Nghiên cứu xây dựng qui trình pilot sản xuất sinh khối bacillus spp làm nguyên liệu probiotic cung cấp carotenoid

BỘGIÁODỤCVÀĐÀO TẠO BỘ Y TẾĐẠIHỌCYDƢỢCTHÀNHPHỐHỒCHÍMINH TRNHUTM Nghiên cứu xây dựng quy trình pilot sảnxuất sinh khốiBacillusspp làm ngun liệuprobioticcungcấpcarotenoid Chunngành:CơngnghệdƣợcphẩmMã số:62730101 TĨMTẮTUNÁNTIẾNSD Ƣ Ợ C HỌC ThànhphốHồChíMinh - 2014 Cơngtrìnhđượchồn thànhtại: ĐẠIHỌC YDƯỢCTP.HCM Người hướngdẫn khoahọc: PGS.TS.TrầnCátĐông GS.TS.NguyễnVănThanh Phảnbiện1: Phảnbiện2: Phảnbiện3: Luận án bảo vệ Hội đồng chấm luận án cấp trườngHọptại: …………………………………………………… Vàohồi…… giờ……ngày… tháng… năm…… Có thểtìmhiểuluậnántại: - ThưviệnQuốcgiaViệtNam - Thưviện khoa họctổnghợp TP.HCM - Thưviện Đạihọc Y DượcTP.HCM GIỚITHIỆUU N ÁN 1.Đặt vấnđề Trong nh ng năm gần đây, việc dùng nguồn vi khuẩn để sản xuất sốcarotenoid quan trọng quan tâm nghi n cứu Việc sử dụng vikhuẩn sinh carotenoid làm nguy n liệu sản xuất thực phẩm chức cónhiều ưu điểm dễ ni cấy qui mô lớn, tăng trưởng nhanh, sử dụngcơchất giáthành thấp, ngồi cịn cón h n g g i t r ị c ộ n g t h m n h c ó thể bổ sung th m men trợ ti u hóa, ổn định bảo quản Trong sốcác vi khuẩn sinh carotenoid,Bacilluscó nhiều ưu điểm ch ng có khảnăngtạobào tửbền vớinhiệtnn dễ bảoquản sản xuất Tr n giới Việt Nam chưa có nhiều nghi n cứu sâu, tồn diện vềBacillussinhcarotenoidđểcungc ấ p c a r o t e n o i d M ụ c t i u l u ậ n n nghi n cứu xây dựng quy trình pilot sản xuất sinh khốiBacillusspp.làmnguyn liệu probioticcungcấp carotenoid, hướngđếnnộidungsau: PhânlậpBacillussinhcarotenoid,khảosát đặcđiểmprobiotic Khảosát khả năngsinh carotenoidtừ cácvikhuẩnphânlậpđược Khảo sát môi trường thay điều kiện ni cấy để xây dựng quytrìnhln men Xâyd ự n g q u y t r ì n h l n m e n q u y m ô p i l o t đ ể s ả n x u ấ t s i n h k h ố i Bacilluslàmnguynliệuprobioticcungcấpcarotenoid Xâydựngti uchuẩn cơsởcủa nguy nliệu Nghin cứu khảnăngứngdụngsinh khốithuđược Tínhcấpthiếtcủađềtài Các chất chống oxi hóa tự nhi n quan tâm nghi n cứu rấtnhiềunhưflavonoid,carotenoid,polyphenol,… trongđó,c a r o t e n o i d chnhiều vìc ó thểlàm giảm t lệm ccác bệnhmạn t nh acácbệnhvềmt.Cáccarotenoidsửdụngtrong n h ungthư,timmạch,ch chế phẩm thường chiết xuất từ thực vật tổng hợp hóa