Nghiên cứu công nghệ sản xuất asparaginase trên hệ thống lên men chìm sục khí 100 lít

Khóa luận tốt nghiệp Viện Đại học Mở Hà Nội LỜI CẢM ƠN Khóa luận tốt nghiệp thực hướng dẫn ThS Nguyễn Thị Hương Trà – Bộ môn Nghiên cứu công nghệ sinh học sau thu hoạch Viện Cơ điện Nông nghiệp Công nghệ sau thu hoạch Với kính trọng lịng biết ơn sâu sắc, xin gửi lời cám ơn chân thành đến ThS Nguyễn Thị Hương Trà, người định hướng nghiên cứu, hướng dẫn, bảo tận tình ln đồng hành giúp đỡ tơi q trình hồn thành khóa luận Tơi xin cảm ơn tới tồn thể cán làm việc Bộ mơn Nghiên cứu Công nghệ sinh học sau thu hoạch - Viện Cơ điện Nông nghiệp Công nghệ sau thu hoạch, người giúp đỡ tạo điều kiện tốt cho thời gian thực khóa luận Tơi xin chân thành cảm ơn thầy cô khoa Công nghệ sinh học- Viện Đại học Mở Hà Nội, giảng dạy truyền đạt kiến thức quý báu suốt thời gian học tập phấn đấu trường Cuối cùng, xin cảm ơn gia đình bạn bè giúp đỡ ủng hộ tơi suốt q trình học tập hồn thành khóa luận Hà nội, ngày 15 tháng 05 năm 2015 Người thực Phạm Nguyệt Hằng Phạm Nguyệt Hằng Lớp: CNSH-1103 Khóa luận tốt nghiệp Viện Đại học Mở Hà Nội MỤC LỤC DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT i DANH MỤC HÌNH CÁC HÌNH .ii DANH MỤC CÁC BẢNG iii MỞ ĐẦU MỤC TIÊU NỘI DUNG NGHIÊN CỨU PHẦN I: TỔNG QUAN 1 Giới thiệu chung asparaginase 1.1.1 Sự phân bố asparaginase tự nhiên 1.1.2 Cấu tạo đặc tính 1.1.3 Ứng dụng 1.2 Giới thiệu acrylamide 1.2.1 Khả gây bệnh 1.2.2 Cơ chế hình thành acrylamide thực phẩm 1.2.3 Phương pháp giảm acrylamide sản xuất bánh nướng 1.2.4 Cơ chế xúc tác asparaginase 1.3 Nghiên cứu sản xuất asparaginase giới 1.4 Nghiên cứu sản xuất asparaginase đề tài 14 PHẦN II VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 15 2.1 Vật liệu 15 2.1.1 Đối tượng 15 2.1.2 Hóa chất 16 2.1.3 Môi trường 17 2.1.4 Thiết bị dụng cụ 19 2.2 Phương pháp 20 2.2.1 Làm tươi chủng giống 20 2.2.2 Nhân giống cấp 20 2.2.3 Nhân giống cấp 20 2.2.4 Lên men 20 Phạm Nguyệt Hằng Lớp: CNSH-1103 Khóa luận tốt nghiệp Viện Đại học Mở Hà Nội 2.2.5 Ảnh hưởng tốc độ khuấy 21 2.2.6 Nghiên cứu thu hồi asparaginase 21 2.2.7 Phương pháp xác định asparaginase 22 2.2.8 Xác định hoạt độ asparaginase 24 PHẦN III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 27 3.1 Nghiên cứu sản xuất asparaginase hệ thống lên men chìm sục khí 100 lít 27 3.1.1 Nghiên cứu sản xuất asparaginase hệ thống lên men chìm sục khí 100 lít tốc độ khuấy 250 rpm 27 3.1.2 Nghiên cứu sản xuất asparaginase hệ thống lên men chìm sục khí 100 lít tốc độ khuấy 300 rpm 30 3.1.3 Nghiên cứu sản xuất asparaginase hệ thống lên men chìm sục khí 100 lít tốc độ khuấy 350 rpm 33 3.2 Nghiên cứu thu hồi asparaginase 37 3.3 Xây dựng quy trình cơng nghệ sản xuất asparaginase hệ thống lên men chìm sục khí 100 lít 41 KẾT LUẬN 47 TÀI LIỆU THAM KHẢO 48 Phạm Nguyệt Hằng Lớp: CNSH-1103 DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT rpm Rounds per minute (vòng/phút) vvm Volume of air per volume of fermetation solution per minute (thể tích khí/thể tích dịch lên men/phút) l/m Litter/minute (lít/phút) w/v Weight/volume (trọng lượng/thể tích) U/g Unit/gram (đơn vị/gam) U/l Unit/litter (đơn vị/lít) U/ml Unit/milliliter (đơn vị/mililit) kDa Kilodalton Da Dalton mA Miliampe µl microlitter SDS-PAGE Sodium dodecyl sunfate-polyacrylamide gel electrophoresis JECFA (Joint FAO/WHO Expert Committee on Food Additives) Hội đồng chuyên gia chung Tổ chức Nông lương (FAO) Tổ chức Y tế giới (WHO) phụ gia thực phẩm FDA (Food and Drug Administration) Cục Quản lý thực phẩm dược phẩm Hoa Kỳ FAO (Food and Agriculture Organization) Tổ chức Nông lương WHO (World Health Organization) tổ chức Y tế giới Phạm Nguyệt Hằng i Lớp: CNSH-1103 DANH MỤC HÌNH CÁC HÌNH Hình 1.1 Cơ chế tác dụng asparaginase q trình phát triển mơ khối u Hình 1.2 Cơ chế phản ứng hình thành acrylamide Hình 1.3 Cơ chế xúc tác asparaginase Hình 1.4 Sơ đồ cơng nghệ sản xuất asparaginase từ chủng vi sinh vật tái tổ hợp 10 Hình 2.1 Đường chuẩn biểu thị mối tương quan OD450 lượng NH3 25 Hình 3.1 Động học trình lên men sản xuất asparaginase từ P pastoris SMD1168-pPIC9asp2 quy mơ 100 lít với tốc độ khuấy 250 rpm 30 Hình 3.2 Động học trình lên men sản xuất asparaginase từ P pastoris SMD1168-pPIC9asp2 quy mơ 100 lít với tốc độ khuấy 300 rpm 33 Hình 3.3 Động học trình lên men sản xuất asparaginase từ P pastoris SMD1168-pPIC9asp2 quy mơ 100 lít với tốc độ khuấy 350 rpm 37 Hình 3.4 Phân tích protein dịch lên men điện di SDS-PAGE 39 Hình 3.5 Phân tích protein dịch lên men gel polyacrylamide khơng biến tính định tính hoạt tính asparaginase 40 Hình 3.6 Quy trình lên men asparaginase tái tổ hợp quy mơ 100 lít 41 Hình 3.7 Quy trình thu hồi asparaginase tái tổ hợp 43 Phạm Nguyệt Hằng ii Lớp: CNSH-1103 DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1 Tóm tắt cơng nghệ sản xuất asparaginase Novozymes DSM 11 Bảng 2.1 Công thức pha gel cô gel tách (cho gel) 22 Bảng 2.2 Công thức pha gel cô gel tách (2 gel) 23 Bảng 2.3 Công thức đổ đĩa thạch thử hoạt tính 24 Bảng 2.4 Thành phần phản ứng xác định hoạt độ asparaginase 26 Bảng 3.1 Bảng theo dõi thơng số q trình lên men P pastoris SMD1168-pPIC9asp2 với tốc độ khuấy 250 rpm 28 Bảng 3.2 Hoạt độ asparaginase dịch lên men khoảng thời gian khác 29 Bảng 3.3 Bảng theo dõi thông số trình lên men P pastoris SMD1168-pPIC9asp2 với tốc độ khuấy 300 rpm 31 Bảng 3.4 Hoạt độ asparaginase dịch lên men khoảng thời gian khác 32 Bảng 3.5 Bảng theo dõi thông số trình lên men P pastoris SMD1168-pPIC9asp2 với tốc độ khuấy 350 rpm 34 Bảng 3.6 Hoạt độ asparaginase dịch lên men khoảng thời gian khác 36 Phạm Nguyệt Hằng iii Lớp: CNSH-1103 MỞ ĐẦU Asparaginase (EC 3.5.1.1) hay cịn có tên