Enzyme thông dụng

Chương CÁC ENZYME PHỔ BIẾN TRONG SINH HỌC PHÂN TỬ NỘI DUNG DNA polymerase RNA polymerase Ligase Phosphatase kinase Nuclease DNA POLYMERASE Xúc tác phản ứng hình thành polymer cách tập hợp dNTP Không thể tổng hợp chuỗi polynucleotide từ đầu (de novo) Xúc tác gắn nucleotide vào đầu 3’-OH primer có sẵn Hầu hết polymerase dùng SHPT có nguồn gốc từ vi khuẩn từ virus kí sinh chúng DNA POLYMERASE prokaryote Ở vi khuẩn có loại DNA polymerase: Pol I, Pol II Pol III Cả loại có hoạt tính xúc tác kéo dài 5’ 3’ với tốc độ khác hoạt tính 3’ 5’ exonuclease Pol III (Kornberg Gefter, 1970) phức hợp enzyme điều khiển q trình tái DNA Pol I cịn có hoạt tính 5’ 3’ exonuclease DNA Pol I E coli gồm phần, - phân đoạn lớn đoạn Klenow có hoạt tính 5’ 3’ polymerase 3’ 5’ exonuclease; - phân đoạn nhỏ có hoạt tính 5’ 3’ exonuclease DNA polymerase I DNA POLYMERASE prokaryote T4 DNA polymerase thực khuẩn thể cần khuôn primer để hoạt động 3’ 5’ exonuclease dNTPs 5’ 3’ polymerase có dNTPs Có thể sử dụng T4 DNA polymerase kỹ thuật nick translation hay gắn nhãn đầu 3’ DNA sợi đôi DNA polymerase thực khuẩn thể T7 cơng cụ lí tưởng cho việc giải trình tự DNA Dạng chỉnh sửa enzyme có tốc độ polymer hố 300 nucleotide/giây DNA POLYMERASE prokaryote Terminal deoxynucleotidyl transferase (TdT) xúc tác việc bổ sung homopolymer vào đầu 3’-OH DNA không cần khuôn mẫu TdT sử dụng dán nhãn DNA với nucleotide biến đổi (ddNTP, DIG-dUTP), kéo dài primer giải trình tự DNA TdT cần DNA primer sợi đơn có Mg2+, chấp nhận DNA sợi đơi primer có Co2+ RACE (Rapid amplification of 5’- cDNA end) DNA POLYMERASE prokaryote Polymerase bền nhiệt Bst polymerase DNA Pol I bền nhiệt phân lập từ vi khuẩn chịu nhiệt Bacillus stearothermophilus (Bst) Bst Pol I hoạt động tốt 65oC, bị bất hoạt 75oC/15’; có hoạt tính 5’ 3’ exonuclease hoạt tính đạt mức cao có nồng độ cao Mg2+ Bst Pol I gồm phân đoạn protein Phân đoạn lớn bền nhiệt hữu dụng phản ứng giải trình tự 65oC DNA POLYMERASE prokaryote Polymerase bền nhiệt Taq polymerase tinh lần vào năm 1976 từ vi khuẩn Thermophilus aquaticus (vi khuẩn sống nhiệt độ 70oC - 80oC) Taq polymerase có halflife 90oC/40’ 100oC/5’; hoạt tính tối đa enzyme đạt 80oC cần Mg2+ Taq polymerase thiếu hoạt tính 3’ 5’ exonuclease (hoạt tính sửa sai, proofreading), enzyme có độ xác thấp 10 RNA polymerase SP6 T7 RNA pol cần Mg2+ khuôn DNA sợi đôi SP6 T7 RNA pol đặc hiệu promoter phiên mã trình tự DNA tạo dịng kiểm soát promoter tương ứng (SP6 T7) Quá trình phiên mã SP6 hay T7 RNA pol diễn đến hết phần poly(A) khn mẫu dạng trịn, q trình lặp lại nhiều lần trước RNA pol tách Làm thẳng mạch khuôn trước dịch mã đảm bảo kết thúc hiệu trình phiên mã 21 Ligase DNA ligase nối đoạn DNA cách hình thành liên kết phosphodiester nhóm 3’-OH nhóm phosphate vị trí hở sợi đơn phân tử DNA sợi đơi Trong SHPT, DNA ligase sử dụng để nối đoạn DNA đầu đầu dính, thêm linker/adaptor hay sửa vị trí hở (nick) DNA ligase khơng bền nhiệt gồm DNA ligase từ Chlorella virus thực khuẩn thể T7 (34 kDa, 41 kDa), thực khuẩn thể T4 (68 kDa) DNA ligase bền nhiệt phân lập từ nguồn vi khuẩn chịu nhiệt, hoạt động nhiệt độ từ 45 – 80oC 22 Ligase T4 DNA ligase từ thực khuẩn thể thường sử dụng SHPT, đơn phân có khối lượng 68 kDa cần Mg2+ ATP để hoạt động T4 DNA ligase nối đầu đầu cố kết hay sửa vị trí hở (nick) sợi đơn sợi đơi DNA, RNA tổ hợp lai DNA/RNA 23 RNA ligase xúc tác hình thành