Xác định một số điểm đa hìnhđột biến, biểu hiện gen A20, CYLD; biểu hiện gen tín hiệu STAT1, STAT3 và nồng độ IL6, TNFα ở bệnh nhân bạch cầu dòng tủy. Xác định vai trò của gen A20CYLD đối với quá trình tăng sinh và apoptosis của tế bào K562 và chức năng của đại thực bào biệt hóa từ PBMC của người bệnh AML khi được xử lý với fludarabine
1 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ - NGUYỄN THANH HUYỀN NGHIÊN CỨU VAI TRÒ CỦA GEN A20 VÀ CYLD TRONG ĐIỀU HÒA CHỨC NĂNG TẾ BÀO Ở BỆNH NHÂN BẠCH CẦU DỊNG TỦY TĨM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC Hà Nội - Năm 2023 Cơng trình hồn thành tại: Học viện Khoa học Công nghệ, Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam Người hướng dẫn khoa học: Người hướng dẫn khoa học 1: PGS.TS Nguyễn Xuân Cảnh Người hướng dẫn khoa học 2: PGS.TS Nguyễn Thị Xuân Phản biện 1: GS.TS Trần Huy Thịnh Phản biện 2: GS.TS Nguyễn Duy Bắc Phản biện 3: PGS.TS Đồng Văn Quyền Luận án bảo vệ trước Hội đồng đánh giá luận án tiến sĩ cấp Học viện, họp Học viện Khoa học Công nghệ - Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam vào hồi … ’, ngày … tháng … năm 2023 Có thể tìm hiểu luận án tại: Thư viện Học viện Khoa học Công nghệ Thư viện Quốc gia Việt Nam MỞ ĐẦU Tính cấp thiết luận án Bệnh bạch cầu dòng tủy loại bệnh bạch cầu phổ biến xảy lứa tuổi thường gặp người trưởng thành Bệnh bạch cầu dịng tủy có hai loại: Bệnh bạch cầu dịng tủy cấp tính (AML – Acute myeloid leukemia) bệnh bạch cầu dịng tủy mạn tính (CML – Chronic myeloid leukemia) Hơn nửa bệnh nhân bạch cầu dòng tủy phát 60 tuổi, với tuổi mắc bệnh trung bình bệnh nhân 64 Hiện nay, việc điều trị cho bệnh nhân bạch cầu dòng tủy chủ yếu thường thực biện pháp hóa trị ghép tế bào đồng loài Tuy nhiên tỷ lệ lui bệnh sau hóa trị liệu thời gian ổn định bệnh giảm, đồng thời tác dụng phụ việc điều trị lại tăng đáng kể người bệnh lớn tuổi Do đó, nhiều nhà khoa học nước quan tâm nghiên cứu nguyên nhân gây bệnh bạch cầu dịng tủy Các gen A20, CYLD mã hóa cho protein thuộc nhóm DUB (Deubiquitinase) đóng vai trị quan trọng điều hịa q trình tăng sinh q trình chết tế bào theo chương trình (apoptosis) Các protein DUB phân cắt liên kết peptide isopeptide protein đích ubiquitin để làm đảo ngược q trình sinh học bên tế bào Protein A20, CYLD tham gia điều hịa âm tính phản ứng miễn dịch giải phóng cytokine viêm qua đường tín hiệu STAT Khi A20, CYLD biểu bất thường liên quan đến hình thành phát triển bệnh bạch cầu bệnh ung thư hạch Gần đây, tỷ lệ người mắc bệnh bạch cầu dòng tủy ngày tăng, việc điều trị bệnh lý cịn gặp nhiều khó khăn, đồng thời A20, CYLD xác định có liên quan đến nguy mắc bệnh CLL ALL Đây lý mà nhiều nhà khoa học giới Việt Nam tập trung nghiên cứu đa hình/đột biến biểu gen A20, CYLD, biểu viêm gen tín hiệu liên quan bệnh bạch cầu dịng tủy Vincristine thuốc chống ung thư có chất alkaloid, tách chiết từ Dừa cạn (Catharantus roseus) Vincristine thúc đẩy trình apoptosis số tế bào ung thư Chính vậy, với việc xác định đa hình gen CYLD, A20 bệnh bạch cầu dịng tủy tiếp tục đánh giá vai trị gen q trình tăng sinh apoptosis tế bào ung thư máu - K562 xử lý vincristine bước tiến việc tìm biện pháp ức chế phát triển dòng tế bào bệnh bạch