gọi khác L-asparaginase amidohydrolase; asparaginase II; L-asparaginase; colaspase; elspar; leunase; crasnitin; α-asparaginase Asparaginase đại phân tử có cấu trúc phân tử C1377H2208N382O442S17 Asparaginase enzym xúc tác cho trình thủy phân axit amin L-asparagine thành axit aspartic ammonia Hiện nay, asparaginase thường ứng dụng công nghiệp thực phẩm dược phẩm Trong công nghiệp thực phẩm, asparaginase sử dụng chất phụ gia dùng để bổ sung vào trình chế biến thực phẩm nhằm làm giảm hình thành acrylamide thực phẩm Hãng Novozymes (Đan Mạch) DSM (Pháp) sản xuất thương mại hóa thành cơng asparaginase tái tổ hợp từ chủng nấm sợi biến đổi gen tương ứng A oryzae A niger để ứng dụng công nghiệp thực phẩm Tên thương mại sản phẩm asparaginase từ A oryzae Acrylaway® cịn asparaginase từ A Niger PreventASeTM Trong khn khổ đề tài này, nhóm đề tài đề tài "Nghiên cứu sản xuất enzym asparaginase tái tổ hợp, ứng dụng giảm lượng acrylamide tạo thành sản xuất bánh nướng" xây dựng quy trình cơng nghệ sản xuất asparaginase từ chủng P pastoris SMD1168 tái tổ hợp mang gen pPIC9asp2 hệ thống lên men chìm sục khí lít Bằng phương pháp điện di kiểm tra gel acrylamide, ép gel định tính hoạt tính định lượng phương pháp so màu cho thấy lần lên men, asparaginase biểu thành cơng có hoạt tính Tạo chế phẩm asparaginase dạng bột phương pháp đơng khơ có bổ sung chất bảo vệ maltodextrin với tỷ lệ maltodextrin : dịch enzym 0,5:1 (w/v) Chế phẩm có hoạt độ asparaginase khoảng 3800 U/g, độ ẩm 5% Với mong muốn sản xuất thử nghiệm asparaginase quy mô lớn, tiến hành thực nội dung ”Nghiên cứu công nghệ sản xuất asparaginase hệ thống lên men chìm sục khí 100 lít” dựa thơng số quy trình lên men hệ thống lên men chìm sục khí lít Phạm Nguyệt Hằng Lớp: CNSH-1103 MỤC TIÊU Có thơng số cơng nghệ quy trình lên men sản xuất asparaginase từ P pastoris SMD1168-pPIC9asp2 hệ thống thiết bị lên men chìm sục khí dung tích 100 lít NỘI DUNG NGHIÊN CỨU - Nghiên cứu sản xuất asparaginase hệ thống lên men chìm sục khí 100 lít tốc độ khuấy 250 rpm - Nghiên cứu sản xuất asparaginase hệ thống lên men chìm sục khí 100 lít tốc độ khuấy 300 rpm - Nghiên cứu sản xuất asparaginase hệ thống lên men chìm sục khí 100 lít tốc độ khuấy 350 rpm - Nghiên cứu thu hồi asparaginase - Xây dựng quy trình cơng nghệ sản xuất enzyme asparaginase hệ thống lên men chìm sục khí 100 lít Phạm Nguyệt Hằng Lớp: CNSH-1103 PHẦN I: TỔNG QUAN 1 Giới thiệu chung asparaginase 1.1.1 Sự phân bố asparaginase tự nhiên Asparaginae tổng hợp từ nhiều nguồn khác tự nhiên thực vật, vi sinh vật vi khuẩn, nấm, xạ khuẩn vv Vi sinh vật thường sử dụng cho sản xuất L-asparaginase Erwinia caratovora, Bacillus sp., Corynebacterium glutamicum E coli (Ashraf et al, 2003; Cammack et al, 1972; Wade et al, 1968) Nguồn vi khuẩn: Vi khuẩn thường sử dụng cho sản xuất L-asparaginase Erwinia