học,có nhiều nhược điểm sử dụng dung môi chiết xuất độc hại ảnhhưởng đến môi trường, phụ thuộc vào thời tiết, carotenoid k m bền khóbảo quản,… ViệcsửdụngbàotửvikhuẩnBacillussinhcarotenoiddướidạngprobiotic, cung cấp carotenoid đường ti u hóa có nhiều ưuđiểm nhưthờigiannuôicấy ng n,không quachiếtxuất,bảoquảncarotenoidđ n g i ả n , l m ộ t h n g t i ế p c ậ n m i v ề n g u n v p h n g thức cung cấp carotenoid so với cách thức truyền thống chiết xuất haytổnghợp hóa họctồntạinhiều nhược điểmđã n u Nhữngđóng gópmớicủa luận án Đây nghi n cứu đầu ti n sử dụng bào tửBacilluslàm nguồn cung cấpcarotenoid Việt Nam Nghi n cứu mở hướng tiếp cận mớivề nguồn phương thức cung cấp carotenoid, với nh ng đóng góp mớicụthể nhưsau: - Phân lập, định danh haichủng vikhuẩnBacillustạiViệtNamlà BacillusmarisflaviDD1.1vàBacillus infantisAT14,đ p ứ n g y u cầulàmnguy n liệu probioticcungcấpcarotenoid - Xâydựngđượcquytrìnhl nmenthusinhkhốibàotửổnđịnhởquy mơ pilot, với thông số phù hợp, sử dụng nguy n liệu giá thànhthấp, s n có Việt Nam, quy trình có t nh kinh tế, ứng dụngvào thựctếtạo n n sản phẩmcógiá cạnhtranh - Chứngminhđược khảnănghấpthu carotenoidtạinimmạc ruột,khả điều trị ti u chảy kháng sinh tr n mơ hình động vật có vđốivới haichủngvikhuẩnBacillusphânlập Bốcụcluận án Luận án gồm: 139 trang, đặt vấn đề trang, tổng quan tài liệu 26 trang,đối tượng - vật liệu - thiết bị phương pháp nghiên cứu 21 trang, kếtquả nghiên cứu 72 trang, bàn luận 14 trang, kết luận kiến nghị trang.Luậnáncó71bảng,23hình,7sơđồ,118tàiliệuthamkhảo,gồm11tàiliệu tiếng Việt, 107 tài liệu tiếng Anh, 13 phụ lục thể kết quảthựcnghiệm Chƣơng1.TỔNGQUANTÀII Ệ U 1.1 Thựcphẩmchứcnăng: khái niệm,tiêuchí 1.2 Probiotic:kháiniệm,cáctiêuchívềprobiotic 1.3 Thực phẩm chức probiotic sức khỏe: tác dụng củathựcphẩmchức năngvà probiotic đốivớisức khỏe, yhọc 1.4 Carotenoid: cấu tr c,p h â n dụng loại,đặctính lhóa, s i n h h ọ c vàvaicủacarotenoidtrongy tác học,c c p h n g p h p đ ị n h l ợ n g , địnhtínhcarotenoid 1.5 Các vi sinh vật sinh carotenoid: trình bày chi sinh carotenoid vàcácloạicarotenoid đặc trưngđược sinh 1.6 Vi khuẩnBacillus: đặc điểm vi khuẩn bào tửBacillus,cácứngdụng 1.7 Lên men sản xuất sinh khối: vấn đề môi trường lên men, yếutốảnhhưởngđến sinh