Nghien cuu toi uu hoa quy trinh tach va dung hop 30771

Phạ m Thị Ng ân Lớ p: CN SH 07 02 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC    KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP Đề tài NGHIÊN CỨU TỐI ƯU HĨA QUY TRÌNH TÁCH VÀ DUNG HỢP PROTOPLAST GIỮA CÁC DÒNG KHOAI TÂY DẠI VỚI GIỐNG KHOAI TÂY TRỒNG ATLANTIC PHỤC VỤ CHƯƠNG TRÌNH CHỌN TẠO GIỐNG KHOAI TÂY KHÁNG BỆNH VIRUS VÀ BỆNH MỐC SƯƠNG Giáo viên hướng dẫn : GS.TS Nguyễn Quang Thạch KS Hoàng Thị Giang Sinh viên thực : Phạm Thị Ngân Lớp : KSCNSH0702 – K14 HÀ NỘI - 2011 LỜI CẢM ƠN Trong suốt trình thực tập cuối khố Phịng thí nghiệm Cơng nghệ sinh học khoai tây - Viện sinh học nông nghiệp - Trường đại học nông nghiệp Hà Nội, nhận đước giúp đỡ nhiệt tình, chu đáo thầy giáo, GS.TS Nguyễn Quang Thạch Thầy giúp nâng cao kiến thức, hiểu biết sâu rộng cơng nghệ sinh học nơng nghiệp nói riêng lính vực khác cơng nghệ sinh học nói chung Lời đầu tiên, tơi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc kính trọng tới thầy Tơi xin gửi lời biết ơn chân thành tới cán công tác Viện sinh học nông nghiệp, đặc biệt KS Hoàng Thị Giang bảo tạo điều kiện thuận lợi cho suốt thời gian thực tập Tôi xin gửi lời cảm ơn đến thầy cô giáo Viện đại học Mở Hà Nội, đặc biệt thầy cô khoa Công nghệ sinh học truyền đạt kiến thức vô q báu cho tơi có tảng sở để tơi hồn thành tốt luận văn Tơi xin gửi lời cảm ơn tới gia đình, bạn bè tôi, người chia sẻ, động viên, giúp đỡ góp ý cho tơi suốt q trình thực tập hoàn thành bào cáo tốt nghiệp Hà nội, ngày 25 tháng năm 2011 Sinh viên Phạm Thị Ngân MỤC LỤC MỞ ĐẦU I Đặt vấn đề II Mục đích yêu cầu Mục đích 2 Yêu cầu PHẦN I TỔNG QUAN TÀI LIỆU .3 1.1 Giới thiệu chung khoai tây 1.1.1 Nguồn gốc 1.1.2 Phân loại 1.1.3 Đặc điểm thực vật học khoai tây .4 1.1.4 Tình hình sản xuất khoai tây giới nước 1.2 Tình hình nhiễm bệnh virus khoai tây 1.2.1 Tình hình nhiễm bệnh vius .9 1.2.2 Tác hại bệnh virus 11 1.2.3 Tình hình nhiễm bệnh mốc sương khoai tây .13 1.3 Các hướng nghiên cứu tạo giống khoai tây 15 1.3.1 Nghiên cứu chuyển gen 15 1.3.2 Nghiên cứu dung hợp tế bào trần 16 1.3 Tạo giống khoai tây dung hợp tế bào trần 21 1.3.1 Khái niệm tế bào trần (protoplast) lai soma (somatic hybrid) 23 1.3.2 Quá trình tách, dung hợp, nuôi cấy tái sinh protoplast 23 1.3.3 Xác định lai soma 25 PHẦN II VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 29 2.1 Vật liệu 29 2.1.1 Giống khoai tây Atlantic (Solanum tuberosum cv.Atlantic) .29 2.1.2 Các dòng khoai tây dại 29 2.2 Nội dung, địa điểm thời gian nghiên cứu .29 2.2.1 Nội dung nghiên cứu 29 2.2.3 Địa điểm thời gian nghiên cứu 31 2.3 Phương pháp nghiên cứu 31 2.3.1 Phương pháp tách protoplast (Theo quy trình viện JKI – viện .31 2.3.2 Phương pháp đếm protoplast pha loãng mật độ 32 2.3.3 Phương pháp chuẩn bị hóa chất tách protoplast 33 2.3.5 Phương pháp dung hợp protoplast xung điện 34 2.3.6 Phương pháp chuẩn bị dung dịch dung hợp 34 2.3.7 Phương pháp nuôi cấy tái sinh protoplast sau dung hợp 35 2.3.8 Các tiêu theo dõi .35 2.3.9 Phuơng pháp xử lý số liệu: 35 PHẦN III KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 36 3.1 Các kết tách protoplast 36 3.1.1 Thí nghiệm 1: So sánh khả tách protoplast kiểu gen khác 36 3.1.2 Thí nghiệm 2: Nghiên cứu ảnh hưởng tuổi in vitro đến suất chất lượng tách protoplast dòng khoai tây dại giống Atlantic .39 3.1.3 Thí nghiệm 3: Nghiên cứu ảnh hưởng nồng độ dung dịch Enzyme đến suất chất lượng protoplast 41 3.2 Các kết nuôi cấy protoplast 44 3.2.1 Nghiên cứu ảnh hưởng môi trường nuôi cấy đến phân chia tái sinh protoplast .44 3.2.2 So sánh ảnh hưởng loại môi trường nuôi cấy đến phân chia tái sinh protoplast .48 3.3 Các kết dung hợp protoplast 54 3.3.1 Tối ưu hóa thơng số quy trình dung hợp xung điện giống khoai tây Atlantic dòng khoai tây dại 54 PHẦN IV KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 57 4.1 Kết luận 57 4.2 Đề nghị 58 TÀI LIỆU THAM KHẢO 59 PHỤ LỤC 62 DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1: Diện tích, suất sản lượng khoai tây khu vực giới năm 2007 Bảng 2: Diện tích, suất sản lượng khoai tây Việt Nam Bảng 3: Khả tách protoplast vật liệu nghiên cứu 36 Bảng 4: Ảnh hưởng tuổi in vitro đến suất chất lượng protoplast .39 Bảng 5: Ảnh hưởng nồng độ dung dịch enzym đến suất chất lượng protoplast .42 Bảng 6: Ảnh hưởng môi trường nuôi cấy đến phân chia protoplast hình thành microcalli 45 Bảng 7: Ảnh hưởng môi trường nuôi cấy đến phân chia protoplast hình thành microcalli 49 DANH MỤC CÁC BIỂU ĐỒ Biểu đồ 1: Ảnh hưởng tuổi in vitro đến suất protoplast 41 Biểu đồ 2: : Ảnh hưởng môi trường nuôi cấy đến phân chia protoplast 46 Biểu đồ 3: Ảnh hưởng loại môi trường nuôi cấy đến phân chia hình thành microcalli protoplast 49 DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1: Hình ảnh lớp protoplast sau li tâm lần 37 Hình 2: protoplast dịng sau tách 38 Hình 3: Mật protoplast giống Atlantic tách dung dịch enzym khác 43 Hình 4: Hình ảnh microcallus môi trường khác giống Atlantic 47 Hình 5: Hình ảnh callus giống Atlantic phân chia môi trường .51 Hình 6: Hình ảnh protoplast giống Atlantic phân chia mơi trường VKM II 53 Hình 7: Protoplast sau xung điện 56 CÁC KÍ TỰ VIẾT TẮT  AFLP-Amplified Fragment length polymorphism  BC (Back cross)  NST Nhiễm sắc thể  PLRV Potato leafroll luteovirus PLRV  PVA Potato A potyvirus  PVM Potato M carlavirus  PVM Potato M carlavirus  PVS Potato S carlavirus  PVV Potato V potyvirus  PVX Potato X potexvirus  PVY.Potato Y potyvirus MỞ ĐẦU I Đặt vấn đề Khoai tây loại trồng quan trọng Việt Nam, đặc biệt vùng Đồng Sông Hồng Gần đây, biến đổi khí hậu tồn cầu làm thay đổi sản xuất trồng giới Việt Nam Sự biến đổi khí hậu kéo theo xuất hàng loạt loại bệnh dịch hại làm thiệt hại đến suất sản lượng trồng nghiêm trọng Để đối phó với tác động biến đổi khí hậu tồn cầu tương lai, nhiệm vụ cấp thiết đặt cho nhà chọn tạo giống khoai tây phải tạo giống khơng có suất cao, chất lượng tốt mà đồng thời phải chống chịu với stress môi trường Hiện nay, sản xuất khoai tây giới nói chung Việt Nam nói riêng phải đối mặt với loại bệnh virus, PVY bệnh nguy hiểm bệnh mốc sương (do nấm Phytophthora infestans) Chiến lược sử dụng loại thuốc bảo vệ thực vật để phòng trừ bệnh virus PVY không thành công (Jones cộng sự, 1982; De Bokx Van der Want, 1987; Valkolen cộng sự, 1996) Việc trồng củ giống vị nhiễm virus PVY (potato Y potyvirus) PLRV (potato leafroll luteovirus) làm giảm suất tới 80% (Banttari cộng sự, 1993) Bên cạnh đó, bệnh mốc sương cho bệnh hại khoai tây nghiêm trọng toàn giới (Hammann, 2009; Thieme, 2010) Để phòng trừ bệnh phải lượng lớn thuốc bảo vệ thực vật năm (mất khoảng 14 lần phun/mỗi vụ) Mỗi năm nước Đức tới 470 EURO/ha để phòng trừ bệnh thuốc bảo vệ thực vật (Darsow, 2008) Các dòng khoai tây dại có khả kháng cao với hầu hết chủng gây bệnh virus mốc sương Do đó, lồi khoai tây dại nguồn cung cấp gen giàu có cho q trình cải tiến giống khoai tây nhà chọn tạo giống nhà di truyền học Tuy nhiên khó để lai tạo hữu tính lồi dại (2n = 2x = 24) với khoai tây trồng (2n = 4x = 48) không tương hợp genom, bất thụ lai xa… Chính lai soma dung hợp protoplast giải pháp hữu hiệu để khắc phục nhược điểm Đối với Việt Nam, công tác chọn tạo giống khoai tây kháng bệnh nhiều hạn chế, chủ yếu áp dụng phương pháp truyền thống, chưa áp dụng phương pháp CNSH đại, chưa có vật liệu phong phú mang tính trạng quý mang gen kháng virus, mốc sương, chống chịu với stressmôi trường Xuất phát từ lý trên, tiến hành nghiên cứu đề tài: “Nghiên cứu tối ưu hóa quy trình tách dung hợp protoplast dịng khoai tây dại với giống khoai tây trồng Atlantic phục vụ chương trình chọn tạo giống khoai tây kháng bệnh virus bệnh mốc sương” II Mục đích yêu cầu Mục đích Tối ưu hóa q trình tách dung hợp tế bào trần dòng khoai tây dại dòng khoai tây trồng phục vụ chương trình chọn tạo giống khoai tây kháng bệnh virus mốc sương dung hợp tế bào trần Yêu cầu - Xác định thông số tối ưu cho quy trình tách protoplast dịng giống nghiên cứu (nồng độ enzym, tuổi in vitro thích hợp để tách protoplast, …) - So sánh khả tách protoplast dòng giống nghiên cứu (mật độ protoplast, chất lượng protoplast, khả phân chia nuôi cấy) - Xác định mơi trường thích hợp để nuôi cấy - Xác định loại môi trường nuôi cấy protoplast thích hợp - Tối ưu hóa quy trình dung hợp protoplast xung điện dòng khoai tây dại S tarnii với giống khoai tây Atlantic