caratovora, Bacillus sp., Corynebacterium glutamicum E coli (Ashraf et al, 2003; Cammack et al, 1972; Wade et al, 1968) Tổng hợp asparaginase từ hai dòng đột biến, WF 933 Serratia marcescens nghiên cứu Thành phần môi trường lên men khác ảnh hưởng đến sản lượng enzym Sản lượng enzyme tối đa môi trường lên men chứa glycerol peptone Bên cạnh đó, trình lên men sản xuất asparaginase chịu ảnh hưởng số tác nhân nguồn carbon, nguồn nitơ với thông số khác độ pH, nhiệt độ Nguồn nấm men nấm mốc: Sản xuất asparaginase từ chủng khác nấm ghi nhận Các chủng sản xuất asparaginase thường sử dụng Aspergillus tamarii, Aspergillus terreus, A oryzae (Hendriksen, H., Kornbrust, B A., Stergaard, P and Stringer, M (2009) ) A niger Nguồn xạ khuẩn: xạ khuẩn phân lập từ đất vùng rễ thuốc Thái có khả sinh tổng hợp asparaginase Xạ khuẩn biển phân lập từ mẫu trầm tích vùng ven biển Parangipettai Cochin Nam Ấn Độ Sản xuất tinh chế asparaginase Streptomyces tendae TK-VL_333 Nguồn thực vật: Một loạt lồi thực vật mơ tả có khả sinh asparaginase Ớt xanh (Capsicum annum L.) me (Tamarindus indica) chứa lượng asparaginase định Gen mã hóa cho enzyme asparaginase phân lập từ thực vật Lupinus angustifolius Tuy nhiên, asparaginase thu từ chủng tự nhiên thường có sản lượng thấp, E coli - 255 U/g (đơn vị/g tế bào khô), Erwinia caratovora 40 - 450 U/g, Serratia marcescens 100 - 335 U/g (Gulati et al., 1997), A niger 70 U/l (Ferrara et Phạm Nguyệt Hằng Lớp: CNSH-1103 al., 2006) 1.1.2 Cấu tạo đặc tính Asparaginase (EC 3.5.1.1) hay cịn có tên gọi khác L-asparaginase amidohydrolase; asparaginase II; L-asparaginase; colaspase; elspar; leunase; crasnitin; α-asparaginase Asparaginase đại phân tử có cấu trúc phân tử C1377H2208N382O442S17 Asparaginase enzym xúc tác cho trình thủy phân axit amin L-asparagine thành axit aspartic ammonia L-asparaginase enzym bao gồm tiểu phần với tổng cộng 321 amino acid Tinh thể hình kim hay hình trụ, tan nước, không tan methanol, acetone, chloroform Độ bền vững: dạng tinh thể bền với nhiệt, pH, ánh sáng Khoảng pH bền vững 6,0 - 8,5 Điểm đẳng điện khoảng từ 5,0 - 6,8 Khối lượng phân tử khoảng 160 kDa Nhiệt độ tối ưu số vi sinh vật cho sản xuất enzym khoảng 37oC 1.1.3 Ứng dụng 1.1.3.1 Ứng dụng y học Asparaginase ứng dụng để điều trị bệnh bạch cầu lymphoblastic cấp tính (ALL) Nó sử dụng để điều trị số bệnh máu khác Asparaginase làm phân hủy hóa chất tế bào khối u Các tế bào khối u cần chất để làm cho protein tạo tế bào ung thư khác Mơ bình thường tổng hợp L-asparagine với lượng đủ cho trình tổng hợp protein Hầu hết mơ khối u cần tổng hợp asparaginase từ bên ngồi để sinh trưởng Asparaginase có tác dụng làm ngăn cản tổng hợp protein khối u Nó gây chết tế bào cách hoạt hóa q trình gây chết tế bào theo chương trình Do L-asparagine chất thiết yếu cho tăng trưởng tế bào khối u nên giảm