Trần phương nhi nghiên cứu quy trình làm giàu flavonoid từ dịch chiết vỏcây núc nác khóa luận tốt nghiệp dược sĩ

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI TRẦN PHƯƠNG NHI NGHIÊN CỨU QUY TRÌNH LÀM GIÀU FLAVONOID TỪ DỊCH CHIẾT VỎ CÂY NÚC NÁC KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ HÀ NỘI - 2023 BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI TRẦN PHƯƠNG NHI MSV: 1801523 NGHIÊN CỨU QUY TRÌNH LÀM GIÀU FLAVONOID TỪ DỊCH CHIẾT VỎ CÂY NÚC NÁC KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ Người hướng dẫn: TS Bùi Thị Thúy Luyện Nơi thực hiện: Bộ mơn Kỹ thuật Hóa dược Chiết xuất HÀ NỘI - 2023 LỜI CẢM ƠN Lời tơi xin bày tỏ lịng biết ơn chân thành đến TS Bùi Thị Thúy Luyện, người trực tiếp hướng dẫn định hướng cho suốt thời gian thực khóa luận Tơi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới PGS.TS Nguyễn Văn Hải, phó trưởng khoa Cơng nghệ hóa dược ln quan tâm tạo điều kiện, giúp đỡ tơi tơi gặp khó khăn q trình nghiên cứu khoa Tơi xin gửi lời cảm ơn tới thầy cô, anh chị kĩ thuật viên mơn Kỹ thuật hóa dược chiết xuất môn Công Nghiệp Dược, đặc biệt bạn K73 em K74 tham gia nghiên cứu ln giúp đỡ tơi nhiệt tình để tơi hồn thành khóa luận cách tốt Tôi xin gửi lời cảm ơn tới Ban giám hiệu, mơn phịng ban tồn thể cán nhân viên Trường Đại học Dược Hà Nội tạo điều kiện cho suốt q trình học tập trường thực khóa luận Cuối cùng, xin gửi lời cảm ơn tới gia đình bạn bè ln ủng hộ, động viên suốt thời gian vừa qua Do thời gian kinh nghiệm cịn hạn chế nên khóa luận cịn nhiều thiếu sót, em nhóm nghiên cứu mong nhận bảo ý kiến đóng góp thầy bạn bè Hà Nội, ngày 23 tháng năm 2023 Sinh viên Trần Phương Nhi MỤC LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, BIỂU ĐỒ ĐẶT VẤN ĐỀ CHƯƠNG TỔNG QUAN 1.1 Vài nét núc nác 1.1.1 Tên gọi phân bố 1.1.2 Đặc điểm thực vật 1.1.3 Bộ phận dùng 1.1.4 Thành phần hóa học .3 1.2 Tổng quan flavonoid vỏ thân núc nác 1.2.1 Tác dụng dược lý flavonoid núc nác 1.3 Ứng dụng flavonoid từ núc nác 1.4 Một số phương pháp chiết xuất flavonoid từ dược liệu 1.5 Một số phương pháp làm giàu flavonoid toàn phần 10 1.6 Giới thiệu nhựa macroporous 11 1.6.1 Giới thiệu chung 11 1.6.2 Ứng dụng nhựa macroporous làm giàu nhóm hợp chất flavonoid/polyphenol từ dược liệu .14 CHƯƠNG ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 16 2.1 Đối tượng nghiên cứu 16 2.1.1 Đối tượng nghiên cứu .17 2.1.2 Chất chuẩn Hóa chất 17 2.1.3 Dụng cụ thiết bị 17 2.2 Nội dung nghiên cứu 17 2.2.1 Lựa chọn khảo sát số yếu tố ảnh hưởng đến trình hấp phụ phản hấp phụ flavonoid nhựa macroporous .17 2.2.2 Xây dựng quy trình điều chế cao giàu flavonoid từ vỏ núc nác sử dụng nhựa macroporous quy mơ phịng thí nghiệm 18 2.3 Phương pháp nghiên cứu 18 2.3.1 Phương pháp định lượng flavonoid toàn phần 18 2.3.2 Phương pháp làm giàu flavonoid toàn phần từ dịch chiết vỏ thân núc nác 20 CHƯƠNG 3: THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN .22 3.1 Kết thẩm định phương pháp định lượng quang phổ UV-VIS 22 3.1.1 Tính thích hợp hệ thống 22 3.1.2 Tính tuyến tính 23 3.1.3 Độ xác 24 3.1.4 Độ 25 3.2 Kết khảo sát trình hấp phụ flavonoid từ dịch chiết lên nhựa macroporous 26 3.2.1 Lựa chọn nhựa hấp phụ 26 3.2.2 Ảnh hưởng nồng độ dịch chiết đến khả hấp phụ hạt nhựa macroporous 27 3.2.3 Khảo sát tốc độ nạp dịch 28 3.2.4 Khảo sát thể tích dịch nạp 28 3.3 Kết khảo sát trình giải hấp phụ nhựa macroporous 29 3.3.1 Khảo sát lựa chọn dung môi giải hấp phụ 29 3.3.2 Khảo sát lựa chọn dung môi rửa tạp 31 3.3.3 Khảo sát thể tích dung mơi giải hấp phụ dung môi rửa tạp 31 3.4 Xây dựng quy trình làm giàu flavonoid tồn phần từ dịch chiết vỏ núc nác sử dụng nhựa macroporous D101 33 BÀN LUẬN 36 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 39 TÀI LIỆU THAM KHẢO DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT STT Ký hiệu Tên đầy đủ BV Thể tích khối hạt ( Bed Volume) HSCCC HPLC RSD Độ lệch chuẩn tương đối (Relative Standard Deviation) EtOH ethanol DPPH 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl ABTS 2,2'-azino-bis-3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonic acid 20 mg QE/g Hàm lượng flavonoid tồn phần tính theo miligam quercetin/gam dược liệu Sắc ký ngược dòng tốc độ cao (High Speed Counter Current Chromatography) Sắc ký lỏng hiệu cao (High Performance Liquid Chromatography) DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.2.Phân loại nhựa macroporous… 13 Bảng 2.1 Danh mục hóa chất sử dụng 17 Bảng 1.Khảo sát tính thích hợp hệ thống phương pháp 23 Bảng 2.Mối tương quan nồng độ độ hấp thụ dung dịch quercetin chuẩn 23 Bảng 3.3.Kết khảo sát độ xác ngày mẫu thử 24 Bảng 3.4.Kết khảo sát độ xác khác ngày mẫu thử 25 Bảng 3.5.Kết khảo sát độ đúng… 25 Bảng 3.6.Kết khảo sát dung môi rửa tạp 31 Bảng 7.Kết đánh giá độ ổn địng quy trình làm giàu flavonoid tồn phần 35 DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, BIỂU ĐỒ Hình 1.1.Đặc điểm thực vật núc nác Hình 1.2.Một số hợp chất vỏ thân núc nác [16] Hình 1.3.Cơng thức cấu tạo phân nhóm flavon Hình 1.4.Một phần mạng lưới polyme polystyren liên kết chéo [37] 12 Hình 1.5.Một số yếu tố ảnh hưởng tới trình làm giàu (phân lập) hoạt chất [44] 14 Hình 3.1.Đường chuẩn biểu thị mối tương quan nồng độ độ hấp thụ dung dịch quercetin chuẩn 24 Hình 3.2.Biểu đồ đánh giá khả hấp phụ giải hấp phụ số nhựa macroporous 26 Hình 3.3.Biểu đồ khảo sát ảnh hưởng nồng độ flavonoid 27 Hình 3.4.Biểu đồ khảo sát tốc độ nạp dịch 28 Hình 3.5.Đồ thị biểu thị nồng độ flavonoid toàn phần dịch chảy qua cột nhựa 29 Hình 3.6.Biểu đồ biểu diễn tỷ lệ giải hấp phụ theo nồng độ ethanol 30 Hình 3.7.Đồ thị biểu diễn mối tương quan thể tích dịch rửa tạp khối lượng cắn khơ 32 Hình 3.8.Đồ thị biểu diễn mối tương quan thể tích dịch rửa giải nồng độ flavonoid toàn phần dịch rửa giải 32 Hình 3.9.Cao núc nác khơ: (a) Trước làm giàu; (b) Sau làm giàu nhựa macroporous D101 35 Hình 3.10.Sơ đồ quy trình làm giàu flavonoid toàn phần từ dịch chiết vỏ thân núc nác 33 ĐẶT VẤN ĐỀ Núc nác có tên khoa học Oroxylum indicum (L.) Kurz, loài thực vật có hoa thuộc họ Núc nác hay cịn gọi họ Chùm ớt (Bignoniaceae) Núc nác tìm thấy nhiều nơi giới, đặc biệt Nam Á, Đông Nam Á Trung Quốc [6], [17] Theo y học cổ truyền Việt Nam, hạt vỏ thân núc nác hai phận thường sử dụng Vỏ thân núc nác gọi hoàng bá nam thường sử dụng điều trị viêm đường tiết niệu, tiểu tiện máu, ngoài, lỵ, dị ứng ngồi da [2] Các nghiên cứu trước thành phần hóa học vỏ thân núc nác có mặt thành phần chính: flavon (chrysin, oroxylin-A, baicalein, scutellarein, ) dạng glycosid chúng (baicalein-7-O-glucuronide, scutellarein-7-O-rutinoside, ) [16] Hiện nhiều nghiên cứu giới dịch chiết từ vỏ thân núc nác có tác dụng chống oxy hóa, chống dị ứng, chống viêm, kháng khuẩn, chống đái tháo đường typ flavonoid núc nác chất có vai trị quan trọng giảm nguy ung thư bệnh tim mạch [35], [41] Từ tiềm lớn flavonoid vỏ thân núc nác để phát triển sản phẩm chăm sóc sức khỏe việc nghiên cứu quy trình chiết xuất làm giàu flavonoid đơn giản hiệu vỏ thân núc nác cần thiết [52] Hiện nay, nhựa macroporous ứng dụng rộng rãi lĩnh vực phân lập tinh chế hợp chất có nguồn gốc từ thiên nhiên với nhiều ưu điểm trội: tính tiện lợi, chi phí thấp, dễ tái sử dụng, khả hấp phụ/phản hấp phụ chọn lọc nhiều nhóm phân tử mục tiêu, độ lặp lại tốt không cần sử dụng dung môi độc hại, hầu hết sử dụng dung môi nước ethanol Ở Việt Nam, chưa có nghiên cứu quy trình làm giàu flavonoid tổng từ vỏ thân núc nác Nhận thức ưu điểm hạt nhựa macroporous với mong muốn tạo cao núc nác có hàm lượng flavonoid lớn để đưa vào dạng bào chế tăng khả ứng dụng dược liệu công nghệ Dược phẩm, đề tài “Nghiên cứu quy trình làm giàu flavonoid từ dịch chiết vỏ núc nác’’ thực với mục tiêu: Lựa chọn khảo sát số yếu tố ảnh hưởng đến trình hấp phụ phản hấp phụ flavonoid nhựa macroporous Xây dựng quy trình làm giàu flavonoid từ dịch chiết vỏ núc nác sử dụng nhựa macroporous quy mơ phịng thí nghiệm CHƯƠNG TỔNG QUAN 1.1 Vài nét núc nác 1.1.1 Tên gọi phân bố  Tên khoa học: Oroxylum indicum L., thuộc chi Oroxylum, họ Chùm ớt (Bignoniaceae)  Tên thông thường: mộc hồ điệp, nam hoàng bá, hoàng bá nam, thiên tầng chi, bạch ngọc nhi, mạy ca (Tày), co ca liên (Thái), p’sờ lụng (K’ho), kờ lúc (K’dong), póc ta lốp (Ba Na)  Phân bố: Cây núc nác mọc hoang trồng nhiều nơi Việt Nam, Trung Quốc, Malaixia, Ấn Độ Campuchia [3] 1.1.2 Đặc điểm thực vật Cây nhỡ cao 7-10 m, thân nhẵn phân nhánh, thân có nhiều sẹo lá, vỏ màu xám, bẻ có màu vàng Lá to dài tới 1,5 m, kép lông chim lẻ 2-3 lần Hoa to màu nâu đỏ sẫm, mọc thành chùm đầu cành Quả nang to, dẹp, dài tới tới 80 cm, rộng 5-7 cm Hạt dẹt, có cánh mỏng màng, màu trắng ngà [2] Hình 1.1.Đặc điểm thực vật núc nác 1.1.3 Bộ phận dùng  Bộ phận dùng vỏ thân (Cortex Oroxyli) Vỏ sau bóc làm khơ Vỏ cuộn lại thành hình ống hay hình cung, dày 0,6 cm đến 1,3 cm, dài ngắn khơng định Mặt ngồi màu vàng nâu nhạt, nhăn nheo, có nhiều đường vân dọc, ngang 0.3 Nồng độ (mg/ml) 0.25 0.2 0.15 0.1 0.05 0 10 12 Thể tích dịch nạp (BV) Hình 3.5.Đồ thị biểu thị nồng độ flavonoid toàn phần dịch chảy qua cột nhựa Nhận xét: Trong trình hấp phụ hoạt chất lên hạt nhựa macroporous, việc lựa chọn điểm dừng hấp phụ quan trọng, ảnh hưởng tới tính kinh tế phương pháp Điểm dừng hấp phụ điểm gãy đường cong hấp phụ mà tốc độ hấp phụ hoạt chất bắt đầu giảm, đồng nghĩa với nồng độ hoạt chất dịch hứng tăng Nếu dừng trước điểm gãy: dung lượng hấp phụ thấp, dẫn đến tăng chi phí phải tăng khối lượng hạt nhựa mẻ dịch chiết Nếu dừng sau điểm gãy: dung lượng hấp phụ tăng không đáng kể sau điểm gãy, dẫn đến hiệu suất hấp phụ giảm, tốn thời gian Từ đường cong biểu diễn phụ thuộc nồng độ flavonoid theo thể tích dịch nạp, thấy tăng thể tích dịch nạp từ 1BV đến 8BV nồng độ flavonoid dịch hứng tăng dần từ 0,104 mg/mL đến 0,260 mg/mL Tuy nhiên, từ sau thời điểm BV thứ nồng độ flavonoid dịch hứng có xu hướng thay đổi khơng đáng kể, điều cho thấy tốc độ hấp phụ flavonoid hạt nhựa bắt đầu giảm nhanh hạt nhựa hấp phụ thêm flavonoid từ dịch chiết Vì thấy q trình hấp phụ flavonoid cột nhựa diễn từ từ đạt tới trạng thái bão hòa thời điểm nạp dịch BV thứ Do lựa chọn thể tích dịch nạp 8BV để đảm bảo hiệu suất quy trình, hạn chế tối đa lượng flavonoid khơng hấp phụ rút ngắn thời gian thực quy trình 3.3 Kết khảo sát trình giải hấp phụ nhựa macroporous 3.3.1 Khảo sát lựa chọn dung mơi giải hấp phụ Sau q trình hấp phụ kết thúc, tiến hành khảo sát trình giải hấp phụ với dung môi rửa giải nước cất dung dịch ethanol có nồng độ từ 10% đến 96% để lựa chọn dung môi rửa giải tối ưu Tiến hành theo mục 2.3.2.4, Kết thể hình 3.6 29 16 Tỷ lệ giải hấp phụ (%) 14 12 10 0 10 20 30 40 50 60 70 80 96 Nồng độ ethanol (%) Hình 3.6.Biểu đồ biểu diễn tỷ lệ giải hấp phụ theo nồng độ ethanol Nhận xét: Nguyên tắc phương pháp phương pháp rửa giải theo gradient nồng độ Theo đó, với tăng dần tỷ lệ hai thành phần EtOH:nước, chất hấp phụ hạt nhựa macroporous với độ phân cực khác tách khỏi cách theo dung môi phân đoạn khác Dựa vào lượng flavonoid dịch giải hấp phụ, thấy khả rửa giải tăng dần dung môi rửa giải sử dụng có nồng độ ethanol tăng dần từ 0% đến 96% (tỷ lệ giải hấp phụ tương ứng tăng từ 2,05% đến 14,62%) Ở nồng độ ethanol 0% đến 40%, tỷ lệ rửa giải hoạt chất thấp tăng khơng đáng kể, điều dung dịch ethanol nồng độ 0% đến 40% có độ phân cực lớn không phù hợp với độ phân cực flavonoid hấp phụ nhựa macroporous Từ dung dịch ethanol có nồng độ 50% đến 96%, tỷ lệ rửa giải flavonoid tăng mạnh, với ethanol 96% cho thấy khả giải hấp phụ flavonoid tốt ( tỷ lệ giải hấp phụ flavonoid 14,62%) Kết giải thích theo độ hịa tan flavonoid, flavonoid tan tốt cồn không tan nước nên tăng dần tỷ lệ ethanol:nước dung dịch rửa giải độ phân cực dung dịch rửa giải giảm dần gần với độ phân cực flavonoid núc nác Thêm vào ethanol cao độ hạn chế rửa giải tạp chất thân nước, giúp làm tăng nồng độ flavonoid dịch rửa giải so sánh với dung dịch ethanol thấp độ, mà ethanol 96% cho thấy khả rửa giải tốt Hơn nữa, ethanol 96% dung môi dễ thu hồi, lựa chọn làm dung mơi giải hấp phụ 30 3.3.2 Khảo sát lựa chọn dung môi rửa tạp Dược liệu chiết cồn 70%, chứa lượng lớn nước (30%) nên nhiều tạp chất có khả tan tốt nước có mặt dịch chiết (chất màu, polysaccharid) Vì vậy, cần sử dụng dung mơi rửa giải khác nhằm mục đích loại bỏ tối đa lượng tạp trước sử dụng ethanol 96% để rửa giải hỗn hợp flavonoid hấp phụ nhựa Kết khảo sát dung môi rửa giải cho thấy nước dung dịch ethanol có nồng độ 10%-30% có tỷ lệ giải hấp phụ flavonoid thấp Do tiến hành thí nghiệm theo mục 2.3.2.4 với dung môi rửa tạp nước, ethanol 10% - 30% để chọn dung môi rửa tạp chất phù hợp Kết thể bảng 3.6 Bảng 3.6.Kết khảo sát dung môi rửa tạp Nồng độ ethanol (%) Khối lượng cắn khô (mg) Tỷ lệ flavonoid cắn (%) 12,2 0,88 10 11,0 1,14 20 11,6 1,53 30 12,0 1,76 Nhận xét: Kết khảo sát cho thấy nước có khối lượng cắn khơ thu lớn (12,2 mg) tỷ lệ flavonoid cắn (0,88%) Các dung mơi có nồng độ ethanol từ 10% - 30% có khối lượng cắn khô không chênh lệch nhiều tỷ lệ flavonoid cắn lại cao nhiều so với nước cất Điều cho thấy nước cất có khả rửa giải nhiều tạp chất thân nước đồng thời rửa giải hoạt chất Các dung mơi có nồng độ ethanol từ 10% - 30% có khả rửa tạp so với nước lượng hoạt chất trình rửa tạp lớn Vì nước cất chọn làm dung mơi rửa tạp 3.3.3 Khảo sát thể tích dung môi giải hấp phụ dung môi rửa tạp  Tiến hành thí nghiệm theo mục 2.3.2.4, kết khảo sát thể tích dung mơi rửa tạp thể hình 3.7 31 Khối lượng cắn khơ (mg) 14 12 10 0 Thể tích nước cất (BV) Hình 3.7.Đồ thị biểu diễn mối tương quan thể tích dịch rửa tạp khối lượng cắn khô Nhận xét: Kết khảo sát cho thấy phân đoạn giải hấp phụ tạp, khối lượng cắn khô giảm dần theo thể tích nước cất rửa tạp Ở BV nước cất thứ nhất, thu 11,8 mg cắn khối lượng cắn thu giảm nhanh xuống 0,3 mg BV nước cất thứ Từ thấy phần lớn lượng tạp loại bỏ 3BV nước cất Lượng tạp lại phân đoạn sau cịn việc sử dụng nhiều 3BV nước cất để rửa tạp vừa tốn thời gian dung môi rửa tạp mà lượng tạp rửa thêm khơng đáng kể, 3BV nước cất lựa chọn để rửa tạp  Khảo sát thể tích dung mơi rửa giải Tiến hành thí nghiệm theo mục 2.3.2.4, kết thể hình Nồng độ (mg/ml) 0.25 0.2 0.15 0.1 0.05 0 Thể tích (BV) Hình 3.8.