tổnghợp carotenoidở visinhvật 1.8 NghiêncứuvikhuẩnsinhcarotenoidthếgiớivàtạiViệtNam:tómt t cácnghiên cứu giớivà nướcvề tìnhh ì n h n g h i ê n cứu vi khuẩnBacillussinh carotenoid Chưa có nhiều nghiên cứu vềvikhuẩnBacillussinh carotenoid Chƣơng ĐỐI TƢỢNG, VTIỆU, THIẾT BỊVÀPHƢƠNGPHÁPNGHIÊNCỨU 2.1 Đối tƣợng nghiên cứu:vi khuẩn (VK) phân lập từ mẫu đất nướcởBàRịa-VngTàu,BìnhThuận,NhaTrangvàĐàNng 2.2 Vật liệu snvt vnvttnm:chủngvikhuẩnATCC,hoặctừdựán Colorspore, PTN Vi sinh Công nghệ Dược Chuột nh t tr ngSwissalbio,ViệnPasteurNhaTrang tS i g m a , M e r c k , cáccôngtydượctrongnước MtrnTSA,TSB,NA,NBcủaẤnĐộ.MHA(Đức) 2.3 Thiết Máy luân nhiệt Mastercycler Personal (Eppendorf), Bộ điện di ngangMini-Sub Cell GT (Bio-Rad), Máy quang phổ UV-Vis GeneQuant 1300(GEHealthCare),MáytánsiêuâmVCX130PB(Sonics),hệt h ố n g HPL CSmartline2500(Knauer),… 2.4 Phƣơngphápnghiêncứu 2.4.1 PhânlậpchủngVK,sànglọc, đnhdanh T ut p m ẫ u tv n Vùng biểnC ầ n G i , B R ị a - V n g T u , Đ Nng, BìnhThuận, NhaTrang P ân l pTrực khuẩn Gram (+), sinh bào tử, có màu lưu lại đểnghiêncứusànglọckhảnăngsinhcarotenoid Sn lọ:hoạttínhchốngoxyhóa, phổ UV-Visdịch chiếtsinhkhối Địnd n: Dựatrên giải trình tựgen16SrADN 2.4.2 Khảosátđặcđiểmproiotic K ản ă n s n enzymn oạ b oủ ủ n vk u ẩ n :k h ả n ă n g s i n h protease(caseinase, gelatinase),amylase, lipase Tk ảnănốk án vớ VK âyb n (chủng ATCC):S a u r e u s , E coli,S.faecalis,P.aeruginosa,Sal paratyphi A, K pneumoniae K ản ă n ịud dị vịv muố m t Khản ă n g sống s ó t V K s a u , 60,90 phtở pH2,3;sau 1, ởmuốimật0,15%,0,3% Tn mn ạy ảmk án s n :P P p h a l o ã n g kháng s i n h t r o n g t h c h theo M7 - A9 M45 – A (CLSI) Sử dụng 15 kháng sinh đại diện chocácnhómpenicilin,cephem,glycopeptid,aminoglycosid,macrolid,tetra cyclin,quinolon,phenicol, ansamycin 2.4.3 Khảosátđiềukiệnnuôicấyvàđƣờngcongtăngtrƣởng Đềuknpát trểnủ v k uẩnt 20-45oC,t pH6-11 Đnont ă n t r ởntrênTSBđoODmỗigiờ,đếm sống đ ể k i ể m chứng.Xác định thờigian hệ 2.4.4 Khảosátđặcđiểmsinhcarotenoid Xáịnml ợnroteno dbằnPLC(Knauer- Đức):acetonitril:methanol:dicloromethan(7:2:1,tt/tt),RP18(250m m , , mm, μm); UV-Vis, λm); UV-Vis, λ 450nm; ml/ ph t; t ophòng; 20μm); UV-Vis, λl Xác định hàmlượngcarotenoid qua đườngchuẩn canthaxanthin