nối phosphodiester đầu 5’ phosphate 3’-OH RNA sợi đơn hay phân tử DNA Chuyển loại nhóm phosphate Alkaline phosphatase (AP) tinh từ E coli sinh vật bậc cao, sử dụng để loại bỏ nhóm 5’-phosphate khỏi nucleic acid để ngăn chặn đóng vịng DNA vector thí nghiệm tạo dịng AP bị bất hoạt tác nhân tạo phức (chelating agents) EGTA, nồng độ thấp phosphate vô T4 polynucleotide kinase xúc tác phản ứng chuyển nhóm phosphate từ phân tử ATP đến đầu 5’-OH nucleic acid, trao đổi nhóm 5’-phosphate, hay phosphoryl hố đầu 3’ mononucleotide 24 Nuclease Phân cắt liên kết phosphodiester chuỗi nucleic acid Có hai nhóm chính: - exonuclease-hoạt động hai đầu phân tử nucleic acid - endonuclease phân cắt vùng bên phân tử Deoxyribonuclease phân cắt DNA tạo khe hở (nicks) ribonuclease cắt RNA 25 Nuclease Dnase I (deoxyribonuclease I) endonuclease chiết xuất từ tụy tạng bò, phân cắt sợi đơi/đơn DNA có mặt ion hóa trị Khi có Mg 2+ dung dịch , enzyme tạo nick sợi đôi DNA; diện Mn2+ làm enzyme cắt hai sợi DNA Ứng dụng Nick translation Tạo đoạn DNA ngẫu nhiên cách cắt sợi đôi DNA Tinh RNA từ tế bào hay hỗn hợp phiên mã 26 27 Nick translation dNTP mang đồng vị phóng xạ 32P vị trí Pα gắn vào trình tự DNA qua trình nick translation 28 Nick translation Nuclease DNase I Là glycoprotein 31 kDa , thường dạng hỗn hợp gồm isoenzyme (A, B, C, D) Bị bất hoạt 75oC 5’ với EGTA mM Ưu tiên xúc tác phản ứng cắt vị trí 3’ pyrimidine (C/T) 29 Phức hợp Dnase I 30 Nuclease Exonuclease III (exodeoxyribonuclease III) enzyme đơn phân tử 28 kDa với nhiều hoạt tính: 3’-exonuclease, xúc tác loại bỏ nucleotide khỏi đầu 3’-OH sợi đôi DNA Phosphatase, loại bỏ gốc phosphate chuỗi DNA kết thúc với nhóm 3’-phosphate Rnase H, phân giải sợi RNA tổ hợp lai DNA/RNA Endonuclease, phân cắt base lỗi (apurinic, apyrimidic) khỏi khung đường phosphate DNA 31 Nuclease Rnase T1 protein 11 kDa tinh từ Aspergillus oryzae, có hoạt tính endonuclease phân cắt đặc hiệu RNA sợi đơn base G Rnase T2 tinh từ Aspergillus oryzae, có KLPT 36000 cắt tất liên kết phosphodiester RNA S1 nuclease công cụ hữu hiệu để xác định dạng lai nucleic acid, đánh dấu vùng DNA sợi đôi, loại vùng sợi đơn DNA dạng so le S1 nuclease metalloprotein 32 kDa, phân cắt RNA DNA sợi đơn thành 5’ mononucleotide 32 Nuclease Exonuclease VII tinh từ E coli K12 , chuỗi poypeptide 88 kDa Phân giải đặc hiệu DNA sợi đơn (từ đầu phân tử) Thường dùng để tạo DNA đầu bằng; đặc biệt sử dụng để loại bỏ primer khỏi phản ứng PCR 33 Nuclease Ribonuclease Ribonuclease tuỵ (RNAse A) endonuclease cắt sợi đơn RNA nucleoside 3’-phosphate 3’-phosphooligonucleotide kết thúc với Cp/Up; sử dụng trong: Giảm nhiễm RNA ly trích plasmid DNA Lập đồ đột biến DNA/RNA cách phân cắt vị trí khơng tương đồng RNAse A hoạt động điều kiện khác khó bất hoạt Tuy nhiên sử dụng diethyl pyrocarbonate (DEPC), muối guanidinium, βmercaptoethanol, kim loại nặng hay phức hợp vanadylribonucleoside để ức chế hiệu RNAse A 34 Nuclease Ribonuclease Ribonuclease H (RNAse H) phân giải đặc hiệu RNA phức hợp lai RNA/DNA; phân giải RNA probe phản ứng lai trước, loại bỏ đuôi poly-A đầu 3’của mRNA RNAse H có hoạt tính tối đa điều kiện pH 7,5 – 9,1 với có mặt tác nhân khử, ion Mg2+/Mn2+ Enzyme bị ức chế N-ethylmaleimide mức thấp nồng độ ion cao Các loại ribonuclease khác (RNAse Phy I, RNAse CL3, RNAse Phy M) sử dụng nhiều giải trình tự RNA với tính đặc hiệu u cầu phân cắt đặc hiệu khác 35