cầu dịng tủy Bên cạnh đó, đại thực bào có vai trị quan trọng phản ứng chống viêm, sửa chữa mô, cân nội môi đặc biệt có khả ức chế phát triển khối u trình apoptosis tế bào ung thư Do vậy, tìm vai trị gen CYLD A20 với chức đại thực bào nhiệm vụ quan trọng hướng tới xây dựng biện pháp hỗ trợ điều trị bệnh ung thư hiệu Từ lý trên, luận án “Nghiên cứu vai trò gen A20 CYLD điều hòa chức tế bào bệnh nhân bạch cầu dòng tủy” thực Mục tiêu nghiên cứu luận án - Xác định đa hình, biểu gen A20, CYLD, biểu viêm số gen tín hiệu liên quan bệnh bạch cầu dịng tủy - Xác định vai trò gen A20, CYLD điều hòa chức tế bào ung thư máu đại thực bào bệnh nhân bạch cầu dòng tủy Các nội dung nghiên cứu luận án: - Xác định số điểm đa hình/đột biến, biểu gen A20, CYLD; biểu gen tín hiệu STAT1, STAT3 nồng độ IL-6, TNF-α bệnh nhân bạch cầu dòng tủy - Xác định vai trò gen A20/CYLD trình tăng sinh apoptosis tế bào K562 chức đại thực bào biệt hóa từ PBMC người bệnh AML xử lý với fludarabine CHƯƠNG TỔNG QUAN 1.1 Bệnh bạch cầu dịng tủy cấp tính Bệnh bạch cầu dịng tủy cấp tính (AML) bệnh bạch cầu phổ biến người trưởng thành Bệnh AML đặc trưng tăng sinh tế bào blast, chủ yếu tồn tủy xương, dẫn đến trình tạo máu bình thường bị ức chế tượng suy tủy xương Gần đây, việc điều trị bệnh bạch cầu dịng tủy cấp tính người trẻ tuổi có bước tiến đáng kể việc điều trị cho người bệnh lớn tuổi gặp nhiều trở ngại Mặc dù có cải thiện việc điều trị bệnh việc tiên lượng tình trạng bệnh gặp nhiều khó khăn 1.2 Bệnh bạch cầu dịng tủy mạn tính Bệnh bạch cầu dịng tủy mạn tính (CML) loại ung thư bắt nguồn từ số tế bào tạo máu có tủy xương Bệnh CML đặc trưng gia tăng tế bào bạch cầu hạt biệt hóa Ban đầu, tế bào bạch cầu hạt tăng lên máu ngoại vi chúng hoạt động tương đối bình thường Tuy nhiên, bệnh tiến triển, tế bào bạch cầu chưa trưởng thành (nguyên bào tủy) bắt đầu tích tụ máu tủy xương Sự phát triển mức nguyên bào tủy làm giảm phát triển tế bào máu khác, dẫn đến thiếu hụt tế bào hồng cầu tiểu cầu Sự thay đổi tạo dung hợp gen BCR-ABL, từ sản xuất mức tyrosine kinase gây nên bệnh CML Các tế bào bạch cầu phát triển tủy xương vào máu di chuyển tới phận khác thể Bệnh CML phát triển chậm chuyển thành bệnh bạch cầu cấp tính nhanh khó điều trị 1.3 Giới thiệu chung enzyme deubiquitinase A20 CYLD 1.3.1 Protein A20 A20 protein kích thích yếu tố hoại tử khối u 3, mã hóa gen TNFAIP3 A20 nằm nhiễm sắc thể số 6q23.3, trình tự cDNA dài 4.440 bp với khung đọc mở gồm 2.370 Nu mã hóa cho protein chứa 790 axit amin A20 hoạt động điều hòa âm tính NF-κB để đáp ứng với nhiều kích thích coi chất ức chế khối u Rối loạn chức A20 liên quan đến bệnh ác tính tế bào lympho Hơn nữa, protein liên kết A20 A20 sử dụng làm dấu ấn sinh học mục tiêu điều trị khối u ác tính tế bào lympho 1.3.2 Protein CYLD Protein CYLD enzyme deubiquitinase mã hóa gen cylindromatosis (CYLD) CYLD nằm nhiễm sắc thể 16q12.1 người, có kích thước 60 kb mã hóa cho enzyme thioesterase chứa 956 amino acid với ba vùng bảo thủ protein-glycine (Cap-Gly) để tương tác với protein mục tiêu đường tín hiệu NF-κB Protein CYLD hoạt động chất ức chế khối u nên CYLD bị đột biến giảm mức độ biểu thúc đẩy phát triển loại khối u CYLD có vai trị ức chế