Tài liệu thí nghiệm CN protein - enzyme

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG CĐ KINH TẾ CÔNG NGHỆ TPHCM KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC ***************** GVGD: ThS. Lê Thanh Hải TPHCM, tháng 03 năm 2013 - i - MỤC LỤC LI NÓI U 1 NI QUY THC TP 2 BÀI 1: NH LƯNG NITƠ ACID AMIN BNG PHƯƠNG PHÁP CHUN  FORMOL (PHƯƠNG PHÁP SORENSEN) 3 1/ Nguyên tc 3 2/ Thc hành 3 2.1. Nguyên liu và hóa cht 3 2.2. Dng c và thit b 3 2.3. Tin hành 3 2.4. Kt qu 4 BÀI 2: PHN NG BIURE 5 1/ Nguyên tc 5 2/ Thc hành 5 2.1. Nguyên liu và hóa cht 5 2.2. Dng c và thit b 5 2.3. Tin hành 5 2.4. Kt qu 5 BÀI 3: XÁC NH IM NG IN CA PROTEIN CASEIN 6 1/ Nguyên tc 6 2/ Thc hành 6 1.1. Nguyên liu và hóa cht 6 1.2. Dng c và thit b 6 1.3. Tin hành 6 1.4. Kt qu 6 BÀI 4: SO SÁNH TÁC DNG XÚC TÁC CA ENZYME VI XÚC TÁC VÔ CƠ 7 1/ Nguyên tc 7 2/ Thc hành 7 2.1. Nguyên liu và hóa cht 7 2.2. Dng c và thit b 7 2.3. Tin hành 7 2.4. Kt qu 8 BÀI 5: TÍNH C HIU CA ENZYME 9 1/ Nguyên tc 9 2/ Thc hành 9 2.1. Nguyên liu và hóa cht 9 - ii - 2.2. Dng c và thit b 9 2.3. Tin hành 9 2.4. Kt qu 10 BÀI 6: TÁC DNG CA CHT KÍCH THÍCH VÀ CHT KÌM HÃM 11 1/ Nguyên tc 11 2/ Thc hành 11 2.1. Nguyên liu và hóa cht 11 2.2. Dng c và thit b 11 2.3. Tin hành 11 2.4. Kt qu 12 BÀI 7: XÁC NH HOT TÍNH CA ENZYME LIPASE 13 1/ Nguyên tc 13 2/ Thc hành 13 2.1. Nguyên liu và hóa cht 13 2.2. Dng c 13 2.3. Tin hành 13 2.4. Tính kt qu 14 BÀI 8: KHO SÁT HOT TÍNH ENZYME ASCOBATOXIDASE 15 1/ Nguyên tc 15 2/ Thc hành 15 2.1. Nguyên liu và hoá cht 15 2.2. Dng c 15 2.3. Tin hành 15 2.4. Cách tính kt qu: 16 BÀI 9: XÁC NH HÀM LƯNG PROTEIN TRONG DCH CHIT T QU DA (PHƯƠNG PHÁP LOWRY) 17 1/ Nguyên tc 17 2/ Thc hành 17 2.1. Nguyên liu và hoá cht 17 2.2. Dng c và thit b 17 2.3. Tin hành 17 2.4. Tính kt qu 19 BÀI 10: KHO SÁT HOT TÍNH ENZYME BROMELIN 20 1/ Nguyên tc 20 2/ Thc hành 20 2.1. Dng c 20 2.2. Hoá cht 20 - iii - 2.3. Cách tin hành 20 2.4. Kt qu 21 BÀI 11: XÁC NH HOT TÍNH ENZYM α-AMYLASE THEO PHƯƠNG PHÁP SMITH VÀ ROE 22 1/ Nguyên tc 22 2/ Thc hành 22 2.1. Nguyên liu và hoá cht 22 2.2. Dng c và thit b 22 2.3. Cách tin hành 23 2.4. Tính kt qu 25 - 1 - LỜI NÓI ĐẦU Giáo trình “Thc hành công ngh protein – enzyme” ưc biên son nhm phc v cho môn hc thc hành công ngh protein – enzyme ca sinh viên chuyên ngành công ngh thc phm và sinh hc ng dng – Khoa Công ngh Sinh hc – Trưng Cao ng Kinh t Công ngh TPHCM. Giáo trình ưc biên son da trên cơ s tham kho các tài liu và sách thí nghim v protein – enzyme trong và ngoài nưc. Trong tài liu này gm 11 bài thc hành nhm giúp sinh viên làm quen vi các phương tin và quy tc an toàn thí nghim, s dng dng c, thit b và thc hành thí nghim nh tính, nh lưng acid amin, protein, enzyme t ơn gin n phc tp. Các bài thí nghim này giúp sinh viên nm vng tính cht ca protein – enzyme và hiu rõ hơn các kin thc lý thuyt ã hc t môn hc Công ngh Protein – Enzyme. Tác giả ThS. Lê Thanh Hi - 2 - NỘI QUY THỰC TẬP 1. Sinh viên phi có mt ti phòng thí nghim úng gi, nu ngh hc phi có lý do chính áng, phi xin phép giáo viên. 2. Sinh viên phi c k, nm vng ni dung bài thí nghim  nhà và chun b sn bn báo cáo kt qu thí nghim trưc khi thí nghim. 