Đồ thị biểu diễn mối tương quan thể tích dịch rửa giải nồng độ flavonoid toàn phần dịch rửa giải 32 Nhận xét: Việc lựa chọn điểm dừng giải hấp phụ yếu tố quan trọng định tính kinh tế phương pháp Nếu dừng hấp phụ sớm, hoạt chất hấp phụ nhựa macroporous không rửa giải hồn tồn dẫn đến thất hoạt chất, giảm hiệu suất quy trình Ngược lại, thời gian rửa giải lâu, gây tốn dung môi rửa giải lượng hoạt chất rửa giải thêm không đáng kể, tốn thời gian tốn lượng cô thu hồi dung môi Từ đường cong giải hấp phụ trên, thấy nồng độ flavonoid rửa giải phân đoạn giảm dần theo thời gian Nồng độ flavonoid dịch rửa giải giảm dần từ BV dịch rửa giải thứ (0,200 mg/mL) tới BV dịch rửa giải thứ (0,150 mg/mL), BV thứ nồng độ flavonoid dịch rửa giải giảm mạnh (0,076 mg/mL) Có thể thấy phần lớn lượng flavonoid rửa giải gần hoàn tồn sau 5BV thể tích dung dịch ethanol 96% Việc sử dụng nhiều 5BV ethanol để giải hấp phụ vừa tốn thêm dung môi mà lượng hoạt chất thu thêm khơng đáng kể Do 5BV ethanol 96% lựa chọn để giải hấp phụ 3.4 Xây dựng quy trình làm giàu flavonoid tồn phần từ dịch chiết vỏ núc nác sử dụng nhựa macroporous D101 Từ kết khảo sát trên, quy trình làm giàu flavonoid toàn phần từ dịch chiết vỏ núc nác có hàm lượng flavonoid tồn phần 1,7% (tính theo khối lượng dược liệu thô) sử dụng nhựa macroporous D101 đưa sau: Bước 1: Chuẩn bị cột dung dịch hấp phụ - Dịch chiết vỏ núc nác pha loãng nước cất đến nồng độ flavonoid toàn phần dung dịch khoảng 0,320 mg/mL - Chuẩn bị cột: g nhựa D101 xử lý cách ngâm với NaOH 4%, HCl 4%, ethanol 96% rửa nước cất đến pH trung tính, sau nhồi lên cột hấp phụ đường kính cm, chiều cao 25 cm, 1BV khoảng 10 mL Bước 2: Quá trình hấp phụ - Cho 8BV dịch chiết chảy từ từ qua cột nạp g nhựa D101 với tốc độ 4BV/h Bước 3: Quá trình giải hấp phụ - Cột nhựa sau hấp phụ rửa 3BV nước cất với tốc độ 4BV/h, sau cho 5BV dung dịch ethanol 96% chảy từ từ qua cột với tốc độ 4BV/h Thu lấy dịch giải hấp phụ Bước 4: Cô đặc sấy khô - Dịch giải hấp phụ cô thu hồi dung môi áp suất giảm (500 mbar, 50°C) đến cắn chuyển qua giấy nến sấy khô tủ sấy tĩnh chân không nhiệt độ 60°C 33 Sơ đồ quy trình: Nước cất Dich chiết Pha lỗng tới nồng độ flavonoid tồn phần khoảng 0,320 mg/mL Dịch hấp phụ Cho 8BV dịch hấp phụ chảy qua cột nhựa D101 Tốc độ dòng 4BV/h Nước cất ( Flavonoid + tạp)/cột Cho 3BV nước cất chảy qua cột nhựa D101 vừa hấp phụ Tốc độ dòng 4BV/h Ethanol 96% Flavonoid/cột Giải hấp phụ 5BV ethanol 96% Tốc độ dịng 4BV/h Dịch giải hấp phụ Cơ áp suất giảm (500 mbar, 50°C) Cắn Sấy tủ sấy chân khơng T°: 60°C Cao khơ giàu flavonoid Hình 3.10.Sơ đồ quy trình làm giàu flavonoid tồn phần từ dịch chiết vỏ thân núc nác 34 Đánh giá độ ổn định quy trình Thực quy trình lần với mẫu cao dược liệu thơ có hàm lượng flavonoid 3,65 (mg QE/g) Kết thể bảng 3.7 Bảng 7.Kết đánh giá độ ổn định quy trình làm giàu flavonoid tồn phần Mẻ Khối lượng cao (g) Trung bình 0,2063 0,2072 0,2029 0,2055 RSD Hàm lượng flavonoid tồn phần tính theo quercetin (mg QE/g) 43,45 42,95 42,60 43,00 0,81% Hiệu suất thu hồi (%) 22,10 20,86 21,77 21,58 2,43% Nhận xét: Kết cho thấy thông số khối lượng cao khơ hàm lượng flavonoid tồn phần cao khơng có khác biệt đáng kể mẻ Ở quy mơ phịng thí nghiệm quy trình tương đối ổn định (RSD : 2,43%), với 0,6 g cao dược liệu thô thu khối lượng cao tinh chế trung bình 0,2055 g hàm lượng flavonoid cao tính theo quercetin trung bình 43,00 (mg QE/g), hiệu suất thu hồi 21,58% Hình 3.9.Cao núc nác khơ: (a) Trước làm giàu; (b) Sau làm giàu nhựa macroporous D101 35 BÀN LUẬN Phương pháp làm giàu flavonoid nhựa macroporous Tinh chế làm giàu sản phẩm tự nhiên từ thực vật nhận quan tâm ngày lớn năm gần nhu cầu ngày tăng sản phẩm chăm sóc sức khỏe Sắc kí cột Silica gel phương pháp hay sử dụng để tách aglycon flavon, nhiên phương pháp tốn thời gian cơng sức đồng thời có nhược điểm hấp phụ đảo ngược chất hấp phụ Gần đây, sắc ký ngược dòng tốc độ cao coi giải pháp thay để tách aglycon flavon từ thực vật, nhiên, ứng dụng phân tách quy mơ lớn bị hạn chế chi phí cao sản lượng thấp đòi hỏi thiết bị chuyên dụng Nhựa macroporous xem phương pháp tiềm với nhiều ưu điểm như: tiện lợi, thực đơn giản, chi phí vận hành thấp, nhựa tái sử dụng nhiều lần, tiêu thụ dung mơi hạn chế sử dụng dung môi độc hại Nhiều nghiên cứu Việt Nam vài năm gần ứng dụng rộng rãi nhựa macroporous làm giàu hợp chất có nguồn gốc dược liệu, kể đến vài nghiên cứu như: ứng dụng nhựa macroporous