hình thành khối u thơng qua điều hịa q trình apoptosis, hoại tử tế bào Những phát cho thấy CYLD coi dấu ấn sinh học, nhân tố để thúc đẩy cho trình điều trị bệnh bạch cầu hiệu 1.4 Tín hiệu STAT1 STAT3 STAT1 tham gia truyền tín hiệu IFN loại I II phản ứng viêm sau thể bị nhiễm virus bảo vệ vật chủ khỏi công vi khuẩn ký sinh trùng; STAT3 kích hoạt thúc đẩy trình hình thành bệnh ung thư đầu cổ, tế bào đa u tủy, số khối u rắn, bệnh bạch cầu u lympho 1.5 Vai trò Vincristine Vincristine chất chiết xuất từ dừa cạn (Cantharanthus roseus) có tác dụng ức chế hiệu số bệnh ung thư Cơ chế hoạt động Vincristine xác định tương tự với chất chống ung thư đặc hiệu dựa theo chu kỳ tế bào Trong trình điều trị, vincristine thường gây độc hệ thống thần kinh, giải phóng chất trung gian cho q trình tiền viêm IL-6 TNF-α Bằng cách kích hoạt đường tín hiệu NF-κB/STAT, vincristine tác nhân điều hòa phần hoạt động chống ung thư 1.6 Tế bào PBMC Tế bào PBMC loại tế bào hệ miễn dịch thể người Tế bào PBMC sử dụng để nghiên cứu bệnh truyền nhiễm, phát triển vaccine, miễn dịch học, khối u ác tính huyết học liệu pháp cấy ghép Về bản, nghiên cứu PBMC điều kiện in vitro cung cấp thông tin liên quan đến chức tế bào, nhận dạng dấu ấn sinh học mơ hình bệnh Việc sử dụng PBMC người để thúc đẩy phục hồi chuột bị suy giảm miễn dịch coi sở để nghiên cứu hệ thống miễn dịch người phản ứng tế bào mầm bệnh, chất độc ung thư mơ hình in vivo CHƯƠNG VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Đối tượng nghiên cứu Đối tượng nghiên cứu 92 bệnh nhân chẩn đoán mắc bệnh AML 50 bệnh nhân chẩn đoán mắc bệnh CML (nhưng chưa điều trị) Nhóm đối chứng 80 người tình nguyện khỏe mạnh Các tế bào bạch cầu dòng tủy mạn K562 mua từ tổ chức ATCC (American type culture collection – Bộ sưu tập giống chuẩn Mỹ) Đại thực bào biệt hóa từ tế bào PBMC người khỏe bệnh nhân mắc bệnh nhân AML 2.2 Sơ đồ nghiên cứu Hình 2.1 Sơ đồ nghiên cứu 2.3 Phương pháp nghiên cứu ✓ Thu thập mẫu ✓ Tách chiết DNA khuếch đại gen A20/CYLD ✓ Giải trình tự phương pháp Sanger xác định điểm đa hình ✓ Tách chiết RNA, tổng hợp cDNA kỹ thuật Realtime-PCR ✓ Ni cấy, xử lý dịng tế bào K562 incristine ✓ Phân lập biệt hóa tế bào PBMC sử dụng M-CSF ✓ Bất hoạt gen ✓ ELISA ✓ Western blot ✓ Đếm tế bào theo dòng chảy (Flow cytometry) ✓ Phân tích số liệu CHƯƠNG KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 3.2 Đánh giá đa hình gen CYLD, A20 3.2.1 Đa hình gen CYLD bệnh bạch cầu dịng tủy 3.2.1.1 Đa hình gen CYLD bệnh bạch cầu dịng tủy cấp tính Xác định nucleotide exon 16 bị thay đổi, có SNP (p.Q723H/c.2435 G>C; p.E735K/c.2445 G>A; p.E747K/c.2481 G>A) SNP không đồng nghĩa khiến cho amino acid cũ bị thay amino acid (Hình 3.1) SNP (p.E723E/c.2411 G>A) SNP đồng nghĩa Trong số đa hình này, phân bố kiểu gen vị trí p.E723E, p.Q731H p.E735K tuân theo định luật cân HWE nhóm bệnh, nhóm chứng tồn quần thể nghiên cứu (p > 0,05); Đối với điểm đa hình vị trí p.Q731H khác biệt đáng kể kiểu gen GC bệnh nhân AML nhóm chứng khỏe mạnh phát so sánh với kiểu gen GG (p = 0,0024) Bên cạnh đó, tần số allele C cho thấy khả liên quan đến giảm nguy mắc bệnh AML cao (p = 0,0032) Để xác định liệu tác động SNP không đồng nghĩa gen CYLD làm thay đổi