cách tiêm asparaginase làm cạn nguồn dinh dưỡng cho phát triển khối u Phạm Nguyệt Hằng Lớp: CNSH-1103 ml dầu phá bọt 31 45,48 350 30 6,79 32 46,17 350 30 6,89 500 Tạo bọt, bổ sung ml dầu phá bọt 33 46,03 350 30 6,78 Kết soi kính hiển vi cho thấy suốt trình lên men chủng phát triển tốt, không bị tạp nhiễm Khả phát triển P pastoris SMD1168-pPIC9asp2 trình bày bảng 3.5 Nhìn vào số liệu bảng cho thấy, từ giai đoạn bắt đầu tiếp giống khoảng chủng phát triển chậm Đây giai đoạn chủng thích nghi với mơi trường Sau đó, chủng phát triển với tốc độ nhanh đạt đỉnh 32 với giá trị OD600nm đạt 46,17 Sau thời gian này, tiếp methanol 1% giá trị OD600nm có xu hướng giảm Để thu asparaginase với hoạt độ tối đa, dịch lên men thu sau 33 lên men Trong trình lên men, giá trị pH tương đối ổn định, dao động khoảng 6,5 - 7,1, số giai đoạn tạo bọt phải bổ sung dầu phá bọt Hoạt độ asparaginase xác định thời gian lên men 12, 20, 25, 31, 32, 33 Kết trình bày bảng 3.6 Bảng 3.6 Hoạt độ asparaginase dịch lên men khoảng thời gian khác Thời gian lên men 12 20 25 31 32 33 42 63 70 94 98 91 (giờ) Hoạt độ asparaginase (U/ml) Kết cho thấy hoạt tính asparaginase tăng dần theo thời gian lên men từ 12 đến 32 Tại 12 lên men hoạt tính asparaginase đạt 42 U/ml Hoạt tính enzym đạt cao 98 U/ml 32 lên men giảm xuống 91 U/ml sau 33 lên men So sánh với lên men tốc độ khuấy 300 rpm với tốc độ khuấy này, P Phạm Nguyệt Hằng 36 Lớp: CNSH-1103 pastoris SMD1168-pPIC9asp2 phát triển hoạt độ enzym thấp Điều trình lên men tạo nhiều bọt việc bổ sung dầu phá bọt giảm mức độ thoáng khí nên ức chế phát triển vi sinh vật Bên cạnh đó, tốc độ khuấy lớn làm tế bào va đập mạnh vào thành tăng lên men nên ảnh hưởng đến cấu trúc phát triển tế bào Việc tạo bọt trình lên men dễ gây nhiễm vi sinh vật ngoại lai Vì chúng tơi lựa chọn tốc độ khuấy thích hợp cho lên men P pastoris SMD1168-pPIC9asp2 hệ thống lên men chìm sục khí 100 lít 300 rpm, trình lên men dừng mật độ tế bào giảm Hình 3.3 Động học trình lên men sản xuất asparaginase từ P pastoris SMD1168-pPIC9asp2 quy mơ 100 lít với tốc độ khuấy 350 rpm 3.2 Nghiên cứu thu hồi asparaginase Đề tài nghiên cứu thu hồi asparaginase từ dịch lên men phương pháp thẩm tích, tủa protein amonium sulphate + thẩm tích loại muối lọc tiếp tuyến + đặc mẫu Đã lựa chọn lọc tiếp tuyến cô đặc mẫu cho thu hồi enzym Quy trình thu hồi asparaginase từ dịch lên men lên men P pastoris SMD1168-pPIC9asp2 hệ thống lên men chìm sục khí 100 lít áp dụng theo quy trình thu nhận nghiên cứu trước lọc tiếp tuyến đặc mẫu lọc tiếp tuyến trao đổi đệm Dịch enzym sau lên men loại xác tế bào hệ thống lọc tiếp tuyến với màng lọc 0,2 µm (Cross Flow Fiber Cartridge, GE Phạm Nguyệt Hằng 37 Lớp: CNSH-1103 Healthcare, USA) (khác với quy mơ lít, dịch lên men loại xác tế bào ly tâm 5000 rpm 10 phút) Dịch lọc (không chứa tế bào) thu lại Vì asparaginase từ chủng gốc A oryzae có khối lượng phân tử khoảng 60 kDa nên sử dụng biện pháp thu chế phẩm asparaginase kỹ thuật hệ thống lọc tiếp tuyến sử dụng màng lọc cut off 10 kDa (Cross Flow Fiber Cartridge, GE Healthcare, USA) Ở bước này, tiến hành cô đặc dịch protein tái tổ hợp xuống thể tích cịn 1/30 so với ban đầu (cô đặc 30 lần) Dịch cô đặc trao đổi đệm PBS 1X thông qua hệ thống lọc tiếp tuyến với màng lọc 10 kDa với thể tích đệm gấp lần thể tích mẫu Bước dùng để loại môi trường khỏi asparaginase tái tổ hợp Để đánh giá khả sinh asparaginase P pastoris SMD1168-pPIC9asp2 hệ thống lên men chìm sục khí 100 lít q trình thu hồi asparaginase từ dịch lên men, tiến hành điện di biến tính để kiểm tra protein tổng số, sau tiến hành điện di khơng biến tính thử hoạt tính đặt gel đĩa thạch (zymography) Mẫu dịch sau 32 lên men P pastoris SMD1168-pPIC9asp2 hệ thống lên men chìm sục khí lít (ký hiệu ASP5), mẫu dịch sau 31 lên men P pastoris SMD1168-pPIC9asp2 hệ thống lên men chìm sục khí 100 lít (ký hiệu ASP100) mẫu dịch enzym sau lọc tiếp tuyến trao đổi đệm (ký hiệu ASP) so sánh với mẫu dịch lên men từ P pastoris SMD1168 khơng mang gen mã hóa asparaginase lên men bình tam giác (ký hiệu pPIC9) Kết thể hình 3.4 3.5 M Phạm Nguyệt Hằng ASP ASP100 38 ASP5 pPIC9 Lớp: CNSH-1103 Hình 3.4 Phân tích protein dịch lên men điện di SDS-PAGE Ghi chú: M : thang protein chuẩn (Fermentas) pPIC9 : dịch lên men từ P pastoris SMD1168 không mang gen mã hóa asparaginase ASP5 : dịch lên men từ P pastoris SMD1168-pPIC9asp2 hệ thống lên men chìm sục khí lít ASP100 : dịch lên men từ P pastoris SMD1168-pPIC9asp2 hệ thống lên men chìm sục khí 100 lít ASP : mẫu dịch enzym sau lọc tiếp tuyến trao đổi đệm pPIC9 ASP5 ASP100 ASP M Phạm Nguyệt Hằng pPIC9 ASP5 ASP100 ASP M 39 Lớp: CNSH-1103 130 130 100 70 100 70 Hình 3.5 Phân tích protein dịch lên men gel polyacrylamide khơng biến tính định tính hoạt tính asparaginase M : thang protein chuẩn (Fermentas) pPIC9 : dịch lên men từ P pastoris SMD1168 khơng mang gen mã hóa asparaginase ASP5 : dịch lên men từ P pastoris SMD1168-pPIC9asp2 hệ thống lên men chìm sục khí lít ASP100 : dịch lên men từ P pastoris SMD1168-pPIC9asp2 hệ thống lên men chìm sục khí 100 lít ASP : mẫu dịch enzym sau lọc tiếp tuyến trao đổi đệm Kết điện di biến tính protein mẫu cho thấy đường chạy ASP5, ASP100 ASP thấy xuất băng kép khoảng 50 - 60 kDa; mẫu pPIC9 khơng thấy xuất băng kép khoảng Kết cho thấy có nhiều protein tổng hợp tiết môi trường ba mẫu Tuy nhiên lượng protein tiết ba mẫu chưa xác định asparaginase bị glycosyl hóa mức độ khác Đặc biệt mức độ glycosyl hóa cịn bị ảnh hưởng nhiều điều kiện lên men Nghiên cứu Hendriksen cộng (2009) cho thấy asparaginase từ A oryzae BECh2 có khối lượng phân tử 35 - 40 kDa bị glycosyl hóa nên kết điện di xuất băng kép khoảng 40 - 65 kDa