Thông tin tài liệu
Lời cảm ơn Li khoá luận xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới thầy cô khoa Công nghệ Sinh học Viện Đại học Mở Viện Đại học Mở Hà Nội đà tận tình dạy dỗ, bảo suốt thời gian học tập trờng đà xếp chu đáo nơi thực tập tốt nghiệp để hoàn thành luận văn cách tốt Tôi xin chân thành cảm ơn PGS.TS Lê Huy Hàm Viện Đại học Mở Viện tr ởng Viện Di truyền Nông nghiệp đà tận tình hớng dẫn dìu dắt suốt trình nghiên cứu hoàn thành đề tài luận văn Cảm ơn tập thể cán phòng thí nghiệm trọng điểm Công nghệ tế bào thực vật Viện Đại học Mở Viện Di truyền Nông nghiệp đặc biệt TS Phạm Thị Lý Thu, TS Nguyễn Thị Khánh Vân, Ths Vũ Văn Tiến CN Phạm Thị Hơng đà đóng góp nhiều ý kiến quý báu, tạo điều kiện nhiệt tình giúp đỡ thời gian thực đề tài Cuối xin gửi lời cảm ơn đến gia đình, bạn bè ngời thân đà động viên, sát cánh bên tôi, giúp đỡ gặp khó khăn Hà Nội, ngy 19 tháng năm 2009y 19 tháng năm 2009 Sinh viên MC LC TRANG PHN I MỞ ĐẦU .1 1.1 Đặt vấn đề 1.2 Mục ®Ých cđa t i .2 Page of 50 đề 1.3 ý nghÜa khoa häc vµ ý nghĩa thực tiễn đề tài PHẦN II TỔNG QUAN TÀI LIỆU .4 2.1 Một số đặc điểm sinh học bÌo tÊm Spirodela polyrrhiza 2.1.1 2.1.2 2.1.3 2.1.4 HƯ thèng ph©n lo¹i Đặc điểm hình thái bèo Ph¬ng thøc sinh s¶n Ph©n bè cđa bÌo tÊm 2.2 Các yếu tố môi trờng nuôi cấy ảnh hởng tới ®êi sống bÌo tÊm… 2.3 C¸c phơng pháp chuyển gen vào thực vật .9 2.3.1 Phơng pháp chuyển gen trực tiếp 10 2.3.2 ph¬ng ph¸p chun gen gi¸n tiÕp 12 2.4 Chun gen gi¸n tiÕp nhê vi khn Agrobacterium tumefaciens .12 2.4.1 CÊu tróc vµ chøc Ti-plasmid 13 2.4.2 Cu truc chức đạn T-DNA 14 2.4.3 Cơ chế ph©n tư cđa chun gen th«ng qua A.tumefaciens 15 2.4.4 Hệ thống vectơ chuyển gen 16 2.5 Tình hình nghiên cứu xây dung hệ thèng chun gen vµo bÌo tÊm 18 2.5.1 Tình hình nghiên cứu giới 18 2.5.2 Tình hình nghiên cøu níc 20 PHẦN III : VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHI£N CỨU 22 3.1 VËt liƯu nghiªn cøu 22 3.1.1 Vật liệu thực vật .22 3.1.2.Vật liệu vi khun vy 19 tháng năm 2009 plasmid 22 3.1.3 Ho¸ chÊt máy móc thiết bị phục vụ cho nghiên cứu 23 3.2 Phơng pháp nghiên cứu 24 3.2.1 Xây dng h thng chuyn gen vy 19 tháng năm 2009o bốo tm S polyrrhiza 24 3.2.2 Quan sát xác định tỷ lệ biểu tạm thời gen gus…………… … 27 Page of 50 3.2.3 Phương pháp tách chiết DNA bèo tấm……………………………….…27 3.2.4 Phương pháp phân tích PCR…………………………………………….28 3.3 Néi dung nghiªn cøu 29 3.4 Các tiêu đánh giá 31 PHẦN IV : KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 32 4.1 Xây dng quy trình polyrrhiza 32 chuyển gen v o bÌo S 4.1.1 Chn lc chng vi khuẩn thích hợp cho thí nghiệm chuyn gen bèo tm SP nguyên vy 19 tháng năm 2009 callus .32 4.1.2 Ảnh hưởng mật độ vi khuẩn tới tỷ lệ biểu tạm thời gen gus SP nguyên vy 19 tháng năm 2009 callus 34 4.1.3.Ảnh hưởng thời gian ly t©m ch©n kh«ng tới tỷ lệ biểu tạm thời gen gus callus .35 SP nguyên vy 19 tháng năm 2009 4.1.4 nh hng ca hy 19 tháng năm 2009m lng AS tới tỷ lệ biểu tạm thời gen gus bÌo tÊm SP callus .36 nguyên vy 19 tháng năm 2009 4.2 Chuyn gen bn vng vo callus bốo Spirodela polyrrhiza thông qua vi khuẩn Agrobacterium .39 4.2.1 KÕt qu¶ nu«i cấy phục hồi sau đồng nu«i cấy 39 4.2.2 KÕt qu¶ chọn lọc sau diệt khuẩn .39 4.2.3 Kt qu tách chiết DNA phân tích PCR dòng bèo chuyn gen 42 PHẦN V : KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ .44 5.1 Kết luận 44 Page of 50 5.2 Đề nghị 45 TÀI LIỆU THAM KHẢO .46 BẢNG KÍ HIỆU CÁC CHỮ VIẾT TẮT ADN AS Deoxyribo Nucleic Acid Bp base pair CH Casein hydrolysate Cs cộng EDTA Ethylene Diamine Tetraacetace Acid Acetosyringone Page of 50 Et-Br gus MCS NOS NOS-p NptII OD600 PCR SP T-DNA Ethidium Bromide β-glucuronidase gene= gen m· ho¸ ββ- glucuronidase Multi-Cloning Site Nopaline Sythetase Nopaline Sythetase promotor Neomycin phosphotransferase gene Mật độ vi khuẩn đo bước sãng 600nm quang phæ kế DUR 800 Spectrophotometer h·ng Beckman Coulter Polymerase Chain Reaction Spirodela polyrrhiza Transferred – DNA = DNA chuyển Ti- Tumor inducing plasmid = plasmid gây khối u thực vật plasmid X-gluc 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β -D-glucuronic acid PHẦN I MỞ ĐẦU 1.1.Đặt vấn đề ThËp niên cuối kỷ 20 đầu kỷ 21 chứng kiến thành tựu vợt bậc lĩnh vực công nghệ sinh hc thực vật Một thành tựu tạo giống trồng chuyển gen có đặc tính mi nh chống chịu sâu, bệnh, kháng thuốc diệt cỏ 7Đến cuối năm 2008 diện tích chuyển gen toàn cầu đà đạt 125 triệu Một loạt giống trồng với đặc tính hoàn toàn nh: chịu hạn, chu mặn, tăng cờng khả hấp thụ nitơ, chịu úng, tăng cờng sinh trởng, tăng cờng chất lợng dinh dỡng, chất lợng chế biến, tăng cờng hoạt chất sinh học 7đà đợc nghiên cứu chuẩn bị đa vào ứng dụng sản xuất (James, 2008) Sự phát triển hứa hẹn sáng sủa công nghệ sinh học thực vật sử dụng chuyển gen để sản xuất chất có hoạt tính sinh học nh: vitamin, c¸c Page of 50 dược chất, c¸c ho¸ chÊt sử dụng công nghiệp, y tế nh: kháng nguyên, kháng thể, interferon, vaccine 7(Mason & cs, 1998) Có nhiều hệ thống sản xuất protein tái tổ hợp cần thiết cho mục đích khác ngời Đó hệ thống sử dụng tế bào động vật bậc cao, vi khuẩn, nấm men 7Gần tế bào côn trùng, thực vật biến đổi gen đ ợc sử dụng để khắc phục nhợc điểm hệ thống sản xuất protein sử dụng tế bào động vật bậc cao, vi khuẩn nấm men Do nhiệm vụ to lớn đặt cho nhà khoa học tìm kiếm hệ thống sản xuất protein tái tổ hợp khác, rẻ tiền, dễ sử dụng không mang nguy lây nhiễm bệnh có nguồn gốc virus Hệ thống thực vật So với hƯ thèng trun thèng, thùc vËt cã nhiỊu lỵi thÕ việc sản xuất protein tái tổ hợp Vaccine thực vật sản xuất thông qua kỹ thuật di truyền đợc gọi Vaccine sản xuất thực vật (Rowlandson & Tackaberry, 2003) Vaccine đợc sử dụng dạng tinh khiết hay dới dạng dịch chiết thực vật nguyên liệu thực vật Vaccine tái t hp cã thể đưa v o thực vật ăn người v động vật, tạo khả đưa vaccine v o qua đường miệng, g©y miễn dịch cho hệ thống m ng nhầy v miễn dịch to n thể (Hansson et al, 2000; Fishcher et al, 2003).ý tưởng sử dụng thực vật l m hệ thống sn xut vaccine ung (edible vaccine) ó lôi cun nh khoa học nhiều nước tham gia v o nghiªn cứu thập niªn vừa qua v thu nhiều kết khả quan (Rowlandson & Tackaberry, 2003) Spirodela polyrrhiza l lo i bÌo tÊm cã tèc ®é sinh sản vụ tính nhanh Thi gian nhân đôi sinh khối chóng vßng 36 - 48 BÌo S polyrrhiza d nuôi trng vi thit b v thao tác n gin, môi trng dinh dng không phc tp, to bèo ng nht, h s nh©n sinh khối lớn thời gian ngắn, h m lượng protein cao với th nh phần axit amin phong phó (Landolt,1986) V× vËy viƯc sư dơng bÌo tÊm nãi chung Spirodela polyrrhiza nói riêng làm đối tợng chuyển gen để sản xuất loại protein tái tổ hợp có giá trị cao với giá thành thấp híng nghiªn cøu triĨn väng Page of 50 Xt phát từ sở khoa học đòi hỏi thực tế trên, thực đề tài: Nghiên cứu xây dựng quy trình chuyển gen vào bÌo tÊm Spirodela polyrrhiza th«ng qua Agrobacterium tumefaciens “ 1.2 Mục đích đề tài Xây dựng quy trình chun gen vào callus bèo nguyên Spirodela polyrrhiza th«ng qua Agrobacterium tumefaciens 1.3 Ý nghĩa khoa học thực tiễn đề tài *ý nghÜa khoa häc: Kết đề tài cung cấp dẫn liệu khoa học khả tiếp nhận gen từ Agrobacterium tumefaciens vµo loµi bÌo tÊm Spirodela polyrrhiza * ý nghĩa thực tiễn: Là sở ứng dụng để chuyển gen quan tâm vào bèo Spirodela polyrrhiza nhằm sản xuất protein tái tổ hợp Page of 50 PHN II TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Một số đặc điểm sinh học bèo Spirodela polyrrhiza 2.1.1 Hệ thống phân loại BÌo gồm chi: Spirodela, Landoltia, Lemna, Wolffia, Wolffiella thuộc họ Lemnaceae với khoảng 40 lo i kh¸c (Landolt, 1998; Les & cs, 2002; http://plants.usda.gov/java/profile?symbol=SPPO) Spirodela polyrrhiza thuộc: Giới : Thực vật (Plantae) Ph©n giới: Thực vật cã mạch (Tracheobionta) Liªn ng nh: Thực vật cã hạt (Spermatophyta) Ng nh: Ngọc lan (hạt kÝn) (Magnoliophyta) Lp: Mt mm (Liliopsida) Phân lp: Ráy (Arecidae) B: R¸y (Arales) Họ: bÌo tÊm (Lemnaceae) Chi: Spirodela b a a Bèo vại nuôi b Hình thái bèo tm S.polyrrhiza H×nh 2.1: Bèo Sprirodela polyrrhiza Page of 50 S polyrrhiza thuộc chi Spirodela, chi n y gồm lo i: S intermedia v S polyrhiza Chi Spirodela l chi nguyªn thủy họ Lemnacea v cã kÝch cỡ genome nhỏ (Landolt, 1986) 2.1.2 Đặc điểm hình thái bèo Bèo tm nói chung dng thân, điển hình m c th gói gn mt cu trúc gọi cánh bèo (frond) Chúng có hình dạng kích thc rt a dng, t,1 mm n 10,0 mm, t hình cầu đến hình trứng méo, hình ovan; t không rễ tới có mt rễ v nhiều rễ Mặc dï tổ chức quan chóng bị suy giảm so với c¸c lo i thc vt in hình nhng hu ht loài bèo có y mô v c quan tng tự nhiều lo i thực vật hạt kÝn lớn như: rễ, hoa, quả, hạt, Sự suy giảm tổ chức thể cã thể quan s¸t thấy bắt đầu chi Spirodela, tiếp đến l chi Lemna, Wolffiella v Wolffia (Landolt, 1986) Bèo S polyrrhiza có hình dạng giống lá, h×nh trøng mÐo, thể dạng mng, d i 1,5 Viện Đại học Mở 10,0 mm, rng 1,5- 8,0 mm Mt cánh bèo có m u xanh nhờ tập trung diệp lục, có mt chm nâu vùng nút (node) cánh Mô biểu bì gồm nhu mô quang hợp xen kẽ gian bào khí lớn, nhờ gian bào khí mà bèo trôi đợc mặt nớc Mặt dới (mặt bụng) có màu nâu đỏ, thờng gặp bèo hoá già sống môi trêng thiÕu chÊt dinh dìng PhÇn phÝa díi nót cã hai túi bên vảy mành tạo thành Các cánh bèo đợc hình thành từ mô phân sinh điểm nút nằm hai túi màng Mỗi cánh bÌo cã 7-21 rƠ mäc t¹i vïng nót phÝa ngoµi hai tói (Landolt, 1986) 2.1.3 Phương thức sinh sản Bèo có hai phương thức sinh sản để trì nịi giống: sinh sản hữu tính sinh sản vơ tính Sinh sản hữu tính thực thơng qua hoa tạo hạt tương tự lồi thực vật hạt kín khác Khơng có kích thước thể nhỏ mà hoa hạt bèo nhỏ bé, mà bèo xem loại thực vật hạt kín nhỏ bé giới thưc vật (Landolt, 1986) Page of 50 Bèo sinh sản vơ tính thơng qua hình thức nảy chồi, cánh bèo sinh từ vùng mô phân sinh nằm sâu cánh bèo mẹ chúng tách khỏi cánh bèo mẹ trưởng thành hầu hết loài Khi cánh bèo hình thành thân chúng mang sẵn hệ cánh bèo hình thành mơ phân sinh chúng (Landolt, 1986) Trong tự nhiên, sinh sản vơ tính phương thức chủ yếu giúp cho quần thể bèo phát triển nhanh chóng, cịn phương thức sinh sản hữu tính giúp cho quần thể bèo có đa dạng di truyền xảy điều kiện nhiệt độ, độ ẩm chất dinh dưỡng thích hợp với hoa, thụ phấn kết trái Hạt bèo có sức chống chịu lớn với đièu kiện nóng, lạnh khơ hạn nên tồn qua nhiều năm bùn, đất điều kiện ngoại cảnh bất lợi (Ladolt, 1986) 2.1.4 Phân bố bèo S βpolyrhiza nói riêng bèo nói chung, sống vùng nước ao hồ hay đầm lầy Đặc điểm vùng nước tĩnh lặng có dịng chảy chậm Chúng sống vùng nước lợ thấy (Landolt, 1986) βS βpolyrhiza phân bố rộng rãi toàn giới trừ vùng cực Bắc, cận Bắc cực, vùng ẩm ướt hay khơ với mùa hè ấm, phia Đơng phía Nam Nam Mỹ, New Zealand số đảo khác, gặp vùng có khí hậu Địa Trung Hải (Landol, 1986) Page 10 of 50
Ngày đăng: 09/08/2023, 15:33
Xem thêm:
