QUÁTRÌNHTIẾTPROTEIN ỞT Ế BÀOVISINHVẬT
Quátrìnhtiếtprotein ởtếbàoEucaryotes
Cácpreproteinhìnhthànhtrongnấmmenítnhấtcóhaiconđườngvậnchuyểnmộtđường quaSRPtrunggianvàmộtconđườngđộclậpkhác.Vậnchuyểnproteinqua SRP trung gian vẫn chưa đƣợc mô tả rõ ràng nhƣng phức hợp vận chuyểnprotein củaS cerevisiaexuất hiện 5 polypeptide khác nhau: Sec61, Sec62, Sec63,và 2 protein phát hiện thêm gần đây Protein Sec61 có một số trình tự kỵ nước liênkết với ER và liên kết trực tiếp với protein tiết trong quá trình vận chuyển, tương tựnhư TRAM trong tế bào động vật có vú nhưng trình tự của Sec61 không có bất kỳđiểm tương đồng nào với TRAM mà chúng lại có một số điểm tương đồng vớiproteinSecY ởE.coli(Simonen&Palva, 1993).
Trong suốt hoặc ngay sau khi vận chuyển protein trong tế bào động vật có vúvà trongS cerevisiae, các peptide tín hiệu đƣợc loại bởi SPase Hai phức hợp chuỗicáce n z y m e p h â n c ắ t t í n h i ệ u ( S P a s e ) c ủ a đ ộ n g v ậ t c ó v ú v à n ấ m m e n c ó t ư ơ n g đồng với Sec11 (YaDeau et al., 1991) Trong khoang lưới nội chất của ER của cả tếbào nấm men và động vật có vú đều có BiP (Binding immunoglobulin protein), mộtloại protein đóng vai trò quan trọng trong quá trình gấp cuộn của các protein tiết.BiP củaS. cerevisiae(Kar2) tương tác với protein trong bước sớm quá trình vậnchuyển protein qua màng BiP rất cần thiết cho sự sinh trưởng của tế bào nấm men(Simonen&Palva,1993)
Quátrìnhtiếtprotein ởE.coli
TrongE coli, khoảng 50% protein của tế bào được tiết ra ngoài môi trườngvới hơn 90% protein đƣợc vận chuyển thông qua Sec/P (Low et al., 2013) Các SPđƣợc cho là hỗ trợ liên kết với các nhân tố tham gia quá trình tiết nhƣ: SecB,GroEL, DnaK và DnaJ và trong đó SecB đóng vai trò là nhân tố chính Liên kết củaSecBn g ă n p r e p r o t e i n g ấ p c u ộ n k h i c h ƣ a t h ể h i ệ n c h ứ c n ă n g G r o E L ,
DnaJ còn có một số chức năng khác trong tế bàoE colingoài vai trò trong quá trìnhtiết protein Phức hợp preprotein với các nhân tố tiết đƣợc vận chuyển đến màng tếbào bởi ái lực của SecA với
SP và SecB SecA là protein màng ngoại vi và có ái lựcđối với với phần protein trưởng thành của preprotein (Simonen & Palva, 1993).Ngoài chức năng vận chuyển, SecA còn tham gia liên kết và thủy phân ATP nhằmcung cấp năng lƣợng cho quá trình chuyển vận qua màng.
Một số protein trên màngSecY,SecEcùngvớiSecAhìnhthànhnênhệvậnchuyểnởE.coli.Chuỗipolypeptide có thể trƣợt qua màng tế bào trên bề mặt của phức hợp SecY/E Phầnxúc tác của các enzyme phân cắt peptide tín hiệu nằm ở phía bào chất và quá trìnhphân cắt SP có thể xảy ra trong hoặc ngay sau quá trình vận chuyển Chức năng của2 proteinSecD và SecF trên màng chƣa đƣợc biết rõ, tuy nhiên chúng có thể đóngvaitròtrongviệchỗtrợquátrìnhgấpcuộncủaproteinkhimớiđƣợcvậnchu yểnlên periplasmic tương tự với protein BiP của động vật có vú và của tế bào nấm men(Simonen&Palva,1993).
QuátrìnhtiếtproteintrongBacillus
Quá trình tiết protein ởBacilluslà hệ thống tiết protein của vi khuẩn đầu tiênđƣợcnghiêncứu.BacilluslàvikhuẩnG + nên cócơchếtiếtđiểnhình đƣợcbiếtđếnlàkhácsovớiE.coli,S. cerevisiaevàđộngvậtcóvú.TếbàocủaBacillusđƣợcbaoquanh bởi màng tế bào chất, đƣợc bao phủ bởi một thành tế bào dày (10 đến 50 nm)bao gồm chủ yếu là các chuỗi peptidoglycan và teichoic hoặc teichuronic acid (ChuH.H., 2001). Theo Tjalsma et al., 2004; Fu et al., 2007, bốn con đường tiết proteinđược biết có mặt trong vi khuẩn Gram âm và Gram dương đó là: Sec-SRP, Tat, quanhântốvậnchuyểnATPbindingcassette(ABC- transporter)vàconđườngPseudopillin(Compathway).CácSPcủaBacillusđãcórấ tnhiềucôngtrìnhcôngbố (Kolkman et al., 2008; Igarashi et al., 1998; Borchert & Nagarajan, 1991a; Henget al.,2005b; Low et al., 2012; Tjalsma et al., 2000a; Jonet et al., 2012;Sakakibaraetal.,1993).CácconđườngtiếtproteintrongBacilluscũngnhưcáce nzymphân cắttínhiệuthamgiatrongcácconđườngnàyđượcthểhiệntrênHình1.1,Cơchếtiếtđược thểhiệntrênhình1.2.
Trong Sec/P, ribosome liên kết với đầu N của SP nhờ Ffh protein.ProteinFfh, Hbsu và scRNA là các hợp phần trong phức hợp SRP (signal recognitionparticle) tham gia trong quá trình vận chuyển, sau đó phức hợp SRP- precusor sẽtương tác với SecA nhờ các liên kết với SP Cụm liên kết SRP –Precusor – SecAđược đưa tới vị trí màng tế bào và tương tác với các yếu tố protein vận chuyển trênmàng SecYEG, SecE, SecG và các protein hỗ trợ SecDF, SpoIIIJ và YqjG Sau đó,SP sẽ đƣợc phân cắt bởi một enzyme trên màng là SPase I (SipS-W), Precusorprotein đƣợcđƣa raquacácSec-porebởi SecAchủyếunhờvào nguồnnănglƣợng
ATP và các điện tử trên kênh dẫn truyền Đoạn SP bị phân cắt bởi 2 SPase là SppAvà TepA, các exoprotein sẽ đƣợc vận chuyển qua màng tế bào do đó nó đƣợc điềukhiển bởi WprA, một protease trên màng tế bào và được tăng cường tạo ra nhờ xúctác của PrsA, một lipoprotein trên màng tế bào BdbB và BdbC là các protein thamgia giúp cho việc hình thành các cầu nối disulfide(prophage-derived disulfide bondformation protein) trong quá trình hình thành cấu trúc protein Một số protease ởthành tế bào tích điện âm chính vì vậy các ion Ca 2+ và Fe 3+ rất cần thiết cho việc ổnđịnhhoạttínhcủamộtsốexoprotein.
Hình1.2.Sơđồcơchếtiếtprotein ngoại bào theoSec/P ở B.subtilis
CấutrúccủalớpmàngtếbàocủaBacillikhông cólớpmàngngoài(OM-Outermembrane)chonênsaukhitổnghợpcácproteincóthểđƣợcgiữlạitrongtế bào chất hoặc vận chuyển vào CM hoặc chúng sẽ đƣợc vận chuyển qua CM vàothành tế bào, sau đó protein có thể vẫn giữ trên thành hoặc tiết ra môi trường nuôicấy (Tjalsma et al., 2000a) Thông qua các con đường tiết khác nhau sản phẩmproteincóthểđượctiếtrangoàimôitrườngnuôicấy(nhưtrong:Sec/P,Tat/
P,ABCtransporter),cóthểlàtồntạiởmặtbêncủamàngtếbào(Sec/P,Com)vàcũngcóthể nằm trên thành tế bào (Sec/P) (Tjalsma et al., 2000a, 2004; Brockmeier, 2006).ĐốivớichiBacillus,cácproteinchủyếuđƣợctiếttheoSec/P-SRP.
Trong quá trình vận chuyển, các protein thiếu các tín hiệu vận chuyển sẽđƣợc giữ lại trong tế bào chất và đƣợc gấp cuộn cần hoặc không cần sự có mặt củacác chaperone và đại diện cho nhóm này nhƣ các protein: GroEL-GroES và DnaK-DnaJ-GrpE(Tjalsmaetal.,2000;Chu.,2001).
Thành tế bào củaB subtilistương tự như periplasm ở vi khuẩn Gram âm vànó chiếm khoảng 9% tổng khối lƣợng của protein tế bào và các protein đƣợc giữ lạitrong thành tế bào bao gồm các enzyme nhƣ: DNases, Rnases (Merchante, et al.,1995), protease (Margot &
Karamata, 1996,Msadek, et al., 1998),e n z y m e t h a m giavàoquátrìnhtổnghợppeptidoglycan(penicillin- bindingprotein)vàcáchydrolases có liên quan đến quá trình tăng trưởng tế bào, phân chia tế bào, sự hìnhthành bào tử, và sự nảy mầm (Tjalsma, et al., 2000) Hầu hết các protein đƣợc vậnchuyển qua màng tế bào chất đều đƣợc tổng hợp với một
SP Giống như các vikhuẩn Gram dương khác,B subtilisthiếu lớp màng ngoài nên nhiều protein đượctiết trực tiếp ra môi trường nuôi cấy trong quá trình sinh trưởng trong đó chủ yếu làcácenzymenhƣ:proteases,lipase,carbohydrase,DNasesvàRnases nhằmthựchiệnvai trò giúp vsv có thể thích ứng với điều kiện môi trường bằng việc sử dụng nguồndinh dưỡng sẵn có Ngoài các enzyme ra, một nhóm protein thứ hai đƣợc tiết làthành viên của nhóm phosphatase (PhrAvà PhrK) đóng vai trò nhận biết mật độ tếbào, điều chỉnh sự phát triển và sự hình thành bào tử (Tjalsma, et.al., 2000; Chu H.H., 2001) Ngƣợc lại với các enzyme phân hủy cơ chất và các Phr protein, hầu hếtcác protein không đƣợc tiết, bao gồm cả các protein tham gia quá trình giống nhƣtạothànhtếbào,liênkếtcơchất,hoặctiếtprotein,đềuphảiđƣợcgiữlạitrênmàng tế bào với đầy đủ chức năng và nhằm để ngăn việc mất hoạt tính của các protein nàykhi ở dạng tự do trong tế bào chất Chúng chứa các SP tương tác với màng hoặc vớithành tế bào nhưng không bị phân cắt bởi các enzyme tham gia vào quá trình tiếtprotein Ngoài ra, một số protein tiết còn có thể hình thành lên các cấu trúc like –pilinởtrênbềmặt tếbào (Tjalsma,et.al.,2000;Chu ,2001)
Các SP đƣợc biết đến gồm 5 loại và phân biệt dựa trên điểm nhận biết phâncắt bao gồm: peptide tín hiệu của con đường tiết chung (Sec/P), peptide tín hiệuTwin-arginine, peptide tín hiệu Lipoprotein, peptide tín hiệu pilin-like protein vàcuốicùnglàcácpeptidetínhiệuthamgiatrongquátrìnhtiếtbacteriocinvàpheromones (Tjalsma, et al., 2000; Tjalsma, et al., 2004) Peptide tín hiệu đƣợc biếtđến có ít nhất 3 chức năng chính (van Roosmalen et al., 2004): Đầu tiên, nhận biếtthụ thể trong bộ máy tiết và chuyển tới bộ máy xúc tác vận chuyển protein quamàng; Thứ hai, các SP nhƣ mộty ế u t ố q u y ế t đ ị n h c h o x á c đ ị n h p r e p r o t e i n t r ê n màng và bắt đầu di chuyển đến các vùng ưa nước ở đầu cuối C của các preproteintrong khi phần N vẫn đƣợc định vị ở phía cis của tế bào; Thứ ba, các SP có thể ứcchế quá trình gấp cuộn của các protein mới hình thành vì vậy tránh đƣợc việc kíchhoạt các enzyme có hại cho bộ máy tiết của enzyme bên trong tế bào và giúp choquátrìnhtiếtđƣợc xảyrahoàntoàn.
Quá trình vận chuyển ra bên ngoài tế bào của khoảng 300 protein thuộc chiBacilluschủ yếu đƣợc tiết qua Sec/P (secretory pathway) vì thế Sec/P đƣợc coi làcon đường tiết chung cho chi này (Tjalsma, et al., 2000a) Các peptide tín hiệu củacon đường này luôn gồm ba vùng với chức năng riêng: vùng N (tích điện dương),vùng kỵ nước H và vùng đầu cuối C (Leite, 2011; Brockmeier et al.,
2006b; Low etal.,2013).SựkhácbiệtcủaSPởvikhuẩnG(+)vàG(-)đƣợcsosánhtrongBảng 1.1(Dalbey&Heijne,2002).Sec/
Pđượcxemnhưconđườngtiếtchungchohầuhếtproteinc ủ aB a c i l l u s v ớ ib ộ m á y t i ế t t h a m g i a g ồ m 5 t h à n h p h ầ n c h í n h : ( 1 ) C á c chaperon của tế bào chất (cytosolic chaperones); (2) Bộ máy vận chuyển (SecA,SecY, SecE, SecG, và SecDF-YajC); (3) Các enzyme phân cắt peptide tín hiệu(SPase) phân cắt SP của preprotein tạo thành đoạn trưởng thành; (4) Các enzymephân cắt (hay còn gọi là SPase) cắt SP khỏi preprotein trên màng; (5) Các nhân tốgấp cuộn (folding factors) Trung bình SP loại I củaBacillusdài hơn SP trongE.colitừ 5 – 7 axit amin Trong vi khuẩn Gram dương, vị trí phân cắt của SPasekhoảng 7 - 9 axit amin trong khi ởE colivị trí phân cắt xảy ra tại vị trí 3 - 7 (Leite,2011).Vịtrí+1 sauđiểmphâncắtcủaSPasethườnglàAla(27%)cònlạilàcácaxitamin khác ngoại trừ proline và cysteine (Tjalsma et al., 2000) Các nhân tố tham giavậnchuyểnproteintheoSec/ Pđƣợctrìnhbàytrongbảng1.2(Tjalsmaetal.,2000).
Bảng1.1.Sosánhsựkhácbiệtcủacácpeptide tín hiệuởG + vàG - theo Sec/P
STT Chỉtiêuso sánh Gramdương Gramâm
1 Độ dài SP trungbình(axitamin
Tíchđiệndương(thấp),gi àu Lys/Arg
4 VùngC Phâncực/trungtính,kéodàihình thành cấu trúc β, dàihơn,giàuPro/Thr
Phân cực/trung tính, kéo dàihình thành cấu trúc β, ngắnhơn,giàu
5 Vịtrí-1&-3theotrình tự Ala – X -Ala ChủyếuAla,đôikhiđƣợcthay bằngSer/Gly
VùngN(N–region)mangđiệntíchdươngcủachuỗipreproteintrongSPtheoSec/P có chứa trung bình khoảng 1 – 5 axit amin, trong đó chứa 2 axit amin Lysinevà Arginine (Low et al., 2013; Leite,
2011) Một preprotein không mang điện tíchdương vẫn được nhận biết bởi bộ máy vận chuyển tuy nhiên chúng sẽ được tiết rấtchậm.VùngNsẽtươngtácvớicácATPase,SecAvàvớicácphospholipidtíchđiệnâm(Dalbey&VonHeijne,2002).
Ffh,FtsY,4.5SR NA,SecB YgjH(?)
Phức hợp SRP (gồmscR1 RNA, Srp72p,Srp68p, Srp54p,Sec65p, Srp21p,Srp14p,và Srp7p),DPα/β
GroEL,GroES DnaK, DnaJ,GrpE, yếu tốkíchhoạt
GroEL,GroES DnaK, DnaJ,GrpE,yếutố kíchhoạt
Nhântốvậnchuyển SecA SecA Ribosome,Kar2(Bip)
SecY, SecG,SecE,S ecDF,YrbF
SecY, SecG,SecE,Se cD/F,YajC
Sec61, Ssh1(Sec61α),Sbh1, Sbh2(Sec61β), Sss1(Sec61γ)) Sec62/63,Sec66/67
P,SipW,LspA LepB,LspA Sec11
SPPases SppA,TepA SppA,OpdA
SurA, PpiD,RotA, FkpA,DsbA/B/C/
CPR2, CPR4, CPR5,CPR8,FPR2, PDI, Ero1, Eug1.
Kar2(BiP),Lhs1, (Hsp70) (Nguồn:Tjalsmaetal.,2000)
Vùng H (hydrophobic H- region) là vùng tâm kị nước có chứa khoảng 19 axitamin và có cấu trúc xoắn α được hình thành do tương tác của vùng N tích điệndương với các phospholipid tích điện âm Thông thường hai axit amin Glycine vàProline sẽ đƣợc tìm thấy nằm giữa vùng này với khoảng 60% vùng H của SP ởBacilluschứa Glycine ở giữa và 50% chứa Prolin hoặc Glycine ở điểm bẻ gãy cấutrúc xoắn -7 và -4 (Tjalsma, et al., 2000., Leite, 2011) Hai axit amin này đƣợc xemlàvịtríbẻgãycácliênkếtcủaxoắnαvàhìnhthànhnêncấutrúckẹptóctạivịtrí chèn của các SP trên màng hay trên kênh vận chuyển Vùng N và vùng H đều cầnchoquá trình nhậnbiếtSPbởi SecA (Leite,2011).
Vùng C (carboxyl – terminal) có chứa từ 3 – 7 axit amin và phải có cấu trúcchuỗi β có chứa vị trí phân cắt bởi SPase (van Roosmalen et al., 2004) Vị trí nàythường nằm ở -3 ÷ -1 (Dalbey & Von Heijne, 2002; Nielsen et al., 1997a; vonHeijne & Abrahmsèn, 1989) và thông thường đặc trưng bằng các axit amin Ala-X-AlavớiX làaxitamin bấtkỳ.Vịtrí-3cóthể đƣợcthaythế bằngcácaxitaminnhƣ:Valine, Threonine, Leucin và Isoleucin Trong các nghiên cứu về điểm nhận biếtphân cắt của SPase trên các SP trong Sec/P ởBacilluscó tới 71% là A-X-A, 18% làV–X–A còn lại là một số axit amin khác Đặc biệt vị trí -1 của điểm phân cắt củaSPase loại I đặc trƣng cho điểm phân cắt SP của preprotein trongB. subtilis(vanRoosmalenetal.,2004).
CácSP loại II giốngvới SP loạiI nhƣngchứa một vùng đƣợc gọi là“lipoprotein box” với trình tự bảo thủ Leu-Ala-Gly-Cys Trong màng tế bào chất,cystein trong trình tự này liên kết cộng hóa trị với lipid Quá trình phân cắt cáclipoprotein diễnrakhi SPđƣợc phâncắtbởiSPaseloại II.Sauđó,nhómacyl ( )sẽđƣợc liênkếtvớicystein.
Vận chuyển protein theo Tat/P có sự tham gia của các cofactor là các ion kimloại đóng vai trò trong các phản ứng oxi hóa khử và các SP cũng đƣợc phân cắt bởiSPase I TAT/P đƣợc phát hiện trong Thylakoit và sau đó đƣợc phát hiện có mặttrong tất cả các vi khuẩn, vi khuẩn cổ (Berks et al., 2003; Kolkman et al., 2008).Ngày nay, số lƣợng lớn các vi khuẩn đƣợc biết có trình tự Tat mang dạng motif Z –R - R - X– Φ - Φ, trong đó, Z có thể thay thế bằng axit amin phân cực bất kỳ và Φđại diện cho các axit amin kỵ nước và motif này cũng phù hợp với cơ chất cắt củahệthốngTattronghầuhếtcácThylakoidởthựcvật(Tjalsmaetal.,2004;vanDijlet al.,2002;Tjalsmaetal.,2000b).
TrongB subtilisđƣợc phát hiện có khoảng 27 protein tiết theo con đườngnày Trong số đó, 14 SP có điểm nhận biết phân cắt tín hiệu bởi SPaseI, 5
EnzymephâncắtpeptidetínhiệucủaSec/P
1.1.4.1 Peptidasephâncắttín hiệuloại ItrongGramâm Đặc trƣng nhất của peptidase loại I trongE coliđƣợc gọi là các leaderpeptidase (Lep) Gen mã hóa cho SPase là genlepBlà một protein dài 323 axit amin(35,9 kDa) với 2 vùng N (4 -28 và 58 - 76) gần với vùng tế bào chất nhỏ (axit amin29 -57) và đứng trước vùng xúc tác C ( gồm các a.a 77- 323) GenLepBchỉ có mặttrongE colivà cần thiết cho sự sinh trưởng và biến đổi của tế bào Sự có mặt củaSPase loại I trong nhiễm sắc thể (NST) đặc trƣng cho một số vi khuẩn Gram âmnhƣ:E.coli,Haemophilusinfluenzae,Pseudomonasfluorescens,Rhodobactesphaer oides, Salmonella typhimuriumvàYersinia pestis Có một số loài vi khuẩnGram âm có 2 loại SPase nhƣPseudomonas aeruginosa, và có 3 loại SPase nhƣBradyrhizobiumjaponicum(vanRoosmalenet al.,2004).
TrongvikhuẩnGramdương,thôngthườngSPaseloạiIđượcphổbiếntronghệ thống tiết protein (Tjalsma et al., 2000) và ngày nay có rất nhiều SPase loại Iđược phân lập trong vi khuẩn Gram dương. Đã có những phân tích về chức năng vàđặctínhsinhhóacủaSPaseloạiIcủacácvikhuẩnGramdươngtrongB.subtilis,B.cereus,B a n t h r a c i s , B a m y l o l i q u e f a c i e n s , S l i v i d a n s , S p n e u m o n i a e B anthraciscó chứa 6 vàB subtiliscó chứa 5 gen mã hóa cho SPase loại I trên
NST.Genm ã h ó a c h o S P a s e t r o n gB s u b t i l i s đ ãđ ƣ ợ c g i ả i m ã b a o g ồ m : S i p S , S i p T , SipU,SipVvàSipW(vanWelyetal.,2001;Fuetal.,2007;Harwood&Cranenbu rgh, 2008; Tjalsma et al., 1997; Song et al., 2015) Tjalsma và cộng sự đãchứng minh SipS và SipT là hai gen quan trọng nhất trong SPase củaB subtilistrong khi
SipU, SipV và SipW ít có vai trò hơn trong quá trình tiết protein (Tjalsmaet al.,
1997) Trong các vi khuẩn gram dương bao gồm:Streptomyces lividans,
S.coelicolor, C perfringenscó 4 gen mã hóa cho SPase loại I đƣợc tìm thấy bao gồm:SipW, SipX, SipY, SipZ và SipS, SipT, SipV và SipW trongB. amyloliquefaciens(vanRoosmalenetal.,2004).TrongL.plantarum,L.monocytogenesv àStaphylococcusepidermidiscóbagenmãhóachoSPase.Trongkhiđó,B.halodurans, S. aureus(spsAvàspsB) vàS carnosus(sipAvàsipB) có hai gen mãhóachoSPase.,Streptococcuspneumoniae,S.mitis,L.lactis,Mycobacteriumleprae,
Mycobacterium tuberculosisvàAquifex aeolicuschỉ có một gen mã hóa choSPase(vanRoosmalenetal.,2004)
Các tín hiệu peptidase lipoprotein (Tín hiệu peptidase II) ởE colilà mộtproteinnhỏcókíchthướckhoảng18-kDanằmtrongCM.LoạiIISPasecóthểđượcchia làm hai loại Major SPase bao gồm SipS(S), SipT(T) và Sip(P) rất cần thiết choquátrìnhbiếnđổitếbào.CácminorSPasebaogồmSipU(U),SipV(V)v à SipW(W).Sip PmãhóachogensinhplasmidpTA1015vàpTA1040cómặttrong
B subtilisnato Tất cả các SPase còn lại nằm trên NST SipW là loại SPase chỉ cótrênmạnglướinộichất,cótươngđồngcaovớiSPasecủaeucaryotevàvikhuẩncổ.SipP của procaryote có thụ thể gắn trên màng ở đầu N trong khi đó SipW lại có thụthể gắn trên đầu C.B.s u b t i l i schỉ có một genlspAmã hóa cho SPase loại II với
4thụthểtrênmàngcầnthiết choquátrìnhphâncắtcủa114lipoproten(Tjalsm aetal., 2004; Rey et al., 2004) Tín hiệu peptidase lipoprotein của vi khuẩn gram dươngđượcp h á t h i ệ n ởS a u r e u s v àS P a s e I I c ủ a l o à i n à y cós ự t ư ơ n g đ ồ n g t h ấ p v ớ i peptidasel i p o p r o t e i n c ủ a v i k h u ẩ n g r a m â m đ ã c ô n g b ố ( D a l b e y & V o n H e i j n e , 2002;F u etal.,2007)
HỆBIỂUHIỆNPROTEINTÁITỔHỢPỞVISINHVẬT
VaitròcủaBacillustrongcôngnghiệpsảnxuấtenzyme
Các loài thuộc chiBacillusđã, đang và ngày càng trở thành những vi sinh vậtquan trọng hàng đầu về mặt ứng dụng Các ứng dụng của nhóm này bao trùm hàngloạt lĩnh vực, từ sản xuất thực phẩm thủ công truyền thống đến công nghệ lên menhiện đại, đến sinh học phân tử, y - duợc học chữa các bệnh hiểm nghèo, chế phẩmxửlýônhiễmmôitruờng,thuhồibạckimloạitừcácphếliệu.Chínhvìlẽđónên đã có ngày càng nhiều các nghiên cứu sâu về chiBacillusnày cũng nhƣ mở rộngứng dụng của chúng đối với đời sống con nguời Từ đầu những năm 60 một số loàiBacillusđã đƣợc sử dụng và cải tiến để lên men sản xuất các enzyme thủy phântương ứng Năm 2004, thị trường enzyme công nghiệp trên thế giới ước tính là 1,6tỷ đô la Mỹ và có xu hướng ngày càng tăng Khoảng 50 - 60% các enzyme thươngmại được sản xuất bởi các loài thuộcBacillus Hai trong số các enzyme chiếm vị tríquan trọng nhất là protease kiềm
(subtilisins) đƣợc sử dụng trong chất tẩy rửa giadụngvàamylaseđƣợcsửdụngtrongcácứngdụngcôngnghiệpcónguồngốctừchinày Các enzyme đƣợc sản xuất bởiB subtilisvàB licheniformisđƣợc sử dụngrộng rãi làm chất phụ gia trong các chất tẩy rửa (bột giặt) Chất tẩy rửa đầu tiên cóchứaenzymevikhuẩnđƣợcsảnxuấtvàonăm1956vớitênBIO-40 Đếnnăm1963,Novo A/S đãgiới thiệu acalasedưới tên thươngmạilà BIOTEX đượcchiết xuất từ
B licheniformis Đến gần đây, tất cả các protease bổ sung vào chất tẩy dùng trên thịtrường đều là serine protease được sản xuất từ các chủngBacillus(Reddy et al.,2003; Maarel et al., 2002; Alkando & Ibrahim, 2011) và chủ yếu là từB subtilis.Trên thế giới, mỗi năm người ta đã sử dụng 89% enzyme này cho ngành côngnghiệp chất tẩy rửa Trong đó, hai công ty lớn là Novo Nordisk và GenencorIntematinal mỗi năm đã cung cấp cho toàn cầu hơn 95% lƣợng enzyme protease từloàinày(Guptaetal.,2008)
Bảng1.3.Một sốchấtcónguồn gốcvikhuẩn vàứng dụngcủa chúng
Amylasekiềm Chất tẩyrửa B.lichenifomis B.lichenifomis α-amylase Phâncắttinhbột B.lichenifomis B.lichenifomis
Glucoseisomerase Chếbiến tinh bột B.coaluglans B.coaluglans
CGTase Chuyển hóa tinh bộtthành dextrin B.fimus B.fimus Β-glucanase Biếnđổi glucan B.subtilis B.subtilis
Levansucrase Xúc tác hoạt độngHydrolase/trasferla se
Esterase Phân hủylypolytic B.circulans B.circulans
Interleukin-1beta Dượcphẩm Người B.subtilis
Basicpeptides Khángsinh B.reviBacillusbrevis B.reviBacillus brevis endotoxin Thuốctrừsâu sinhhọc B thuringiensis B thuringiensis
Purinenucleotides Dƣợcphẩm,nângcaom ùi vị B.subtilis B.subtilis
Riboflavin Nângcao mùivị B.subtilis B.subtilis
2-acetyl1-pyrroline Giavị popcom B.cereus B.cereus
Polyhydroxybutyrate Chấtdẻo sinhhọc Vikhuẩn B.megaterium
HệthốngbiểuhiệnởBacillus
Đây là chi đƣợc sử dụng chủ yếu để thu nhận các enzyme nhƣ protease (chocông nghiệp giặt tẩy), amylase (cho công nghiệp tinh bột, chế biến bánh…). Một sốưu điểm của việc sử dụng hệ thống biểu hiện củaBacillustrong sản xuất protein táitổ hợp: các loài thuộc chi này có hệ thống di truyền đặc trƣng, có khả năng biến nạpcao, tốc độ sinh trưởng mạnh, không có lipopolysacharide chứa bên ngoài màng,trao đổi chất mạnh mẽ, bộ gen của vi khuẩnB subtilisvàB licheniformisđã đƣợcgiải trình tự và chúng đƣợc biết không sinh ra các nội hoặc ngoại độc tố đƣợc FDAcông nhận là an toàn Các protein của các loài này lại được tiết vào môi trường lênmen làm cho quá trình thu nhận dễ dàng, thu hồi sản phẩm hiệu quả và giảm chi phísảnxuất Chủng chủ cho biểu hiện thường thuộc các loàiB megaterium,B subtilis,
B.licheniformis,B.brevis.SảnphẩmproteintáitổhợpởB.subtilisthuđƣợclêntới25g/l.B. licheniformislà chủng chủ biểu hiện tốt nhất interleukin-3 khi đƣợc sosánh với sự biểu hiện protein này trongE coli, S cerevisiae, Kluyveromyces lactisvà tế bào động vật có vú C127 (Vitikainen, 2004; van Dijl et al., 2002) Các proteintái tổ biểu hiện thành công trongBacillusbao gồm interleukin-3EGF, esterase(củaPseudomonas), xylanase, naproxen esterase, amylase và rất nhiều loại protease khác(Demain&Vaishnav,2009).
ĐặcđiểmditruyềncủaBacillussubtilis
Hệ gen củaB subtilisbao gồm khoảng 4.2 Mb và số lƣợng các cặp base củaloài này có hơi khác nhauB subtilissubsp.subtilisRO-NN-1 là 4,011,949 bp. trongkhi đóB subtilissubsp BSn5 và TU-B-10 T chứa 4,207,222 bp (Earl et al., 2012).Trong đó có tới 87% gen mã hóa cho 4100 ORF (Wipat & Harwood, 1999). Cácprotein của các ORF này đã được 25 phòng thí nghiệm của các nước thuộc Cộngđồng châu Âu và Nhật Bản phân tích chức năng trong đó có tới 40% ORF chƣa xácđịnh đƣợc vai trò nào đối với chínhB subtilis Với đặc điểm này, nhiều gen của cácvi sinh vật khác đƣợc phiên mã và dịch mã ởB subtilis Vì vậy, chúng đƣợc sửdụngrộngrãilàmchủngchủđểbiểuhiện gentrongcôngnghệDNAtáitổhợp.
HệbiểuhiệnởE.colivàvisinhvậtkhác
E colilà chủng chủ đƣợc sử dụng sớm nhất và rộng rãi nhất trong công nghệsản xuất các protein tái tổ hợp Những tiến bộ ngày nay về hiểu biết di truyền trongquá trình phiên mã, dịch mã và quá trình gấp cuộn protein trongE colicùng với cáccông cụ cải thiện di truyền đƣa loài này có nhiều thuận lợi và ƣu thế hơn so với hệbiểu hiện protein phức tạp trong eukaryote (Terpe, 2006) Hệ thống này có sự biểuhiện nhanh, hiệu suất thu hồi cao, dễ dàng nuôi cấy và biến đổi gen, giá thành rẻ vàthu hồi sinh khối nhanh nhƣng có nhiều nhƣợc điểm: khi protein tái tổ hợp có cácliên kết disulfide rất khó biểu hiện, sinh các protein không glycosyl, sinh proteincùng với nội độc tố, hình thành acetate gây độc tế bào (điều này có thể tránh đƣợcbằngcáchkiểmsoát mứcđộoxy),proteinsảnxuấtởtrongtếbàothườngởdạngthểvùiv à đ ể c ó h o ạ t t í n h c ầ n t á i g ấ p c u ộ n p r o t e i n H i ệ u s u ấ t t h u h ồ i c ó t h ể đ ạ t t ớ i 5.5g/l α – interferone trong dịch nuôi cấy
(Demain & Vaishnav, 2009) Để tăng hiệusuấtthuhồisảnphẩm,cầnphảicómộthệthốngpromotermạnh(cócácgenla c,tac, trc) Hệ thống biểu hiện trongE coliđã đƣợc sử dụng nhằm thu các protein lạ:phoA(alkalinephosphatase)vớihàmlƣợngproteinđạt5.2g/ltrongperiplasm,LFT(levanfruc totransferase) với hàm lượng đạt 4 g/l trong môi trường, hGCSF (humangranulocyte colony-stimulatory factor) với hàm lƣợng 3.2 g/l trong periplasm; IGF-1(insulin- likegrowthfactor)vớihàmlƣợng2.5g/ltrongperiplasm;choleratoxinBvớinồng độ1 g/ltrong môitrường(Mergulhãoetal.,2005).
Vi khuẩn Gram âmRalstonia eutrophađƣợc sử dụng làm vật chủ trong côngnghệ DNA tái tổ hợp (Demain & Vaishnav, 2009; Terpe, 2006) Hệ thống biểu hiệncủa loài này có nhiều ƣu điểm hơnE coli Hệ thốngPfenexcủaPseudomonasfluorescenscó thể thu đƣợc 4 g/l TNF- α.Staphylococcus carnosuscó khả năng sinhtổng hợp khoảng 2 g/l protein của động vật có vú trong khi ởStreptomyces lividansthìlƣợngtổnghợp nàylà0.2g/l(Demain &Vaishnav,2009).
CÁC YẾUTỐLIÊNQUANĐẾN BIỂU HIỆNGEN ỞBacillus subtilis
Lựachọnpromoter
Promoter của vi khuẩn nằm ngay trước vị trí khởi đầu phiên mã và chứa haiđoạn ngắn tương đối bảo thủ, mỗi đoạn gồm 6 nucleotide cách vị trí khởi đầukhoảng 35 bp (trình tự TTGACA) và 10 bp (trình tự TATAAT) Một promotermạnhlàpromoterphảicókhảnănglàmtăngcườngmứcđộbiểuhiệngen.Promoterd ùngchohệbiểuhiệnởB.subtilisbaogồm:
-amylase bền nhiệt tái tổ hợp ứng dụng trong công nghiệp Pspacpromoter: đƣợc tạo thành từ đoạn đầu 5’ từ phage SPOI ởB. subtilisvà đầu 3’ của lacZ promoter từE colivà đƣợc cảm ứng bởi IPTG (1 ÷ 10 mM)(Vavrováetal., 2010).
- PromoterXylRcủaB.subtilis(Mingetal.,2010)vàB.megaterium(Naturwissen schaften, 2007, 2010) cảm ứng bằng xylose dùng điều hòa biểu hiệngentrongB.subtiliscũngnhƣE.coli.
- Promoter củasacBcảm ứng bằng sucrose (1 ÷ 30 mM) Rất nhiều hệ biểuhiệnđƣợcthiếtkếtrên cơsởcủa promotersacB(Hengetal.,2005a).
- Promotercảmứngtựđộngbaogồmcácpromotercảmứngtrựctiếpmứcđ ộ biểu hiện thấp trong pha lag và pha log và có mức độ biểu hiện cao hơn khiở pha nghỉ (stationary) nhƣ:aprE(Nijland & Kuipers, 2008) vàgsiB(Eymann &Hecker, 2001; Petersohn et al., 1999) Hệ thống promoter cảm ứng tự động khôngđƣợc dùng trong nghiên cứu cơ bản nhƣng lại đƣợc dùng trong công nghiệp bởichúng khôngy ê u c ầ u c h ấ t c ả m ứ n g H i ệ n n a y m ớ i p h á t t r i ể n t h ê m h ệ t h ố n g c ả m ứngmớirẻhơn,antoànhơnchohệthốngpromotercảm ứngcủacôngngh iệplàP glv cảmứngbằngmaltose (Mingetal.,2010).
- Hệ biểu hiện với vector phage nhƣ phage 105 và pBSX (ởB subtilis
- Promoter Pgracvới kích thước khoảng 182 bp của vector pHT43 cho phépbiểu hiện protein tái tổ hợp trongBacillusở mức độ cao trong tế bào chất.
Promoternày đƣợc xây dựng dựa trên promoter mạnh phụ thuộc σ A của operongroESLtừB.subtilisdung hợp với yếu tố điều hòa lac operator (lacO) từE colivà cảm ứng bằngIPTG củalacoperator Sử dụng promoter này cho hiệu quả biểu hiện rất cao (Phanetal.,2012; HuỳnhKiềuThanhvàcs.,2014)
Ngoài các promoter được mô tả ở trên, trong công nghiệp người ta đã thiếtkế các promoter đặc biệt cho năng suất protein ngoại bào tới 20 g/l, nhƣng vì lí dothương mại mà trình tự được giữ bí mật Trong nhiều trường hợp các promoter củachủngchủnhƣspoVG(promoterđiềuhòasựhìnhthànhbàotửởBacillus),promotercủagen α-amylase(pAmy),promotercủagenprotease…đƣợcsửdụngđểbiểu hiện gen α-amylase tạo sự đồng nhất giữa RNA-polymerase của chủng chủ vớipromoterởvectơtáitổhợp(Lietal.,2004)
CácvectorbiểuhiệnởBacillussubtilis
Vector biểu hiện có thể đƣợc thiết kế để tối đa hóa quá trình khởi đầu dịchmã nhƣ có mang một trình tự RBS bảo thủ, một mã bộ ba khởi đầu ATG ở vị trí tốiưu(cách8bp)vềphíasaucủaRBS,mộtgenechọnlọc(thườnglàkhángmộtkhángsinh nào đó), một promoter mạnh, sau vị trí đƣa gene vào là hai hay ba trình tự kếtthúc phiên mã mạnh để ngăn việc phiên mã các gene khác trong plasmid Một sốplasmid nội sinh đƣợc phát hiện có mặt trongBacillus Tuy nhiên, khi sử dụng cácplasmid này không thể lựa chọn trực tiếp các khuẩn lạc đã đƣợc biến nạp trong mộtsố loài thuộc chi này và không kiểm soát đƣợc chức năng của tế bào chủ bởi cấutrúc của các plasmid này chƣa đƣợc làm rõ.
Vị vậy, các plasmid ngoại lai đƣợc sửdụng biểu hiện trongBacilluslà pUB110, pE194, pC194, pBSMuL, pAL vector,vectorcảmứnglạnh,pHT(pHT01,pHT43),vectortích hợpNSTcủaB.subtilis
Chọntrìnhtự peptidetínhiệu
Cácn gh iê n c ứ u t á c độ ng đế n q u á tr ìn h vậ n c h u y ể n p r o t e i n q u a m à n g , đặ c biệtlàyếutốSPđượcquantâmhơncả.Cũngtheohướngnày,Eggertvàcộngsựđãđưa ra chỉ ra rằng mức độ tiết protein tái tổ hợp quan tâm phụ thuộc vào loại SP màgenđ ó đ ƣ ợ c g ắ n ( E g g e r t e t a l , 2 0 0 3 ) S à n g l ọ c S P đ ể đ á n h g i á k h ả n ă n g t i ế t enzyme bằng cách gắn các SP quan tâm với một gen đích là đoạn gen mã hóa choprotein trưởng thành của một đối tượng enzyme quan tâm là phương pháp hữu hiệutrong sàng lọc tăng cường hoạt tính của chủng tái tổ hợp Từ đó đánh giá khả năngtiếtenzymevàcóthểthấyđƣợctầmquantrọngcủaSPtrongquátrìnhtiết(Brockmeier, 2006; Ying et al., 2012; Fan et al., 2011) Hiện nay, có rất nhiều cáccông trình nghiên cứu của các tác giả khắp nơi trên thế giới về ảnh hưởng của SPlên khả năng tiết enzyme (Itoh et al., 1990; Yarimizu et al., 2015; Nakamura &Takase, 1990; Pechsrichuang et al., 2016; Jonet et al., 2012; Borchert &
Nagarajan,1991a;Chen&Nagarajan,1994;Brockmeier,2006;Sakakibaraetal.,1993;Songetal.,2015; Lowetal.,2013;Saengkerdsubetal.,2013;Goethe- universita,1996)
Đột biếnpeptidetínhiệu
Enzymelà ch ất xúc tác si nh họ cch o nhiềun gàn hc ôn g nghiệp k hác nha u: hóa chất nông nghiệp,chất tẩy rửa, tinh bột,hàng dệt, chăm sóc cán h â n , b ộ t g i ấ y và giấy, chế biến thực phẩm và thức ăn gia súc Dựa trên việc ứng dụng của cácenzyme trong quy trình công nghiệp khác nhau, rất nhiều cải tiến trong sản xuất thuhồi hồi enzyme đã đƣợc thực hiện nhằm nâng cao hiệu suất của quá trình, tính kinhtế và tính khả thi Để thực hiện đƣợc điều này các enzyme trong công nghiệp cầnphải có một số cải biến nhằm đáp ứng đƣợc nhu cầu về số lƣợng, tính chất củaenzyme Một số phương pháp có thể được cải thiện nhằm tăng lượng enzyme thuhồi nhƣ: tạo enzyme tái tổ hợp, tối ƣu hóa điều kiện nuôi cấy hoặc có thể can thiệpvào quá trình vận chuyển protein bằng cách tác động vào một số yếu tố tham giatrong con đường tiết của enzyme quan tâm Yêu cầu việc cải thiện tính chất củaenzymetrongcôngnghiệpnhƣ:Độđặchiệubềmặt,mứcbiểuhiện,tínhhòata n, tính ổn định, độ hoạtđ ộ n g , t í n h c h ọ n l ọ c , h o ặ c đ ộ b ề n n h i ệ t , s ự d u n g n ạ p đ ố i v ớ i các dung môi hữu cơ… Dựa trên trình tự gen, trình tự axit amin của một enzymenhiều phương pháp được áp dụng nhằm cải thiện các đặc tính khác nhau của cácenzymemục tiêu bằngcách tạo ra các đột biến trình tựD N A m ã h ó a c h o e n z y m e đó Các phương pháp có thể được áp dụng nhƣ đột biến điểm và đột biến ngẫunhiên….Đ ộ t b i ế n t h ê m / b ớ t h o ặ c t h a y t h ế c á c a x i t a m i n c ụ t h ể Đ ộ t b i ế n n g ẫ u nhiên là một đột biến đƣợc tạo dọc theo chiều dài gen ở vị trí bất kỳ nhờ ep – PCRhayerror prone PCR (Rabbaniet al., 2011) Đối với các trình tự SP đã biết, có thể nghiên cứu sử dụng đột biến địnhhướng để có thể đánh giá tác động hay ảnh hưởng đến quá trình tiết của mộtenzyme (Borchert & Nagarajan, 1991a; Simonen & Palva, 1993; Caspers et al.,2010b, Ismail et al., 2011; Han et al., 2017 ) Các SP tiết trong Sec/P luôn có cấutrúc 3 vùng với các chức năng khác nhau đƣợc biết đến với độ dài đoạn SP của genα–amylase từ chiBacillusbao gồm khoảng 25 - 40 aa Những đột biến tạo thànhđược thiết kế dựa trên SP ban đầu đồng thời có thế áp dụng các phương pháp nhƣ:đột biến điểm (SDM – site directed mutagenenesis) hay sử dụng error prone PCR,đột biến thêm đoạn, đột biến mất đoạn hoặc có thể tạo đột biến bằng các conđườngtổnghợphóahọcnhằmthaythếvịtrímongmuốntrướckhighéptrởlạigen.Phương pháp gây đột biến ở mức bão hòa là một phương pháp được sử dụng rấtnhiều và là công cụ hữu hiệu để có thể thực hiện đƣợc mục đích này bằng việc thaythế các axit amin thông qua PCR Quá trình tiết tự nhiên của sản phẩm trong chủngchủ là không cao, do đó, việc biểu hiện ở mức cao các enzyme công nghiệp mongmuốn có thể dẫn tới lỗi trong sự gấp cuộn các protein (Schallmey et al., 2004) và cóthể gây lỗi trong sự biểu hiện từ đó không thu đƣợc các protein mongmuốn(Harwood & Cranenburgh, 2008) Nhằm mục đích đánh giá tác động cũng nhƣ vaitrò của các vùng trên SP đối với quá trình tiết enzyme quan tâm (Borchert &Nagarajan, 1991a; Simonen & Palva, 1993; Caspers et al., 2010b) và để tăng cườngkhả năng tiết enzyme ngoại bào, đoạn SP của gen thường được gây đột biến bằngcáchthêmđoạnvàovịtrínàođóhoặcthayđổicácaxitaminnhằmbiếnđổiđi ện tích trên đoạn SP ở vùng này (Suominen et al., 1990; Itoh et al., 1990; Southgate etal.,1993;Yamabhaietal.,2008).
Theo Brockmeier và các nghiên cứu của các tác giả khác có thể sử dụngpeptide tự nhiên, thông qua quá trình nghiên cứu gây đột biến tạo ra các peptide tínhiệu mạnh tăng cường tiết enzyme Tăng tiết enzyme quan tâm thì có thể làm tănglượng enzyme thu hồi, vì vậy, phương pháp chiếm ưu thế và sử dụng rộng rãi hiệnnay để tăng hoạt tính enzyme đó là can thiệp vào quá trình tiết enzyme Ở đây chothấy rõ tầm quan trọng của các nhân tố tiết mà SP lại là nhân tố chính (Brockmeieret al., 2006b; Caspers et al., 2010a; Brockmeier et al., 2006a,c; Caspers et al.,2010b) Với các đột biến mong muốn bao gồm: đột biến thay đổi điện tích đầu Nbằng việc bổ sung một axit amin tích điện âm hoặc không mang điện tích; đột biếnlàm tăng hoặc giảm tính kỵ nước của vùng H, rút ngắn cấu trúc vùng H làm chậmđộng học của quá trình; đột biến trên vùng C hay thay đổi axit amin tại vị trí nhậnbiếtphâncắtcủaSPnhằmtăngcườngkhảnăngtiếtenzymemongmuốn.
MặcdùvùngNkhôngđóngvaitròquantrọngchoquátrình tiếtnhƣvùngH,nhƣng khi SP có chứa 1 vùng N –acidic, protein sẽ đƣợc tiết chậm hơn Xem xétcác tác động của biến đổi điện tích đầu N, có thể kết luận rằng sự hiện diện của cácđiện tích dương điển hình không hoàn toàn cần thiết để quá trình tiết xảy ra mặc dùcác điện tích dương thấp hoặc bằng không dẫn đến làm giảm bài tiết protein.Điềunày phù hợp với các công bố trước đó cho các sinh vật khác nhƣ nghiên cứu củaGennity và cs ởE coli(Gennity et al.,
1990) và công bố của Chen và Nagarajan ởBacillus (Chen & Nagarajan, 1994).
Loại SP duy nhất hoàn toàn đòi hỏi một điệntíchdương(mặcdùcóthểlàmgiảmhoạttính)đểtrựctiếptiếtlàSPtiếtlevansucrase trongBacillus (Borchert & Nagarajan, 1991a) Trong nghiên cứu độtbiến ở vùng H, việc thêm một axit amin không tích điện, phân cực trong vùng nàyhoặc rút ngắn các axit amin luôn có ảnh hưởng tiêu cực đến khả năng tiết Điều nàychỉ ra rằng, cần phải duy trì một chuỗi các axit amin kỵ nước liên tục ở mức độ nhấtđịnh và không bị gián đoạn trong các SP Từ thí nghiệm của các tác giả đã công bốvớicácSPkhácnhau,Pagevàcộngsựđãđưarakếtluậnvềsựtươngquangiữa chiều dài của lõi kỵ nước và mức tiết xylanase trongS lividans(Pagé et al.,
1996).IzardvàKendallđãđưarađánhgiávềSPcủaE.coli,tínhkỵnướccủacácđộtbiếntại lõi kỵ nước có thể làm rối loạn quá trình vận chuyển các chuỗi polypeptide làmcho chúng không xảy ra hoặc sự tương tác quan trọng trong quá trình vận chuyểnkhôngđƣợchoànthành (Izardetal.,1996).Hiệuquảcủaviệctạocáccácđộtbiếnởcấp độ phiên mã có vẻ là một chủ đề gây tranh cãi Đột biến SP có ảnh hưởng mứcđộ phiên mã của mRNA và hiệu suất dịch mã ở cảE. colivàBacillus(Nakamura etal., 1989; Gennity et al., 1990; Itoh et al., 1990) Vùng đầu C là nhân tố quan trọngtrong quá trình, nó đƣợc sử dụng để nghiên cứu đột biến trình tự SP làm tăng tổnghợp enzyme Các phương pháp đột biến SP được sử dụng có thể là đột biến ngẫunhiên hoặc đột biến điểm (Borchert & Nagarajan,
Lagosetal.,2006).TácgiảBorchertvàNagarajan(BorchertandNagarajan., 1991)sử dụng levansucrase củaB amyloliquefaciennhƣ một proteinmô hình nhằm nghiên cứu cấu trúc và chức năng của 3 vùng trong cấu trúc củaSPtrongBacillus(BorchertandNagarajan,1991a;Simonen&Palva,1993)
Sửdụngchủng chủđãđƣợc cải biếndi truyền
Một nhân tố chính ảnh hưởng đến quá trình biểu hiện protein trong chủngchủ đƣợc phát hiện nữa chính là do quá trình biểu hiện một lƣợng lớn protease củachính loàinày vìthế chủngB.subtilisWB600 (cắt bỏ6 gen),B. subtilisW B 7 0 0(cắt bỏ 7 gen mã hóa protease),B subtilisW800 (cắt bỏ 8 gen mã hóa protease)
…đƣợc sử dụng làm tăng hiệu suất biểu hiện Các nghiên cứu gần đây cho thấy khôngchỉ các protease được tiết mới ảnh hưởng đến khả năng tiết enzyme của các chủngtái tổ hợp mà còn có một protease liên kết màng nhƣ CWBP52 và CWBP53 là sảnphẩm của gen wprA Mặc dù 2 protein này không thể hiện hoạt tính serin proteasenhƣng khi bất hoạt gen wprA của chủngB.subtilisWB800 lại cho thấy tăng tiếtprotein WprA có thể phân hủy protein biểu hiện bao gồm cả staphylokinase và α- amylase(Leeetal.,2000;Stephensonetal.,1998).
α-AMYLASE
Cấu trúccủaα –amylase
Alpha- amylasel à e n z y m e c ó c h ứ a i o n C a 2+ vàc ó c ấ u t r ú c đ a v ù n g v ớ i 3 vùngc h í n h A, B , C T r o n g đ ó , v ù n g A g i ữ v a i t r ò t r u n g t â m c h ứ a s i ê u c ấ u t r ú c (β/α)8điển hình hoặc vùng xúc tác TIM (triose phosphate isomerase) với một cấutrúc cuộn đa đối xứng của 8 chuỗi β bao quanh bởi 8 vòng xoắn, một dạng cấu trúcđƣợc biết đến trong ít nhất là ở 9 họ của enzyme glycosyl hydrolase (Rivera et al.,2003).Mặcdùcósựđadạngvềhoạtđộngxúctácnhƣngvịtríhoạtđộngluônđƣợcđịnh vịở vị trí đầucuối Cacbon Vùng B vàC thông thườngở vịt r í đ ố i d i ệ n c ủ a cấu trúc này.Vòng liên kết của xoắn liền kề mang axit amin ở vị trí hoạt động.ThôngthườngvùngB đượchìnhthànhgiữa vùngcấutrúcnhôragiữasợibậc bavàxoắn bậc 3 của TIM barrel, đƣợc nằm giữa hai vùng A - C và đƣợc liên kết vớivùng A bằng liên kết disulphide (Henrissat & Bairoch, 1993; Ramachandran,2005).VùngCcócấutrúcgấpnếpβliênkếtvớicácvùngAbởimộtchuỗiđơnpolypeptide và tham gia vào sự ổn định cấu trúc cho vùng TIM bằng việc bảo vệvùng A khỏi dung môi Vị trí tâm hoạt động của α -amylase nằm ở giữa carboxylcuốicủa2vùngAvàB Canxi(Ca 2+) nằmgiữavùngAvàBvàcóthểđảmb ảo hoạt động ổn định của cấu trúc bậc ba và là chất hoạt hóa allosteric (Souza
&Magalhães, 2010; Zhang et al., 2017) Một số enzyme có thêm vùng D chức năngchƣa đƣợc xác định và vùng E có khả năng liên kết với tinh bột sống (SBD) (đặcbiệt cyclodextrin glucanotransferase) và cả 2 vùng này nằm ngay sau vùng C. Tuynhiên,trongmộtsốtrườnghợpnhưglucoamylase(EC3.2.1.3)vùngliênkếttinhbộtcó mặt tại đầu N của protein (Ramachandran, 2005; Souza & Magalhães, 2010).Vùng liên kết tinh bột (SBD) dài khoảng 100 axit amin và gắn tại đầu cuối C trừtrường hợp SBD ở đầu N của glucoamylase ởRhizopus oryzae Chỉ có các vi sinhvật nhƣ: một số nấm sợi, vi khuẩn G dương, proteobacteria, vi khuẩn cổ, xạ khuẩnđƣợcbiếtđếncókhảnăngsinhα-amylasechứavùngnày(Janeček,2005;Ramachandran, 2005).Sựcần thiết cómặtSBD củacácenzymelà khácn h a u Trong trường hợp glucoamylase ởA nigerkhi loại bỏ vùng SBD, hoạt tính đối vớitinh bột sống thì giảm hẳn trong khi đó vẫn giữ hoạt tính tốt đối với tinh bột tan.Vùng SBD hoặc vùng E của CGTases khi bị cắt bỏ sẽ làm mất chức năng thủy phâncủa enzyme này Mặc dù có rất nhiều nghiên cứu về SBD và vai trò trong liên kếtvới tinh bột, tuy nhiên mối liên kết của SBD và vùng xúc tác vẫn chƣa đƣợc nghiêncứurõràng (Ramachandran,2005).
α-AmylasetừBacillus
Trong số các vi sinh vật sinh α-amylase,Bacillusdường như có số loài lớnnhất và đa dạng nhất Hầu nhƣ các loài thuộc chi này đều có thể tìm thấy các chủngsinh α-amylase Phần lớn các chủngBacillussinh truởng và phát triển ở nhiệt độbình thuờng nhƣ các vi sinh vật ƣa ấm và α-amylase đƣợc tổng hợp bởi các loàiB.subtilis,B.stearothermophilus,B.licheniformis,B.amyloliquefaciens,B.circula ns,
B.coagulan,B.caldoliticus,B.acidocodaricus,B.megaterium…,trongđóB.subtilis , B. stearothermophilus, B licheniformisvàB amyloliquefaciens, đƣợc biếtđến là những loài sản xuất amylase tốt và được sử dụng rộng rãi trong sản xuấtthương mại cho các ứng dụng khác nhau (Mobini-dehkordi
2 0 1 5 ) T h e o quyluậtthìnhữngchủngsinhtruởngởnhiệtđộcaothìsinhα- amylasebềnởnhiệt độ cao hơn nhƣng trong giốngBacilluslại thuờng gặp rất nhiều chủng sinh truởng,phát triển ở nhiệt độ không cao nhƣng lại sinh α-amylase bền nhiệt Chính tính chấtđặc biệt này củaBacillusđã làm cho nó trở thành một đối tuợng đuợc quan tâmnghiên cứu để thu nhận các loại enzyme công nghiệp Nhóm tác giả Trần Đình Mấnvà cs đã có nhiều nghiên cứu phân lập, tách dòng cũng nhƣ biểu hiện gen mã hóacho α-amylase từBacillusđặc biệt là đối tƣợngB licheniformisvà còn nhiều loàikhácthuộcchinàyphânbốởbiểncũngnhư ởsuốinướcnóngtrảidàitrêncảnước:Mỹ lâm, Bình Châu, Đảnh Thạnh, La Phù…(Nguyễn Thanh Huyền và cs., 2004;Trần Đình Mấn vàcs.,2011)nhằm tìm và phát hiệncác genmãh ó a c h o e n z y m e này ở các nguồn đặc trƣng (Trần Đình Mấn và cs., 2004; Trần Đình Mấn, 2001;TrầnĐìnhMấnvàSchweder,1999). α-amylase bền nhiệt tái tổ hợp ứng dụng trong công nghiệp
AmylasetừB.licheniformis:CácchủngthuộcloàiB licheniformischínhlàđại diệnquantrọngnhấttrongnhómBacillussinhα-amylasebềnnhiệt.Mộtvídụ điển hình là enzyme α-amylase bền nhiệt Termamyl nổi tiếng của hãng Novocũng đã đuợc thu nhận từ loài này. Mặc dù các chủng thuộc loài này phát triển ởnhiệt độ không cao lắm (37 ÷ 50˚C), nhƣng α-amylase của các chủng này lại cót˚opt rất cao (75 ÷ 90˚C) và rất bền nhiệt Cho đến nay có lẽ đây là loài có α- amylasebềnnhiệtcaonhấttrongnhómBacillus(Pandeyetal.,2000).B.licheniformisNH1 thu được enzyme α - amylase có kích thước 58kDa, hoạt động ởdải pH rộng 4-9 ở nhiệt độ tối ƣu là 90 o C (Sharma & Satyanarayana, 2013).B.licheniformis3BT2 tiết α - amylase có kích thước 58kDa, nhiệt độ tối ưu là 80 o C(Trần Đình Mấn và cs., 2004; Trần Đình Mấn, 2001; Trần Đình Mấn và Schweder,1999)
Alpha-amylase bền nhiệt tái tổ hợp ứng dụng trong công nghiệp amylase từ B subtilis: α-amylase của các chủng này thường hoạtđộngởnhiệtđộtốiưuchỉtừ40÷55˚CvàpHhoạtđộng5÷7.Tuynhiên,cómộtsố chủngB subtilisđƣợc tìm thấy có khả năng sinh α – amylase có trọng lượngphântửđạt54–57kDa,pHtốiưu5.4–6.5,vànhiệtđộtốiưu50–80 o C(Pandeyetal., 2000).Bukhari và cộng sự đã phân lập đƣợc chủngB subtilis10-R từ đất sinhtổnghợpα- amylasehoạtđộngởdảipHrộngtừ5.0–9.0vớidãynhiệtđộtương đối lớn 25 – 80 o C và chỉ mất 38% hoạt tính khi đƣợc xử lý ở 80 O C (Bukhari
&Rehman,2015). α -amylase bền nhiệt tái tổ hợp ứng dụng trong công nghiệp Amylase từ các loài khác thuộc chi Bacillus: α - amylase củaB. lentuscókhối lƣợng phân tử khoảng 42 kDa và hoạt động ở pH từ 6.1 và nhiệt độ tối ƣu70 o C;B.megaterium(KLPTcủaenzymeđạt59kDa).Mộtsốloàithuộcc h iBacilluscònđ ƣợcbiếtđếnvớikhảnăngsinhα-amylasecótrọnglƣợngphântửrấtlớn 97 – 150 kDa và enzyme α - amylase thu đƣợc từ các loài này đạt độ hoạt độngtốt ở pH 5.5 – 12.0 và dải nhiệt độ hoạt động cũng rất đa dạng, từ 37 – 90 o C α -amylase của các chủng thuộcB amyloliquefacienscó khả năng hồ hoá tinh bột rấtmạnh, nhƣng độ bền nhiệt của enzyme không cao chỉ có một số ít chủng có khảnăng sinh α-amylase bền nhiệt (Nusrat & Rahman, 2007).B amyloliquefaciensP-001 hoạt độngở pH 5.5– 8.0 và nhiệt độ hoạt động củaenzymetrong dải 37–
70 o C.Ngoàira,αamylasecònđượctìmthấycótrongB.methylotrophicusP11-amylase bền nhiệt tái tổ hợp ứng dụng trong công nghiệp2cókích thước khoảng 44kDa nhiệt độ và pH tối ưu cho hoạt động tương ứng 70 o C và7.0(Xieet al., 2014).
α-Amylasetừ cácvisinhvậtkhác
Amylase là enzyme có trong: thực vật, động vật và vi sinh vật Ngày nay, sốlƣợng lớn các enzyme amylase từ vi sinh vật đã đƣợc ứng dụng trong các quá trìnhcông nghiệp và các enzyme này đã thay thế hoàn toàn cho việc sử dụng hóa chất đểthủy phân tinh bột trong công nghiệp chế biến tinh bột trước đây (KiroMojsov,2012;M o b i n i - d e h k o r d i & J a v a n , 2 0 1 2 ; N a i d u , 2 0 1 3 ; S o u z a & M a g a l h ã e s , 2 0 1 0 ; Sundarram&Murthy, 2014;Ray, 2015).
Vi sinh vật ƣa nhiệt và siêu ƣa nhiệt, vi khuẩn cổ có ở những nơi có nhiệt độrất cao 80 ÷ 100˚C Nhiệt độ phát triển cao nhất của những chủng này có thể lên tới110˚C Vi sinh vật cổ là nhóm nằm ở đỉnh rễ của cây di truyền và là đối tƣợngnghiên cứu ở nhiều phòng thí nghiệm trên thế giới về cấu trúc và chức năng củaprotein siêu bền nhiệt Các enzyme α-amylase bền nhiệt hiện nay còn thu đƣợc từcác loài:Geobacillus thermoleovoranscó nhiệt độ hoạt động tối ƣu ở 70 o C, pH7(Souza&Magalhães,2010;Yavuzetal.,2004),Pyrococcuswoesei(Pandeyetal.,
2000),Pyrococcusfuriosus(Wangetal.,2016b),vàThermococcusprofundus(Chung et al., 1995; Pandey et al., 2000; Nguyen, 2003), ngoài ra enzyme này cònđƣợc phát hiện có mặt trong một số vi khuẩn siêu ƣa nhiệt đƣợc tìm thấy nhƣThermococcale(Landry et al., 2003) vàSulfolobus(Worthington et al., 2003). Nhiệtđộ hoạt động tối ƣu của các enzyme này là ở 100 o C và 80 o C Gen mã hóa cho cácα-amylase ngoại bào từP furiosusgần đây dã đƣợc tách dòng, tái tổ hợp và biểuhiện trongB. subtilisvàE coli Các enzyme ngoại bào α-amylase bền nhiệt cao ở130 0 CcủaPyrococcusrấtphùhợpchoviệcứngdụngtrongcôngnghiệp(Padayachee,20 06).α-Amylasebềnnhiệtcủavisinhvậtcổđãđuợctìmthấyởcác chủngPyrococcussp KOD1;P woeseiDSM 3773;P furiosus;Thermococcussp.
RT3;T.profundus;T litoralis;Dictyolglomus thermophilum;Fervidobacteriumsp.;Natronococcus amylolyticus;Thermotoga maritima…(Pandey et al., 2000).Hầu hết các α-amylase của các loài này có t˚opt 90 ÷ 100˚C.Nhiệt độ hoạt động tốiđa cóthể caohơn120˚C,có loạiở 130˚Cvẫn còn20% hoạttínhnhƣα-amylase của
Các loài thuộc chiClostridiumnhƣ:C acetobutylicum, C.butricum,
C.thermohydrosulfuricum,C.thermosulfurogenes(Pandeyetal.,2000)vàThermoanae robacter(Hobel, 2004) cũng có khả năng sinh tổng hợp α-amylase.Phầnl ớ n α - a m y l a s e c ủ a n h ó m n à y c ó t ˚ o p t 7 5 ÷ 9 0 ˚ C v à p H o p t 5 , 5 ÷ 6 , 5 T u y nhiên, α - amylase củaC acetobutylicumđƣợc biết đến có khối lƣợng phân tửkhoảng 84.000 Da và hoạt động ở pH 5,6 với nhiệt độ tối ƣu cho enzyme là 45 o C,củaC perfingenescó khối lƣợng phân tử khoảng 76.000Da, hoạt động ở pH 6,5 vànhiệtđộrấtthấpchỉkhoảng30 o C(Pandeyetal.,2000). α-Amylase của xạ khuẩn mới chỉ đuợc thu nhận ở một số chủng thuộc cácgiốngStreptomycesnhƣS.albus(ChinnaNarasaiahetal.,2014),S.griseusIMRU357
0,S thermocyaneoviolaceusvà đã cómột số côngbố vềt á c h d ò n g g e n mã hóa cho α-amylase ngoại bào của các loài này (Sevillano et al., 2016; CadenasRFetal.,1992).Ngoàira,hoạttínhα- amylasecònđƣợctìmthấytrongThermoactinomyces(Yokotaetal.,2001;Haki,2003).T hermoactinomycesvulgaris đượcbiếtđếncókhảnăngsinh α -amylasecókíchthướckhoảng53kDa,pHopt4.8
(A.niger,A.oryzae,A.awamori,A.fumigatus(Sundarram&Murthy,2014)),Thermomyc eslanuginosus(Padayachee,2006;Pandeyetal.,2000),Penicilliumexpansum,P.brunne um,P.fellutanum,P.chrysogenumvà cả một số loài thuộc chiMucor(Domsch et al.,
1995;Petruccioli &Federici, 1992) đã đƣợc sử dụng phổ biến nhất để sản xuất α-amylase. Nấm mốcđƣợc biết đến chủ yếu sinh α - amylase hoạt động ở nhiệt độ trung bình khoảng từ30–55 o CvàpHtừaxitđếntrungtínhnhư:A.flavus(kích thước52-75kDa,pHopt
6.0 – 7.0 và topt= 30 - 55 o C),A fumigatus(kích thước 65 kDa, pHopt5.5 và topt@ o C),A oryzae(kích thước 50 - 52 kDa, pHopt4 – 5.3 và topt= 44 - 50 o C) (Pandeyet al., 2000) Chỉ có một số ít chủng nấm mốc sinh α-amylase bền nhiệt nhƣAspergillussp.K-amylase bền nhiệt tái tổ hợp ứng dụng trong công nghiệp
27(Abeetal.,1988);MyceliophthoratherrmophilaD 1 4(Sahukhan et al., 1993)vàTalaromyces helicus(Olagoke, 2014).Cácα - a m y l a s e này có ƣu điểm là thuỷ phân tinh bột sâu hơn các α-amylase từ vi khuẩn và bền ởvùngpHthấpkhoảng4,0÷5,0. Đạid i ệ n c ủ a α - a m y l a s e b ề n n h i ệ t t ừ n ấ m m e n l à α - a m y l a s e c ủ a c h ủ n gCryptococcussp.S-2 có khả năng thuỷ phân tinh bột sống.Cryptococcus flavuscóhoạttínhα- amylasehoạtđộngở50 o C,pH5.5(Souza&Magalhães,2010;Wanderley et al., 2004).Lypomyces kononenkoaeđƣợc biết có khả năng sinh α -amylasecủangoạibàođạt0.8g/ lvàenzymethuđượccókíchthướckhoảng76kDa,pHoptcho hoạt động của enzyme khoảng từ 4.5 - 5.0, và topt= 70 o C (Pandey et al.,2000).Saccharomyces kluyveriYKM5 đƣợc biết đến có khả năng sinh α - amylasecónhiệtđộtốiưu ở30 o C,pH5.0.ỞViệtNam,có mộtsốcáccôngtrìnhnghiêncứuvề α-amylase ở nấm men và tách dòng trình tự gen mã hóa cho enzyme này củachủngSaccharomycesfibuligena(LêVănTrườngvàcs.,1995;TrươngNamHảivàNôngVă n Hải,1996; TrươngNamHảivàPlelizer,1997). α-Amylase còn đƣợc tìm thấy tiết ngoại bào ởL plantarumA6,L. brevis.Mộtloạtcácvikhuẩncótrongdạcỏcủabònhƣ:Bacteroidesruminicola,
Ruminobacter amylophilus, Butyrivibrio fibrisolvens, Selenomonas ruminantium, vàStreptococcusbovis,Chromohalobactersp.,HaloBacillussp.,Haloarculahispanica,Halo monas meridiana, vàB.dipsosauri(Sundarram & Murthy,
2014)cũngđềucókhảnăngsửdụngtinhbột.ΑmylasemylasecònđƣợctìmthấytrongAeromonas cavie, B acidocaldarius(hoạt động ở 75 o C với kích thước khoảng160kDa,pHtốiưulà3),Alteromonashaloplanctis,Halobacterium(H. halobium,
H salinarum…), Micrococus luteus(trọng lƣợng phân tử của enzymeđ ạ t k h o ả n g 56 kDa, pHopt6.0, topt= 30 o C), M varians(trọng lƣợng phân tử của enzyme đạtkhoảng 14 – 56 kDa, pHopt7.0 và topt= 45 o C).Pseudomonsa stutzeri,
Pycnoporussanguineus, Rhizopus sp., schizophyllum commune, Filobasidium capsuligenum(cókhả năng tiết α - amylase khoảng 2mg/ml, trọng lƣợng của enzyme đạt khoảng 56kDa,pHopt5.6vàtoptE o C)…(Pandeyetal.,2000)
α-Amylasetáitổhợptrongvisinhvật
B brevistuy nhiênB licheniformisvà nhiều loài khác của chi này các vector chỉ cóthể biến nạp biểu hiện vào tế bào trần hoặc bằng xung điện Trong khi đó,B. subtiliscó thể biến nạpvàotế bào trần, biếnnạpbằng xungđiện,tiếphợp, tảin ạ p n ê n chúng đƣợc sử dụng rộng rãi với vai trò là chủng chủ tách dòng và biểu hiện gen.B.subtilist i ế tí t n h ấ t 7 p r o t e a s e n g o ạ i b à o b a o g ồ m : a l k a l i n e p r o t e a s e ( s u b t i l i s i n , aprE),neutralproteases(nprEvànprB),metalloproteaseE(mpr),và3 serineproteases (epr, bpf, vpr) Các protein tự nhiên của chiBacillusđều có khả năngchống lại tác dụng của các protease này, tuy nhiên các protein tái tổ hợp lại cho thấyrất nhạy cảm với sự có mặt của chúng Hai enzyme đầu tiên là aprE, nprE chiếmkhoảng96–
9 8 % hoạtt ín hp ro te asec ủatế bà o Các chủngcôn gn g h i ệ p dùngđể biểu hiện protein tái tổ hợp thường được xóa bỏ 6-8 loại protease ngoại bào (Terpe,2006) Wu và cs (1991) đã loại bỏ 6 enzyme ngoại bào và chỉ giữ lại 0.32% hoạttính.K h i b ổ s u n g v à o m ô i t r ƣ ờ n g n u ô i c ấ y 2 m M P M S F , h o ạ t t í n h p r o t e a s e c ủ a chủng nghiên cứu sẽ bị mất Gen mã hóa α amylase kiềmB. alcalophilusJN21(CCTCC NO.M 2011229) đƣợc tách dòng và biểu hiện trongB. subtilisW600 bằngvector biểu hiện pMA5 hoạt tính enzyme thu đƣợc là 415U/ml, pH hoạt động 7,0-
11,t 10U/ml chiếm 22,31 % (29chủng) trong khi đó hoạt tính enzyme đƣợc xác định với hàm lƣợng