3. Trong phòng thí nghim phi mc áo blouse, rt thn trng khi s dng dung môi d cháy n và hóa cht c hi. 4. Áp dng tr im 20% tng bài thí nghim trong các trưng hp sau: không chun b trưc, không có áo blouse, i tr quá 10 phút không gi trt t, tác phong không nghiêm túc, vi phm ni quy phòng thí nghim, thao tác cu th không thn trng. 5. Khi làm thí nghim phi trt t, cn thn, gi sch nơi làm thí nghim, tit kim hóa cht, làm v hay gây hư hng thit b thì phi bi thưng. 6. Sau khi thí nghim, sinh viên phi ra sch dng c, sp xp li dng c, hóa cht úng ch, lau sch bàn thí nghim và bàn giao cho cán b ph trách phòng thí nghim. 7. Cui bui sinh viên phi np báo cáo kt qu li cho giáo viên hưng dn. Thực hành Công nghệ Protein - Enzyme - 3 - BÀI 1: ĐỊNH LƯỢNG NITƠ ACID AMIN BẰNG PHƯƠNG PHÁP CHUẨN ĐỘ FORMOL (PHƯƠNG PHÁP SORENSEN) 1/ Nguyên tắc Các aldehyde d kt hp vi nhóm amin. Khi cho formaldehyde tác dng vi acid amin, nhóm amin b methylen hóa to thành dn xut methylen imino acid. Hp cht to thành có tính acid mnh hơn acid amin t do, các nhóm carboxyl ca chúng d dàng nh phân bng kim, qua ó gián tip tính ưc lưng nitơ amin ca các acid amin có trong dung dch. 2/ Thực hành 2.1. Nguyên liệu và hóa chất - Nưc mm : 1ml - Dung dch NaOH 0,05N : 100ml - Dung dch HCl 0,05N : 30ml - Formol trung tính : 10ml - Bromthymol blue 0,04% : 20ml - Phenolphtalein 0,5% : 20ml - Dung dch m phosphate pH = 7 : 50ml o Dung dich A: 27,8 g NaH 2 PO 4 hoà tan trong 1000ml o Dung dch B: 53.05g Na 2 HPO 4 .7H 2 O hoc 71.1g Na 2 HPO 4 .12H 2 O pha trong 1000ml o  pha dung dch m phosphate pH =7 hút dung dch A và dung dch B theo t l sau: Dung dich A: 39 ml + dung dich B: 61ml thêm nưc va  200ml. - Dung dch m phosphate pH = 9,2 : 50ml (Hòa tan 456g kali hydro phosphate ngm 3 phân t nưc (K 2 HPO 4 .3H 2 O) trong 1000ml nưc ct) 2.2. Dụng cụ và thiết bị - Bình nh mc 100ml : 1 bình - Pipette 1ml : 2 - Pipette 10ml : 2 - Erlen 100ml : 6 bình - Burette 25ml : 1 - Becher 100ml : 4 cái 2.3. Tiến hành Chuẩn bị thang màu có pH 7 và pH 9,2 Ly 2 erlen 100ml: - Cho vào bình th nht: 20ml dung dch có pH 7,0 và 5 git bromthymol blue 0,04%. - Cho vào bình th hai: 20ml dung dch có pH 9,2; 5 git bromthymol blue 0,04% và 3 git phenolphtalein 0,5% Khi ó dung dch trong bình 1 có màu xanh lc nht, dung dch trong bình 2 có màu tím xanh. Màu ca các dung dch trên gi trong bình kín có th bn trong na tháng. Thực hành Công nghệ Protein - Enzyme - 4 - Xác định hàm lượng nitơ amin trong nước mắm: Nưc mm là mt dung dch thy phân protein có th nh lưng nitơ bng phương pháp chun  formol. Do nưc mm có màu ti cn phi pha tht loãng