Nghiên cứu điều chế gel vi nhũ tương chứa diosmin và quercetin

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH VŨ LÊ HÀ NGHIÊN CỨU ĐIỀU CHẾ GEL VI NHŨ TƯƠNG CHỨA DIOSMIN VÀ QUERCETIN LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC TP HỒ CHÍ MINH - Năm 2022 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH VŨ LÊ HÀ NGHIÊN CỨU ĐIỀU CHẾ GEL VI NHŨ TƯƠNG CHỨA DIOSMIN VÀ QUERCETIN NGÀNH: CÔNG NGHỆ DƯỢC PHẨM – BÀO CHẾ Mã số: 8720202 LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS.TS NGUYỄN ĐỨC HẠNH TP HỒ CHÍ MINH – Năm 2022 LỜI CAM ĐOAN Tơi xin cam đoan luận văn cơng trình nghiên cứu riêng hướng dẫn khoa học PGS.TS Nguyễn Đức Hạnh Các số liệu kết luận văn trung thực chưa cơng bố cơng trình nghiên cứu khoa học Tác giả luận văn Vũ Lê Hà TÓM TẮT Luận văn tốt nghiệp thạc sĩ Dược học khóa 2020 – 2022 Chun ngành: Cơng nghệ dược phẩm bào Bào chế thuốc Mã số: 8720202 NGHIÊN CỨU ĐIỀU CHẾ GEL VI NHŨ TƯƠNG CHỨA DIOSMIN VÀ QUERCETIN Vũ Lê Hà Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS Nguyễn Đức Hạnh Đặt vấn đề Diosmin quercetin hai hoạt chất thuộc nhóm flavonoid, có tác dụng chống oxy hoá, kháng viêm, làm bền thành mạch, có tiềm ứng dụng bào chế dạng thuốc dùng qua da hỗ trợ điều trị suy giãn tĩnh mạch Cả hai hoạt chất diosmin quercetin có độ tan nước Vì vậy, đề tài nghiên cứu phát triển dạng bào chế gel vi nhũ tương chứa diosmin quercetin (DQE) Đối tượng phương pháp nghiên cứu: Độ tan diosmin quercetin tá dược xác định phương pháp bão hoà để lựa chọn tá dược cho công thức vi nhũ tương (VNT) Giản đồ pha xây dựng, sử dụng phương pháp chuẩn độ nước Hoạt chất tải vào công thức VNT chọn đánh giá cảm quan, pH, độ nhớt, kích thước tiểu phân Độ bền vật lý VNT chứa diosmin quercetin (DQM) đánh giá qua chu kỳ nóng lạnh, chu kỳ bao gồm giai đoạn: ± oC 48 45 ± oC 48 ly tâm tốc độ 10.000 vòng/ phút 30 phút DQE điều chế từ DQM khảo sát phối hợp với tá dược tạo gel khác (HPMC, Sepinov Derm, Sepimax Zen) Các tính chất DQE đánh giá gồm: cảm quan, pH độ nhớt Quy trình định lượng đồng thời diosmin quercetin DQM DQE xây dựng thẩm định theo hướng dẫn ICH Kết quả: DQM chọn có kích thước giọt 165,6 ± 2,0 nm (PDI=0,267) bền với thử nghiệm sốc nhiệt ly tâm DQM có thành phần cơng thức gồm Plurol oleique CC479: Cremophor RH40: Transcutol P: Nước với tỷ lệ 15%: 16,67%: 8,33%: 60% (kl/kl) Hàm lượng diosmin quercetin DQM 0,005% 0,01% (kl/kl) DQE gel hoá từ DQM với tỷ lệ tá dược tạo gel Sepinov Derm 0,1% DQE có pH 3,95 có tính chất lưu biến phi Newton kiểu giả dẻo Quy trình định lượng đồng thời diosmin quercetin DQM DQE phương pháp HPLC đạt yêu cầu theo hướng dẫn ICH tính đặc hiệu, tính tương thích hệ thống, độ tuyến tính, độ xác độ Từ kết kiểm nghiệm lô DQE, tiêu chuẩn sở (TCCS) DQE đề xuất gồm tiêu cảm quan, pH, độ nhớt, định tính, định lượng Kết luận: Nghiên cứu xây dựng thành công công thức DQE chứa 0,005% diosmin 0,01% quercetin Kết nghiên cứu làm tiền đề cho việc phát triển dạng bào chế dùng để hỗ trợ điều trị suy giãn tĩnh mạch Từ khóa: Gel vi nhũ tương, diosmin, quercetin, vi nhũ tương ABSTRACT Graduation thesis of Pharmacy Master’s degree – Academic year 2020-2022 Speciality: Pharmaceutical technology and pharmaceutic Code: 8720202 DEVELOPMENT OF MICROEMULGEL CONTAINING DIOSMIN AND QUERCETIN Vu Le Ha Instructor: Assoc Prof Ph D Nguyen Duc Hanh Introduction: Diosmin and quercetin are two flavonoid active ingredients, possess anti- inflammatory effects, stabilize blood vessels, and could be the potential API for transdermal formulations to support the treatment of varicose veins Both diosmin and quercetin have poor water solubility This study aimed at developing a microemulgel dosage form containing diosmin and quercetin (DQE) Materials and methods: The solubilities of diosmin and quercetin in different excipients were investigated by using the saturation method to select excipients of microemulsion The phase diagram was constructed using the water titration method Active ingredients were loaded into the selected microemulsion formulation and evaluated for its organoleptic, pH, viscosity, and particle size The physical stability of microemulsion containing diosmin and quercetin (DQM) was evaluated through thermal cycles, each cycle consisted of phases: ± oC for 48 hours and 45 ± oC for 48 hours and high-speed centrifugation at 10000 rpm for 30 minutes DQE was prepared from DQM employing different gelling excipients (HPMC, Sepinov Derm, Sepimax Zen) The properties of DQE were evaluated including: organoleptic, pH and viscosity Procedures for the simultaneous quantification of diosmin and quercetin in DQM and DQE were developed and validated according to ICH guidelines Results: The selected DQM had a droplet size of 165.6 ± 2.0 nm (PDI=0.267) and was robust to thermal and centrifugation tests The chosen DQM consisted of Plurol oleique CC479: Cremophor RH40: Transcutol P: water with the ratios of 15%, 16.67 %, 8.33% and 60 % (w/w), respectively The contents of diosmin and quercetin in DQM were 0.005% and 0.01% (w/w), respectively DQE was obtained from DQM using Sepinov Derm as the gel-forming excipient at the ratio of 0.1% The DQE has a pH of 3.95 and non-Newtonian rheological properties The procedure for the simultaneous quantification of diosmin and quercetin in DQM and DQE using HPLC method met the requirements of the ICH guidelines for specificity, system suitability, linearity, accuracy, and precision From the test results of batches of DQE, the quality of DQE was proposed including organoleptic, pH, viscosity, qualitation and quantitation Conclusion: The DQE formulation containing 0.005% diosmin and 0.01% quercetin was successfully developed The results could be useful for the development of a transdermal dosage form to support the treatment of varicose veins Key words: Microemulgel, diosmin, quercetin, microemulsion i MỤC LỤC DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT iv DANH MỤC BẢNG v DANH MỤC HÌNH .vii MỞ ĐẦU TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan diosmin quercetin 1.1.1 Diosmin 1.1.2 Quercetin 1.1.3 Tác dụng dược lý phối hợp diosmin quercetin 1.2 Tổng quan VNT 1.2.1 Định nghĩa phân loại VNT 1.2.2 Thành phần cấu tạo VNT 10 1.2.3 Ưu nhược điểm hệ VNT 12 1.2.4 Một số tiêu chí đánh giá VNT 12 1.3 Tổng quan gel 13 1.3.1 Định nghĩa phân loại gel 13 1.3.2 Ưu nhược điểm gel 13 1.3.3 Một số tiêu chí đánh giá tính chất gel 14 1.3.4 Một số tá dược tạo gel thường dùng 14 1.3.5 Một số nghiên cứu ứng dụng hệ gel vi nhũ tương 15 1.4 Tổng quan số tá dược sử dụng 16 1.4.1 Labrasol 16 1.4.2 Cremophor RH40 16 1.4.3 Cremophor EL 17 1.4.4 Transcutol P 17 1.4.5 Lutrol E 400 17 1.4.6 Plurol oleique CC497 17 1.4.7 Labrafac lipophile 18 ii ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 19 2.1 Đối tượng nghiên cứu 19 2.1.1 Chất chuẩn, hoá chất, dung môi 19 2.1.2 Thiết bị 20 2.2 Phương pháp nghiên cứu 20 2.2.1 Xây dựng công thức đánh giá tính chất DQM 20 2.2.2 Xây dựng thẩm định quy trình định lượng đồng thời diosmin quercetin DQM phương pháp HPLC 23 2.2.3 Xây dựng công thức đánh giá tính chất DQE 28 2.2.4 Xây dựng TCCS DQE 29 KẾT QUẢ 31 3.1 Xây dựng cơng thức đánh giá tính chất DQM 31 3.1.1 Xây dựng công thức DQM 31 3.1.2 Đánh giá tính chất DQM 40 3.2 Xây dựng thẩm định quy trình định lượng đồng thời diosmin quercetin DQM phương pháp HPLC 43 3.2.1 Xây dựng quy trình định lượng đồng thời diosmin quercetin DQM phương pháp HPLC 43 3.2.2 Thẩm định quy trình định lượng đồng thời diosmin quercetin DQM phương pháp HPLC 46 3.3 Xây dựng công thức DQE 54 3.3.1 Động lực học tính chất nhớt – đàn hồi gel vi nhũ tương khảo sát 54 3.3.2 Độ nhớt gel vi nhũ tương nồng độ khảo sát 57 3.3.3 Cơng thức quy trình bào chế DQE 60 3.4 Xây dựng TCCS DQE 62 3.4.1 Xây dựng thẩm định quy trình định lượng đồng thời diosmin quercetin DQE phương pháp HPLC 62 3.4.2 Kết kiểm nghiệm lô DQE 71 3.4.3 Dự thảo TCCS DQE 75 iii BÀN LUẬN 76 4.1 Thành phần vi nhũ tương chứa diosmin quercetin 76 4.2 Thành phần gel vi nhũ tương chứa diosmin quercetin 77 4.3 Xây dựng thẩm định quy trình định lượng đồng thời diosmin quercetin phương pháp HPLC 79 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 81 TÀI LIỆU THAM KHẢO 82 DANH MỤC CƠNG TRÌNH ĐÃ CƠNG BỐ 90 PHỤ LỤC PL-1 iv DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT Từ viết tắt Từ nguyên Ý nghĩa D/N Dầu/Nước Vi nhũ tương dầu nước DLS Dynamic light scattering Kỹ thuật tán xạ ánh sáng động DMSO Dimethyl sulfoxide DQE Diosmin quercetin loaded Gel vi nhũ tương chứa diosmin microemulgel quercetin Diosmin quercetin loaded Vi nhũ tương chứa diosmin microemulsion quercetin HLB Hydrophilic lipophilic balance Hệ số cân dầu nước HPLC High performance liquid Sắc kí lỏng hiệu cao DQM chromatography HPMC Hydroxypropylmethyl cellulose HPS Hydroxypropyl starch LPS Lipopolysaccharide N/D Nước/Dầu Vi nhũ tương nước dầu NaCMC Sodium carboxymethyl cellulose Natri carboxymethyl cellulose NLC Nanostructured lipid carriers Hệ giá mang nano lipid rắn PDI Polydispersity Index Chỉ số đa phân tán PLGA Poly lactide-glycolide RSD Relative standard deviation Độ lệch chuẩn tương đối S/CoS Surfactant/cosurfactant Chất diện hoạt/chất đồng diện hoạt TB Trung bình TCCS Tiêu chuẩn sở TEM Transmission electron microscopy Kính hiển vi điện tử truyền qua UV Ultra violet Tử ngoại Vis Visable Khả kiến VNT Vi nhũ tương v DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1 Các điều kiện HPLC định lượng diosmin công bố Bảng 1.2 Các điều kiện HPLC định lượng quercetin công bố Bảng 2.1 Hoá chất, dung môi sử dụng 19 Bảng 2.2 Thiết bị sử dụng 20 Bảng 2.3 Các điều kiện pha động HPLC khảo sát quy trình định lượng đồng thời diosmin quercetin DQM 24 Bảng 2.4 Nồng độ quercetin diosmin khảo sát tính tuyến tính 26 Bảng 2.5 Yêu cầu tỷ lệ phục hồi tương ứng với nồng độ chất phân tích 27 Bảng 2.6 Thành phần công thức gel khảo sát 28 Bảng 2.7 Các điều kiện pha động HPLC khảo sát quy trình định lượng đồng thời diosmin quercetin DQE 29 Bảng 3.1 Độ tan quercetin diosmin số tá dược (n = 3) 31 Bảng 3.2 Thành phần công thức VNT CT1-CT9 36 Bảng 3.3 Kết kích thước giọt VNT công thức CT1- CT9 (n=3) 37 Bảng 3.4 Kết khảo sát khả tải diosmin quercetin công thức CT1, CT2 CT3 39 Bảng 3.5 Công thức DQM 39 Bảng 3.6 Kết pH DQM 40 Bảng 3.7 Tính tương thích hệ thống quy trình định lượng đồng thời diosmin quercetin DQM phương pháp HPLC 46 Bảng 3.8 Tương quan nồng độ diện tích pic diosmin quercetin 49 Bảng 3.9 Kết xử lý thống kê khảo sát tính tuyến tính quy trình định lượng đồng thời diosmin quercetin DQM phương pháp HPLC 50 Bảng 3.10 Độ xác trung gian quy trình định lượng đồng thời quercetin diosmin DQM phương pháp HPLC 51 Bảng 3.11 Kết khảo sát độ quy trình định lượng đồng thời diosmin quercetin DQM phương pháp HPLC 52 Bảng 3.12 Công thức DQE 60 vi Bảng 3.13 Tính tương thích hệ thống quy trình định lượng đồng thời diosmin quercetin DQE phương pháp HPLC 64 Bảng 3.14 Tương quan nồng độ diện tích pic diosmin quercetin 66 Bảng 3.15 Kết xử lý thống kê khảo sát tính tuyến tính quy trình định lượng đồng thời diosmin quercetin DQE phương pháp HPLC 67 Bảng 3.16 Độ xác trung gian quy trình định lượng đồng thời quercetin diosmin DQE phương pháp HPLC 68 Bảng 3.17 Kết khảo sát độ quy trình định lượng đồng thời diosmin quercetin DQE phương pháp HPLC 69 Bảng 3.18 Kết đo pH lô DQE 72 Bảng 3.19 Hàm lượng diosmin quercetin lô DQE 74 Bảng 3.20 Dự thảo TCCS DQE 75 vii DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 Cơng thức cấu tạo diosmin Hình 1.2 Phổ UV-Vis diosmin Hình 1.3 Công thức cấu tạo quercetin Hình 1.4 Phổ UV- Vis quercetin Hình 3.1 Độ tan quercetin diosmin tá dược dầu (n=3) 32 Hình 3.2 Độ tan quercetin diosmin chất diện hoạt chất đồng diện hoạt (n=3) 32 Hình 3.3 Khả nhũ hố Plurol oleique CC497 chất diện hoạt khảo sát 34 Hình 3.4 Giản đồ pha gồm nước, Plurol oleique CC497, Cremophor RH40/chất đồng diện hoạt (Lutrol E-400 hoặcTranscutol P) 35 Hình 3.5 Hình chụp VNT khảo sát CT1- CT9 36 Hình 3.6 Phân bố kích thước giọt VNT cơng thức CT1-CT9 38 Hình 3.7 Hình chụp (a) VNT placebo (b) DQM 40 Hình 3.8 Biểu đồ độ nhớt DQM theo tốc độ trượt γ 41 Hình 3.9 Hình chụp DQM trước sau thử nghiệm chu kỳ nóng lạnh 41 Hình 3.10 Hình chụp DQM (a) trước (b) sau thử nghiệm ly tâm 42 Hình 3.11 Kích thước giọt DQM 42 Hình 3.12 Thế zeta DQM 43 Hình 3.13 Sắc ký đồ HPLC định lượng đồng thời diosmin quercetin DQM với điều kiện pha động khảo sát 44 Hình 3.14 Sắc ký đồ khảo sát tính đặc hiệu quy trình định lượng đồng thời diosmin quercetin DQM phương pháp HPLC (tR diosmin quercetin 4,7 9,3 phút) 47 Hình 3.15 Độ tinh khiết pic (a) diosmin (b) quercetin quy trình định lượng đồng thời diosmin quercetin DQM phương pháp HPLC 48 Hình 3.16 Tương quan nồng độ diện tích pic diosmin quercetin 49 viii Hình 3.17 Mơ đun tồn trữ G’ mô đun tổn hao G” công thức (a) G1, (b) G2 (c) G3 55 Hình 3.18 Mơ đun tồn trữ G’ mơ đun tổn hao G”của công thức (a) G4, (b) G5 (c) G6 56 Hình 3.19 Biểu đồ độ nhớt theo tốc độ trượt công thức (a) G1, (b) G2 (c) G3 57 Hình 3.20 Biểu đồ độ nhớt theo tốc độ trượt công thức (a) G4, (b) G5 (c) G6 58 Hình 3.21 Biểu đồ so sánh độ nhớt DQM công thức G1, G2 G3 sử dụng tá dược tạo gel nồng độ 0,1% 59 Hình 3.22 Biểu đồ so sánh độ nhớt DQM công thức G4, G5 G6 sử dụng tá dược tạo gel nồng độ 0,2% 59 Hình 3.23 Biểu đồ so sánh độ nhớt công thức G2 G5 60 Hình 3.24 Quy trình bào chế DQE 61 Hình 3.25 Sắc ký đồ HPLC định lượng đồng thời diosmin quercetin DQE với điều kiện pha động khảo sát 62 Hình 3.26 Sắc ký đồ khảo sát tính đặc hiệu quy trình định lượng đồng thời diosmin quercetin DQE phương pháp HPLC (tR diosmin quercetin 5,3 9,4 phút) 65 Hình 3.27 Độ tinh khiết pic (a) diosmin (b) quercetin DQE 66 Hình 3.28 Tương quan nồng độ diện tích pic diosmin quercetin 67 Hình 3.29 Hình chụp DQE (a) lơ 1, (b) lơ (c) lơ 71 Hình 3.30 Kết độ nhớt DQE lô 72 Hình 3.31 Kết độ nhớt DQE lô 72 Hình 3.32 Kết độ nhớt DQE lô 73 Hình 3.33 Kết định tính DQE lơ 73 Hình 3.34 Kết định tính DQE lơ 73 Hình 3.35 Kết định tính DQE lô 74 MỞ ĐẦU Diosmin quercetin hai hoạt chất thuộc nhóm flavonoid, có tác dụng chống oxy hoá, kháng viêm, làm bền thành mạch3,4 Diosmin có tác dụng bảo vệ vi tuần hồn5, bảo vệ thần kinh6 tim mạch7 Quercetin có hoạt tính kháng viêm8, trị suy giãn tĩnh mạch4, chống ung thư9, ngăn ngừa đái tháo đường10 Vì vậy, diosmin quercetin có tiềm ứng dụng bào chế dạng thuốc dùng qua da hỗ trợ điều trị suy giãn tĩnh mạch Dạng thuốc dùng qua da có ưu điểm giúp đưa thuốc trực tiếp đến đích tác động, giảm ảnh hưởng phân huỷ thuốc enzym đường tiêu hoá, giảm chuyển hoá lần đầu qua gan Tuy nhiên, hai hoạt chất diosmin quercetin có độ tan nước kém11,12 Hiện nay, nhiều nghiên cứu thực nhằm cải thiện độ tan hoạt chất sử dụng hệ vi tự nhũ (self microemulsion drug delivery), vi nhũ tương (microemulsion), hệ liposome, hệ NLC (nanostructured lipid carriers) Vi nhũ tương (VNT) dạng bào chế quan tâm nhiều năm gần đây, có khả cải thiện độ tan hoạt chất VNT thể nhiều tính chất trội sở hữu tính bền mặt nhiệt động, quy trình điều chế đơn giản, có khả làm tăng sinh khả dụng thuốc nhờ làm giảm tính đối kháng lớp sừng da Với kích thước pha phân tán nhỏ, diện tích bề mặt lớn, VNT giúp phân phối lượng hoạt chất lớn lên bề mặt da so với dạng bào chế khác dung dịch, lotion kem13 Bào chế VNT dùng da giúp tăng khả hoà tan dược chất tan, bảo vệ hoạt chất, tăng tính thấm qua da, tăng tác dụng chỗ Tuy nhiên, VNT có độ nhớt thấp nên khó bám da Để khắc phục nhược điểm này, VNT gel hóa tác nhân tạo gel phù hợp, tăng lưu giữ thuốc da độ ổn định nhờ làm tăng độ nhớt Gel VNT có khả giúp VNT dễ bám thành lớp mỏng dùng da, tạo cảm giác mềm mịn, dễ chịu, gây nhờn rít, dễ rửa nước14 Vì vậy, đề tài: “Nghiên cứu điều chế gel vi nhũ tương chứa diosmin quercetin (DQE)” thực với mục tiêu nghiên cứu cụ thể sau: Xây dựng cơng thức đánh giá tính chất vi nhũ tương chứa diosmin quercetin (DQM) Xây dựng cơng thức đánh giá tính chất DQE Xây dựng tiêu chuẩn sở (TCCS) DQE TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan diosmin quercetin 1.1.1 Diosmin Danh pháp IUPAC: 5-hydroxy-2-(3-hydroxy-4-methoxyphenyl)-7-[(2S,3R,4S,5S, 6R)-3,4,5-trihydroxy-6-[[(2R,3R,4R,5R,6S)-3,4,5-trihydroxy-6-methyloxan-2-yl] oxymethyl]oxan-2-yl]oxychromen-4-one Tên gọi khác: Diosmetin 7-O-rutinoside, diosmina, diosmine, diosminum Cơng thức phân tử: C28H32O15 Hình 1.1 Cơng thức cấu tạo diosmin Tính chất lý hố Diosmin dạng bột, màu vàng nhạt, không tan nước ethanol, tan DMSO dung dịch kiềm loãng, tan nhiều aceton methanol15 Nhiệt độ nóng chảy: 277-278 oC Khối lượng phân tử: 608,5 g/mol Pka: 6,10 ± 0,40 LogP: 2,05 Diosmin ổn định dung môi methanol16, số công thức gel16 hỗn dịch nano17 Bảo quản diosmin nhiệt độ không 30 oC, tránh ánh sáng trực tiếp17 Định lượng diosmin phương pháp HPLC Phổ UV- Vis diosmin2 trình bày Hình 1.2 Hình 1.2 Phổ UV-Vis diosmin2 Một số điều kiện HPLC định lượng diosmin cơng bố trình bày Bảng 1.1 Bảng 1.1 Các điều kiện HPLC định lượng diosmin công bố Pha động Định lượng Định lượng Định lượng Định lượng diosmin diosmin hesperidin, diosmin trong huyết diosmetin diosmin phức hợp với tương huyết eriocitrin chuột18 tương nước cốt chanh người19 Iran20 Methanol: Methanol: Nước: Methanol: nước nước: acid acid formic acetonitril: acid (65:35) phosphoric 1% (58:42) acetic (30:70:0,2) 340 nm cyclodextrins16 (78: 19: 3) 280 nm 340 nm Cột Hypersil Cột pha đảo Cột C8 (4,6 mm Cột pha đảo C18 (4,6 mm C18 (3 mm × 250 mm, (4,6 mm × 250 × 250 mm, × 150 mm, μm) mm, μm) μm) μm) Nhiệt độ cột 25 oC 40 oC 25 oC 25 oC Tốc độ dòng mL/phút 0,5 mL/phút 0,8 mL/phút mL/phút Bước sóng 340 nm phát Cột sắc kí Tác dụng dược lý Tác dụng kháng viêm: Diosmin làm giảm phản ứng viêm21, làm giảm trình hình thành tình trạng viêm bệnh nhân bị rối loạn tĩnh mạch mãn tính3 Tác dụng bảo vệ vi tuần hồn: Diosmin có tác dụng chống lại tổn thương liên quan đến vi tuần hoàn da5 Tác dụng chống oxy hố: Diosmin có khả chống oxy hóa, ngăn chặn tác hại xạ tia cực tím22, bảo vệ tế bào lympho khỏi tổn thương xạ gamma gây ra23 Tác dụng ngăn ngừa đái tháo đường: Diosmin có khả cải thiện tình trạng tăng đường huyết, thúc đẩy tiết β-endorphin, điều chỉnh cân nội môi21 Tác dụng chống ung thư: Diosmin có tác dụng chống lại số dịng tế bào khối u24, tế bào ung thư vú25, làm giảm xuất yếu tố thúc đẩy khối u sớm26 Tác dụng bảo vệ gan: Diosmin phục hồi tình trạng thiếu oxy, viêm, giãn mạch hội chứng gan phổi27, giảm độc tính aflatoxin gây hại cho gan28 Diosmin có khả bảo vệ gan khỏi độc tính rượu29, giảm rối loạn cân nội môi gan nhiễm mỡ30 Tác dụng bảo vệ thần kinh: Diosmin có tác dụng an thần cải thiện giấc ngủ31, làm giảm đau thần kinh32, bảo vệ thần kinh, trí nhớ chấn thương sọ não6 Tác dụng bảo vệ tim mạch: Diosmin có tác dụng hạ huyết áp33, chống kết tập tiểu cầu34, bảo vệ tim mạch7 Tác dụng bảo vệ thận: Diosmin có tác dụng bảo vệ thận35, giảm lắng đọng canxi oxalat thối hóa cầu thận, ống thận36 Một số nghiên cứu dạng bào chế nano chứa diosmin Năm 2020, H Om cộng tiến hành nghiên cứu cải thiện độ tan diosmin Diosmin tải lên hai khung matrix cao phân tử, gồm tinh bột hydroxypropyl (HPS) poly lactide-glycolide-chitin (PLGA/chitin) để điều chế hạt nano diosmin Kết quả, phương pháp làm bay nhũ tương-dung môi tạo hạt nano diosmin hệ PLGA/chitin, phương pháp trung hòa axit-bazơ tạo hạt nano diosmin hệ HPS37 Năm 2017, R Kamel cộng tiến hành nghiên cứu cải thiện độ tan diosmin Trong nghiên cứu này, chất mang dạng keo lipoid sử dụng để tải diosmin, kết hợp với tinh dầu Tinh dầu hương thảo, tinh dầu gừng, tinh dầu hạt nho khảo sát Kết thu cấu trúc nano diosmin ổn định, bảo vệ tốt hoạt chất, có tác dụng chống oxy hố, bảo vệ da an toàn, hiệu quả22 Năm 2013, M S Freag cộng nghiên cứu phát triển hạt nano cho diosmin Kết thu kích thước tiểu phân rắn nano diosmin tối ưu với tỷ lệ diosmin: HPMC (2:1) điều chế kỹ thuật trung hòa gốc axit, cải thiện độ tan khả thẩm thấu diosmin11 1.1.2 Quercetin Danh pháp IUPAC: 2- (3,4-dihydroxyphenyl) -3,5,7-trihydroxy-4H-chromen-4-one Tên gọi khác: 3,3 ', 4', 5,7-pentahydroxyflavone, sophoretin, xanthaurine Công thức phân tử: C15H10O7 Hình 1.3 Cơng thức cấu tạo quercetin Tính chất lý hố Quercetin dạng bột, màu vàng, không tan nước lạnh, tan nước nóng, tan tốt methanol ethanol Nhiệt độ nóng chảy: 316,5 oC Khối lượng phân tử: 302,2 g/mol Pka: 6,44 LogP: 2,16 Quercetin không bền xạ tia UV38 Bảo quản quercetin nhiệt độ không 30 oC, tránh ánh sáng trực tiếp38 Định lượng quercetin phương pháp HPLC Phổ UV- Vis quercetin trình bày Hình 1.4 Hình 1.4 Phổ UV- Vis quercetin1 Một số điều kiện HPLC định lượng quercetin cơng bố trình bày Bảng 1.2 Bảng 1.2 Các điều kiện HPLC định lượng quercetin cơng bố Pha động Bước sóng Định lượng Định lượng Định lượng Định lượng quercetin quercetin quercetin quercetin chế phẩm huyết hỗn hợp VNT42 liposome39 tương chuột40 flavonoid41 Acetonitril : Acetonitril: Acetonitril: Methanol: dung dịch acid acid formic nước (60:40) KH2PO4 0,01M tricloroacetic 0,3% (25:75) (50:50) 0,3% (50:50) 368 nm 254 nm 350 nm 258 nm Cột Eurospher Cột Supelcosil Cột pha đảo Cột pha đảo C18 (250 mm x C18 (250 mm x C18 (150 mm C18 (250 mm mm, µm) 4,6 mm, µm) × 2,0 mm, × 4,6 mm, µm) µm) 0,5 mL/phút 0,8 mL/phút phát Cột sắc ký 0,5 mL/phút Tốc độ dòng 0,9 mL/phút Tác dụng dược lý Tác dụng chống oxy hóa: Quercetin flavonoid có tính chống oxy hoá mạnh Tác dụng chống oxy hoá quercetin nhờ vào trình giảm gốc tự do8 Tác dụng chống ung thư: Tác