Công bố tương tự quan sát thấy Saccharomyces cerevisiae ASPII (Kim et al., 1988) Kết điện di SDS-PAGE cho thấy asparaginase từ A niger có khối lượng phân tử khoảng 50 kDa Tuy nhiên, theo tính tốn lý thuyết khối lượng Phạm Nguyệt Hằng 40 Lớp: CNSH-1103 phân tử enzym 39584 Da Điều giải thích enzym bị glycosyl hóa Dựa vào trình tự axit amin cho thấy enzym có chứa vị trí glycosyl hóa Khi xử lý enzym endoglycosidase H để loại glycosyl hóa khối lượng phân tử enzym khoảng 40 - 42 kDa (DSM Food Specialies, 2006) Asparaginase tái tổ hợp có hoạt tính chúng polyme hóa Vì vậy, để xác định xác protein sinh có hoạt tính thủy phân asparaginase hay không tiến hành điện di khơng biến tính thử hoạt tính đặt gel đĩa thạch (zymography) Kết thể hình 3.5 Kết thử hoạt tính gel cho thấy mẫu pPIC9 không xuất băng protein Ở mẫu ASP5, ASP100 ASP xuất vùng có hình dạng băng protein có màu vàng nhạt, gel So sánh với nhuộm Commassie thấy vùng màu vàng nhạt có đọ cao ngang với băng kép bên điện di có kích thước lớn 130 kDa Sự xuất vùng màu vàng nhạt, gel giải thích sau: phenol đỏ chất thị pH, gặp mơi trường có pH lớn 8,2 có màu cam Phản ứng enzym asparaginase với chất asparagine tạo sản phẩm axit aspartic ammonium Sau phản ứng ammonium bay hết, để lại đĩa thạch axit aspartic xuất băng màu vàng nhạt, sau ủ 20 phút 37oC Như vậy, qua thí nghiệm chứng minh enzym asparaginase biểu có hoạt tính, xác định xác băng asparaginase điện di 3.3 Xây dựng quy trình cơng nghệ sản xuất asparaginase hệ thống lên men chìm sục khí 100 lít Từ kết nghiên cứu viện Công nghệ sinh học lần lên men sản xuất thử nghiệm asparaginase quy mơ 100 lít, chúng tơi xây dựng quy trình cơng nghệ lên men hệ thống lên men chìm sục khí quy mơ 100 lít quy trình thu hồi, tạo chế phẩm enzym dạng bột Quy trình lên men sản xuất quy trình thu hồi asparaginase tái tổ hợp trình bày qua hình 3.6 3.7 Hình 3.6 Quy trình lên men asparaginase tái tổ hợp quy mơ 100 lít Pichia pastoris SMD1168-pPIC9asp2 Phạm Nguyệt Hằng 41 Lớp: CNSH-1103 Làm tươi chủng giống ( môi trường MD , 30˚C , 48 ) Nhân giống cấp ( 150ml môi trường MD, 30˚C , 220rpm , 24 ) Nhân giống cấp ( 6lít mơi trường BMGY, 30˚C ,220rpm, 24 ) Lên men : 50l môi trường BMMY , 32-33 OD600 = ( 300 rpm , tốc độ khí 0.4vvm) 0.25l methanol 100% OD600 ~ 4-5 ( 300 rpm , tốc độ khí 0.4vvm) OD600 ~ 10-12 ( 300 rpm , tốc độ khí 0.4vvm) OD600 ~ 16 ( 300 rpm , tốc độ khí 0.4vvm 0.5l methanol 100% , 5l YNB 10X 3.4l PE 0.5l methanol 100% OD600 ~ 20 ( 300 rpm , tốc độ khí 0.4vvm OD600 ~ 30-40 ( 300 rpm , tốc độ khí 0.4vvm Loại xác tế bào ( Màng lọc 0.2 µm ) Dịch lên men ( hoạt tính ̴ 110 U/ml ) Loại bỏ Zymography , định lượng asparaginase phương pháp Nessler Dịch lên men (hoạt tính asparaginase 110U/ml) Phạm Nguyệt Hằng 42 Lớp: CNSH-1103 Lọc tiếp tuyến cô đặc mẫu 30 lần (màng lọc 10kDa, áp suất đầu vào