KảosátsựtạorotenodteotnĐ n g congtăngtrưởng:mỗigiờ, đo OD erlen Hàm lượng carotenoid: định lượng bằngHPLC(với thơngsốnhưtrên),mỗi giờ(thử nghiệmsơbộ)hoặc2 2.4.5 Nghiêncứuquytrìnhnicấy K ảo sátMTty t ế choTSB:Khoaitây, b p, gạo, đậu nành, đốichứngvới TSB,chọnMTcósinhkhốivà carotenoid≥ MTTSB K ảo sátkảnănt o bott r ê n M T t eo tn • So sánh tạo bào tử gi a MTTT bổ sung K +, Mg2+, Mn2+, Ca2+, Fe2+với DSM,TSM,2SG(cả haidạnglỏngvà rn) 3.7 Quytrìnhlênmen th o t L Mơi trường ĐK15 bổ sung agar 105 g 72,94 ml KCl 10% 10,42 ml MgSO4 12% 10,5 ml Ca(NO3)2 1M 6,86 ml MnCl2 10 mM 5,94 ml FeSO4 mM Chủng gốc AT14 Nhân giống Phân lập TSA, 37oC, 24 Chuẩn Tiệt trùng 121oC,MT 15 phút Đổ hộp nhựa, 70 ml/hộp Cấy chủng, ml/hộp Tăng sinh cấp 1, 10 ml TSB 37oC, 200 vòng/phút, 12 Tăng sinh cấp 2, 350 ml TSB 37oC, 200 vòng/phút, 12 Lên men 37oC, 48 Thêm ml NaCl 0,85% vào hộp, dùng que trải thu sinh khối Lên men Xử ly ́ sau lên Sinh khối ướt giàu bào tử men Tinh chế bào tử và đông khô Ngun liêụ AT14 Sơđồ3.1 Quytrình ni cấythubàotửAT14trênmơitrườngr n 7L Mơi trường Đ5 bổ sung 105 g agar 76,86 ml KCl 10%, 10,22 ml MgSO4 12%, 10,36 ml Ca(NO3)2 1M, 8,26 ml MnCl2 10 mM, 4,55 ml FeSO4 mM Chủng gốc DD1.1 Nhân giống Phân lập TSA, 37oC, 24 Chuẩn Tiệt trùng 121oC,MT 15 phút Đổ hộp nhựa, 70 ml/hộp Cấy chủng, ml/hộp Tăng sinh cấp 1, 10 ml TSB 37oC, 200 vòng/phút, 12 Tăng sinh cấp 2, 350 ml TSB 37oC, 200 vòng/phút, 12 Lên men 37oC, 48 Thêm ml NaCl 0,85% vào hộp, dùng que trải thu sinh khối Lên men Xử ly ́ sau lên Sinh khối ướt giàu bào tử men Tinh chế bào tử và đơng khơ Ngun liêụ DD1.1 Sơđồ 3.2.QuytrìnhnicấythubàotửDD1.1trênmơitrườngrn L Mơi trường ĐK15 bổ sung 77,52 ml KCl 10% 12 ml MgSO4 12% 5,76 ml Ca(NO3)2 1M ml MnCl2 10 mM 8,56 ml FeSO4 mM Chuẩn MT Chủng AT14 Phân lập TSA, 37oC, 24 Tăng sinh cấp 1, 10 ml TSB 37oC, 200 vòng/phút, 12 Tiệt trùng 121oC, 50 phút Tăng sinh cấp 2, 400 ml TSB 37oC, 200 vòng/phút, 12 Lên men 37oC, pO2 50%, pH 8, 350 vòng/phút Lên men Ly tâm thu sinh khối sau 32 Nhân giống Sinh khối ướt giàu bào tử Xử ly ́ sau lên men Tinh chế bào tử và đông khô Nguyên liêụ AT14 Sơđồ 3.3.Quytrìnhnicấythu bàotử AT14trên mơi trường lỏng L Mơi trường Đ5 bổ sung 57,76 ml KCl 10% 10,64 ml MgSO4 12% 9,52 ml Ca(NO3)2 1M 8,72 ml MnCl2 10 mM 4,4 ml FeSO4 mM Chuẩn MT Tiệt trùng 121oC, 50 phút Lên men 37oC, pO2 50%, pH 8, 250 vòng/phút Lên men Ly tâm thu sinh khối sau 36 Chủng DD1.1 Nhân Phân lập TSA, 37oC, 24 giống Tăng sinh cấp 1, 10 ml TSB 37oC, 200 vòng/phút, 12 Tăng sinh cấp 2, 400 ml TSB 37oC, 200 vòng/phút, 12 Sinh khối ướt giàu bào tử Xử ly ́ sau lên men Tinh chế bào tử và đông khô Nguyên liêụ DD1.1 Sơđồ 3.4.Quytrìnhnicấythu bàotửDD1.1trên mơi trườnglỏng 3.7.3.Ứng dụng quy trìnhlênmenth o tử AT14và DD1.1 Kết quảứngdụngthu sinhkhốibào tửtạibảng3.4, 3.5 Bảng 3.4 Ứng dụng quy trình lên men thu bào tử AT14, DD1.1 môitrườngr n(7 L) Chủng Mẻ lên men AT14 (ĐK15KA) TB DD1.1 (Đ5KA) TB BTsaulênm Lƣợngsi Carotenoid BTsautinhchếx1 BTsauđôngkhôx1 en nhkhối (μg/gμg/gg/109BT) 12 12 CFU(μg/g % ) CFU(μg/g % ) 12 x10 CFU (μg/gg) 21,32 17,65(82,8) 16,11(75,6) 55,95 1,1 22,11 16,87(76,3) 16,49(74,6) 54,40 1,2 21,17 17,01(80,3) 16,74(79,1) 54,68 1,1 21,53 17,18(79,8) 16,45(76,4) 55,02 1,13 96,03 84,07(87,5) 80,81(84,2) 187,04 0,31 94,23 85,61(90,9) 81,05(86,0) 190,08 0,31 95,32 82,95(87,0) 80,71(84,7) 184,83 0,32 95,19 84,21(88,5) 80,85(84,9) 187,31 0,31 Bảng 3.5 Ứng dụng quy trình lên men thu bào tử AT14, DD1.1 trongmôitrườnglỏng(8L) Chủng AT14 (ĐK15K) DD1.1 (Đ5K) Mẻ lênm en TB TB Lƣợngsi Carotenoid BTsaulênm BTsautinhchếx1 BTsauđôngkhôx1 nh en (μg/gμg/gg/109BT) 12 12 CFU(μg/g % ) CFU(μg/g % ) 12 x10 CFU khối(μg/gg) 39,14 31,36(80,1) 30,29(77,4) 86,86 1,51 39,32 30,72(78,1) 30,08(76,5) 85,51 1,53 38,82 30,26(77,9) 29,18(75,2) 84,55 1,51 39,09 30,78(78,7) 29,85(76,4) 85,64 1,52 72,53 64,83(89,4) 61,65(85,0) 160,38 0,42 71,45 65,15(91,2) 62,08(86,9) 161,07 0,43 73,01 64,56(88,4) 60,38(82,7) 159,80 0,41 72,33 64,85(89,7) 61,37(84,8) 160,43 0,42 CácmẻlênmenAT14vàDD1.1trênmơitrườnglỏnghoặcr ntheoquytrình đềxuấtcósố lượngbào tửthuđược ổn định Tínhgiáthànhcủamơitrườngthaythếvàngunliệusosánhvớimơitrườ ngthươngmạitạo bàotử DSM: Bảng3.6 Giá thànhcủaMTTT r n sovớithạchDSM Tênmơitrƣờng Giáthành1 lítMT(μg/gVNĐ) Đ5KA(cho DD1.1) 7.300 ĐK15KA (choAT14) 9.800 Thạch DSM 21.000 Bảng3.7.GiáthànhcủaMTTTlỏngsovới môi trườngDSM Đ5K (choDD1 1) 2.300 Tênmơitrƣờng Giáthành1 lítMT(μg/gVNĐ) ĐK15K(cho AT14) DSM 4.000 15.000 Tínhg i n g u y ê n l i ệ u b o t t h