D101 làm giàu bacosid từ rau đắng biển với hàm lượng bacosid đạt 47,41% hiệu suất trình đạt 73,85% [4] Nghiên cứu ứng dụng nhựa D101 giúp phân lập naringin từ cùi bưởi đạt hàm lượng 92,4% với hiệu suất 72,53% [7] Isoflavonoid phân lập thành công từ sắn dây với độ tinh khiết 84,53% sau lần tinh chế nhựa macroporous [9]… Phương pháp tinh chế làm giàu nhựa macroporous coi phương pháp sắc ký hấp phụ, với pha tĩnh sử dụng nhựa macroporous pha động nước ethanol Nguyên lý trình phân tách dựa lực khác hợp phần dịch chiết pha tĩnh (nhựa macroporous) pha động (dung dịch giải hấp phụ) để tách phân đoạn nhóm chất mục tiêu Trong nghiên cứu sử dụng cột nhựa tự nhồi để phù hợp với điều kiện sở cách đưa pha động di chuyển qua pha tĩnh nhờ trọng lực, tốc độ chảy pha động điều chỉnh tay Do yếu tố nên khơng thể tránh khỏi có sai số cách làm hiệu lực tách cột chưa lý tưởng Để cải thiện hiệu phân lập flavonoid sử dụng cột chuyên dụng, hạt nhựa macroporous nhồi áp suất cao, kiểm soát tốc độ chảy pha động bơm Quá trình tinh chế gồm giai đoạn giai đoạn hấp phụ giai đoạn giải hấp phụ  Giai đoạn hấp phụ Trong trình hấp phụ hoạt chất lên hạt nhựa macroporous, lựa chọn điềm dừng hấp phụ quan trọng để đảm bảo tính kinh tế phương pháp Chúng lựa chọn điểm dừng hấp phụ điểm gãy đường cong hấp phụ, trình hấp phụ đạt trạng thái cân nồng độ flavonoid toàn phần dịch sau hấp phụ tăng 36 - Nếu dừng trước điểm gãy: dung lượng hấp phụ thấp, cần phải tăng lượng hạt sử dụng mẻ dịch chiết định dẫn đến tăng chi phí cho việc sử dụng tái sử dụng hạt - Nếu dừng sau điểm gãy: lượng flavonoid hấp phụ không đáng kể, hiệu suất hấp phụ giảm, tốn thời gian Trong khn khổ khóa luận nghiên cứu ảnh hưởng yếu tố đến q trình hấp phụ nồng độ, thể tích dịch nạp cột tốc độ nạp cột Ngồi ra, cịn nhiều yếu tố khác ảnh hưởng đến q trình hấp phụ như: nhiệt độ, pH dịch nạp cột, kích thước cột,… Theo nghiên cứu Ji-Guang Chen cộng sự, tỷ lệ chiều cao/đường kính cột lớn quãng đường di chuyển chất tan dài, tăng thời gian tiếp xúc chất tan nhựa macroporous, tăng dung lượng hấp phụ nhựa Chiều cao cột gấp 2-3 lần chiều dài vùng chuyển khối cho kết hấp phụ tốt Tốc độ nạp dịch nhỏ thời gian tiếp xúc chất tan nhựa tăng lên làm tăng hiệu hấp phụ, nhiên có nhược điểm kéo dài thời gian trình, ảnh hưởng đến hiệu kinh tế, nên lựa chọn tốc độ nạp dịch 4BV/h để rút ngắn thời gian cần thiết cho trình hấp phụ  Giai đoạn giải hấp phụ Chúng sử dụng dung môi giải hấp phụ nước ethanol với nồng độ khác Trong đó, nước dùng để loại số tạp chất thân nước như: số muối vô muối acid hữu cơ, carbohydrat,… Sử dụng nước để rửa tạp chất trước giải hấp phụ giúp sản phẩm sau trình giải hấp phụ ethanol có hàm lượng cao Có lượng flavonoid nhỏ bị thất phần bị giải hấp phụ nên cần cân đối hiệu suất hiệu trình rửa tạp Theo khảo sát chúng tơi lựa chọn 3BV nước cất cho trình rửa tạp để đạt hiệu cao hiệu suất thời gian Tất nồng độ ethanol khảo sát có khả giải hấp phụ flavonoid, khả giải hấp phụ flavonoid nghiên cứu chưa thực hiệu Khi tăng dần nồng độ ethanol từ 10% đến 96% tỷ lệ giải hấp phụ tăng, ethanol 96% cho thấy khả giải hấp phụ hiệu với tỷ lệ giải hấp phụ tĩnh đạt 14,26% Nguyên nhân tượng flavonoid tan ethanol khơng tan nước, tăng nồng độ ethanol làm tăng độ tan flavonoid, dẫn đến làm tăng trình chuyển dịch cân nồng độ flavonoid hấp phụ hạt nhựa bên ngồi dung mơi Hiệu suất giải hấp phụ cịn thấp ethanol có khả rửa giải tính chọn lọc với flavonoid thấp, cần nghiên cứu thay đổi sử dụng loại dung môi giải hấp phụ khác phù hợp Từ đường cong giải hấp phụ (hình 3.8) thấy sau 5BV dịch rửa giải, lượng flavonoid giải hấp phụ khơng đáng kể so với trước nên 5BV ethanol 96% lựa chọn để giải hấp phụ 37 Phương pháp tinh chế làm giàu flavonoid toàn phần từ dịch chiết vỏ thân núc nác sử dụng nhựa hấp phụ macroporous D101 dung môi giải hấp phụ ethanol 96% để thu cao giàu flavonoid không sử dụng dung môi hữu độc hại, dung môi dễ thu hồi, dễ ứng dụng quy mô lớn, hạn chế ảnh hưởng đến sức khỏe người ô nhiễm môi trường tiến hành quy mô lớn Về quy trình điều chế cao giàu flavonoid từ vỏ thân núc nác quy mơ phịng thí nghiệm Các flavonoid vỏ thân núc nác chứa nhóm phenyl khơng phân cực nhóm hydroxyl phân cực gốc glucuronyl nên nhựa macroporous có chất khơng phân cực phân cực áp dụng để hấp phụ flavonoid Tuy nhiên loại nhựa phân cực yếu không phân cực thể khả hấp phụ tốt nhựa phân cực có diện tích bề mặt phù hợp với kích thước phân tử flavonoid Trong nghiên cứu tinh chế baicalin (một flavon có vỏ thân núc nác) từ dịch chiết Scutellaria baicalensis nhựa macroporous, Yuan tao cộng nghiên cứu 10 loại nhựa macroporous khác nhau, nhựa khơng phân cực HPD-100 cho thấy khả hấp phụ giải hấp phụ tốt [50] Theo kết chúng tơi sử dụng nhựa D101 có tính chất khơng phân cực diện tích bề mặt tương tự với HPD-100 phù hợp để làm giàu flavonoid vỏ thân núc nác Sau trình tinh chế, hàm lượng flavonoid tồn phần tính theo quercetin cao tinh chế thu 43 (mg QE/g), tăng gần 12 lần so với hàm lượng flavonoid cao thô ban đầu (3,65 mg QE/g).Tuy nhiên hiệu suất thu hồi thấp: 21,58% Có thể thấy hiệu suất thu hồi flavonoid vỏ thân núc nác cịn thấp q trình hấp phụ giải hấp phụ chưa đạt hiệu cao, nhiên kết nghiên cứu cho thấy hàm lượng flavonoid toàn phần sản phẩm sau làm giàu tăng gần 12 lần, không so với nhiều nghiên cứu khác tinh chế làm giàu flavonoid toàn phần Phương pháp sử dụng dung môi xanh nước ethanol, không sử dụng dung môi hữu độc hại với sức khỏe gây ô nhiễm môi trường Xét khía cạnh kinh tế tính thực tiễn, phương pháp sử dụng dung môi rẻ tiền, dễ kiếm, dễ áp dụng quy mô lớn đặc biệt nhựa macroporous tái sử dụng, thiết bị đơn giản so sánh với phương pháp khác cần địi hỏi dung mơi đắt tiền, ngun liệu đắt tiền thiết bị chuyên dụng 38 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT KẾT LUẬN Sau thời gian thực đề tài “ Nghiên cứu quy trình làm giàu flavonoid từ dịch chiết vỏ núc nác”, rút kết luận sau: Loại nhựa thích hợp lựa chọn để làm giàu flavonoid vỏ thân núc nác nhựa macroporous D101 Khảo sát điều kiện hấp phụ, phản hấp phụ flavonoid từ dịch chiết vỏ thân núc nác nhựa đưa thơng số thích hợp là:  Nồng độ flavonoid toàn phần dịch chiết: 0,320 mg/mL  Tốc độ nạp dịch: 4BV/h  Thể tích nạp dịch chiết: 8BV  Dung môi rửa tạp: 3BV nước cất  Dung mơi rửa giải: ethanol 96%  Thể tích dung môi rửa giải: 5BV Xây dựng triển khai quy trình làm giàu flavonoid tồn phần vỏ thân núc nác quy mơ phịng thí nghiệm thu cao khơ có hàm lượng flavonoid tồn phần 43,00 mg QE/g hiệu suất q trình làm giàu tính theo khối lượng flavonoid toàn phần 21,58% ĐỀ XUẤT Do hạn chế thời gian thiết bị nên kết nghiên cứu bước đầu, làm sở cho nghiên cứu sau điều chế cao chiết giàu flavonoid từ vỏ thân núc nác Để hồn thiện thêm đề tài, chúng tơi xin đề xuất: Tiếp tục nghiên cứu, điều chỉnh dung môi giải hấp phụ thơng số quy trình làm giàu flavonoid để đạt hiệu suất cao quy mô lớn Đánh giá khả tái sử dụng nhựa macroporous Thử hoạt tính sinh học cao giàu flavonoid sau xử lý với nhựa macroporous D101 39 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt Bộ Y Tế (2017), Dược liệu học, NXB Y học, tr 389 Đỗ Tất Lợi (1995), Những thuốc vị thuốc Việt Nam, tr 726-728 Lê Thị Anh Đào, Lê Thị Thu Hương, et al (2007), "Nghiên cứu số thành phần hóa học Núc nác Yên Sơn - Tuyên Quang", Hội nghị Khoa học Cơng nghệ hóa học hữu tồn quốc lần thứ IV, tr 293-297 Lương Thùy Nhung (2018), Ứng dụng nhựa macroporous D101 làm giàu bacosid từ rau đắng biển Bacopa monnieri L., khóa luận tơt nghiệp Dược sĩ, Đại học Dược Hà Nội, tr 31-32 Lê Thị Ngọc Bảo (2021), Nghiên cứu quy trình điều chế cao chiết giàu baicalin từ vỏ thân Núc nác quy mơ phịng thí nghiệm, luận văn thạc sĩ, Đại học Dược Hà Nội, tr 45-50 Nguyễn Thị Duyên, Trần Thị Tuyết Phạm Thị Ngọc, Nguyễn Minh Khởi (2021), "Baicalin methyl ester flavon khác từ vỏ Núc nác", Tạp chí Dược liệu, 26, tr 225-229 Nguyễn Thị Thanh Tâm (2018), Ứng dụng nhựa macroporous tinh chế naringin từ cùi bưởi, khóa luận tốt nghiệp Dược sĩ, Đại học Dược Hà Nội, tr 3334 Phương Thiện Thương, Lê Xuân Thủy Nguyễn Minh Khởi (2013), "Thành phần hóa học Núc nác", Tạp chí Dược liệu, 4(18), tr 213-219 Vũ Văn Tuấn (2017), Ứng dụng nhựa macroporous phân lập isoflavonoid từ sắn dây, luận văn thạc sĩ Dược học, Đại học Dược Hà Nội, tr 53-54 Tiếng Anh 10 Ae-Yeon Lee, Saeromi Kang Soo-Jin Park, Jin Huang, and Dong-Soon Im (2016), "Anti-Allergic Effect of Oroxylin A from Oroxylum indicum Using in vivo and in vitro Experiments", Biomocules and therapeutics, 24(3), pp 289-290 11 Amjad M, Shraim Talaat A, Ahmed, Md Mizanur Rahman,Yousef M,Hijji (2021), "Determination of total flavonoid content by aluminum chloride assay: A critical evaluation", Food Science and Technology, 150, pp 11-19 12 Analysis AOAC Official Methods Of, AOAC Official Methods of Analysis (2016) Appendix F: Guidelines for standard method performance requirements 2019 p 6-9 13 Bao Qun Li, Tao Fu Wang-Hua Gong, Nancy Dunlop, Hsiang-fu Kung, Yaodong Yan, Jian Kang, Ji Ming Wang (2000), "The flavonoid baicalin exhibits antiinflammatory activity by binding to chemokines", Immunopharmacology, 49(3), pp 295-306 14 Bin Zhang, Ruiyuan Yang Yan Zhao, Chun-Zhao Liu (2008), "Separation of chlorogenic acid from honeysuckle crude extracts by macroporous resins", Journal of Chromatography B, 867(2), pp 253-258 15 Bing-Lan Wu, Zhou-Wei Wu, Phạm Dương,Xiao-Fei Shen,Luân Vương,Bình Trần,phù li,Ming-Kui Wang (2019), "Flavonoids from the seeds of Oroxylum indicum and their anti-inflammatory and cytotoxic activities", Phytochemistry Letters, 32, pp 66-69 16 Biswanath Dinda, Bikas Chandra Mohanta, et al (2007), "Flavonoids from the Stem-bark of Oroxylum indicum", Natural Product Sciences, 13(3), pp 190-194 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 Bizal Rai Sonam Bhutia, Prosanta Pal, Bibuti Bhusan Kakoti (2020), "Phytochemical analysis and antibacterial evaluation against selected gram strains by Oroxylum indicum (L.) Kurz stem bark extract, a folklore medicine of Sikkim Himalaya", Journal of Pharmacognosy and Phytochemistry 9(1), pp 11-16 Boqiang Fu, Jie Liu Huan Li, Lei Li, Frank S C Lee, Xiaoru Wang (2005), "The application of macroporous resins in the separation of licorice flavonoids and glycyrrhizic acid", Journal of Chromatography A, 1089(1-2), pp 18-24 Dandan Wang, Xinxin Luo Yike Huang, Min Wang, Zhining Xia (2020), "Combined magnetic molecularly imprinted polymers with a ternary deep eutectic solvent to purify baicalein from the Scutellaria baicalensis Georgi by magnetic separation", Microchemical Journal, 157, pp 105-109 Ehsan Moghaddam, Boon-Teong Teoh Sing-Sin Sam, Rafidah Lani, Pouya Hassandarvish,Zamri Chik, Andrew Yueh,Sazaly, Abubakar, Keivan Zandi (2014), "Baicalin, a metabolite of baicalein with antiviral activity against dengue virus", Scientific reports, 4, pp 5452 Faculty of Medicine Mahasarakham University Maha Sarakham, University Faculty of Medicine Chulalongkorn, et al (2022), "Antioxidant and antiinflammatory activities of Oroxylum indicum Kurz (L.) extract in lipopolysaccharide-stimulated BV2 microglial cells", Tropical Journal of Pharmaceutical Research, 20(4), pp 833-838 Fu Y, Zu Y Liu W, Hou C, Chen L, Li S, Shi X, Tong M (2006), "Preparative separation of vitexin and isovitexin from pigeonpea extracts with macroporous resins.", Journal of chromatography A, 1139(2), pp 206-213 Gong S-Z, Jie Y-K Yuan S-M (2003), "Study of the application of baicalin in functional cosmetics ", China surfactant detergent and cosmetics, 33(3), pp 200203 Haijun Chen, Yu Gao, Jianlei Wu, Yingyu Chen, Buyuan Chen, Jianda Hu, Jia Zhou (2014), "Exploring therapeutic potentials of baicalin and its aglycone baicalein for hematological malignancies", Cancer Letters, 354(1), pp 5-11 Haixia Su, Sheng Yao Wenfeng Zhao, Minjun Li, Jia Liu, WeiJuan Shang, Hang Xie, Changqiang Ke, Meina Gao, Kunqian Yu, Hong Liu, Jingshan Shen, Wei Tang, Leike Zhang, Jianping Zuo, Hualiang Jiang, Fang Bai, Yan Wu, Yang Ye, Yechun Xu (2020), "Discovery of baicalin and baicalein as novel, natural product inhibitors of SARS-CoV-2 3CL protease in vitro", Molecule Biology, pp 10-20 Heesung Chung, Hack Sun Choi Eun-Kyoung Seo, Duk-Hee Kang, Eok-Soo Oh (2015), "Baicalin and baicalein inhibit transforming growth factor-β1-mediated epithelial-mesenchymal transition in human breast epithelial cells", Biochemical and Biophysical Research Communications, 458(3), pp 707-713 Hua-Bin Li, Chen Feng (2005), "Isolation and purification of baicalein, wogonin and oroxylin A from the medicinal plant Scutellaria baicalensis by high-speed counter-current chromatography", Journal of Chromatography A, 1074(1-2), pp 107-110 Hui Ding Zhou (2000), Macroporous resin in the application of traditional chinese medicines in the research, pp 730 Jean Paul Dzoyem, Hiroshi Hamamoto Barthelemy Ngameni, Bonaventure Tchaleu Ngadjui, Kazuhisa Sekimizu (2013), "Antimicrobial action mechanism of flavonoids from Dorstenia species", Drug Discoveries and Therapeutics, pp 6672 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 Jianchu Chen, Zhaoliang Li Allen Y, Chen,Xingqian Ye,Haitao Luo,Gary O, Rankin, and Yi Charlie Chen (2013), "Inhibitory Effect of Baicalin and Baicalein on Ovarian Cancer Cells", International Journal of Molecular Science, 14(3), pp 6012-6025 Jie Dou, Zhou Wang Leon Ma, Bo Peng,Ke Mao, ChengqinLi,Mengqi Su,Changlin Zhou,Guangyong Peng (2018), "Baicalein and baicalin inhibit colon cancer using two distinct fashions of apoptosis and senescence", Open Access Impact Journal, 9(28), pp 20089–20102 Keivan Zandi, Katie Musall Adrian Co, Dongdong Cao,Pouya Hassan Darvish,Thủy Vân Lan,Ryan L Slack,,Karen A Kirby,Leda Bassiss,Frank Amblard,Baek Kim,Sazaly AbuBakar,Stefan Sarafianos,Raymond F Schinazi (2021), "Baicalein and Baicalin Inhibit SARS-CoV-2 RNA-Dependent-RNA Polymerase", Microorganisms, 9(5), pp 893 L J Chen, H Song Q Z Du, Jianrong Li,Dr Y Ito (2005), "Original Articles Analysis of Flavonoids in the Extracts from the Seeds of Oroxylum indicum Using High Speed Countercurrent Chromatography/Mass Spectrometry", Journal of Liquid Chromatography & Related Technologies, 27(10), pp 1549-1555 Li Jing, A.Chase Howard (2010), "Development of adsorptive (non-ionic) macroporous resins and their uses in the purification of pharmacological-active natural products from plant sources", Natural Product Reports, 27(10), pp 14931510 Li Nan-nan, Meng Xian-sheng, et al (2018), "Total Flavonoids from Oroxylum indicum Induce Apoptosis via PI3K/Akt/PTEN Signaling Pathway in Liver Cancer", Evidence-Based Complementary and Alternative Medicine, 2018, pp 293-297 Liu Peng-fei, Han Fu-gen Duan Bin-bin, Deng Tian-sheng, Hou Xiang-lin & Zhao Ming-qin (2012), "Purification and antioxidant activities of baicalin isolated from the root of huangqin (Scutellaria baicalensis gcorsi)", Journal of Food Science and Technology 50, pp 615-619 Mattiasson Bo et al (2010), Macroporous polymes: production, properties and biotechnological biomedical application, CRC Press Mir-Palomo, Silvia Nacher, Amparo, D´ıez-Sales,, et al (2016), "Inhibition of skin inflammation by baicalin ultradeformable vesicles", International Journal of Pharmaceutics, 511(1), pp 23-29 Mukti Kant Nayak, Anurodh S Agrawal Sudeshna Bose , Shawn Narcar , Rahul Bhowmick , Saikat Chakrabarti , Sagartirtha Sarkar , Mamta Chawla-Sarkar (2014), "The antiviral activity of baicalin against H1N1-pdm09 influenza virus is due to the regulation of NS1-mediated cellular innate immune responses.", Journal of Antimicrobial Chemotherapy, 69(5), pp 1298-1310 O Okay (2000), "Macroporous copolymer networks", Progress in polymer science, 25(6), pp 711-779 Patchima Sithisarn, Piyanuch Rojsanga, et al (2021), "Flavone-Rich Fractions and Extracts from Oroxylum indicum and Their Antibacterial Activities against Clinically Isolated Zoonotic Bacteria and Free Radical Scavenging Effects", Molecules, 26(6), pp 1773 Petra Matic, Marija Sabljic Lidija Jakobek (2017), "Validation of Spectrophotometric Methods for the Determination of Total Polyphenol and Total Flavonoid Content", Journal of AOAC International, 100(6), pp 1795-1803 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 Rostagno Mauricio A, M.Prado Juliana (2013), "Natural product extraction: principals and applications", Royal Society of Chemistry, pp Teng Chen et al (2015), "Optimization of a chromatographic process for the purication of saponins in Panax notoginseng extract using a design space approach", Separation and Purification Technology, 154(5), pp 309-319 Xiuqiong He, Lixia Pei Henry H Y Tong & Ying Zheng (2010), "Comparison of Spray Freeze Drying and the Solvent Evaporation Method for Preparing Solid Dispersions of Baicalein with Pluronic F68 to Improve Dissolution and Oral Bioavailability", AAPS PharmSciTech volume, 12(1), pp 104-113 Yang Yu, Mingyan Pei Ling Li (2015), "Baicalin induces apoptosis in hepatic cancer cells in vitro and suppresses tumor growth in vivo", International Journal of Clinical and Experimental Medicine, 8(6), pp 8958–8967 Yuan Yuan, Wenli Hou Minhai Tang, Houding Luo, Li-Juan Chen, Y Hugh Guan, Ian A Sutherland (2008), "Separation of Flavonoids from the Leaves of Oroxylum indicum by HSCCC", Chromatographia, 68, pp 885-892 Yujie Fu, Yuangang Zu Wei Liu, Thomas Efferth, Naijing Zhang, Xiaona Liu, Yu Kong (2006), "Optimization of luteolin separation from pigeonpea [Cajanus cajan (L.) Millsp.] leaves by macroporous resins", Journal of Chromatography A, 145, pp 1137 Zhang HB, Lu P Guo QY, Zhang ZH, Meng XY (2013), "Baicalein induces apoptosis in esophageal squamous cell carcinoma cells through modulation of the PI3K/Akt pathway.", Oncol Lett, pp 1792-1082 Zhanquan Du, Kun Wang Yuan Tao, Lixia Chen, Feng Qiu (2012), "Purification of baicalin and wogonoside from Scutellaria baicalensis extracts by macroporous resin adsorption chromatography", Journal of Chromatography B, 908(1), pp 143-149 Zuo-Fu Wei, Xi-Qing Wang Xiao Peng, Wei Wang, Chun-Jian Zhao, Yuan-Gang Zu, Yu-Jie Fu (2015), "Fast and green extraction and separation of main bioactive flavonoids from Radix Scutellariae", Industrial Crops and Products, 63, pp 175181 Zuofu Wei, Meng Luo Chunjian Zhao, Wei Wang, Lin Zhang, Yuangang Zu, Chunying Li, Tingting Li, Yujie Fu (2013), "An efficient preparative procedure for main flavone aglycones from Equisetum palustre L using macroporous resin followed by gel resin flash chromatography", Separation and Purification Technology, 118, pp 680-689