axit amin đến cấu trúc chức protein hay không nghiên cứu sử dụng cơng cụ Polyphen-2 Dựa kết dự đốn nhận thấy, SNP vị trí p.Q731H gen CYLD dự đốn ngun nhân gây bệnh (Hình 3.2) Hình 3.2 Dự đốn khả gây bệnh SNP không đồng nghĩa p.Q731H gen CYLD Polyphen-2 3.2.1.2 Đa hình gen CYLD bệnh CML Xác định nucleotide exon 16 bị thay đổi, SNP p.Q731H (c.2435 G>C) SNP khơng đồng nghĩa khiến cho amino acid cũ bị thay amino acid SNP p.V725V (c.2417 T>G) SNP đồng nghĩa (Hình 3.3) Trong số đa hình này, phân bố kiểu gen vị trí p.V725V, p.Q731H tuân theo định luật cân HWE toàn quần thể nghiên cứu (p > 0,05) (Bảng 3.3) Đối với điểm đa hình p.V725V, kiểu gen TG bệnh nhân CML nhóm chứng khỏe mạnh phát khơng có khác biệt đáng kể so sánh với kiểu gen TT (p > 0,05) tần số allele G không liên quan đến khả giảm nguy mắc bệnh CML Trong đó, vị trí p.Q731H kiểu gen GC bệnh nhân CML nhóm chứng khỏe mạnh phát có khác biệt đáng kể so sánh với kiểu gen GG (p = 0,0275) Bên cạnh đó, tần số allele C cho thấy khả liên quan đến khả tăng nguy mắc bệnh CML cao (p = 0,0336) Dựa kết dự đốn nhận thấy, SNP vị trí p.Q731H gen CYLD dự đốn gây bệnh 3.2.2 Đa hình gen A20 bệnh bạch cầu dịng tủy 3.2.2.1 Đa hình gen A20 bệnh AML Xác định nucleotide exon (p.L335S/c.1303 T>C; p.K337Q/c.1308 A>C; p.K354N/c.1361 G>T; p.S376T/c.1425 T>A) bị thay đổi SNP không đồng nghĩa khiến cho amino acid cũ bị thay amino acid (Hình 3.4) Sự phân bố kiểu gen vị trí p.L335S, p.K337Q, p.K354N p.S376T tuân theo định luật cân HWE nhóm bệnh tồn quần thể nghiên cứu (p > 0,05) (Bảng 3.5) Bên cạnh đó, điểm đa hình vị trí p.L335S, p.K337Q, p.K354N p.S376T, kiểu gen TC, AC, GT TA khơng có khác biệt đáng kể so sánh với kiểu gen TT, AA, GG TT tương ứng (p < 0,05), đồng thời tần số allele C (p.L335S), C (p.K337Q), T (p.K354N) A (p.S376T) không liên quan đến khả mắc bệnh AML 3.2.2.2 Đa hình gen A20 bệnh CML Xác định nucleotide exon (rs374721883/p.G456V; rs200878487/p.S466G) bị thay đổi SNP không đồng nghĩa khiến cho amino acid cũ bị thay amino acid (Hình 3.5) Bên cạnh đó, phân bố kiểu gen vị trí rs374721883 rs200878487 tuân theo định luật cân HWE nhóm bệnh tồn đối tượng nghiên cứu (p > 0,05) (Bảng 3.7) Đối với điểm đa hình rs374721883 rs200878487, đánh giá mối liên quan kiểu gen với bệnh CML kiểm tra kiểu hình gen trội kiểu gen TT GG tương ứng khơng có quần thể nghiên cứu Kiểu gen GT (rs374721883), CG (rs200878487) bệnh nhân CML nhóm chứng khỏe mạnh phát khơng có khác biệt đáng kể so sánh với kiểu gen GG (rs374721883), CC (rs200878487) (p > 0,05) tần số allele không liên quan đến khả mắc bệnh CML (Bảng 3.9) 3.3 Mức độ biểu gen bệnh nhân bạch cầu dòng tủy 3.3.1 Biểu gen CYLD, A20 bệnh nhân bạch cầu dịng tủy Hình 3.6 Biểu A20, CYLD bệnh nhân bạch cầu dòng tủy * (p < 0,05), ** (p < 0,01) khác biệt có ý nghĩa thống kê nhóm người khỏe nhóm bệnh nhân 11 biểu đồ huỳnh quang CFSE thu từ tế bào K562 nhận thấy, tăng sinh K562 giảm đáng kể xử lý vincristine 300nM Tuy nhiên, trường hợp tế bào bị làm bất hoạt A20, CYLD tác dụng ức chế vincristine tăng sinh tế bào khơng cịn (Hình 3.11) Như vậy, vincristine ức chế tăng sinh tế bào thông qua biểu gen A20, CYLD Hình 3.11 Ảnh hưởng A20, CYLD đến tăng sinh tế bào K562 * (p