQUANTÀI LIỆU 1.1 QUÁTRÌNHTIẾTPROTEIN ỞT Ế BÀOVISINHVẬT 1.1.1 Quátrìnhtiếtprotein ởtếbàoEucaryotes 1.1.2 Quátrìnhtiếtprotein ởE.coli .3 1.1.3 QuátrìnhtiếtproteintrongBacillus 1.1.4 EnzymephâncắtpeptidetínhiệucủaSec/P 16 1.2 HỆBIỂUHIỆNPROTEINTÁITỔHỢPỞVISINHVẬT 18 1.2.1 VaitrịcủaBacillustrongcơngnghiệpsảnxuấtenzyme 18 1.2.2 HệthốngbiểuhiệnởBacillus .20 1.2.3 ĐặcđiểmditruyềncủaBacillussubtilis 20 1.2.4 HệbiểuhiệnởE.colivàvisinhvậtkhác 21 1.3 CÁC YẾUTỐLIÊNQUANĐẾN BIỂU HIỆNGEN ỞBacillus subtilis 22 1.3.1 Lựachọnpromoter 23 1.3.2 CácvectorbiểuhiệnởBacillussubtilis .24 1.3.3 Chọntrìnhtự peptidetínhiệu 25 1.3.4 Đột biếnpeptidetínhiệu 25 1.3.5 Sửdụngchủng chủđãđƣợc cải biếndi truyền 28 1.4 α-AMYLASE 29 1.4.1 Cấu trúccủaα –amylase 29 1.4.2 α-AmylasetừBacillus 30 1.4.3 α-Amylasetừ cácvisinhvậtkhác .32 1.4.4 α-Amylasetáitổhợptrongvisinhvật 35 CHƢƠNG2.VẬTLIỆUVÀPHƢƠNGPHÁP 38 2.1 CHỦNGVISINHVẬTVÀPLASMID .38 2.1.1 Cácchủngdại 38 2.1.2 Chủngchủdùngtrongnghiêncứu 38 2.1.3 Plasmid 39 2.2 MÔI TRƢỜNGNUÔICẤYVÀCÁCCHẤTBỔSUNG 40 2.2.1 Môi trƣờngnuôi cấy .40 2.2.2 Chất bổsung 40 2.3 HÓACHẤTVÀTHIẾTBỊ 41 2.3.1 Thiết bị 41 2.3.2 HóachấtvàKit 41 2.4 CÁC PHƢƠNGPHÁPNGHIÊNCỨU 42 2.4.1 Phânlậpchủng 42 2.4.2 Phƣơngphápxácđịnhhoạttínhα –amylase 42 2.4.3 Phƣơngpháp xácđịnhhàmlƣợngproteinhòatantheoLowry .43 2.4.4 Phƣơngphápthu amylasetrongtếbào .43 2.4.5 Phƣơngphápphânloạichủngchọn lọc 44 2.4.6 PhƣơngpháptáchchiếtDNA 44 2.4.7 Biến nạpDNAplasmidvàochủngchủ .46 2.4.8 KỹthuậtPCR 46 2.4.9 CắtenzymegiớihạnvàligationDNA 49 2.4.10 Phảnứngloạiđầu5’-Phosphat(Dephosphorylation) 50 2.4.11 Phânlậpđoạngenmãhóapeptidetínhiệu 50 2.4.12 Phƣơngphápmegaprimer .50 2.4.13 PhƣơngpháptinhsạchDNAtừ gelagarose 52 2.4.14 PhƣơngphápđiệndiDNA 52 2.4.15 Nghiêncứuđiềukiệnthu nhậnα-amylasecủa chủngtáitổhợp 53 2.4.16 ĐiệndiSDS –PAGE 54 2.4.17 Xácđịnhhoạttínhα –amylasetrêngelpolyacrylamid .55 2.4.18 Xửlýsố liệu 55 CHƢƠNG3.KẾTQUẢNGHIÊNCỨU 56 3.1 PHÂNLẬPVÀTUYỂNCHỌNC Á C C H Ủ N G B A C I L L U S C Ĩ K H Ả NĂNGTIẾTALPHAAMYLASEMẠNHRAMƠITRƢỜNG 56 3.1.1 Phânlậpvàtuyểnchọnsơ bộcácchủngBacilluscóhoạttínha m y l a s e 56 3.1.2 SànglọcbộchủngphânlậpthucácchủngthuộcchiBacilluscóhoạttínhamylas ecao 57 3.1.3 Nghiêncứuđặcđiểmphânloạicủacácchủng .59 3.2 PHÂNLẬPCÁCĐOẠNGENMÃHĨACHOTRÌNHTỰPEPTIDETÍNHIỆU CỦAALPHAAMYLASETỪCÁCCHỦNGCHỌNLỌC 62 3.3 SÀNGLỌC THUPEPTIDE TÍNHIỆU MẠNHCỦAGENα -AMYLASE 67 3.3.1 Tách cácpeptidetínhiệuvàtạotổhợp vớigenđích .70 3.3.2 Tạo vectormang