Nghiên cứu đánh giá hoạt tính kháng phân bào trên dòng tế bào ung thư mcf 7, jurkat t của cao chiết và hoạt chất từ sinh khối, quả thể nhân nuôi của chủng nấm cordyceps neovolkiana dl0004 và isari

BỘGIÁO DỤCVÀĐÀOTẠO VIỆNHÀNLÂMKHOAHỌCV ÀCÔNGNGHỆVIỆTNAM HỌCVIỆNKHOAHỌCVÀCÔNG NGHỆ - NGUYỄNCHÍDŨNG NGHIÊN CỨU ĐÁNH GIÁ HOẠT TÍNH KHÁNG PHÂN BÀOTRÊNDỊNGTẾ BÀOUNGTHƯMCF-7,JURKATTCỦACAOCHIẾT VÀHOẠT CHẤT TỪSINHKHỐI,QUẢTHỂNHÂNNI CỦACHỦNGNẤM CordycepsneovolkianaDL0004VÀIsariacicadaeF0004 LUẬNÁNTIẾNSỸCƠNGNGHỆSINHHỌC BỘGIÁO DỤCVÀĐÀOTẠO VIỆNHÀNLÂMKHOAHỌCV ÀCÔNGNGHỆVIỆTNAM HỌCVIỆNKHOAHỌCVÀCÔNG NGHỆ - ThànhphốHồ ChíMinh–Năm 2022 NGUYỄNCHÍDŨNG NGHIÊN CỨU ĐÁNH GIÁ HOẠT TÍNH KHÁNG PHÂN BÀOTRÊNDỊNGTẾ BÀOUNGTHƯMCF-7,JURKATTCỦACAOCHIẾT VÀHOẠT CHẤT TỪSINHKHỐI,QUẢTHỂNHÂNNI CỦACHỦNGNẤMCordycepsneovolkianaDL0004VÀIsaria cicadaeF0004 Chun ngành: Cơng nghệ sinh họcMãsố:9420201 LUẬNÁNTIẾNSỸCƠNGNGHỆSINHHỌC NGƯỜIHƯỚNGDẪNKHOAHỌC: PGS.TSKH NgơKếSương TS.ĐinhMinhHiệp ThànhphốHồ ChíMinh–Năm 2022 LỜICAMĐOAN Tơi cam đoan luận án tiến sỹ ngành Công nghệ Sinh học, với đề tài “NghiêncứuđánhgiáhoạttínhkhángphânbàotrêndịngtếbàoungthưMCF-7,JurkatTcủacao chiết hoạt chất từ sinh khối, thể nhân ni chủng nấmCordycepsneovolkianaDL0004 vàIsaria cicadaeF0004” cơng trình khoa học Tôi thựchiện hướng dẫn PGS.TSKH Ngơ Kế Sương TS Đinh Minh Hiệp.Nhữngkếtquảnghiên cứucủaluậnánhồntồntrungthựcvà chínhxác NGHIÊNCỨUSINH NguyễnChíDũng LỜICẢMƠN Tơi chân thành kính trọng biết ơn người Thầy, Cơ, Anh, Chị, đồngnghiệp,đồngmơn,giađìnhvàbạnbèđãgiúpđỡTơirấtnhiềucảtronghọcvấncũngnhưcuộc sốnghằngngàytrướcvàtrongqtrìnhlàmluậnántiếnsỹcơngnghệsinhhọcnày.Vớitấtcảsự chânthành,tơixinđượcgửilờicảm ơnchânthựcnhấtđến: PhóGiáosư,TiếnsỹKhoahọcNgơKếSươngđãtậntìnhchỉbảo,hướngdẫnnhững kiến thức vàkinhnghiệmqbáutrongnghiêncứu,trongcơngviệcvàcuộcsống Tiến sỹ Đinh Minh Hiệp động viên hướng dẫn kiến thức kinhnghiệmnghiêncứucũngnhư giúpđỡnhiệttìnhnhữnglúcTơigặpkhókhăn Tiến sỹ Nguyễn Thị Mỹ Nương, Tiến sỹ Dương Thúc Huy Tiến Sỹ ĐặngHồngPhúđãlnhỗtrợtưvấngiúpđỡcácvấnđềliên quan Luận án Thầy cô, nhà khoa học Viện Sinh học nhiệt đới Học viện khoa học vàcông nghệ - Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ tận tụy dạy dỗ nhữngnămtơithamgiachươngtrìnhnghiêncứusinhtạiHọc viện Tập thể bạn học viên, sinh viên, nghiên cứu sinh nhómCordyceps, đặcbiệt Em Vũ Thị Ngân, Trần Tài, Huỳnh Thư, Nguyễn Tài Hoàng, Trần MinhTrang, Nguyễn Hoàng Đăng Khoa, Phạm Thị Mỹ Ninh, Hà Thị Ngọc, NguyễnNguyệtHồng,MaiKiềuTiênvàHàThịBíchHằngđãlnđồnghànhcùngtơitrongsuốtt hờigianthực hiệnLuậnán Cuối cùng, quan trọng, Tôi muốn gửi lời cảm ơn sâu sắc đến Giađình, bạn bè ln hỗ trợ động viên để Tơi vượt qua khó khăn suốt q trìnhhọctập,lànguồnđộnglựcto lớnđểtơicóthểhồnthànhtốtLuậnántiếnsỹ ThànhphốHồChíMinh,ngày01tháng09năm2022 NGHIÊNCỨUSINH NguyễnChíDũng Tran gLỜICAMĐOAN .i LỜICẢMƠN ii DANHMỤCCÁCKÝHIỆU, CÁCCHỮVIẾTTẮT .vi DANHMỤCCÁCBẢNG .ix DANHMỤCCÁCHÌNH x MỞĐẦU CHƯƠNG1.TỔNGQUAN .3 1.1 Tổngquan vềnấmCordyceps 1.1.1 GiớithiệuvềnấmCordyceps .3 1.1.2 TổngquanvềCordycepsneovolkianavàIsariacicadae .6 1.1.3 Giátrịkinhtếcủanấm Cordyceps 1.2 