mi có th so màu ca cht ch th. Ly 1ml nưc mm cho vào bình nh mc 100ml, dùng nưc ct nh mc thành 100ml, lc u. Ly vào bình erlen có cùng dung tích vi 2 bình màu chun 20ml dch mu pha loãng t bình nh mc, thêm 5 git bromthymol blue. Nu dung dch có màu xanh dương thì thêm tng git HCl hay H 2 SO 4 0,05N; nu dung dch có màu vàng thì thêm tng git NaOH 0,05N cho n khi dung dch có màu ng vi màu ca bình 1 có pH 7,0. Thêm 3 git phenolphtalein 0,5%; 4ml formol trung tính ri chun  bng NaOH 0,05N cho n khi hn hp có màu ng vi màu ca dung dch trong bình 2 có pH 9,2. Song song tin hành làm thí nghim kim chng, thay dung dch nghiên cu bng nưc ct. 2.4. Kết quả S gram nitơ acid amin có trong 1 lít nưc mm: ݔ = ሺ ܽ − ܾ ሻ × ܶ × 0,0007 × 100 × 1000 20 × ܸ Trong ó: x: lưng gram nitơ acid amin có trong 1 lít nưc mm a: s ml dung dch NaOH 0,05N dùng  chun dung dch thí nghim b: s ml dung dch NaOH 0,05N dùng  chun dung dch kim chng T: h s hiu chnh nng  ca dung dch NaOH em dùng so vi nng  chun V: s ml nưc mm cho vào bình nh mc 0,0007: s gram nitơ vi 1ml NaOH 0,05N [...]... - Dung dịch HCl 1N : 25ml (85 ml dung dịch HCl đậm đặc trong nước thành 1 lít) - Dung dịch NaCl 3% : 25ml (3 g NaCl trong nước thành 100 ml) - Thuốc thử Lugol : 25ml (0,5 g I2 và 5 g KI trong nước thành 200 ml) 2.2 Dụng cụ và thiết bị - Cối sứ :1 - Ống nghiệm : 20 - Ống đong 50ml :1 - Bể điều nhiệt :1 - Pipet 1ml :2 - Pipet 10ml :2 - Becher 100ml :3 - Erlen 100ml :3 - Máy quang phổ :1 - Curvet :6 -. .. - Curvet :6 - 22 - Thực hành Công nghệ Protein - Enzyme - Giấy lọc :4 - Phễu lọc :3 2.3 Cách tiến hành Ly trích amylase: cho khoảng 100 hạt lúa nảy mầm cho vào cối sứ nghiền nhuyễn với 3-5 ml nước cất Tiếp tục nghiền và thêm dần đến hết 50ml nước cất để hòa tan enzym Lọc dịch bằng giấy lọc, thu dịch lọc có chứa enzym amylase - 23 - Thực hành Công nghệ Protein - Enzyme Tiến hành thí nghiệm theo bảng... 2.1 Dụng cụ - Becher 100ml, 250ml, 500ml - Chậu thuỷ tinh - Pipet 0,2ml, 1ml, 2ml, 5ml - Máy ly tâm - Phễu lọc - Quang phổ kế - Ống nghiệm 2.2 Hoá chất - Dung dịch NaOH 0,5N – 1N - Dung dịch HCl 2N – 0,2N - Dung dịch acid tricloracetic 5% - Dung dịch Tyrosin mẫu: 45mg pha trong 100ml dung dịch HCl 0,2N - Dung dịch đệm KH2PO4 1M: 13,6g pha với nước cất thành 100ml - Dung dịch hemoglobin 2%: cân 2g Hb +... kết quả thí nghiệm xác định tính đặc hiệu của enzyme Ống nghiệm Cơ chất Xúc tác 1 Tinh bột Amylase 2 Tinh bột Bromelin 3 Casein Amylase 4 Casein Bromelin Nhận xét về tính đặc hiệu của enzyme - 10 - Phản ứng thử Kết quả Thực hành Công nghệ Protein - Enzyme BÀI 6: TÁC DỤNG CỦA CHẤT KÍCH THÍCH VÀ CHẤT KÌM HÃM 1/ Nguyên tắc Các chất có tác dụng làm tăng hoạt tính của enzyme gọi là các chất hoạt hóa enzyme. .. 500 nm Vẽ đồ thị biểu diễn sự biến thiên của mật độ quang (∆OD) theo nồng độ protein chuẩn (µg/ml) với trục tung là ∆OD, trục hoành là nồng độ protein - 18 - Thực hành Công nghệ Protein - Enzyme Xác định hàm lượng protein trong mẫu Bảng 6 Bố trí thí nghiệm xác định hàm lượng protein trong mẫu dứa Ống nghiệm số 0 1 2 3 Dung dịch protein mẫu (ml) 0,4 0,4 0,4 0,4 Dung dịch C (ml) 2 2 2 2 0,2 0,2 0,2 0,2... erlen bằng KOH 0,1N - 13 - Thực hành Công nghệ Protein - Enzyme Tiến hành thí nghiệm 2 lần Lấy kết quả là giá trị trung bình của 2 lần thí nghiệm Cách xác định hệ số hiệu chỉnh k: - Chuẩn độ 10ml dung dịch KOH 0,1N bằng dung dịch H2SO4 0,1N chuẩn, thuốc thử màu là phenolphtalein cho đến khi dung dịch vừa mất màu hồng thì dừng lại Xác định lượng H2SO4 0,1N chuẩn cần dùng Tiến hành thí nghiệm 3 lần Lấy... phòng - 11 - Thực hành Công nghệ Protein - Enzyme 2.4 Kết quả Chụp hình và ghi kết quả vào bảng sau: Bảng 4 Bảng kết quả thí nghiệm xác định tác dụng của chất hoạt hóa và kiềm hãm hoạt tính của enzyme amylase Ống nghiệm Cơ chất Xúc tác 1 Tinh bột Amylase 2 Tinh bột Amylase 3 Tinh bột Phản ứng thử Kết quả Amylase Nhận xét về tác dụng của chất hoạt hóa và chất kiềm hãm đến hoạt tính của enzyme amylase -. .. (g) - 19 - Thực hành Công nghệ Protein - Enzyme BÀI 10: KHẢO SÁT HOẠT TÍNH ENZYME BROMELIN 1/ Nguyên tắc Bromelin là 1 enzyme thuộc loại protease có nhiều trong trái thơm Để khảo sát hoạt tính của bromelin, người ta cho enzyme này thuỷ phân các cơ chất protein (hemoglobin, casein…) và do các peptid được giải phóng ra có chứa Tyrosin bằng cách cho tác dụng với thuốc thử Folin 2/ Thực hành 2.1 Dụng cụ -. .. Hoạt độ của enzyme ascorbatoxidase (UI) V1 : Thể tích Na2S2O3 dùng ở erlen thí nghiệm V2 : Thể tích Na2S2O3 dùng ở erlen đối chứng k : Hệ số hiệu chỉnh của dung dịch Na2S2O3 0,01N 0,088 : Số mg acid ascorbic tương ứng với 1 ml dung dịch Na2S2O3 0,01N m : Khối lượng nguyên liệu để chiết enzym (g) t : Thời gian phản ứng (phút) - 16 - Thực hành Công nghệ Protein - Enzyme BÀI 9: XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG PROTEIN. .. trong tủ lạnh - Thuốc thử Folin 2.3 Cách tiến hành Chiết dịch nước thơm chứa enzyme Chọn trái thơm xanh tươi, gọt bỏ vỏ ngoài, cắt nhỏ và xay nát trong máy xay sinh tố Lọc qua tấm vải màn và vắt nước Nước thơm đem ly tâm ở 6000 vòng/phút trong 10 phút Lấy dịch bên trên có chứa enzyme bromelin - 20 - Thực hành Công nghệ Protein - Enzyme Khảo sát hoạt tính enzyme bromelin: Thực hiện 3 loại ống nghiệm (mỗi . 5ml - Dung dch CuSO 4 0,5% : 5ml - Nưc ct : 5ml - Dung dch h tinh bt 1% : 20ml - Thuc th Lugol : 5ml - Thuc th Fehling : 5ml 2.2. Dụng cụ và thiết bị - ng nghim : 03 ng - Pipette. bình kín có th bn trong na th ng. Th c hành Công nghệ Protein - Enzyme - 4 - Xác định hàm lượng nitơ amin trong nước mắm: Nưc mm là mt dung dch th y phân protein có th nh lưng. vào: - ng th nht: 1ml nưc ct - ng th hai: 1ml dung dch enzyme amylase - ng th ba: 1ml dung dch enzyme amylase - ng th tư: 1ml dung dch HCl 1% Sau ó t các ng nghip th nht