tổhợpgenđích .72 3.3.3 ĐánhgiákhảnăngtiếtcủacáctổhợpgenđíchtrongchủngchủB.subtilis168M 75 3.4 ĐÁNHGIÁKHẢNĂNGTIẾTAMYLASECỦACÁCC H Ủ N G T Á I T Ổ HỢP MANGVECTORBIỂUHIỆNCĨCÁCPEPTIDETÍNHIỆUĐỘTBIẾNĐƢ ỢCTHIẾTKẾ 83 3.5 NGHIÊNCỨUĐIỀUKIỆNBIỂUH I Ệ N A L P H A A M Y L A S E C Ủ A CH ỦNGTÁITỔHỢP 91 3.5.1 Xácđịnhđộngthá isinhtrƣở ng vàsinhtổnghợ pαa mylas e củachủng 168MpHVC1 91 3.5.2 Ảnhhƣởngcủanhiệtđộnuôicấylênkhảnăngsinhtrƣởngvàsinhamylase củachủng168MpHVC1 92 3.5.3 ẢnhhƣởngcủanồngđộIPTGlênkhảnăngtiếtamylasecủachủng168MpHVC1 .93 3.5.4 ẢnhhƣởngcủanguồnN,Clênkhảnăngsinhtrƣởngvàsinhamylasecủachủng168 MpHVC1 95 CHƢƠNG4.BÀNLUẬNKẾTQUẢ .97 4.1 QUÁ TRÌNHTIẾTPROTEIN 97 4.1.1 Phânlậpvàthucácchủngtuyểnchọncóhoạttínhα–amylase 97 4.1.2 Proteinngoạibàovàhoạttínhα–amylasecủa chủngtuyểnchọn 98 4.1.3 TáchdịngcácpeptidetínhiệuởBacillusvàđánhgiávaitrịcủacácaxitamintro ng trìnhtựnàyvớiqtrìnhtiết protein .101 4.2 KHẢNĂNGBIỂUHIỆNα–AMYLASEVỚICÁCPROMOTERKHÁCNHAU 105 4.3 SÀNGLỌCCÁCPEPTIDET Í N H I Ệ U V À Đ Á N H G I Á K H Ả N Ă N G BIỂUHIỆNTRONGB.subtilis168M 107 4.4 NGHIÊNCỨUTẠOMỘTSỐĐỘTBIẾNTRÊNPEPTIDETÍNHIỆUVÀĐÁNHGI ÁẢNHHƢỞNGĐẾNK H Ả N Ă N G T I Ế T P R O T E I N Đ Í C H CỦACH ÚNG 113 4.5 NGHIÊNCỨU ĐIỀUKIỆN NUÔICẤY TĂNGTIẾTENZYME .119 KẾTLUẬNVÀ KIẾNNGHỊ 123 NHỮNGC Ô N G T R Ì N H C Ô N G B Ố T R O N G T H Ờ I G I A N T H Ự C H I Ệ N 125 LUẬNÁN TÓMTẮTLUẬNÁN BẰNGTIẾNGANH 126 TÀILIỆUTHAMKHẢO 132 PHỤLỤC DANHMỤCCÁCTHUẬTNGỮVÀKÝHIỆUVIẾTTẮT APS Ammoniumpersulphate BLAST Basiclocalalignmentsearchtool Bp Basepair–cặpbazơ BSA Bovineserumalbumin CM Cellmembrane Cs Cộngsự CTAB hexadecyltrimethylammoniumbromide DNA Deoxyribonucleicacid DTT Dithiothreitol ER Mạnglƣớinộichất/endoplasmicreticulum G- Vikhuẩn Gramâm G+ GRAS VikhuẩnGramdƣơng HAc Axitaxetic Kb kilobase mg Milligram mg/ml Milligram/millilitre mM Milli(10-3)Molar NCBI NationalCentreforBiotechnologyInformation PAGE Polyacrylamidegelelectrophoresis PCR Polymerase chainreaction PMSF Phenylmethylsulfonylfluoride rDNA Ribosomaldeoxynucleicacid SDS Sodiumdodecylsulfat Sec/P Secpathway/Secretionpathway–conđƣờngtiết SP Peptidetín hiệu(SP) SPase SPase Generallyrecognizedassafe–đƣợccoilàantồn SRP Signalrecognition particle STT Sốthứtự TAE Tris-aceticacid-EDTA TAT/P Twin-argininetranslocationpathway TEMED Tetramethylethylenediamine TIM TriosephosphateIsomerase Tm Meltingtemperature U Unit VSV Visinhvật MeOH Methanol TRAM Translocatingchain-associatingmembraneprotein