NghiêncứunuôicấyCordyceps 10 1.3 ThànhphầnhoạtchấtvàhoạttínhsinhhỌccủanấmCordyceps 11 1.3.1 ThànhphầnhoạtchấtcủaCordyceps .11 1.3.2 Hoạttính kháng phânbàocủaCordyceps 16 CHƯƠNG2.VẬTLIỆU-PHƯƠNGPHÁP 24 2.1 Vậtliệunghiêncứu 24 2.1.1 Đối tượngnghiêncứu .24 2.1.2 Hóa chất 25 2.1.3 Dụngcụvàthiếtbị 25 2.2 Phươngphápnghiêncứu 26 2.2.1 Phươngphápthunhậncaochiếtvàcáchợpchất 26 2.2.2 Phương pháp khảo sát hoạt tính gây độc tế bào cảm ứng apoptosis củacaochiếtvàcáchợpchất 37 2.3 Phươngpháp xửlýsốliệu 42 CHƯƠNG3.KẾTQUẢVÀTHẢO LUẬN 43 3.1 Chiết caotừsinh khốivàquảthểC.neovolkianaDL0004vàI.cicadae F0004 43 3.2 Hoạt tính gây độc tế bào của các cao chiết với dòng tế bào ung thư MCF7vàJurkat T 47 3.2.1 Hoạt tính gây độc của các cao chiết C neovolkiana DL0004 đối với cácdòngtếbàoMCF-7vàJurkatT 48 3.2.2 Hoạt tính gây độc của các cao chiết I cicadae F0004 đối với các dòng tếbàoMCF-7vàJurkat T 51 3.2.3 Xácđịnhcaochiếtcókhảnăng gâyđộctếbàocao 55 3.3 Nghiên cứu cảm ứng apoptosis tế bào MCF-7 Jurkat T với các cao chiếttiềmnăng 58 3.3.1 Nghiên cứu cao PE của sinh khối Cordyceps neovolkiana DL0004 cảmứngapoptosistếbàoungthưMCF-7vàJurkatT 58 3.3.2 KếtquảđánhgiákhảnăngcảmứngapoptosiscủacaoEAtừquảthểI.cicada e F0004 67 3.4 Phân chất, tinh sạch định danh các hợp chất của các cao chiết có tiềmnăngkhángphânbào 78 3.4.1 Phânchất caoPEcủasinhkhốiC.neovolkianaDL0004 [59],[83] 78 3.4.2 Phânchất caoEAcủaquảthểIsariacicadaeF0004[59] 83 3.5 Kết đánh giá hoạt tính gây độc tế bào ung thư MCF-7 Jurkat T củacácchất .90 3.6 Kết khả cảm ứng apoptosis tế bào ung thư MCF-7 Jurkat Tcủaergone 92 3.6.1 Hìnhthái tếbào MCF-7vàJurkatTsaukhinhuộmvớiAO/EB 93 3.6.2 Phântích Chukỳtếbàobằngphương phápflow cytomeretry 94 3.6.3 Định lượng tế bào bị cảm ứng apoptosis phương pháp nhuộmAnnexinV/PI 96 KẾTLUẬNVÀ KIẾNNGHỊ 100 Kếtluận 100 Kiếnnghị .101 DANHMỤCCÁCKÝHIỆU, CÁCCHỮVIẾTTẮT Chữviếttắt TiếngAnh Diễngiải AO Acridineorange cridincam ATCC the American Type Bảotànggiốngchuẩn Hoakỳ CultureCollection bFGF BasicFibroblast GrowthFactor Nhântốsinhtrưởngnguyênbào sợi Bu n-Butanol CAT Enzymecatalase CPT Camptothecin DMSO Dimethylsulfoxid DPPH 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl EA Ethylacetate EB Ethidiumbromid EDTA Ethylene diamin etetraaceticacid ED50 Effectivedose,50% Liềulượnghiệuquả EP Ergosterolperoxid EPS Exopolysaccharid Polysaccharidngoạibào EPSF Exopolysaccharidfragment Phân đoạn polysaccharid ngoạibào ER Estrogen Et Ethanol FBS Fetalbovineserum GPx Glutathioneperoxidase HMBC Heteronuclear multiple Huyếtthanhthaibò PhổHMBC bondcorrelation HSQC Heteronuclearsinglequantumcoh PhổHSQC erence IC50 Thehalf maximal Nồngđộức chếtốiđamộtnửa inhibitoryconcentration IFN Interferon-gamma LD50 Lethaldose,50% LPS Lipopolysaccharid MCF-7 MichiganCancerFoundation-7 MDA Malondialdehyde MethA MethAfibrosarsoma MIC The minimum Liềulượnggâychếtmộtnửa DòngtếbàoMCF-7 Nồngđộ ứcchếtốithiểu inhibitoryconcentration MMP2 Matrixmetallopeptidase2 MTH Methuselah GenMethuselah MTT MTTassay XétnghiệmphươngphápMTT NAD Nicotinamidadenindinucleotid NCI NationalCancerInstitute ViệnungthưQuốcgiaHoakỳ