u đ ợ c t q u y t r ì n h s ả n x u ấ t : G i c ủ a nguyênliệubàotửAT14từ80–130đồng/liều,DD1.1từ26–39đồng /liều(109bàotử/liều) 3.8 Xâydựng tiêuchuẩnnguyên liệusinhkhối DựatrêntiêuchuẩnchếphẩmBiosubtyltrongDĐVNIVgồmcáctiêu chí:  Địnhnghĩa  Sảnxuất  Yêu cầu kỹthuật: +Thành phần nguyênliệu + Tiêu chuẩn ngun liệu: hình thức, định tính vi sinh vật,m ấ t k h ố i lượngdo làmkhô, cônghiệu, giớihạn nhiễmkhuẩn, tính an tồn Các tiêu chí có phương pháp thử kèm theo Kết kiểm nghiệm tạiTrung tâm Kiểm nghiệmDượcp h ẩ m Thực phẩm Mỹ p h ẩ m T P H C M đềuđạtcác chỉtiêu 3.9 Thửnghiệmđộctính LD50đường uống DD1.1 AT14 >1011bào tử /chuột, tức >5x1012bàotử/kg Sau 60 ngày thử nghiệm, khơng có chuột chết, cân nặng khơng cósự khác biệt, số huyết học, sinh hóa bình thường Khơng có thayđổi mơ học ởthận,lálách,ruộtnon gan 3.10 Hấp thu, tích lũy carotenoid từ AT14 DD1.1 gan chuộtChuộtu ố n g b o t A T , D D l ợ n g c a r o t e n o i d t í c h l y t r o n g g a n tươngđươngvớiviệcsửdụngdầugấcvàcaogấp16lầnlơNaCl 0,85%hoặclơsửdụngbàotửVKkhơngsinhcarotenoidnhưHU58.Từđócho thấychủngDD1.1,AT14cókhảnăngsinhcarotenoidvàcungcấpcho cơthểvậtchủ quaniêmmạc ruột 3.11 Khảnăngtr tiêuchảydo khángsinhcủaAT14,DD1.1 Liều tối thiểu phòng ngừa điều trị tiêu chảy củaB infantisAT14 vàB.marisflaviDD1.1 106bào tử/10g TTC (#108bào tử/1 kg thể trọng, 2lần/ngày) mẫu thử chứa vi khuẩn mẫu thử phối hợp vớiB.subtilisBS02.TươngtựvớiliềucủacácsảnphẩmprobioticchứaBacillus củaWHO 3.12 Khảnăngứngdụng 3.12.1 Bổsungbào tửvào s a chua Khi bổ sung từ 5x107- 108bào tử /ml (tương ứng với 5x109- 1010bào tửtrên1hs a chua100ml),sachuacómàus ckhácbiệts o vớimẫuđốichứngvàmứcđộ ưathích50% Bào tửVKổnđịnhtrongquá trìnhbảoquản s achua(1 -45ngày) 3.12.2 Độ ổnđịnhcủacốmvàhỗn dịchbổ sungbàotửvikhuẩn Sau 12 tháng theo dõi độ ổn định cốm hỗn dịch bổ sung bào tửAT14 DD1.1 nhiệt độ phòng (25 - 30 oC), độ ẩm 70 – 75%, số lượngbào tử vi khuẩn không thay đổi nhiều Vì vậy, sử dụng AT14 hoặcDD1.1 trongbàochếcốmhoặc hỗndịch Chƣơng4.BÀNLUN 4.1 Vikhuẩnsinhcarotenoid Nghiên cứu tiến hành thu thập mẫu rộng vùng biển sốtỉnhViệtNa m , ba ogồm cảviệ cl ấ y mẫulặpl ại t i nh ngđịađiểm đãcho kết khả quan nghiên cứu trước, kết phân lập 72chủng,trongđócó38chủngcótiềmnăng.Với38chủngphânlậpđược,