dụng chống ung thư quercetin dựa vào khả làm giảm tăng sinh ức chế trình phân bào tế bào ung thư9 Tác dụng chống viêm: Quercetin có khả ức chế sản xuất TNF-α đại thực bào, ức chế sản xuất cytokine tiền viêm ức chế kết tập bạch cầu phản ứng viêm8 Tác dụng ngăn ngừa đái tháo đường: Quercetin có tác dụng ngăn ngừa đái tháo đường nhờ làm giảm triglycerid, cholesterol, tăng High Density Lipoprotein10 Tác dụng giảm đau: Quercetin có khả giảm đau nhờ ức chế sản xuất thụ thể trung gian gây cân oxy hóa43 Ngồi ra, quercetin cịn chất có tác dụng bảo vệ thần kinh44 Một số nghiên cứu dạng bào chế nano chứa quercetin Năm 2017, Xia Lv cộng nghiên cứu bào chế VNT cải thiện độ tan quercetin VNT placebo bao gồm Cremophor EL/1,2-propanediol/tinh dầu (47:23:30) Trong đó, tinh dầu khảo sát tinh dầu bạc hà, đinh hương, hương thảo Kết thu VNT tinh dầu chứa quercetin, cải thiện độ tan, độ ổn định pH, tính ổn định quang học tính thấm qua da quercetin45 Năm 2016, G H Lee cộng bào chế hạt nano silico quercetin có tác dụng chống oxy hố, kháng viêm Quercetin hồ tan n- butyl, sau hỗn hợp phân tán vào nước cất hai lần Các hạt micell điều chế cách sử dụng chất diện hoạt Aerosol-OT (AOT hay natri bis (2-ethylhexyl) sulfosuccinate)8 Năm 2016, Azar Kajbafvala cộng phát triển công thức VNT dùng da, cải thiện độ tan quercetin Tween 80 sử dụng làm chất diện hoạt, Transcutol P sử dụng làm chất đồng diện hoạt, axit oleic sử dụng làm pha dầu Kết thu VNT D/N, hạt nano thân dầu chứa quercetin hình cầu, ổn định nước, có tiềm ứng dụng công thức kem chống nắng46 Năm 2012, nhằm tăng cường khả thấm qua quercetin, R Censi cộng tiến hành nghiên cứu điều chế công thức VNT quercetin Thành phần gồm pha nước nước cất, pha dầu Labrafil, chất diện hoạt Labrasol, chất tăng thấm Transcutol P Quercetin hoà tan VNT nồng độ 1% Kết thu VNT quercetin 1% cải thiện khả thấm qua da47 Năm 2009, với mục tiêu sử dụng quercetin da, S Kitagawa cộng nghiên cứu điều chế công thức VNT quercetin Pha dầu sử dụng isopropyl myristat, pha nước dung dịch NaCl, chất diện hoạt Tween 80, chất đồng diện hoạt ethanol Kết thu VNT chứa quercetin có độ tan cải thiện12 1.1.3 Tác dụng dược lý phối hợp diosmin quercetin Năm 2018, Italo Corsale cộng nghiên cứu tác dụng điều trị bệnh trĩ hỗn hợp flavonoid có diosmin, quercetin đường uống Nhóm nghiên cứu tiến hành 154 bệnh nhân mắc bệnh trĩ Nhóm thử nghiệm gồm 78 người chọn ngẫu nhiên để nhận hỗn hợp diosmin 150 mg, quercetin 150 mg, troxerutin 300 mg, hesperidin 150 mg, rutin 250 mg dùng đường uống Nhóm đối chứng gồm 76 người nhận hỗn hợp diosmin 450 mg, hesperidin 50 mg dạng vi phân tinh khiết dùng đường uống Trong suốt thời gian nghiên cứu, tình trạng chảy máu cải thiện sau tháng nhóm nghiên cứu (79,5 70,5%) nhóm đối chứng (80,2 75%), khơng có khác biệt đáng kể hai nhóm Hỗn hợp flavonoid biện pháp an toàn hiệu để kiểm soát chảy máu bệnh trĩ, làm bền thành mạch, co búi trĩ, co mạch máu suy giãn tĩnh mạch48 1.2 Tổng quan VNT 1.2.1 Định nghĩa phân loại VNT Định nghĩa VNT hệ phân tán siêu vi dị thể, gồm pha dầu pha nước phân tán đồng nhất, ổn định phân tử chất diện hoạt bề mặt phân cách hai pha VNT có tính đẳng hướng mặt quang học, ổn định mặt nhiệt động học, bền, suốt 10 mờ, tiểu phân phân tán kích thước giọt keo13,14 (colloidal dimension), kích thước khoảng từ 10-200 nm49 Phân loại VNT Tùy thuộc vào tỷ lệ thành phần công thức, VNT chia thành hai loại phổ biến: VNT dầu nước (D/N) VNT nước dầu (N/D)13,14 1.2.2 Thành phần cấu tạo VNT VNT có thành phần pha dầu với chất hồ tan dầu; pha nước với chất tan nước; chất diện hoạt chất đồng diện hoạt Các chất diện hoạt đồng diện hoạt đóng vai trị tác nhân hình thành ổn định VNT cách giảm sức căng bề mặt phân cách hai pha Pha dầu Pha dầu thành phần quan trọng VNT Pha dầu gồm chất lỏng không phân cực dầu lạc, dầu đậu tương, dầu hướng dương, isopropyl myristat, triglycerid mạch cacbon trung bình, acid oleic Dầu với chuỗi hydrocarbon ngắn dễ tạo VNT dầu có chuỗi hydrocarbon dài50 Khả hịa tan chất tan dầu tỷ lệ thuận với chiều dài chuỗi hydrocarbon Pha nước Pha nước bao gồm chất lỏng phân cực nước thơm, nước sắc, nước hãm, ethanol, glycerol… dược chất chất phụ dễ hòa tan chất lỏng trên13,14 Trong phần lớn nghiên cứu, nước cất sử dụng làm pha nước Chất diện hoạt Chất diện hoạt chất có khả làm giảm sức căng bề mặt phân cách pha, tạo lớp áo bảo vệ xung quanh tiểu phân pha phân tán, giúp hình thành VNT51 Hệ số cân dầu – nước (HLB) thường sử dụng để lựa chọn chất diện hoạt cho công thức VNT HLB chất diện hoạt chọn phải phù hợp với HLB pha dầu hệ52 Chất diện hoạt khơng ion hóa Các chất diện hoạt khơng ion hóa thường sử dụng cơng thức VNT khả nhũ hóa tốt, độ kích ứng độc tính thấp, tương thích với thành phần 11 khác trình điều chế VNT không bị ảnh hưởng pH53 Một số chất diện hoạt khơng ion hóa thường sử dụng Tween, Span, Labrasol, Cremophor RH40, Cremophor EL Chất diện hoạt lưỡng cực Các chất diện hoạt anion, cation hay khơng ion hóa, tùy thuộc vào mức độ acid dung dịch diện thành phần khác Phospholipid chất diện hoạt lưỡng cực phổ biến sử dụng điều chế VNT54 Chất diện hoạt ion hóa Chất diện hoạt ion hóa sử dụng bị ảnh hưởng pH hay nồng độ chất điện giải Chất diện hoạt ion hóa có loại: anionic cationic:  Chất diện hoạt anionic như: natri stearat, calci oleat, natri lauryl sulfat…  Chất diện hoạt cationic như: cetrimonium bromid, hexadexyl pyridium clorid… Ngồi ra, phối hợp chất diện hoạt khác loại với nhau, ví dụ chất diện hoạt khơng ion hóa ion hóa làm gia tăng vùng tạo VNT Thời gian hình thành VNT kích thước tiểu phân giảm đáng kể phối hợp hai chất diện hoạt55 Chất đồng diện hoạt Trong hầu hết trường hợp, sử dụng chất diện hoạt khơng đủ khả làm giảm sức căng bề mặt phân cách pha dầu pha nước để hình thành VNT Vì vậy, phối hợp thêm chất đồng diện hoạt làm giảm sức căng liên bề mặt hai pha, giúp hệ bền vững, ổn định động học13,14 Vai trò chất đồng diện hoạt:  Cùng với chất diện hoạt làm giảm sức căng bề mặt phân cách hai pha dầu pha nước  Làm tăng độ linh hoạt bề mặt phân cách pha, thúc đẩy trình hình thành VNT bền vững  Làm thay đổi hệ số phân bố dược chất hai pha dầu-nước hệ VNT, ảnh hưởng đến vùng tạo VNT khả giải phóng dược chất 12 1.2.3 Ưu nhược điểm hệ VNT Ưu điểm VNT có khả cải thiện độ tan, làm tăng sinh khả dụng dược chất, áp dụng vào số dạng bào chế viên nang, thuốc dùng da Chất diện hoạt chất đồng diện hoạt VNT làm giảm tính đối kháng hàng rào khuếch tán biểu bì, giúp dược chất thấm qua da dễ dàng Thêm vào đó, VNT có khả bảo vệ dược chất cao, làm tăng độ ổn định dược chất, dạng thuốc có độ ổn định nhiệt động học cao, bền vững Kỹ thuật bào chế VNT đơn giản Ngồi ra, VNT dùng để bào chế dạng thuốc có tác dụng kéo dài13,14 Nhược điểm VNT sử dụng lượng chất diện hoạt cao55, có khả gây kích ứng Bên cạnh đó, tính ổn định VNT bị ảnh hưởng thông số nhiệt độ, giá trị pH mơi trường56 VNT có khả hịa tan dược chất giới hạn Giá thành VNT cao 1.2.4 Một số tiêu chí đánh giá VNT Cảm quan Trong suốt mờ, ánh sáng truyền qua Độ bền vật lý Được khảo sát thông qua chu kì sốc nhiệt q trình ly tâm Kích thước tiểu phân VNT có kích thước tiểu phân khoảng từ 10-200 nm49 Đánh giá cách chụp hình kính hiển vi điện tử truyền qua (Transmission electron microscopy TEM) đo máy phân tích với kỹ thuật tán xạ ánh sáng động (Dynamic light scattering - DLS) Thế zeta Thế zeta phản ánh điện tích bề mặt giọt VNT Lực đẩy tĩnh điện giọt VNT làm chậm trình kết tụ Đây lý zeta thường xem xét số ổn định VNT57 13 1.3 Tổng quan gel 1.3.1 Định nghĩa phân loại gel Gel dạng thuốc chất mềm, dùng da niêm mạc nhằm mục đích bảo vệ da niêm mạc đưa thuốc thấm qua da Thành phần gel gồm hay nhiều hoạt chất, hòa tan hay phân tán đồng hỗn hợp tá dược, chất lỏng, gel hóa nhờ tác nhân tạo gel thích hợp Có hai loại gel:  Gel thân nước: thành phần gồm nước, glycerin, propylen glycol tá dược tạo gel polysaccharid (tinh bột, tinh bột biến tính, natri alginat), dẫn chất cellulose, polyme acid acrylic (carbomer, carbomer copolymer, carbomer interpolymer, methyl acrylat) chất vô (magnesinhôm silicat)…  Gel thân dầu: thành phần gồm dầu parafin phối hợp với polyethylen, dầu béo tá dược tạo gel oxyd silic keo, xà phịng nhơm xà phịng kẽm13,14… 1.3.2 Ưu nhược điểm gel Ưu điểm Gel có khả dễ bám thành lớp mỏng bơi lên da, gây nhờn rít, dễ dàng rửa nước Tính ứng dụng gel cao, quy trình điều chế đơn giản, khơng địi hỏi thiết bị phức tạp Gel có tính ổn định cao so với dạng bào chế khác dùng da, tránh tượng hút ẩm thuốc bột, đảo pha tách pha dạng kem, trở mùi thuốc mỡ, kem nhũ tương Với mục tiêu dùng da, gel tiếp xúc trực tiếp với tác nhân gây bệnh đưa dược chất đến đích tác động da Do đó, hiệu trị liệu cao có tác dụng phụ tồn thân14 Nhược điểm Gel gây kích ứng da, khơ da Sự hấp thu hoạt chất từ gel thay đổi nhiều cá thể hay cá thể phụ thuộc vào nhiều yếu tố Ngoài ra, gel dễ bị nấm mốc, vi khuẩn xâm nhập, dễ bị khô cứng trình bảo quản14 14 1.3.3 Một số tiêu chí đánh giá tính chất gel Cảm quan: đồng nhất, khơng có mùi lạ, khơng biến màu, khơng cứng lại hay tách lớp điều kiện thường, không chảy lỏng nhiệt độ 37 oC phải bắt dính da hay niêm mạc bơi pH: xác định pH gel máy đo pH Đánh giá động lực học tính chất nhớt – đàn hồi: Trong phép đo đánh giá động lực học tính chất nhớt – đàn hồi, đại lượng mô đun phức hợp G* (complex modulus) với ý nghĩa tổng sức cản chống lại biến dạng áp lực lên mẫu đo Mô đun G* cấu thành hai đại lượng mô đun tồn trữ G’ (store modulus) mô đun tổn hao G” (loss modulus)58 biểu thị phương trình số phức sau: G* = G’ + iG” Với: G’ = 𝜎/ 𝛾 * cosδ G” = 𝜎/ 𝛾 * sinδ Trong đó: σ ứng suất trượt γ tốc độ trượt δ góc dời pha biến dạng ứng suất (0 < δ < 90 o) Tính chất vật lý: điểm nhỏ giọt, điểm đơng đặc Đánh giá in vitro tính thấm gel: phương pháp khuếch tán qua gel, phương pháp dùng màng bán thấm14 Các tính chất khác: độ xuyên sâu, khả bám dính, khả chảy khỏi tuýp, độ dàn mỏng, độ đồng 1.3.4 Một số tá dược tạo gel thường dùng Carbopol: sản phẩm trùng hợp acid acrylic, thường dạng bột trắng không tan tan nước trương nở nước tạo thể chất gel, có pH acid Khi trung hòa kiềm làm tăng độ nhớt gel Nồng độ sử dụng 0,5-5% Tương kỵ với phenol, polymer cationic, acid mạnh nồng độ cao chất điện giải; bị giảm độ nhớt tiếp xúc tia UV phản ứng oxy hóa Hydroxypropylmethyl cellulose (HPMC): dẫn chất cellulose, có dạng bột màu trắng trắng ngà, không mùi, vị đắng; tan nước lạnh tạo dung dịch 15 keo, thực tế khơng tan nước nóng ethanol So với methylcellulose, gel tạo thành HPMC có độ suốt tốt chứa sợi khơng tan Ngồi ra, HPMC cịn đóng vai trị chất nhũ hóa chất ổn định HPMC tương kỵ với số tác nhân oxy hóa, khơng tạo phức với muối kim loại Natri carboxymethyl cellulose (NaCMC): dẫn chất cellulose, thường dùng với nồng độ - 5% cần thêm 10 – 20% chất giữ ẩm Tương kỵ với acid mạnh, ion kim loại (sắt, nhôm, thủy ngân, kẽm), gôm xanthan Natri alginat: điều chế từ muối kiềm acid alginic rong biển Nồng độ thường dùng từ – 10%, gel bền pH – 10 Thể chất gel thay đổi tùy nồng độ gel, tăng độ nhớt cách thêm muối calci (calci citrat, calci clorid ) Các poloxamer: copolymer nonionic polyoxyethylen polyoxypropylen, tan ethanol, isopropyl palmitat, propylen glycol, nước, không tan dầu Nồng độ tạo gel từ 15 – 50% Ngồi ra, poloxamer cịn dùng tác nhân nhũ hóa tăng độ tan59 1.3.5 Một số nghiên cứu ứng dụng hệ gel vi nhũ tương Trong nước Năm 2018, Nguyễn Thị Kim Liên, Lê Xuân Trường, Trần Văn Thành nghiên cứu thành công dạng bào chế gel VNT chứa cao rau đắng đất VNT placebo có thành phần gồm Isopropyl Myristat, Tween 20/ Span 80 (5:1) nước, tỷ lệ 5:50:45 Công thức tải lượng hoạt chất nhiều 20%, đạt yêu cầu cảm quan, độ bền, pH 4,42, kích thước giọt trung bình 14,1 nm với số đa phân tán 0,089 zeta -3,3 mV Công thức VNT tối ưu gel hóa HPMC với tỷ lệ 5% (kl/kl) cho chế phẩm gel đạt tiêu hóa lý thể hoạt tính kháng P aeruginosa thử nghiệm in vitro đĩa thạch60 Ngoài nước Năm 2021, Pratikkumar Patel cộng nghiên cứu dạng bào chế gel VNT dùng da điều trị parkinson Nhóm nghiên cứu khảo sát rasagilin mesylat, hoạt chất điều trị bệnh parkinson, hệ gel VNT Các thí nghiệm độ thẩm thấu in vitro, tính kích ứng da thỏ, thử nghiệm tác dụng mơ hình chuột mắc 16 bệnh parkinson, chứng minh chế phẩm có hiệu điều trị triệu chứng parkinson Kết thu gel VNT rasagilin mesylat kích thước giọt 171,8 nm dùng da, có tiềm phát triển dạng thuốc điều trị parkinson49 Năm 2019, Jayanti P Gokhale cộng nghiên cứu công thức gel vi nhũ tương chứa quercetin trị viêm khớp dạng thấp Công thức phát triển kỹ thuật gel hoá VNT Thành phần gồm pha dầu phối hợp dầu arachis axit oleic (15%), chất diện hoạt tween 20 (6%) chất đồng diện hoạt PEG-400 (6%) Kết thu gel vi nhũ tương quercetin 0,01% có tác dụng ức chế sản xuất chất gây viêm không gây độc tế bào hoạt dịch42 Năm 2019, Javed Ahmad cộng nghiên cứu công thức gel vi nhũ tương dùng da Nhóm nghiên cứu khảo sát bào chế gel vi nhũ tương chứa thymol, đánh giá ổn định nhiệt động học, kích thước giọt trung bình, zeta, hàm lượng thuốc khuếch tán thuốc in vitro Kết thu gel vi nhũ tương chứa thymol tối ưu hóa, có kích thước giọt 13,60 ± 0,117 nm với PDI (Polydispersity Index) 0,197 ± 0,008, có tiềm phát triển dạng thuốc dùng da61 1.4 Tổng quan số tá dược sử dụng 1.4.1 Labrasol Labrasol gọi Caprylocaproyl polyoxylglycerides, chất lỏng không màu, tan nước, ethanol, chloroform, methylen clorid, khơng tan dầu Labrasol có vai trị tác nhân nhũ hố, chất diện hoạt khơng ion hố, tác nhân tăng thấm, chất làm tăng độ tan tác nhân hình thành phóng thích chậm Labrasol thường ứng dụng làm chất tự nhũ hóa tăng độ tan dược chất dạng bào chế đường uống dùng da59 1.4.2 Cremophor RH40 Cremophor RH40 (dầu thầu dầu poluoxyl 40 hydro hoá) chất lỏng, sánh, màu trắng, trắng đục vàng, tạo dung dịch suốt, đồng nước, ethanol, 2-propanol, ethyl acetat, chloroform Cremophor RH40 chất diện hoạt khơng ion hố, có thành phần gồm ester acid béo với glycerol 17 polyethylen glycol Cremophor RH40 đóng vai trị chất nhũ hố cơng thức dược phẩm dạng uống, bơi tiêm, đồng thời có vai trị làm tăng độ tan gây thấm59 1.4.3 Cremophor EL Cremophor EL chất diện hoạt khơng ion hóa, chất lỏng, suốt, màu vàng nhạt, tan nước ethanol Cremophor EL ứng dụng nhiều ngành dược với vai trị làm chất nhũ hóa, chất làm tăng độ tan bảo vệ hoạt chất thân dầu59 1.4.4 Transcutol P Transcutol P chất lỏng không màu, dễ tan nước, ethanol, tan phần dầu thực vật, khơng tan dầu khống Transcutol P dung mơi hịa tan tốt hoạt chất tan nước Độ nhớt Transcutol P thấp có mùi đặc trưng Transcutol P làm tăng tính thấm làm giảm kết tụ hoạt chất Là tá dược đa chức năng, Transcutol P ứng dụng làm chất đồng diện hoạt đồng dung môi nhiều dạng bào chế dùng qua da, để cải thiện tính thấm độ tan hoạt chất47 1.4.5 Lutrol E 400 Lutrol E 400 (Polyethylene glycol) cịn gọi PEG 400, có tính thân nước, ổn định, bị phân huỷ nhiệt độ, pH, khơng gây kích ứng ứng da Lutrol E-400 sử dụng rộng rãi thuốc dùng ngoài, đường uống, đường tiêu hóa, nhãn khoa trực tràng Lutrol E 400 dạng lỏng sử dụng chất đồng dung mơi tan nước, có khả hịa tan tốt dược chất tan nước Khi sử dụng viên nang gelatin mềm, Lutrol E 400 làm cứng vỏ nang hấp thu độ ẩm từ gelatin vỏ nang59 1.4.6 Plurol oleique CC497 Plurol oleique CC497 este đơn chức acid oleic polyme glycerin chứa trung bình ba đơn vị glycerin Plurol oleique CC497 ứng dụng làm pha dầu dạng bào chế dùng đường uống dùng nhũ tương, vi nhũ tương, vi tự nhũ59 18 1.4.7 Labrafac lipophile Labrafac lipophile triglycerid mạch carbon trung bình acid béo C8 C10 (đặc biệt dầu dừa dầu hạt cọ) Labrafac lipophile chất lỏng không bị ôi khét nước Labrafac lipophile thường sử dụng pha dầu chế phẩm uống dùng hệ vi tự nhũ, nhũ tương, VNT, hỗn dịch, kem, thuốc mỡ thuốc đạn59 19 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Đối tượng nghiên cứu 2.1.1 Chất chuẩn, hố chất, dung mơi Chất chuẩn: Diosmin chuẩn làm việc (hàm lượng 98,51%) quercetin chuẩn làm việc (hàm lượng 98,92%) cung cấp Khoa Dược, Đại học Y Dược Thành Phố Hồ Chí Minh Hố chất, dung mơi sử dụng nghiên cứu trình bày Bảng 2.1 Bảng 2.1 Hố chất, dung mơi sử dụng Hố chất, dung mơi Nguồn gốc Acetonitril Macron, Hà Lan Methanol Merck, Đức DMSO Merck, Đức Miglyol 812N Gattefosse, Pháp Labrafac PG Gattefosse, Pháp Labrafac CC Gattefosse, Pháp Labrafac lipophile Gattefosse, Pháp Capryol 90 Gattefosse, Pháp Plurol oleique CC497 Gattefosse, Pháp Maisine Gattefosse, Pháp Labrasol Gattefosse, Pháp Cremophor RH40 Gattefosse, Pháp Cremophor EL Gattefosse, Pháp Lutrol E-400 Gattefosse, Pháp Transcutol P Gattefosse, Pháp HPMC Seppic S.A., Pháp Sepimax Zen Seppic S.A., Pháp Seponov Derm Seppic S.A., Pháp 20 2.1.2 Thiết bị Thiết bị sử dụng nghiên cứu trình bày Bảng 2.2 Bảng 2.2 Thiết bị sử dụng Tên thiết bị Model Nơi sản xuất Cân phân tích số lẻ Satorius CPA224S Đức Cân phân tích số lẻ Satorius CP225D Đức Hệ thống sắc ký lỏng Azura hiệu cao (HPLC) Knauer, Đức Bể siêu âm Branson 3800 Pháp Tủ sấy Memmert ULM 500 Đức Máy khuấy từ VELP Italy Máy đo kích thước giọt ZS Zen 3600 zeta Malvern, Anh Máy đo pH Mettler Toledo Mỹ Máy đo lưu biến Haake Viscotester iQ Đức Máy ly tâm Hettich MIKRO 200 Đức Nồi cách thuỷ Memmert WB14 Đức Phần mềm vẽ giản đồ pha Sigma plot 14.5 Mỹ 2.2 Phương pháp nghiên cứu 2.2.1 Xây dựng công thức đánh giá tính chất DQM Khảo sát độ tan quercetin diosmin tá dược Khảo sát độ tan quercetin tá dược Độ tan quercetin tá dược dầu (Miglyol 812N, Labrafac PG, Labrafac CC, Labrafac lipophile, Capryol 90, Plurol oleique CC497, Maisine), chất diện hoạt (Labrasol, Cremophor RH40, Cremophor EL) chất đồng diện hoạt (Lutrol E400, Transcutol P) xác định phương pháp bão hòa47 21 Tiến hành: Cho vào mL tá dược lượng dư quercetin, siêu âm lắc nhiệt độ phòng 48 Lọc qua màng lọc milipore 0,22 μm để loại quercetin khơng tan, thu dung dịch quercetin bão hịa tá dược Pha lỗng quercetin bão hịa tá dược vào bình định mức mL hỗn hợp dung môi methanol:DMSO tỷ lệ 8:2 đến nồng độ phù hợp (tuỳ theo thử nghiệm), lọc qua màng lọc milipore 0,22 μm tiến hành định lượng phương pháp HPLC Độ tan quercetin tá dược tính theo công thức: Cquer = ẩ x C chuẩn quer x độ pha loãng x độ tinh khiết chuẩn Trong đó: Cquer (μg/mL): Độ tan quercetin tá dược Sthử Schuẩn: Diện tích pic quercetin mẫu thử mẫu chuẩn Cchuẩn quer(μg/mL): Nồng độ quercetin mẫu chuẩn Khảo sát độ tan diosmin tá dược Tiến hành tương tự phương pháp khảo sát độ tan quercetin tá dược Khảo sát lựa chọn pha dầu Từ kết khảo sát độ tan tá dược dầu, lựa chọn dầu có khả hịa tan đồng thời quercetin diosmin tối ưu Khảo sát lựa chọn chất diện hoạt Phối hợp dầu chọn với chất diện hoạt (Labrasol, Cremophor RH40, Cremophor EL) theo tỷ lệ 3:7 (kl/kl) pha loãng 100 lần với nước cất, khuấy để yên 15 phút So sánh độ VNT tạo thành Chọn chất diện hoạt có khả phối hợp với dầu tạo thành VNT trong mờ Khảo sát lựa chọn chất đồng diện hoạt Xây dựng giản đồ pha phương pháp chuẩn độ nước (water titration) gồm pha nước, dầu chọn, chất diện hoạt chọn/ chất đồng diện hoạt khảo sát (Transcutol P Lutrol E-400) theo thành phần tỷ lệ sau:  Tỷ lệ chất diện hoạt / chất đồng diện hoạt (S/CoS) 2:1; 3:1; 4:1 (kl/kl) 22  Tỷ lệ dầu / (S/CoS) 1:9; 2:8; 3:7; 4:6; 5:5; 6:4; 7:3, 8:2, 9:1 (kl/kl) Hỗn hợp đồng suốt mờ xem VNT Dùng phần mềm SigmaPlot 14.5 để vẽ giản đồ pha Dựa vào giản đồ pha, chọn chất đồng diện hoạt tạo vùng VNT rộng Lựa chọn công thức DQM Khảo sát khả tải quercetin diosmin số công thức VNT tiềm phương pháp bão hoà Lựa chọn cơng thức có khả tải quercetin diosmin tối ưu Đánh giá tính chất DQM Cảm quan Quan sát mắt thường mức độ suốt mờ, có khả cho ánh sáng truyền qua cơng thức VNT pH Pha lỗng VNT 20 lần nước cất đun sôi để nguội, xác định pH công thức VNT khảo sát máy đo pH, lặp lại lần với công thức61 Độ nhớt Khảo sát tính chất lưu biến DQM máy đo lưu biến Viscotester iQ (Thermo Fisher Scientific, Đức) với đĩa song song P35Ti, khoảng cách đĩa mm, lượng mẫu đo mL Chế độ đo trượt liên tục – kiểm soát tốc độ trượt Khoảng khảo sát tốc độ trượt 0,01 – 100 s-1, nhiệt độ đo 25 oC Độ bền vật lý Chu kỳ nóng lạnh Cơng thức VNT khảo sát cho vào eppendorf, thực chu kỳ nóng lạnh, chu kỳ bao gồm giai đoạn: ± oC 48 45 ± oC 48 Ghi nhận cảm quan, độ bền VNT khảo sát42 Ly tâm Tiến hành ly tâm công thức VNT khảo sát với tốc độ 10000 vòng/phút 30 phút nhiệt độ 25 ± oC46 Ghi nhận tách lớp (nếu có) 23 Kích thước tiểu phân Kích thước tiểu phân, số đa phân tán phân tích phương pháp tán xạ ánh sáng động (Dynamic light scattering) Các cơng thức VNT khảo sát pha lỗng 10 lần nước cất Sau đó, tiến hành đo kích thước giọt hệ số đa phân tán máy đo Malvern Zetasizer Nano – ZS Zen 360045 2.2.2 Xây dựng thẩm định quy trình định lượng đồng thời diosmin quercetin DQM phương pháp HPLC Xây dựng quy trình định lượng đồng thời diosmin quercetin DQM phương pháp HPLC Chuẩn bị mẫu Mẫu chuẩn: - Dung dịch chuẩn gốc (hỗn hợp quercetin chuẩn nồng độ 20 μg/mL diosmin chuẩn nồng độ 10 μg/mL): cân xác khoảng mg quercetin mg diosmin cho vào bình định mức 100 mL, thêm khoảng 80 mL hỗn hợp dung môi methanol:DMSO tỷ lệ 8:2, siêu âm 10 phút, bổ sung hỗn hợp dung môi tới vạch - Dung dịch chuẩn (nồng độ quercetin 1,428 µg/mL, nồng độ diosmin 0,714 µg/mL): cho 714 µL dung dịch chuẩn gốc cho vào bình định mức 10 mL, thêm mL hỗn hợp dung môi methanol:DMSO tỷ lệ 8:2, siêu âm 10 phút, bổ sung vừa đủ dung môi tới vạch, lọc qua màng lọc 0,22 μm Mẫu thử: Cân xác khoảng 0,0714 g DQM vào bình định mức mL, thêm khoảng mL dung môi methanol:DMSO 8:2, siêu âm 10 phút, bổ sung hỗn hợp dung môi tới vạch, lọc qua màng lọc 0,22 µm Khảo sát điều kiện sắc kí HPLC Lựa chọn cột sắc ký nhiệt độ cột: Tham khảo tài liệu sắc ký HPLC công bố quercetin62 diosmin18, kết hợp với trang thiết bị sẵn có, điều kiện khởi đầu để định lượng đồng thời quercetin diosmin sau:  Máy HPLC Azura (Knauer, Đức)  Cột pha đảo: Thermo Scientific Syncronis C18 (250 x 4,6 mm; μm)  Tiền cột C18 HQ105 (4 x 10 mm; µm) 24  Nhiệt độ cột: 30 oC  Đầu dò UV-Vis Lựa chọn bước sóng phát hiện: Tham khảo tài liệu phổ UV – Vis quercetin39,1 diosmin18,2 để chọn bước sóng phát đồng thời hai chất Khảo sát pha động: Tiến hành thực nghiệm số điều kiện pha động HPLC khác (Bảng 2.3) để chọn điều kiện pha động tách hoàn toàn hai pic quercetin diosmin tách khỏi tạp chất, đảm bảo thông số sắc ký nằm giới hạn cho phép Bảng 2.3 Các điều kiện pha động HPLC khảo sát quy trình định lượng đồng thời diosmin quercetin DQM Thời gian (phút) Nước cất Acid formic 0,2% Acetonitril 0-12 0-12 12 12 70 45 69 69 65 65 45 45 - 69 69 65 65 45 45 30 55 31 31 35 35 55 55 31 31 35 35 55 55 Điều kiện I Điều kiện II Điều kiện III Điều kiện IV Thẩm định quy trình định lượng đồng thời diosmin quercetin DQM phương pháp HPLC Quy trình định lượng đồng thời diosmin quercetin DQM thẩm định tính tương thích hệ thống, tính đặc hiệu, tính tuyến tính, độ xác độ theo hướng dẫn ICH Tính tương thích hệ thống Chuẩn bị mẫu dung dịch chuẩn theo phương pháp trình bày mục 2.2.2.1 25 Tiến hành sắc ký lần mẫu dung dịch chuẩn theo điều kiện sắc ký HPLC chọn Tính tương thích hệ thống khảo sát với thông số sắc ký: Thời gian lưu (tR), diện tích pic (S), hệ số bất đối (As), độ phân giải (Rs) số đĩa lý thuyết (N) u cầu: Quy trình đạt tính tương thích hệ thống khi41: - Độ lệch chuẩn (%RSD) thời gian lưu (tR), diện tích pic hoạt chất (S) 2% - Hệ số bất đối (As): 0,8 ≤ As ≤ 1,5 - Độ phân giải (Rs): Rs ≥ 1,5 Độ đặc hiệu Chuẩn bị mẫu dung môi, mẫu placebo, mẫu chuẩn, mẫu thử, mẫu placebo thêm chuẩn Mẫu placebo: Cân xác khoảng 0,0714 g VNT placebo vào bình định mức mL, cho vào khoảng mL hỗn hợp dung môi methanol:DMSO tỷ lệ 8:2, siêu âm 10 phút, bổ sung hỗn hợp dung môi tới vạch, lọc qua màng lọc 0,22 μm Mẫu dung môi: Hỗn hợp methanol:DMSO tỷ lệ 8:2, lọc qua màng lọc 0,22 µm Mẫu chuẩn: Chuẩn bị mẫu phương pháp trình bày mục 2.2.2.1 Mẫu thử: Chuẩn bị mẫu phương pháp trình bày mục 2.2.2.1 Mẫu placebo thêm chuẩn: Cân xác khoảng 0,0714 g VNT placebo vào bình định mức mL, thêm 357 µL chuẩn gốc diosmin (10 µg/mL) thêm 357 µL chuẩn gốc quercetin (20 µg/mL ), bổ sung đủ thể tích, lọc qua màng lọc 0,22 µm Tiến hành sắc ký mẫu theo phương pháp HPLC chọn Yêu cầu: - Sắc ký đồ mẫu placebo không xuất pic khoảng thời gian lưu tương ứng với pic quercetin chuẩn pic diosmin chuẩn - Sắc ký đồ mẫu thử cho pic có thời gian lưu tương tự với pic quercetin pic diosmin mẫu chuẩn Trên sắc ký đồ xuất thêm pic khác (pic tạp), pic quercetin pic diosmin phải tách hoàn toàn khỏi pic tạp 26 - Khi thêm lượng hỗn hợp chuẩn quercetin diosmin vào mẫu placebo, chiều cao diện tích pic quercetin diosmin tăng - Phổ UV – Vis thời gian lưu pic quercetin diosmin mẫu thử giống với phổ UV – Vis thời gian lưu tương ứng chất chuẩn - Sử dụng chức kiểm tra độ tinh khiết pic đầu dò PDA, pic quercetin diosmin mẫu thử phải đạt yêu cầu độ tinh khiết pic Tính tuyến tính Chuẩn bị dung dịch quercetin chuẩn nồng độ 20 μg/mL diosmin chuẩn nồng độ 10 μg/mL Pha loãng dung dịch chuẩn gốc bình định mức 10 mL hỗn hợp dung môi methanol:DMSO (tỷ lệ 8:2), thu dung dịch chuẩn trình bày Bảng 2.4 Bảng 2.4 Nồng độ quercetin diosmin khảo sát tính tuyến tính Dung dịch V chuẩn gốc Nồng độ quercetin Nồng độ diosmin chuẩn (μL) (μL/mL) (μL/mL) 400 0,80 0,40 550 1,10 0,55 700 1,40 0,70 850 1,70 0,85 1000 2,00 1,00 Xác định tương quan nồng độ diện tích pic dung dịch chuẩn Thiết lập phương trình hồi quy vẽ đường biểu diễn tương quan nồng độ diện tích pic Sử dụng trắc nghiệm t để kiểm tra ý nghĩa thơng số phương trình hồi quy trắc nghiệm F để kiểm tra tính thích hợp phương trình hồi quy Yêu cầu: Phương trình hồi quy tuyến tính có dạng y=ax+b với R2 ≥ 0,995 27 Độ xác Tiến hành phân tích mẫu thử có nồng độ chuẩn bị riêng biệt theo phương pháp trình bày mục 2.2.2.1 Từ diện tích pic suy hàm lượng hoạt chất mẫu thử Yêu cầu: Phương pháp phân tích đạt tính xác RSD% hàm lượng quercetin diosmin không vượt 2% Độ Xác định độ phương pháp cách thêm xác lượng chuẩn vào mẫu placebo Mẫu hỗn hợp chuẩn: Dung dịch quercetin chuẩn nồng độ 20 μg/mL diosmin chuẩn nồng độ 10 μg/mL hỗn hợp methanol:DMSO tỷ lệ 8:2 Mẫu placebo thêm chuẩn: Thêm lượng xác hỗn hợp mẫu chuẩn gốc vào mẫu placebo, cho hàm lượng quercetin chuẩn diosmin chuẩn thêm vào nồng độ 80%, 100% 120% hàm lượng quercetin diosmin mẫu thử Tại mức nồng độ thực định lượng mẫu độc lập Xác định độ phương pháp theo công thức: Độ hồi phục (%) = (Lượng chất thu hồi/Lượng chất thêm vào) x 100% Yêu cầu tỷ lệ phục hồi tương ứng với nồng độ chất phân tích63 trình bày Bảng 2.5 Bảng 2.5 Yêu cầu tỷ lệ phục hồi tương ứng với nồng độ chất phân tích63 Nồng độ chất phân tích (%) 100 10 0,1 0,01 0,001 0,0001 0,00001 0,000001 0,0000001 Tỷ số nồng độ Đơn vị tương ứng Tỷ lệ phục hồi (%) 10-1 10-2 10-3 10-4 10-5 10-6 10-7 10-8 10-9 100% 10% 1% 0,1% 100 ppm 10 ppm ppm 100 ppb 10 ppb ppb 98 – 102 98 – 102 97 – 103 95 – 105 90 – 107 80 – 110 80 – 110 80 – 110 60 – 105 40 – 102 28 2.2.3 Xây dựng cơng thức đánh giá tính chất DQE Khảo sát lựa chọn tá dược tạo gel Khảo sát khả gel hoá DQM với số loại tá dược tạo gel (HPMC, Sepinov Derm, Sepimax Zen) hai nồng độ tá dược tạo gel 0,1% 0,2% Thành phần công thức gel khảo sát trình bày Bảng 2.6 Bảng 2.6 Thành phần công thức gel khảo sát Công thức %DQM %HPMC %Sepinov %Sepimax gel (kl/kl) (kl/kl) Derm (kl/kl) Zen (kl/kl) G1 99,9 0,1 - - G2 99,9 - 0,1 - G3 99,9 - - 0,1 G4 99,8 0,2 - - G5 99,8 - 0,2 - G6 99,8 - - 0,2 Phối hợp tá dược tạo gel vào DQM hai nồng độ 0,1% 0,2% Thêm từ từ tá dược tạo gel khuấy liên tục tá dược trương nở hoàn toàn đồng Để yên qua đêm Đánh giá độ nhớt gel vi nhũ tương chứa diosmin quercetin tạo thành từ loại tá dược tạo gel khác Lựa chọn tá dược tạo gel phù hợp tỷ lệ tối ưu dựa tiêu chí đánh giá cảm quan, độ nhớt gel Động lực học tính chất nhớt – đàn hồi (dynamic viscoelasticity) Khảo sát động lực học tính chất nhớt – đàn hồi công thức G1-G6 máy đo lưu biến Viscotester iQ (Thermo Fisher Scientific, Đức) với đĩa song song P35Ti, khoảng cách đĩa mm, lượng mẫu đo mL Chế độ đo trượt liên tục – kiểm soát tốc độ trượt Khoảng khảo sát tốc độ trượt 0,01 – 100 s-1 Chế độ đo Frequency Sweep Test, tần số – 15 Hz, ứng suất trượt (shear stress) nhiệt độ đo 25 oC Ghi nhận giá trị mơ đun tích trữ G’ (storage modulus) mơ đun tổn hao G” (loss modulus) theo tần số (frequency) 29 2.2.4 Xây dựng TCCS DQE Xây dựng thẩm định quy trình định lượng đồng thời diosmin quercetin DQE phương pháp HLPC Tiến hành tương tự mục 2.2.2, nhiên có điều chỉnh điều kiện khảo sát phù hợp với mẫu thử DQE (thành phần thay đổi so với DQM) Các điều kiện pha động HPLC khảo sát quy trình định lượng đồng thời diosmin quercetin DQE trình bày Bảng 2.7 Bảng 2.7 Các điều kiện pha động HPLC khảo sát quy trình định lượng đồng thời diosmin quercetin DQE Thời gian (phút) Acid formic 0,2% Acetonitril Điều kiện V Điều kiện VI Điều kiện VII 12 12 12 69 69 65 65 45 45 67 67 65 65 45 45 71 71 65 65 45 45 31 31 35 35 55 55 33 33 35 35 55 55 29 29 35 35 55 55 Kiểm nghiệm lô DQE Kiểm nghiệm lơ DQE với tiêu chí: cảm quan, pH, độ nhớt, định tính, định lượng Cảm quan Quan sát mắt thường, ánh sáng tự nhiên 30 pH Pha loãng DQE 20 lần nước cất đun sôi để nguội tiến hành đo pH61 Lặp lại thử nghiệm lần Độ nhớt Xác định độ nhớt DQE máy đo lưu biến Viscotester iQ (Thermo Fisher Scientific, Đức), nhiệt độ 25 ± oC Lặp lại thử nghiệm lần Định tính Định tính diosmin quercetin DQE phương pháp HPLC theo điều kiện định lượng khảo sát mục 2.2.4 Định lượng Xác định hàm lượng diosmin queretin DQE phương pháp HPLC theo quy trình định lượng khảo sát mục 2.2.4 Dự thảo TCCS DQE Dựa vào kết kiểm nghiệm lô DQE, đề xuất TCCS DQE với tiêu chí: cảm quan, pH, độ nhớt, định tính, định lượng 31 KẾT QUẢ 3.1 Xây dựng cơng thức đánh giá tính chất DQM 3.1.1 Xây dựng công thức DQM Khảo sát độ tan diosmin quercetin tá dược Kết xác định độ tan quercetin diosmin tá dược phương pháp HPLC trình bày Bảng 3.1 Bảng 3.1 Độ tan quercetin diosmin số tá dược (n = 3) STT Tá dược Độ tan quercetin Độ tan diosmin (mg/mL)64 (mg/mL) Miglyol 812N 0,223 ± 0,005 - Labrafac PG 0,234 ± 0,003 0,136 ± 0,001 Labrafac CC 0,307 ± 0,002 0,144 ± 0,002 Labrafac lipophile 0,204 ± 0,003 - Capryol 90 11,340 ± 0,100 - Plurol oleique CC497 6,617 ± 0,008 0,216 ± 0,002 Maisine 1,183 ± 0,020 - Labrasol 14,09 ± 0,100 0,170 ± 0,005 Cremophor EL 9,636 ± 0,100 0,088 ± 0,001 10 Cremophor RH40 48,519 ± 1,100 0,261 ± 0,005 11 Lutrol E400 71,519 ± 1,300 0,058 ± 0,001 12 Transcutol P 69,567 ± 1,200 0,329 ± 0,005 “-” Không phát phương pháp HPLC 12 1.2 10 0.8 0.6 0.4 0.2 0 Quercetin Độ tan diosmin (mg/mL) Độ tan quercetin (mg/mL) 32 Diosmin 75 0.75 60 0.6 45 0.45 30 0.3 15 0.15 Độ tan diosmin (mg/mL) Độ tan quercetin (mg/mL) Hình 3.1 Độ tan quercetin diosmin tá dược dầu (n=3) Quercetin Diosmin Hình 3.2 Độ tan quercetin diosmin chất diện hoạt đồng diện hoạt (n=3) 33 Trong tá dược dầu khảo sát, Plurol oleique CC497 dầu hoà tan tốt diosmin (0,216 ± 0,002 mg/mL), sau Labrafac CC (0,144±0,002 mg/mL), cuối Labrafac PG (0,136 ± 0,001 mg/mL) Các tá dược dầu cịn lại khơng hồ tan diosmin Quercetin tan tốt Capryol 90 (11,340 ± 0,100 mg/mL) Tuy nhiên, diosmin không tan Capryol 90 Dầu có khả hồ tan quercetin tốt thứ hai Plurol oleique CC497 (6,617 ± 0,008 mg/mL) Vì vậy, dựa vào độ tan diosmin quercetin tá dược, Plurol oleique CC497 lựa chọn làm pha dầu cho công thức VNT Trong chất diện hoạt khảo sát (Cremophor RH40, Labrasol, Cremophor EL), độ tan diosmin quercetin giảm dần theo thứ tự Cremophor RH40 > Labrasol > Cremophor EL Trong đó, diosmin quercetin tan tốt Cremophor RH40 với độ tan 0,261 ± 0,005 mg/mL 48,519±1,100 mg/mL Trong chất đồng diện hoạt khảo sát (Transcutol P Lutrol E 400), độ tan diosmin Transcutol P (0,329 ± 0,005 mg/mL) cao gấp 5,67 lần độ tan diosmin Lutrol E 400 (0,058 ± 0,001 mg/mL) Độ tan quercetin Transcutol P (69,567 ± 1,200 mg/mL) chênh lệch không đáng kể so với độ tan quercetin Lutrol E 400 (71,519 ± 1,300 mg/mL) Khảo sát lựa chọn chất diện hoạt Khả nhũ hóa Plurol oleique CC497 chất diện hoạt khảo sát (Cremophor EL, Cremophor RH40, Labrasol) thể Hình 3.3 Trong chất diện hoạt khảo sát, Cremophor RH40 tạo VNT bền vững Cremophor EL hình thành nhũ tương mờ Labrasol cho khả nhũ hóa Plurol oleique CC497 yếu 34 Mặt khác, độ tan diosmin Cremophor RH40 (0,261 mg/mL) độ tan quercetin Cremophor RH40 (48,519 mg/mL) cao so với chất diện hoạt khảo sát khác Vì vậy, Cremophor RH40 chọn làm chất diện hoạt cho cơng thức DQM Hình 3.3 Khả nhũ hoá Plurol oleique CC497 chất diện hoạt khảo sát Khảo sát lựa chọn chất đồng diện hoạt Khảo sát lựa chọn chất đồng diện hoạt sử dụng phương pháp xây dựng giản đồ pha Giản đồ pha gồm nước, dầu Plurol oleique CC497, hỗn hợp chất diện hoạt Cremophor RH40 chất đồng diện hoạt khảo sát (Lutrol E400 Transcutol P) với tỷ lệ S/CoS 2:1, 3:1, 4:1 trình bày Hình 3.4 Hình 3.4 cho thấy giản đồ pha sử dụng Lutrol E400 làm chất đồng diện hoạt giản đồ pha sử dụng Transcutol P làm chất đồng diện hoạt tạo vùng VNT có độ rộng tương tự Độ tan quercetin Lutrol E400 Transcutol P khác không đáng kể (Bảng 3.1) Tuy nhiên, độ tan diosmin Transcutol P cao gấp 5,67 lần độ tan diosmin Lutrol E400 (Bảng 3.1) Vì vậy, Transcutol P sử dụng làm chất đồng diện hoạt cho công thức DQM 35 Hình 3.4 Giản đồ pha gồm nước, Plurol oleique CC497, Cremophor RH40/ chất đồng diện hoạt (Lutrol E-400 hoặcTranscutol P) Chú thích: Vùng chấm bi vùng tạo VNT, vùng màu xám vùng tạo gel 36 Khảo sát lựa chọn công thức DQM Từ giản đồ pha sử dụng Transcutol P làm chất đồng diện hoạt (Hình 3.4), chọn khảo sát tính chất (cảm quan, kích thước giọt, khả tải hoạt chất) công thức VNT CT1-CT9 với thành phần trình bày Bảng 3.2 Bảng 3.2 Thành phần công thức VNT CT1-CT9 Công thức %Plurol oleique CC497 %Nước %S/CoS Tỷ lệ (kl/kl) (kl/kl) (kl/kl) S/CoS CT 15 60 25 4:1 CT 15 60 25 3:1 CT 15 60 25 2:1 CT 10 60 30 4:1 CT 10 60 30 3:1 CT 10 60 30 2:1 CT 10 70 20 4:1 CT 10 70 20 3:1 CT 10 70 20 2:1 Cảm quan công thức VNT CT1-CT9 Hình chụp VNT cơng thức CT1-CT9 trình bày Hình 3.5 Hình 3.5 Hình chụp VNT khảo sát CT1- CT9 37 Kết kích thước giọt cơng thức VNT CT1-CT9 Kích thước giọt cơng thức CT1-CT9 trình bày Bảng 3.3 Hình 3.6 Bảng 3.3 Kết kích thước giọt VNT cơng thức khảo sát CT1- CT9 (n=3) Cơng thức Kích thước giọt TB (nm) PDI CT 173,1 ± 2,0 0,233 CT 164,6 ± 2,0 0,192 CT 157,7 ± 2,0 0,192 CT 146,3 ± 2,0 0,323 CT 166,3 ± 2,0 0,403 CT 231,6 ± 2,0 0,411 CT 235,8 ± 2,0 0,460 CT 247,6 ± 2,0 0,465 CT 262,5 ± 2,0 0,405 CT1, CT2 CT3 có PDI 0,233; 0,192 0,192 nhỏ 0,3 Các cơng thức cịn lại có PDI lớn 0,3 Hình chụp CT1, CT2 CT3 có cảm quan cơng thức khác (Hình 3.5) Bên cạnh đó, CT1, CT2 CT3 có kích thước giọt trung bình 173,1 ± 2,0 nm; 164,6 ± 2,0 nm 157,7 ± 2,0 nm, nhỏ 200 nm Các cơng thức CT6-CT9 có kích thước giọt trung bình lớn 200 nm CT4 CT5 có kích thước nhỏ 200 nm PDI lớn 0,3 tỷ lệ phần trăm hỗn hợp S/CoS chiếm 30%, lớn tỷ lệ hỗn hợp S/CoS CT1, CT2 CT3 (chỉ chiếm 25%) Do đó, CT1, CT2 CT3 lựa chọn để tiếp tục khảo sát khả tải hoạt chất 38 CT1 CT4 CT7 CT2 CT3 CT5 CT6 CT8 CT9 Hình 3.6 Phân bố kích thước giọt VNT công thức CT1-CT9 39 Khảo sát khả tải hoạt chất số công thức VNT Kết tải diosmin quercetin vào công thức VNT tiềm (CT1, CT2 CT3) trình bày Bảng 3.4 Bảng 3.4 Kết khảo sát khả tải diosmin quercetin CT1, CT2 CT3 CT1 CT2 CT3 Quercetin Diosmin Quercetin Diosmin Quercetin Diosmin (%) (%) (%) (%) (%) (%) 0,503 0,001 0,477 0,002 0,703 0,007 ± 0,001 ± 0,0005 ± 0,001 ± 0,0005 ± 0,001 ± 0,0005 Khả tải tối đa CT3 có khả tải đồng thời hoạt chất cao Khả tải tối đa CT3 quercetin 0,703%, diosmin 0,007% Vì vậy, CT3 chọn để điều chế DQM Liều có hoạt tính VNT chứa quercetin dùng da có tác dụng kháng viêm 0,01%42 Để công thức VNT đảm bảo liều quercetin có hoạt tính khả tải diosmin ổn định, đề tài chọn tải kết hợp đồng thời quercetin diosmin VNT với tỷ lệ 0,01% 0,005% (kl/kl) Thành phần công thức DQM (CT3 chọn) trình bày Bảng 3.5 Bảng 3.5 Công thức DQM Thành phần Tỷ lệ % (kl/kl) Diosmin 0,005 Quercetin 0,01 Plurol oleique CC497 15 Cremophor RH40 16,67 Transcutol P 8,33 Nước 59,985 40 3.1.2 Đánh giá tính chất DQM Cảm quan VNT trước sau tải có thay đổi màu sắc, từ khơng màu chuyển sang màu vàng nhạt (màu hoạt chất quercetin diosmin) Hình chụp VNT placebo DQM trình bày Hình 3.7 a DQM b (a) (b) Hình 3.7 Hình chụp (a) VNT placebo (b) DQM pH Kết xác định pH DQM trình bày Bảng 3.6 Bảng 3.6 Kết pH DQM Mẫu đo Độ pH 3,924 3,915 3,908 TB 3,916 41 Lưu tính Kết độ nhớt DQM theo tốc độ trượt trình bày Hình 3.8 20000 η (mPas) 15000 10000 5000 0 20 40 60 80 100 ɣ̇ (1/s) Hình 3.8 Biểu đồ độ nhớt DQM theo tốc độ trượt γ Hình 3.8 cho thấy tốc độ trượt (γ) tăng dần từ 0,01 – 100 s-1, độ nhớt gel giảm dần đường cong ứng suất trượt phi Newtonian theo kiểu giả dẻo (pseudoplastic flow)58 Độ bền vật lý Chu kỳ nóng lạnh Sau chu kỳ nóng lạnh, chu kỳ gồm:  48 nhiệt độ ± oC  48 nhiệt độ 45 ± oC Các mẫu DQM giữ cảm quan ban đầu, khơng có tượng tách lớp hay đổi màu (Hình 3.9) (a) (b) Hình 3.9 Hình chụp DQM (a) trước (b) sau thử nghiệm chu kỳ nóng lạnh 42 Ly tâm Sau ly tâm với tốc độ 10000 vòng/phút thời gian 30 phút Các mẫu DQM giữ cảm quan ban đầu, không xảy tượng tách lớp (Hình 3.10) a (a) (b)b Hình 3.10 Hình chụp DQM (a) trước (b) sau thử nghiệm ly tâm Kích thước tiểu phân zeta Kích thước tiểu phân Kích thước tiểu phân đo phương pháp tán xạ ánh sáng động (DLS) DQM sau pha lỗng 10 lần với nước cất, có dãy phân bố kích thước giọt Hình 3.11 Hình 3.11 Kích thước giọt DQM Kích thước giọt VNT DQM sau pha loãng 10 lần với nước cất 165,6 ± 2,0 nm Kích thước giọt VNT trước (kích thước giọt CT3 157,7 ± 2,0 nm) sau tải hoạt chất (kích thước giọt DQM 165,6 ± 2,0 nm) có tăng nhẹ 43 Thế zeta Thế zeta DQM trình bày Hình 3.12 Hình 3.12 Thế zeta DQM Thế zeta DQM sau pha loãng 10 lần với nước cất -12,6 mV Giá trị tuyệt đối zeta lớn 30 mV thường coi ổn định, đảm bảo độ bền hệ VNT57 DQM có |zeta| 12,6 mV, nhỏ 30 mV Tuy nhiên, VNT có khả ổn định nhờ tượng ổn định không gian hạt nano (steric stabilization of nanoparticles) Chất đồng diện hoạt khơng ion hố xen kẽ với chất diện hoạt, giúp tạo khoảng cách giọt phân tán, tránh tượng kết tụ tách pha 3.2 Xây dựng thẩm định quy trình định lượng đồng thời diosmin quercetin DQM phương pháp HPLC 3.2.1 Xây dựng quy trình định lượng đồng thời diosmin quercetin DQM phương pháp HPLC Lựa chọn dung môi pha động cột sắc ký Qua tham khảo nghiên cứu tác giả M J Dubber năm 200541, M A Campanero năm 201019, kết hợp với điều kiện sẵn có, đề tài chọn khảo sát điều kiện HPLC sử dụng cột sắc ký pha đảo C18, chọn hệ dung môi khảo sát ban đầu acetonitril – nước với tỷ lệ 30:70 làm dung môi pha động 44 Lựa chọn bước sóng phát Quercetin có đỉnh hấp thu cực đại bước sóng 256 nm 381 nm (Hình 1.2) Diosmin có đỉnh hấp thu cực đại bước sóng 268 nm 370 nm (Hình 1.4) Xét đỉnh hấp thu cực đại này, nhận thấy : - Tại bước sóng 256 nm, diosmin có khả hấp thu - Tại bước sóng 381 nm, diosmin gần không hấp thu - Tại bước sóng 370 nm, quercetin diosmin hấp thu so với bước sóng 268 nm - Tại bước sóng 268 nm, diosmin hấp thu tốt bước sóng đảm bảo khả định lượng xác quercetin Do đó, lựa chọn bước sóng 268 nm để định lượng đồng thời quercetin diosmin DQM Khảo sát tỷ lệ pha động Tiến hành khảo sát số điều kiện pha động HPLC Bảng 2.3 Kết sắc kí đồ HPLC với chương trình pha động khảo sát trình bày Hình 3.13 Quercetin Hình 3.13 Sắc ký đồ HPLC định lượng đồng thời diosmin quercetin DQM với điều kiện pha động khảo sát 45 Điều kiện I:  Không rửa giải pic diosmin quercetin sau 12 phút  Giải pháp: Tăng tỷ lệ acetonitril từ 30% lên 55% Điều kiện II:  Đã rửa giải quercetin, nhiên độ phân giải diosmin chưa tốt  Giải pháp: Đổi chương trình từ isocratic sang gradient Điều kiện III:  Quercetin rửa giải tốt, nhiên pic diosmin cịn dính với pic tạp  Giải pháp: Thay nước chương trình pha động acid formic 0,2% Điều kiện IV:  Tách pic diosmin quercetin khỏi pic tạp, đồng thời pic diosmin quercetin đạt yêu cầu độ phân giải Vì vậy, chọn điều kiện IV làm hệ dung môi rửa giải để định lượng đồng thời diosmin quercetin DQM phương pháp HPLC Vậy, điều kiện định lượng đồng thời quercetin diosmin DQM phương pháp HPLC sau: + Cột pha đảo: Thermo Scientific Syncronis C18 (250 x 4,6 mm; μm) + Tiền cột: C18 HQ105 (4 x 10 mm; µm) + Nhiệt độ cột: 30 oC + Tốc độ dịng: 0,8 mL/phút + Thể tích tiêm mẫu: 20 μL + Bước sóng phát hiện: 268 nm + Pha động: Điều kiện IV Thời gian (phút) Acid formic 0,2% Acetonitril 12 69 69 65 65 45 45 31 31 35 35 55 55 46 3.2.2 Thẩm định quy trình định lượng đồng thời diosmin quercetin DQM phương pháp HPLC Tính tương thích hệ thống Kết tính tương thích hệ thống quy trình định lượng đồng thời diosmin quercetin DQM phương pháp HPLC trình bày Bảng 3.7 Bảng 3.7 Tính tương thích hệ thống quy trình định lượng đồng thời diosmin quercetin DQM phương pháp HPLC Diosmin STT tR (phút) S (mAU.s) RS1 RS2 As N 4,73 26,53 1,57 1,67 1,12 27074 4,63 26,19 1,56 1,54 1,13 22462 4,67 27,01 1,74 1,52 1,14 25096 4,62 26,74 1,61 2,03 1,15 27439 4,77 26,37 1,65 1,64 1,20 24764 4,70 26,76 1,53 1,89 1,13 22763 TB 4,69 26,60 1,61 1,72 1,15 24933 %RSD 1,24 1,12 Quercetin STT tR (phút) S (mAU.s) RS1 RS2 As N 9,33 130,52 1,68 1,78 1,12 112280 9,57 125,31 1,67 1,72 1,14 112673 9,18 127,82 1,77 1,90 1,20 112280 9,28 127,02 1,68 1,75 1,15 112673 9,27 128,65 1,90 1,64 1,18 100421 9,10 128,23 1,74 1,51 1,16 111889 TB 9,29 127,93 1,74 1,72 1,16 110369,3 % RSD 1,71 1,34 Yêu cầu RSDG”, điều có nghĩa nồng độ 0,1% 0,2% tá dược khảo sát có khả tạo gel cho chế phẩm dùng da Tuy nhiên, so sánh độ nhớt tá dược khảo sát mức nồng độ 0,1% 0,2%, Sepinov Derm tạo độ nhớt cao tá dược HPMC Sepimax Zen Thêm vào đó, sử dụng Sepinov Derm để làm tác nhân tạo gel cho chế phẩm dùng da, giúp tạo cảm giác mát, mềm mịn, dễ chịu so với tá dược HPMC Sepimax Zen Do đó, Sepinov Derm lựa chọn làm tá dược tạo gel cho công thức DQE Sepinov Derm sử dụng nồng độ 0,1% cho độ nhớt DQE khoảng 1400mPas Khi tăng nồng độ Sepinov Derm lên 0,2%, không làm độ nhớt DQE thay đổi đáng kể Vì vậy, để giảm chi phí q trình sản xuất, chọn 0,1% nồng độ cho tá dược tạo gel Sepinov Derm cơng thức DQE Bên cạnh đó, cách thức đóng gói sử dụng chế phẩm (lọ, tuýp, bình xịt,…) ảnh hưởng đến việc lựa chọn độ nhớt phù hợp cho gel Với mục tiêu bào chế gel vi nhũ tương đóng gói dạng tuýp nhôm, độ nhớt DQE khoảng 1400 ± 50 mPas sử dụng tá dược Sepinov Derm nồng độ 0,1% phù hợp Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh 79 4.3 Xây dựng thẩm định quy trình định lượng đồng thời diosmin quercetin phương pháp HPLC Trong nghiên cứu quercetin diosmin, chưa có tài liệu cơng bố về định lượng đồng thời hai thành phần chế phẩm Phương pháp HPLC lựa chọn để khảo sát xây dựng quy trình định lượng đồng thời diosmin quercetin có độ nhạy tính xác cao Định lượng đồng thời diosmin quercetin DQM Dựa vào tài liệu công bố định lượng riêng lẻ diosmin19 quercetin41, tác giả thường sử dụng acetonitril methanol làm dung mơi pha động Do đó, đề tài bắt đầu khảo sát hệ dung môi pha động acetonitril: nước tỷ lệ 30:70 với chương trình đẳng môi Sau 12 phút không rửa giải diosmin quercetin Khi tăng tỷ lệ acetonitril từ 30% lên 55%, rửa giải quercetin, nhiên độ phân giải diosmin chưa tốt Diosmin quercetin hai flavonoid có độ phân cực khơng giống (quercetin có nhóm hydroxyd cấu trúc nên có độ phân cực diosmin có nhóm hydroxyd) Do đó, dù chế độ rửa giải đẳng môi thường ưu tiên lựa chọn thử nghiệm với điều kiện đẳng môi, rửa giải đồng thời diosmin quercetin Vì vậy, chương trình rửa giải gradient lựa chọn khả tách tốt hơn, rút ngắn thời gian phân tích Khi sử dụng pha động nước acetonitril, thông số pic diosmin quercetin chưa đạt yêu cầu Vì vậy, acid formic sử dụng Điều kiện pha động chọn acid formic nồng độ 0,2% acetonitril với chương trình rửa giải gradient, tỷ lệ acetonitril tương ứng 31%, 35% 55% 0-2 phút, 3-4 phút 512 phút Kết tách pic diosmin quercetin khỏi pic tạp DQM, đồng thời pic diosmin quercetin đạt yêu cầu độ phân giải Định lượng đồng thời diosmin quercetin DQE Khi định lượng đồng thời diosmin quercetin DQE, điều kiện pha động thay đổi để phù hợp với mẫu DQE Điều kiện pha động chọn acid formic nồng độ 0,2% acetonitril với chương trình rửa giải gradient, tỷ lệ acetonitril tương ứng 29%, 35% 55% 0-2 phút, 3-4 phút 5-12 phút Kết Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh 80 tách pic diosmin quercetin khỏi pic tạp DQE, đồng thời pic diosmin quercetin đạt yêu cầu độ phân giải Như vậy, hai quy trình định lượng đồng thời diosmin quercetin DQM DQE sử dụng hệ pha động gồm acid formic 0,2% acetonitril chương trình gradient Bước sóng phát 268 nm có khả phát tốt hai hoạt chất diosmin quercetin Dung môi pha mẫu hỗn hợp methanol: DMSO tỷ lệ 8:2 có khả hồ tan đồng thời diosmin quercetin mẫu thử Quy trình định lượng đồng thời diosmin quercetin cho thấy nhiều ưu điểm: Quy trình chuẩn bị mẫu đơn giản, dễ thực hiện; Thời gian phân tích ngắn (12 phút) so với đề tài nghiên cứu đăng báo quốc tế (thời gian phân tích khoảng 20 phút) Quy trình định lượng đồng thời diosmin quercetin phương pháp HPLC xây dựng thẩm định thành cơng ứng dụng để kiểm soát chất lượng DQM DQE Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh 81 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ Kết luận Sau trình thực đề tài với mục tiêu đề ra, luận văn đạt số kết sau: - Đề tài xây dựng công thức đánh giá tính chất DQM Thành phần công thức DQM gồm Plurol oleique CC497: Cremophor RH40: Transcutol P: Nước với tỷ lệ 15%: 16,67%: 8,33%: 60% (kl/kl) Hàm lượng diosmin quercetin DQM 0,005% 0,01% (kl/kl) DQM có màu vàng nhạt, bền với thử nghiệm sốc nhiệt ly tâm Kích thước giọt DQM 165,6 ± 2,0 nm (PDI=0,267), zeta 12,6 mV pH DQM có giá trị 3,92 - Đề tài xây dựng công thức đánh giá tính chất DQE DQE điều chế từ DQM dựa kết khảo sát với loại tá dược tạo gel (HPMC, Sepinov Derm, Sepimax Zen) nồng độ 0,1 0,2% Sepinov Derm nồng độ 0,1% chọn cho cơng thức DQE DQE có màu vàng nhạt, đồng nhất, pH 3,95 có tính chất lưu biến phi Newton kiểu giả dẻo - Đề tài xây dựng thẩm định quy trình định lượng đồng thời diosmin quercetin DQM DQE phương pháp HPLC đạt yêu cầu theo hướng dẫn ICH tính đặc hiệu, tính tương thích hệ thống, độ tuyến tính, độ xác độ - Dựa kết kiểm nghiệm lô DQE (quy mô 10 g), đề tài xây dựng dự thảo TCCS DQE với tiêu: cảm quan, pH, độ nhớt, định tính, định lượng Đề nghị Để tiếp tục hoàn thiện đề tài, đề nghị: - Đánh giá khả giải phóng hoạt chất in vitro - Đánh giá tác dụng dược lý DQE, đặc biệt tác dụng triệu chứng bệnh suy giãn tĩnh mạch Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh 82 TÀI LIỆU THAM KHẢO Hồ Võ Thuỳ Anh Nghiên cứu bào chế tiểu phân nano chứa quercetin phương pháp tự kết tạo Luận văn thạc sĩ Đại học Y Dược Thành Phố Hồ Chí Minh 2020 Srilatha D, Nasare M, Nagasandhya B, Prasad V, Diwan P Development and Validation of UV Spectrophotometric Method for Simultaneous Estimation of Hesperidin and Diosmin in the Pharmaceutical Dosage Form Spectroscopy 2013:1-4 Feldo M, Wojciak-Kosior M, Sowa I, et al Effect of Diosmin Administration in Patients with Chronic Venous Disorders on Selected Factors Affecting Angiogenesis Molecules 2019;24(18):3316 doi:10.3390/molecules24183316 Lichota A, Gwozdzinski L, Gwozdzinski K Therapeutic potential of natural compounds in inflammation and chronic venous insufficiency Eur J Med Chem 2019;176:68-91 doi:10.1016/j.ejmech.2019.04.075 Shalkami AS, Hassan M, Bakr AG Anti-inflammatory, antioxidant and antiapoptotic activity of diosmin in acetic acid-induced ulcerative colitis Hum Exp Toxicol 2018;37(1):78-86 doi:10.1177/0960327117694075 Mirshekar MA, Fanaei H, Keikhaei F, Javan FS Diosmin improved cognitive deficit and amplified brain electrical activity in the rat model of traumatic brain injury Biomed Pharmacother 2017;93:1220-1229 doi:10.1016/j.biopha.2017.07.014 John SSQaB Diosmin exhibits antihyperlipidemic effects in isoproterenol induced myocardial infarcted rats Eur J Pharmacol 2013;718:213-218 Lee GH, Lee SJ, Jeong SW, et al Antioxidative and antiinflammatory activities of quercetin-loaded silica nanoparticles Colloids Surf B Biointerfaces 2016;143:511-517 doi:10.1016/j.colsurfb.2016.03.060 Reyes-Farias M, Carrasco-Pozo C The Anti-Cancer Effect of Quercetin: Molecular Implications in Cancer Metabolism 2019;20(13):3177 doi:10.3390/ijms20133177 Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Int J Mol Sci Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh 83 10 Yarahmadi A, Khademi F, Mostafavi-Pour Z, Zal F In-Vitro Analysis of Glucose and Quercetin Effects on m-TOR and Nrf-2 Expression in HepG2 Cell Line (Diabetes and Cancer Connection) Nutr Cancer 2018;70(5):770775 doi:10.1080/01635581.2018.1470654 11 Freag MS, Elnaggar YS, Abdallah OY Development of novel polymerstabilized diosmin nanosuspensions: in vitro appraisal and ex vivo permeation Int J Pharm 2013;454(1):462-471 doi:10.1016/j.ijpharm.2013.06.039 12 Kitagawa S, Tanaka Y, Tanaka M, Endo K, Yoshii A Enhanced skin delivery of quercetin by microemulsion J Pharm Pharmacol 2009;61(7):855-860 doi:10.1211/jpp/61.07.0003 13 Lê Quan Nghiệm, Huỳnh Văn Hóa Bào chế sinh dược học tập NXB Giáo dục Việt Nam; 2014 14 Lê Quan Nghiệm Sinh dược học hệ thống trị liệu NXB Y Học; 2007 15 Huỳnh Thị Kim Chi Nghiên cứu bán tổng hợp xác định hoạt tính chống oxy hố diosmin dẫn xuất Luận văn thạc sĩ Đại học Cần Thơ 2012 16 Filho LFS, Menezes PP, Santana DVS, et al Effect of Pulsed Therapeutic Ultrasound and Diosmin on Skeletal Muscle Oxidative Parameters Ultrasound Med Biol 2018;44(2):359-367 doi:10.1016/j.ultrasmedbio.2017.09.009 17 Abd El Hady WE, Mohamed EA, Soliman OAE, El-Sabbagh HM In vitro-in vivo evaluation of chitosan-PLGA nanoparticles for potentiated gastric retention and anti-ulcer activity of diosmin Int J Nanomedicine 2019;14:7191-7213 doi:10.2147/IJN.S213836 18 Cheng C, Zhang H, Li Y, et al The effect of Diosmin on the blood proteome in a rat model of venous thrombosis Int J Biol Macromol 2017;104:778-787 doi:10.1016/j.ijbiomac.2017.06.045 19 Campanero MA, Escolar M, Perez G, et al Simultaneous determination of diosmin and diosmetin in human plasma by ion trap liquid chromatography- Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh 84 atmospheric pressure chemical ionization tandem mass spectrometry: Application to a clinical pharmacokinetic study J Pharm Biomed Anal 2010;51(4):875-881 doi:10.1016/j.jpba.2009.09.012 20 Saeidi I, Hadjmohammadi MR, Peyrovi M, et al HPLC determination of hesperidin, diosmin and eriocitrin in Iranian lime juice using polyamide as an adsorbent for solid phase extraction J Pharm Biomed Anal 2011;56(2):419-422 21 Zheng Y, Zhang R, Shi W, et al Metabolism and pharmacological activities of the natural health-benefiting compound diosmin Food Funct 2020;11(10):8472-8492 doi:10.1039/d0fo01598a 22 Kamel R, Abbas H, Fayez A Diosmin/essential oil combination for dermal photo-protection using a lipoid colloidal carrier J Photochem Photobiol B 2017;170:49-57 23 Hosseinimehr SJ, Ahmadi A, Mahmoudzadeh A, Mohamadifar S Radioprotective effects of Daflon against genotoxicity induced by gamma irradiation in human cultured lymphocytes Environ Mol Mutagen 2009;50(9):749-752 doi:10.1002/em.20499 24 Naso L, Martinez VR, Lezama L, et al Antioxidant, anticancer activities and mechanistic studies of the flavone glycoside diosmin and its oxidovanadium(IV) complex Interactions with bovine serum albumin Bioorg Med Chem 2016;24(18):4108-4119 doi:10.1016/j.bmc.2016.06.053 25 Lewinska A, Adamczyk-Grochala J, Kwasniewicz E, Deregowska A, Wnuk M Diosmin-induced senescence, apoptosis and autophagy in breast cancer cells of different p53 status and ERK activity Toxicol Lett 2017;265:117-130 doi:10.1016/j.toxlet.2016.11.018 26 Tahir M, Rehman MU, Lateef A, et al Diosmin abrogates chemically induced hepatocarcinogenesis via alleviation of oxidative stress, hyperproliferative and inflammatory markers in murine model Toxicol Lett 2013;220(3):205-218 doi:10.1016/j.toxlet.2013.04.004 Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh 85 27 Bakr AG, El-Bahrawy AH, Taha HH, Ali FEM Diosmin enhances the antiangiogenic activity of sildenafil and pentoxifylline against hepatopulmonary syndrome via regulation of TNF-alpha/VEGF, IGF-1/PI3K/AKT, and FGF1/ANG-2 signaling pathways Eur J Pharmacol 2020;873:173008 doi:10.1016/j.ejphar.2020.173008 28 Singh C, Prakash C, Mishra P, et al Hepatoprotective efficacy of Premna integrifolia L leaves against aflatoxin B1-induced toxicity in mice Toxicon 2019;166:88-100 doi:10.1016/j.toxicon.2019.05.014 29 Tahir M, Rehman MU, Lateef A, et al Diosmin protects against ethanolinduced hepatic injury via alleviation of inflammation and regulation of TNFalpha and NF-kappaB activation Alcohol 2013;47(2):131-139 doi:10.1016/j.alcohol.2012.12.010 30 Rapavi E, Kocsis I, Feher E, et al The effect of citrus flavonoids on the redox state of alimentary-induced fatty liver in rats Nat Prod Res 2007;21(3):274281 doi:10.1080/14786410500518545 31 Fernandez SP, Wasowski C, Loscalzo LM, et al Central nervous system depressant action of flavonoid glycosides Eur J Pharmacol 2006;539(3):168176 doi:10.1016/j.ejphar.2006.04.004 32 Bertozzi MM, Rossaneis AC, Fattori V, et al Diosmin reduces chronic constriction injury-induced neuropathic pain in mice Chem Biol Interact 2017;273:180-189 doi:10.1016/j.cbi.2017.06.014 33 Silambarasan T, Raja B Diosmin, a bioflavonoid reverses alterations in blood pressure, nitric oxide, lipid peroxides and antioxidant status in DOCA-salt induced hypertensive rats Eur J Pharmacol 2012;679(1-3):81-89 doi:10.1016/j.ejphar.2011.12.040 34 Q Z Characterization of active antiplatelet chemical compositions of edible Citrus limon through ultra-performance liquid chromatography single quadrupole mass spectrometrybased 2018;9:2762-2773 Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn chemometrics Food Funct Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh 86 35 Nirumand MC, Hajialyani M, Rahimi R, et al Dietary Plants for the Prevention and Management of Kidney Stones: Preclinical and Clinical Evidence and Molecular Mechanisms Int J Mol Sci 2018;19(3):765 doi:10.3390/ijms19030765 36 Noorafshan A, Karbalay-Doust S, Karimi F Diosmin reduces calcium oxalate deposition and tissue degeneration in nephrolithiasis in rats: a stereological study Korean J Urol 2013;54(4):252-257 doi:10.4111/kju.2013.54.4.252 37 Om H, El-Naggar ME, El-Banna M, et al Combating atherosclerosis with targeted Diosmin nanoparticles-treated experimental diabetes Invest New Drugs 2020;38(5):1303-1315 doi:10.1007/s10637-020-00905-6 38 Golonka I, Wilk S, Musial W The Influence of UV Radiation on the Degradation of Pharmaceutical Formulations Containing Quercetin Molecules 2020;25(22):5454 doi:10.3390/molecules25225454 39 Hatahet T, Morille M, Hommoss A, et al Liposomes, lipid nanocapsules and smartCrystals(R): A comparative study for an effective quercetin delivery to the skin Int J Pharm 2018;542(1-2):176-185 doi:10.1016/j.ijpharm.2018.03.019 40 Abdelkawy KS, Balyshev ME, Elbarbry F A new validated HPLC method for the determination of quercetin: Application to study pharmacokinetics in rats Biomed Chromatogr 2017;31(3):3819 doi:10.1002/bmc.3819 41 Dubber MJ, Sewram V Fau - Mshicileli N, Mshicileli N Fau - Shephard GS, Shephard Gs Fau - Kanfer I, Kanfer I The simultaneous determination of selected flavonol glycosides and aglycones in Ginkgo biloba oral dosage forms by high-performance liquid chromatography-electrospray ionisationmass spectrometry 2005;(0731-7085 (Print)) 42 Gokhale JP, Mahajan HS, Surana SJ Quercetin loaded nanoemulsion-based gel for rheumatoid arthritis: In vivo and in vitro studies Biomed Pharmacother 2019;112:108622 doi:10.1016/j.biopha.2019.108622 Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh 87 43 Carullo G, Cappello AR, Frattaruolo L, et al Quercetin and derivatives: useful tools in inflammation and pain management Future Med Chem 2017;9(1):7993 doi:10.4155/fmc-2016-0186 44 Babaei F, Mirzababaei M, Nassiri-Asl M Quercetin in Food: Possible Mechanisms of Its Effect on Memory J Food Sci 2018;83(9):2280-2287 doi:10.1111/1750-3841.14317 45 Xia Lv, Liu T, Ma H, et al Preparation of Essential Oil-Based Microemulsions for Improving the Solubility, pH Stability, Photostability, and Skin Permeation of Quercetin AAPS PharmSciTech 2017;18(8):3097-3104 doi:10.1208/s12249-017-0798-x 46 Kajbafvala A, Salabat A, Salimi A Formulation, characterization and invitro/ex-vivo evaluation of quercetin-loaded microemulsion for topical application Pharmaceutical Development and Technology 2016;23(8):741-750 47 Censi R, Martena V, Hoti E, Malaj L, Di Martino P Permeation and skin retention of quercetin from microemulsions containing Transcutol(R) P Drug Dev Ind Pharm 2012;38(9):1128-1133 doi:10.3109/03639045.2011.641564 48 Corsale I, Carrieri P, Martellucci J, et al Flavonoid mixture (diosmin, troxerutin, rutin, hesperidin, quercetin) in the treatment of I-III degree hemorroidal disease: a double-blind multicenter prospective comparative study Int J Colorectal Dis 2018;33(11):1595-1600 doi:10.1007/s00384-0183102-y 49 Patel P, Pol A, Kalaria D, et al Microemulsion-based gel for the transdermal delivery of rasagiline mesylate: In vitro and in vivo assessment for Parkinson's therapy Eur J Pharm Biopharm 2021;165:66-74 doi:10.1016/j.ejpb.2021.04.026 50 Sisak MAA, Daik R, Ramli S Study On The Effect Of Oil Phase And CoSurfactant On Microemulsion Systems Malaysian Journal of Analytical Sciences 2017;21(6):1409 – 1416 Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh 88 51 Võ Xuân Minh, Nguyễn Văn Long Kỹ thuật bào chế sinh dược học dạng thuốc tập NXB Y học; 2004 52 SA R, MW OB, SA G, S H-M, DS K Short-term supplement of virgin coconut oil improves endothelial dependent dilation but not exercise-mediated hyperemia in young adults Nutr Res 2019;11(7):17-26 53 Khodakiya AS, Chavada JR Microemulsions as Enhanced Drug Delivery Carrier: An Overview American Journal of Pharmtech Research 2012;2(4):207-226 54 Berry N Development and stability of microemulsions as carriers for nutraceuticals Master of Science thesis; 2007 55 Khương Thị Mai Lan Nghiên cứu bào chế vi nhũ tương Natri diclofenac dùng qua da Luận văn thạc sĩ Đại học Dược Hà Nội 2007 56 Agrawal OP, Agrawal S An Over View Of New Drug Delivery Systems: Microemulsion Asian Journal of Pharmaceutical Science & Technology 2012; 2:5-12 57 Callender SP, Mathews JA, Kobernyk K, Wettig SD Microemulsion utility in pharmaceuticals: Implications for multi-drug delivery Int J Pharm 2017;526(1-2):425-442 doi:10.1016/j.ijpharm.2017.05.005 58 Froelich A, Osmałek T, Kunstman P, Roszak R, Białas W Rheological and textural properties of microemulsion-based polymer gels with indomethacin Drug Dev Ind Pharm 2016;42(6):854-61 59 Rowe RC, Sheskey PJ, Owen SnC, American Pharmacists Association Handbook of pharmaceutical excipients / edited by Raymond C Rowe, Paul J Sheskey, Marian E Quinn 6th ed APhA/Pharmaceutical Press; 2009 60 Nguyễn Thị Kim Liên, Lê Xuân Trường, Trần Văn Thành Bào chế gel vi nhũ tương từ cao khô Rau đắng đất [Glinus oppositifolius (L.) Aug DC., Molluginaceae] Tạp chí khoa học công nghệ Việt Nam 2018;61(5):11-15 Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh 89 61 Ahmad J, Gautam A, Komath S, et al Topical Nano-emulgel for Skin Disorders: Formulation Approach and Characterization Recent Pat Antiinfect Drug Discov 2019;14(1):36-48 doi:10.2174/1574891X14666181129115213 62 Weng S, Lian J Determination of isorhamnetine and quercetin in flavone hippophaes tablets by HPLC method Zhong Yao Cai 2001;24(12):893-894 63 "Standard Format and Guidance for AOAC Standard Method Performance Requirement (SMPR) Documents" 2011:pp.9 64 Phan Hoàng Đoan Phương, Nguyễn Đức Hạnh Nghiên cứu điều chế vi nhũ tương chứa đồng thời quercetin curcumin Tạp chí Dược học 2020;60(1) 65 Khan B, Bakhsh S, Khan H, Mahmood T, Rasul A Basics of Self Micro Emulsifying Drug Delivery System Journal of Pharmacy and Alternative Medicine.2012;1 Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh 90 DANH MỤC CƠNG TRÌNH ĐÃ CƠNG BỐ Vũ Lê Hà, Võ Thanh Hóa, Nguyễn Đức Hạnh, Xây dựng quy trình định lượng đồng thời diosmin quercetin vi nhũ tương DQM phương pháp HPLC-UV, Tạp chí y học Việt Nam 2022;1(22) Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PL - PHỤ LỤC Phụ lục Dự thảo tiêu chuẩn sở DQE SỞ Y TẾ… DỰ THẢO TIÊU CHUẨN CƠ SỞ CÔNG TY … GEL VI NHŨ TƯƠNG CHỨA DIOSMIN VÀ QUERCETIN Bộ phận: Trang: Tiêu chuẩn: TCCS Mã số: Có hiệu lực từ: Ban hành theo định số: … ngày… tháng năm A TIÊU CHUẨN CHẤT LƯỢNG Cảm quan: DQE có màu vàng nhạt, thể chất đồng nhất, khơng chảy lỏng nhiệt độ 37 oC pH: 3,7 - 4,3 Độ nhớt: 1400 ± 50 mPas Định tính: Thời gian lưu diosmin quercetin (tR 5,3 9,4 phút) sắc ký đồ mẫu thử lô DQE tương ứng với thời gian lưu diosmin quercetin sắc ký đồ mẫu hỗn hợp chuẩn Định lượng: - Hàm lượng diosmin không thấp 0,004% - Hàm lượng quercetin khơng thấp 0,009% B QUY TRÌNH PHÂN TÍCH Cảm quan: kiểm tra mắt thường (thể chất, màu sắc, mùi ), DQE phải đạt yêu cầu nêu pH: Tiến hành máy đo pH Mettler Toledo (Mỹ) Độ nhớt: Tiến hành máy đo lưu biến Haake Viscotester iQ (Đức) Định tính: Tiến hành phương pháp HPLC Điều kiện sắc ký HPLC Cột pha đảo: Thermo Scientific Syncronis C18 (250 x 4,6 mm; μm) Tiền cột: C18 HQ105 (4 x 10 mm; µm) Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PL - Nhiệt độ cột: 30 oC Tốc độ dịng: 0,8 mL/phút Thể tích tiêm mẫu: 20 μL Bước sóng phát hiện: 268 nm Chương trình pha động: Thời gian (phút) Acid formic 0,2% Acetonitril 71 29 71 29 65 35 65 35 45 55 12 45 55 Mẫu chuẩn - Dung dịch chuẩn gốc (hỗn hợp quercetin chuẩn nồng độ 20 μg/mL diosmin chuẩn nồng độ 10 μg/mL): cân xác khoảng mg quercetin mg diosmin cho vào bình định mức 100 mL, thêm khoảng 80 mL hỗn hợp dung môi methanol:DMSO tỷ lệ 8:2, siêu âm 10 phút, bổ sung hỗn hợp dung môi tới vạch - Dung dịch chuẩn (nồng độ quercetin 1,428 µg/mL, nồng độ diosmin 0,714 µg/mL): hút 714 µL dung dịch chuẩn gốc cho vào bình định mức 10 mL, thêm mL dung môi methanol:DMSO tỷ lệ 8:2, siêu âm 10 phút, bổ sung vừa đủ dung môi tới vạch, lọc qua màng lọc 0,22μm Mẫu thử Cân xác khoảng 0,0714 g DQE vào bình định mức mL, thêm khoảng mL dung môi methanol:DMSO (8:2), siêu âm 10 phút, bổ sung hỗn hợp dung mơi tới vạch, lọc qua màng lọc 0,22 µm Cách tiến hành Tiêm riêng biệt 20 µL dung dịch chuẩn dung dịch thử Tiến hành sắc ký theo điều kiện mô tả, ghi nhận sắc ký đồ Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PL - Yêu cầu: Thời gian lưu diosmin quercetin (tR 5,3 9,4 phút) sắc ký đồ mẫu thử lô DQE tương ứng với thời gian lưu diosmin quercetin sắc ký đồ mẫu hỗn hợp chuẩn Định lượng: Tiến hành phương pháp HPLC Điều kiện sắc ký HPLC Cột pha đảo: Thermo Scientific Syncronis C18 (250 x 4,6 mm; μm) Tiền cột: C18 HQ105 (4 x 10 mm; µm) Nhiệt độ cột: 30 oC Tốc độ dịng: 0,8 mL/phút Thể tích tiêm mẫu: 20 μL Bước sóng phát hiện: 268 nm Chương trình pha động: Thời gian (phút) Acid formic 0,2% Acetonitril 71 29 71 29 65 35 65 35 45 55 12 45 55 Mẫu chuẩn - Dung dịch chuẩn gốc (hỗn hợp quercetin chuẩn nồng độ 20 μg/mL diosmin chuẩn nồng độ 10 μg/mL): cân xác khoảng mg quercetin mg diosmin cho vào bình định mức 100 mL, thêm khoảng 80 mL hỗn hợp dung môi methanol: DMSO tỷ lệ 8:2, siêu âm 10 phút, bổ sung hỗn hợp dung môi tới vạch - Dung dịch chuẩn (nồng độ quercetin 1,428 µg/mL, nồng độ diosmin 0,714 µg/mL): hút 714 µL dung dịch chuẩn gốc cho vào bình định mức 10 mL, Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PL - thêm mL dung môi methanol: DMSO tỷ lệ 8:2, siêu âm 10 phút, bổ sung vừa đủ dung môi tới vạch, lọc qua màng lọc 0,22μm Mẫu thử Cân xác khoảng 0,0714 g DQE vào bình định mức mL, thêm khoảng mL dung môi methanol:DMSO (8:2), siêu âm 10 phút, bổ sung hỗn hợp dung mơi tới vạch, lọc qua màng lọc 0,22 µm Cách tiến hành Tiêm riêng biệt 20 µL dung dịch chuẩn dung dịch thử Tiến hành sắc ký theo điều kiện mơ tả, ghi nhận sắc ký đồ Tính hàm lượng (%) diosmin quercetin theo diện tích pic Hàm lượng diosmin quercetin (%) DQE tính theo cơng thức: 𝑋 (%) = 𝑆 ×𝐶 × x độ tinh khiết chuẩn × 100 𝑆 × 1000 m St, Sc : Diện tích pic diosmin (hoặc quercetin) mẫu thử mẫu chuẩn C : Nồng độ dung dịch diosmin (hoặc quercetin) chuẩn (µg/mL) m : Khối lượng cân DQE (mg) ………, ngày …… tháng …… năm Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn