TNU Journal of Science and Technology 227(10) 47 55 http //jst tnu edu vn 47 Email jst@tnu edu vn OPTIMIZATION OF THE EXTRACTION PROCESS OF POLYPHENOLS AND FLAVONOIDS FROM BREADFRUIT LEAVES (Artocarpu[.]
TNU Journal of Science and Technology 227(10): 47 - 55 OPTIMIZATION OF THE EXTRACTION PROCESS OF POLYPHENOLS AND FLAVONOIDS FROM BREADFRUIT LEAVES (Artocarpus altilis) Nguyen Thi Ai Lan1, Tran Chi Linh2* 1Tra Vinh University, 2Can Tho University ARTICLE INFO ABSTRACT Received: 28/4/2022 This study aims to optimize the extraction conditions of polyphenols and flavonoids from breadfruit leaves To achieve this, the Box-Behnken design was implemented for the optimization itself The influence of four factors, including: raw material/ solvent ratio, ethanol concentration, ultrasonic time and ultrasonic temperature on the extraction of polyphenols and flavonoids were studied As a result, the optimal extraction conditions were extraction time of 15.98 min, extraction temperature of 69℃, solid-to-solvent ratio of 1/30 (w/v) and ethanol concentration of 69% for ultrasound-assisted extraction Under these conditions, the measured polyphenols and flavonoids were 227.38±1.27 mg/g GAE and 113.36±2.07 mg/g QE, respectively, which was in agreement with the predicted value (TPC=228.46 mg/g GAE; TFC=112.58 mg/g QE) Optimum extraction of breadfruit leaves has good ability to neutralize free radicals 2,2'-azino-bis(3ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid) (EC50=56.57±0.10 µg/mL) and 2,2diphenyl-1-picrylrylhydrazyl (EC50=68.85±0.53 µg/mL) and nitric oxide (EC50=77.21±0.84 µg/mL) Revised: 14/6/2022 Published: 14/6/2022 KEYWORDS Antioxidant Artocarpus altilis Box-Behnken Flavonoids Polyphenols TỐI ƯU HĨA QUY TRÌNH CHIẾT XUẤT POLYPHENOL VÀ FLAVONOID TỪ LÁ CÂY SA KÊ (Artocarpus altilis) Nguyễn Thị Ái Lan1, Trần Chí Linh2* 1Trường Đại học Trà Vinh, 2Trường Đại học Cần Thơ THÔNG TIN BÀI BÁO Ngày nhận bài: 28/4/2022 Ngày hoàn thiện: 14/6/2022 Ngày đăng: 14/6/2022 TỪ KHĨA Chống oxy hóa Sa kê Box-Behnken Flavonoid Polyphenol TĨM TẮT Nghiên cứu nhằm mục đích tối ưu hóa điều kiện chiết xuất polyphenol flavonoid từ sa kê Để đạt điều này, thiết kế Box-Behnken sử dụng để tối ưu hóa quy trình chiết xuất polyphenol flavonoid từ sa kê Ảnh hưởng bốn yếu tố, bao gồm: tỷ lệ nguyên liệu/ dung môi, nồng độ ethanol, thời gian nhiệt độ siêu âm đến trình chiết xuất polyphenol, flavonoid thực Kết cho thấy, điều kiện chiết xuất tối ưu thời gian 15,98 phút, nhiệt độ 69℃, tỷ lệ nguyên liệu dung/ dung môi 1/30 (w/v) nồng độ ethanol 69% với hỗ trợ sóng siêu âm Trong điều kiện này, hàm lượng polyphenol (TPC), flavonoid (TFC) đo 227,38±1,27 mg GAE/g cao chiết 113,36±2,07 mg QE/g cao chiết, phù hợp với giá trị dự đoán (TPC=228,46 mg GAE/g cao chiết; TFC=112,58 mg QE/g cao chiết) Cao tối ưu sa kê có khả trung hịa tốt gốc tự 2,2'-azino-bis(3ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid) (EC50=56,57±0,10 µg/mL) 2,2-diphenyl-1-picrylrylhydrazyl (EC50=68,85±0,53 µg/mL) nitric oxide (EC50=77,21±0,84 µg/mL) DOI: https://doi.org/10.34238/tnu-jst.5924 * Corresponding author Email: tclinh@ctu.edu.vn http://jst.tnu.edu.vn 47 Email: jst@tnu.edu.vn TNU Journal of Science and Technology 227(10): 47 - 55 Giới thiệu Gốc tự phân tử có nhiều electron chưa ghép đơi obitan lớp ngồi [1] Nhiều gốc tự dạng oxy phản ứng (reactive oxygen species, ROS) nitơ phản ứng (reactive nitrogen species, RNS) phần thiếu trình sinh lý bình thường thể người [2] Tuy nhiên, gốc tự sản sinh mức thể tiếp xúc với xạ, hóa chất độc hại, thuốc lá, rượu bia tiêu thụ chất béo bị oxy hóa [3] Các ROS RNS sản sinh mức dẫn đến tổn thương oxy hóa phân tử sinh học: lipid, protein, DNA màng tế bào đến phát triển bệnh tim mạch, ung thư, đái tháo đường, tăng huyết áp rối loạn thối hóa thần kinh [4], [5] Chất chống oxy hóa có khả loại bỏ gốc tự có tiềm lớn việc cải thiện bệnh lý ROS RNS gây [6] Các chất chống oxy hóa tổng hợp phổ biến như: butylated hydoxytoluene, butylated hydoxyanisole propylgallate sử dụng nhiều lại gây ảnh hưởng đến tuổi thọ có nhiều tác dụng phụ [7] Chính vậy, ngày có nhiều quan tâm đến việc chiết xuất chất chuyển hóa thứ cấp từ thực vật, để có giải pháp thay hợp chất chống oxy hóa tổng hợp an tồn, hiệu chi phí thấp Các hợp chất chuyển hóa thứ cấp từ thực vật thuộc nhóm polyphenol, flavonoid có hoạt động dược lý quan trọng, bao gồm: chống oxy hóa, chống ung thư, ức chế enzyme chống viêm [8] Polyphenol flavonoid có nhiều đặc điểm sinh hóa, hoạt tính sinh học khác nhau, đặc tính mơ tả tốt hầu hết polyphenol, flavonoid khả chống oxy hóa [9] Các hợp chất thuộc nhóm polyphenol flavonoid chứng minh có diện chiết xuất từ sa kê (Artocarpus altilis) [10], [11] Các nghiên cứu trước cho thấy sa kê có tác dụng chống ung thư, bảo vệ tim mạch, kiểm soát huyết áp, bảo vệ gan nhiều hoạt tính sinh học đáng quý khác [7] Các hoạt tính sinh học mà sa kê sở hữu chứng minh có mối quan hệ mật thiết với hàm lượng polyphenol (TPC) flavonoid (TFC) [12] Tuy nhiên, nghiên cứu để tối ưu hóa điều kiện chiết xuất polyphenol flavonoid từ sa kê (LSK) hạn chế Do đó, nghiên cứu thực nhằm tìm điều kiện chiết xuất tối ưu cao chiết giàu polyphenol flavonoid từ sa kê Nghiên cứu góp phần cung cấp sở khoa học cho việc định hướng khai thác dược liệu cách hiệu Vật liệu phương pháp nghiên cứu 2.1 Vật liệu Cây sa kê thu lấy quận Bình Thủy, thành phố Cần Thơ trình bày Hình LSK sử dụng nghiên cứu già khô vừa rụng Mẫu LSK định danh lưu trữ phịng thí nghiệm Hóa Sinh Lâm Sàng (Phịng C11.105), mơn Hóa Sinh, Khoa Y - Dược, trường Đại học Trà Vinh với mã số lưu trữ là: CT_Aal202001050011 Hình Mẫu sa kê sử dụng nghiên cứu Ghi chú: A-Một nhánh sa kê, B-Mặt sa kê già khô vừa rụng; C-Mặt sa kê già khô vừa rụng http://jst.tnu.edu.vn 48 Email: jst@tnu.edu.vn TNU Journal of Science and Technology 227(10): 47 - 55 2.2 Phương pháp nghiên cứu 2.2.1 Xử lý nguyên liệu xác định độ ẩm LSK sau thu rửa sạch, loại bỏ phần sâu bệnh, cắt nhỏ phơi khơ bóng râm Sau đó, LSK xay nhuyễn thành bột đem ray qua khay để thu hạt bột dược liệu có kích thước hạt 60 mesh Bột dược liệu LSK có độ ẩm 4,75±0,11% xác định theo mô tả Dược Điển Việt Nam V [13] Bột dược liệu LSK bảo quản túi nhựa PE, đặt hộp nhựa kín lưu trữ 4oC để sử dụng cho thí nghiệm 2.2.2 Xác định ảnh hưởng yếu tố đơn tối ưu hóa quy trình chiết xuất polyphenol, flavonoid từ bột dược liệu LSK Máy siêu âm gia nhiệt (Derui DR-MH30, China) với tần số 40 kHz sử dụng để phát sóng siêu âm hỗ trợ chiết xuất polyphenol flavonoid Bột dược liệu LSK chiết xuất polyphenol, flavonoid điều kiện: tỷ lệ nguyên liệu/ dung môi từ 1/10 đến 1/40 (w/v); ethanol từ 40 đến 99,5% (v/v); nhiệt độ siêu âm từ 30 đến 90oC; thời gian siêu âm từ đến 35 phút Trong trình khảo sát ảnh hưởng yếu tố đơn: ethanol 90%, nhiệt độ 30oC, thời gian siêu âm phút tỷ lệ nguyên liệu/ dung môi 1/10 (w/v) cố định Tiến hành lọc dịch chiết cô đuổi dung môi thu lấy cao chiết để xác định TPC TFC theo mô tả mục 2.2.3 Sau tiến hành khảo sát đơn nhân tố, 03 yếu tố có ảnh hưởng nhiều đến TPC, TFC cao LSK chọn để xây dựng quy trình chiết xuất tối ưu Phương pháp đáp ứng bề mặt theo thiết kế Box-Behnken với ba yếu tố, ba cấp độ phần mềm Design expert 11.0 sử dụng để thiết kế thí nghiệm đánh giá mơ hình Các điều kiện chiết xuất tối ưu sử dụng để điều chế cao tối ưu khảo sát hoạt tính chống oxy hóa theo mô tả mục 2.2.4 2.2.3 Phương pháp định lượng polyphenol flavonoid TPC cao LSK xác định theo mô tả Patra cộng (2020) [14] TPC biểu thị mg gallic acid (GAE) g cao chiết, dựa vào đường chuẩn: y=0,0103x+0,1147 (R²=0,9991) TFC cao LSK xác định theo mô tả Akanni cộng (2014) [7] TFC biểu thị mg quercetin (QE) g cao chiết, dựa vào đường chuẩn: y=0,0049x+0,0039 (R²=0,9978) 2.2.4 Khảo sát hoạt tính chống oxy hóa cao tối ưu LSK Hiệu trung hòa gốc tự 2,2'-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid) (ABTS+) thực theo Khorasani cộng (2015) [15] Phản ứng gồm: 990 µL ABTS+ với 10 µL cao tối ưu LSK, phút, 25oC Độ hấp thu quang phổ xác định bước sóng 734 nm Hiệu trung hòa gốc tự 2,2-diphenyl-1-picrylrylhydrazyl (DPPH) thực theo Mensor cộng (2001) [16] Cao tối ưu LSK 960 µL phản ứng với 40 µL DPPH (1000 µg/mL) Mẫu thử ủ tối, 30 phút 25oC đo độ hấp thu quang phổ bước sóng 517 nm Hiệu trung hòa gốc tự nitric oxide (NO) thực theo Ebrahimzadeh cộng (2009) có điều chỉnh [17] Cao tối ưu LSK mL cho phản ứng với mL natri nitroprusside (5 mmol/L) 150 phút nhiệt độ phịng Sau đó, 0,5 mL thuốc thử Griess thêm vào tiến hành đo độ hấp thu quang phổ bước sóng 546 nm Vitamin C sử dụng làm chất đối chứng dương phương pháp chống oxy hóa Hiệu suất chống oxy hóa nồng độ trung hịa 50% gốc tự (half maximal effective concentration, EC50) xác định theo mô tả Khorasani cộng (2015) [15] 2.2.5 Xử lý phân tích số liệu Các số liệu khảo sát đơn yếu tố trình bày dạng MEAN±SEM xử lý phần mềm Minitab 16.0 kiểm định ANOVA-Tukey’s Biểu đồ vẽ phần mềm Microsof excel 2013 Số liệu biểu đồ mơ hình tối ưu xử lý phần mềm Design expert 11.0 http://jst.tnu.edu.vn 49 Email: jst@tnu.edu.vn TNU Journal of Science and Technology 227(10): 47 - 55 Kết bàn luận 3.1 Ảnh hưởng yếu tố đơn đến trình chiết xuất polyphenol flavonoid từ LSK TPC TFC chứng minh thấp sử dụng đơn dung môi ethanol nước để chiết xuất [18] Sự kết hợp ethanol nước với tỷ lệ thích hợp tạo điều kiện chiết xuất hiệu polyphenol flavonoid [19] Trong Hình 2A kết hợp ethanol nước tỷ lệ khác ảnh hưởng đáng kể đến TPC TFC Cụ thể, TPC TFC tăng liên tục từ nồng độ ethanol 40% (TPC=72,81±0,99 mg GAE/g cao chiết; TFC=49,86±2,44 mg QE/g cao chiết) đến 70% (TPC=117,99±0,75 mg GAE/g cao chiết; TFC=97,11±5,09 mg QE/g cao chiết) bắt đầu giảm 80% (TPC=104,80±0,65 mg GAE/g cao chiết; TFC=71,85±4,89 mg QE/g cao chiết) Do đó, nồng độ ethanol từ 60 đến 80% chọn để đưa vào thiết kế Box-Behnken Hình Hàm lượng polyphenol flavonoid cao LSK Ghi chú: A: Ảnh hưởng nồng độ ethanol đến TPC TFC; B: Ảnh hưởng nhiệt độ siêu âm đến TPC TFC; C: Ảnh hưởng thời gian siêu âm đến TPC TFC; D: Ảnh hưởng tỷ lệ nguyên liệu/ dung môi đến TPC TFC Nghiên cứu Hossain cộng (2011) cho thấy, nhiệt độ yếu tố chi phối trình chiết xuất polyphenol flavonoid [20] Ở Hình 2B, TPC TFC tăng chiết nhiệt độ 30oC (TPC=97,65±0,61 mg GAE/g cao chiết; TFC=61,98±2,35 mg QE/g cao chiết) đến 70oC (TPC=119,66±1,32 mg GAE/g cao chiết; TFC=99,54±2,35 mg QE/g cao chiết) bắt đầu giảm 80oC Do đó, phạm vi nhiệt độ siêu âm từ 60°C đến 80°C chọn vào thiết kế Box-Behnken Sự gia tăng nhiệt độ dung môi làm giảm độ nhớt môi trường chiết xuất, giúp dung môi thâm nhập vào hạt bột dược liệu làm tăng hiệu suất chiết suất [18] Tuy nhiên, nhiệt độ tăng cao dẫn đến phân hủy biến chất polyphenol flavonoid [21] Như thể Hình 2C, TPC (121,88±2,08 mg GAE/g cao chiết) TFC (101,18±6,47 mg QE/g cao chiết) đạt cao sau 15 phút đánh siêu âm bắt đầu giảm đáng kể sau (p0,05) Nguyên nhân tỷ lệ nguyên liệu 1/30 hàm lượng chất chiết xuất đạt đến độ bão hịa [21] Do đó, tỷ lệ ngun liệu/ dung môi 1/30 chọn để sử dụng khảo sát 3.2 Tối ưu hóa quy trình chiết xuất polyphenol flavonoid từ LSK TPC TFC chiết xuất từ bột dược liệu LSK chịu ảnh hưởng đáng kể nồng độ ethanol (60-80%, v/v), nhiệt độ siêu âm (60-80°C) thời gian siêu âm (10-20 phút) nên chọn đưa vào thiết kế Box-Behnken Ngồi ra, tỷ lệ ngun liệu/ dung mơi 1/30 cố định trình tối ưu Trong 17 nghiệm thức thiết kế Box-Behnken, TPC TFC thu cao nghiệm thức trung tâm (từ nghiệm thức 13 đến 17, Bảng 1) Bảng Ma trận thực nghiệm Box-Behnken ba yếu tố LSK Nghiệm thức 10 11 12 13 14 15 16 17 Các biến độc lập A (%, v/v) B (oC) C (phút) 60 60 15 80 60 15 60 80 15 80 80 15 60 70 10 80 70 10 60 70 20 80 70 20 70 60 10 70 80 10 70 60 20 70 80 20 70 70 15 70 70 15 70 70 15 70 70 15 70 70 15 Hàm lượng polyphenol (mg GAE/g cao chiết) 124,85e±1,94 131,33de±2,24 108,67f±2,97 86,67g±1,12 146,21c±1,94 139,09cd±2,24 174,69b±2,97 166,28b±2,97 125,50e±4,04 86,02g±3,88 143,62c±4,48 122,27e±2,24 226,47a±2,97 224,52a±7,35 226,47a±2,97 227,77a±1,94 226,47a±2,24 Hàm lượng flavonoid (mg QE/g cao chiết) 60,45fg±2,27 65,21c-f±6,27 53,37g±1,84 43,31h±2,48 72,83c±1,70 69,70cde±1,18 87,52b±1,70 83,17b±1,89 62,63def±3,70 42,76h±3,30 70,79cd±1,43 61,27efg±2,45 112,42a±2,05 112,29a±6,38 111,74a±1,43 111,06a±0,41 110,24a±2,16 Ghi chú: A-Nồng độ ethanol (%, v/v); B-Nhiệt độ (oC); C-Thời gian siêu âm (phút) Các giá trị có mẫu tự theo sau cùng cột giống khác biệt khơng có ý nghĩa mức 5% Dựa vào giá trị thực nghiệm Bảng 1, nghiên cứu áp dụng phương pháp phân tích hồi quy số liệu thực nghiệm, thu mơ hình đa thức bậc hai dự đoán TPC TFC sau: YPolyphenol = -5786,155 + 58,06412 × A + 107,57587 × B + 34,837 × C - 0,0712 × A × B 0,00645 × A × C + 0,09065 × B × C - 0,381225 × A² - 0,753375 × B² - 1,266 × C² YFlavonoid = -2855,25625 + 28,441 × A + 53,52287 × B + 15,85575 × C - 0,03705 × A × B 0,0061 × A × C + 0,05175 × B × C - 0,185112 × A² - 0,374537 × B² - 0,58935 × C² Trong đó, A yếu tố nồng độ ethanol; B yếu tố nhiệt độ; C yếu tố thời gian siêu âm Phân tích ANOVA thực để đánh giá tác động yếu tố đơn, tương tác yếu tố mức độ phù hợp mô hình dự đốn với thực nghiệm trình bày Bảng Kết cho thấy, nồng độ ethanol, nhiệt độ thời gian siêu âm có tương tác với (p0,05), hệ số tương quan (R2polyphenol=0,9999; R2flavonoid=0,9996) mơ hình dự đoán >0,8 Hệ số biến động (CV) TPC TFC 0,57% 0,99%, giá trị CV tương đối thấp (CV0,05, R2>0,8 CV