Nghiên cứu tác dụng kháng khuẩn và độc tính cấp, độc tính tại chỗ của tinh dầu vỏ quả chúc (citrus hystrix) trồng ở an giang

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y DƯỢC CẦN THƠ TRẦN ĐỖ THIÊN TRÍ NGHIÊN CỨU TÁC DỤNG KHÁNG KHUẨN VÀ ĐỘC TÍNH CẤP, ĐỘC TÍNH TẠI CHỖ CỦA TINH DẦU VỎ QUẢ CHÚC (Citrus hystrix) TRỒNG Ở AN GIANG LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ ĐẠI HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC ThS TRẦN HOÀNG YẾN ThS NGUYỄN HOÀNG YẾN Cần Thơ – 2018 LỜI CẢM ƠN Em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến Ths.Ds Trần Hồng Yến hướng dẫn tận tình, truyền đạt kiến thức, kinh nghiệm, giúp đỡ cho em suốt trình thực đề tài Em xin cảm ơn thầy PGS.TS Phạm Thành Suôl tạo điều kiện cho em hoàn thành tốt luận văn Em xin cảm ơn thầy PGS.TS Dương Xn Chữ, Ths.Bs Cao Thị Kim Hồng, thầy Ths.Ds Lê Thanh Vĩnh Tuyên truyền đạt kiến thức kinh nghiệm, giúp đỡ em hoàn thành tốt luận văn Em xin gửi lời cảm ơn đến thầy cô liên môn Dược lý-Dược lâm sàng Trường Đại học Y dược Cần Thơ giúp đỡ, tạo điều kiện thuận lợi thời gian làm luận văn Em xin gửi lời cảm ơn đến anh Cơng Vinh (lớp CKII) khơng ngại khó khăn dành thời gian để giúp đỡ hỗ trợ em thời gian nghiên cứu Cảm ơn bạn nhóm đề tài Dược lý nhóm đề tài Dược liệu khóa 39 đồng hành, nhiệt tình giúp đỡ, chia sẻ kinh nghiệm quý báu cho Cảm ơn gia đình ln dõi theo ủng hộ, tạo điều kiện để thực tốt luận văn LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu riêng tơi Các số liệu, kết nêu luận văn trung thực chưa cơng bố cơng trình nghiên cứu khác Cần Thơ, ngày 14 tháng năm 2018 Trần Đỗ Thiên Trí i MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN LỜI CAM ĐOAN MỤC LỤC i DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT iii DANH MỤC CÁC BẢNG iv DANH MỤC HÌNH v ĐẶT VẤN ĐỀ Chương TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tổng quan Chúc 1.1.1.Giới thiệu chung mô tả 1.1.2.Phân bố, thu hái chế biến 1.1.3.Ứng dụng dân gian 1.1.4.Thành phần hóa học 1.1.5.Các nghiên cứu tác dụng dược lý hoạt tính sinh học tinh dầu Chúc 1.2 Tổng quan mơ hình thử tác dụng kháng khuẩn 1.2.1.Các vi khuẩn thường gặp 1.2.2.Phương pháp nghiên cứu tác dụng kháng khuẩn in vitro 10 1.3 Tổng quan mơ hình thử độc tính cấp 16 1.3.1 Định nghĩa độc tính thuốc 16 1.3.2 Độc tính cấp thuốc 16 1.3.3 Tầm quan trọng việc xác định LD50 17 1.3.4 Mơ hình thử độc tính cấp 19 1.3.5 Quan sát ghi chép kết 21 1.3.6 Cách tính LD50 22 1.4 Tổng quan mơ hình thử độc tính chỗ 22 1.4.1 Mục đích thử nghiệm độc tính chỗ 22 1.4.2 Một số phương pháp nghiên cứu độc tính chỗ 23 Chương ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 24 ii 2.1 Đối tượng, hóa chất, vật liệu, thiết bị nghiên cứu động vật thí nghiệm 24 2.1.1.Đối tượng nghiên cứu 24 2.1.2.Động vật thí nghiệm 24 2.1.3.Hố chất dung mơi 24 2.1.4.Dụng cụ trang thiết bị 25 2.1.5.Vật liệu 25 2.1.6.Địa điểm nghiên cứu 25 2.1.7.Thời gian nghiên cứu 25 2.2 Phương pháp nghiên cứu 26 2.2.1.Khảo sát hoạt tính kháng khuẩn tinh dầu vỏ Chúc 26 2.2.2.Khảo sát độc tính cấp tinh dầu vỏ Chúc 29 2.2.3.Khảo sát độc tính chỗ tinh dầu vỏ Chúc 31 Chương KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 35 3.1 Kết khảo sát hoạt tính kháng khuẩn tinh dầu vỏ Chúc 35 3.1.1.Kết định tính khả kháng khuẩn 35 3.1.2.Kết xác định giá trị MIC 36 3.2 Kết khảo sát độc tính cấp tinh dầu vỏ Chúc 37 3.3 Kết khảo sát độc tính chỗ tinh dầu vỏ Chúc 41 Chương BÀN LUẬN 43 4.1 Khảo sát hoạt tính kháng khuẩn tinh dầu vỏ Chúc 43 4.2 Khảo sát độc tính cấp tinh dầu vỏ Chúc 44 4.3 Khảo sát độc tính chỗ tinh dầu vỏ Chúc 47 KẾT LUẬN 49 KIẾN NGHỊ 50 TÀI LIỆU THAM KHẢO 51 iii DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT Chữ viết tắt MIC Tiếng Anh Minimal inhibitory concentration MBC Minimal bactericidal concentration CFU NAD Colony forming unit Nicotinamide adenine dinucleotide Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate 50% Lethal concentration The half maximal inhibitory concentration Median lethal dose Methicillin-susceptible Staphylococcus aureus Methicillin-resistant Staphylococcus aureus Tryptic Soy Broth Tryptic Soy Agar Mueller-Hinton agar Dimethylformamid Polyethylen glycol Dimethyl sulfoxide NADP LC50 IC50 LD50 MSSA MRSA TSB TSA MHA DMF PEG DMSO Tiếng Việt Nồng độ ức chế tối thiểu Nồng độ diệt khuẩn tối thiểu Đơn vị tạo khuẩn lạc Nồng độ ức chế 50% đối tượng thử Liều chết 50% Tụ cầu vàng nhạy Methicillin Tụ cầu vàng kháng Methicillin iv DANH MỤC CÁC BẢNG Trang Bảng 2.1 Cân nặng thỏ nồng độ tinh dầu sử dụng 32 Bảng 2.2 Thang điểm đánh giá mức độ kích ứng da thỏ 34 Bảng 2.3 Đánh giá mức độ kích ứng dựa vào trị số trung bình .34 Bảng 3.1 Định tính khả kháng khuẩn .35 Bảng 3.2 Giá trị MIC chất thử nghiệm .36 Bảng 3.3 Kết khảo sát độc tính cấp tinh dầu vỏ Chúc .37 Bảng 3.4 Kết khảo sát độc tính chỗ tinh dầu vỏ Chúc 42 v DANH MỤC HÌNH Trang Hình 1.1 Cây Chúc (Citrus hystrix) Hình 2.1 Mơ tả hình vẽ đĩa giấy có vịng kháng khuẩn 27 Hình 2.2 Cách cấy đĩa thạch 28 Hình 2.3 Mơ hình thử nghiệm độc tính tinh dầu vỏ Chúc da bụng thỏ 33 Hình 3.1 Kết định tính khả kháng khuẩn tinh dầu vỏ Chúc 35 Hình 3.2 Giá trị MIC chủng Streptococcus pneumoniae 36 Hình 3.3 Giá trị MIC chủng Haemophilus influenzae 36 Hình 3.4 Giá trị MIC chủng Staphylococcus aureus .36 Hình 3.5 Đại thể gan (A), thận (B) liều 2500mg/Kg (PO) 38 Hình 3.6 Đại thể gan (A), thận (B) liều 3000mg/Kg (PO) 38 Hình 3.7 Đại thể gan (A), thận (B) liều 3500mg/Kg (PO) 39 Hình 3.8 Đại thể gan (A), thận (B) liều 4000mg/Kg (PO) 39 Hình 3.9 Đại thể gan (A), thận (B) liều 4500mg/Kg (PO) 40 Hình 3.10 Đại thể gan (A), thận (B) liều 5000mg/Kg (PO) 40 Hình 3.11 Kết khảo sát độc tính chỗ dầu oliu tinh dầu vỏ Chúc nồng độ 40mg/mL dầu oliu 41 Hình 3.12 Kết khảo sát độc tính chỗ tinh dầu vỏ Chúc nồng độ 80mg/mL 120mg/mL dầu oliu 42 ĐẶT VẤN ĐỀ Việt Nam đất nước có truyền thống lâu đời y học cổ truyền Từ xa xưa ông cha ta biết sử dụng loài cỏ tự nhiên để chữa trị bệnh đơn giản Qua thời gian dài khai thác, thăm dò, đúc kết, du nhập giống từ nước ngoài, nguồn gen dược liệu Việt Nam trở nên vô phong phú, đa dạng chủng loại lẫn công dụng trị liệu, đầu tư nghiên cứu, ứng dụng rộng rãi điều trị Vùng An Giang với diện tích rừng rộng lớn, khí hậu nhiệt đới gió mùa, nóng ẩm quanh năm, đặc biệt có địa hình núi trung bình đồi thấp, điều kiện thổ nhưỡng đa dạng, nguồn nước dồi dào, môi trường thuận lợi cho sinh sôi, phát triển nhiều lồi thực vật, có nhiều thuốc quý, đặc hữu, có giá trị kinh tế cao Hưởng ứng Quyết Định 1976/QĐ-TTG ngày 30/10/2013 Thủ tướng Chính phủ “Quy hoạch tổng thể phát triển dược liệu đến năm 2020 định hướng đến năm 2030” với mục tiêu phát triển dược liệu thành ngành sản xuất hàng hóa, bên cạnh phải đảm bảo cân khai thác bảo tồn [14], tỉnh An Giang có động thái tích cực nghiên cứu phát triển nguồn tài nguyên dược liệu chỗ Tuy nhiên việc phát triển dược liệu thành sản phẩm hàng hóa có tác dụng trị liệu vấp phải nhiều khó khăn, tác dụng điều trị thực dược liệu dấu chấm hỏi lớn cho người tiêu dùng lẫn bác sĩ điều trị Vì yêu cầu cấp thiết đặt phải chứng minh công dụng thực tế, hết mức độ an toàn dược liệu sử dụng người Do đó, thử tiền lâm sàng bước quan trọng, có vai trị định nghiên cứu phát triển chế phẩm trị liệu Cây Chúc (citrus hystrix) loài thực vật đặc hữu An Giang, tỉnh quan tâm phát triển Dân gian dùng Chúc loại gia vị, dùng để gội đầu, trồng Chúc quanh nhà để đuổi rắn Ở Việt Nam, dược liệu Chỉ thực Chỉ xác thường sử dụng từ Chúc [11] Hiện nay, chưa có đề tài nghiên cứu tinh dầu vỏ Chúc nước công bố Trong đó, tinh dầu vỏ Chúc nghiên cứu giới chứng minh có tác dụng kháng khuẩn, kháng nấm tốt, đặc biệt với dòng vi khuẩn thường gặp viêm nhiễm đường hô hấp [36] Mùi tinh dầu cịn có tác dụng chống muỗi tốt [35], dùng trị liệu mùi hương để giảm stress hỗ trợ điều trị trầm cảm [23], Cây Chúc cho thấy loài đa dụng, có tiềm để phát triển thành nhiều dịng sản phẩm khác nhau, mang lại lợi ích kinh tế to lớn Xuất phát từ thực tế trên, tiến hành “Nghiên cứu tác dụng kháng khuẩn độc tính cấp, độc tính chỗ tinh dầu vỏ Chúc (Citrus hystrix) trồng An Giang” nhằm làm rõ hoạt tính sinh học độ an toàn tinh dầu vỏ Chúc, giúp cho việc nghiên cứu tinh dầu Chúc ngày rõ ràng đồng thời góp phần nâng cao giá trị sử dụng Chúc khai thác hiệu tiềm kinh tế mà mang lại Đề tài thực với ba mục tiêu cụ thể sau: - Khảo sát tác dụng kháng khuẩn tinh dầu vỏ Chúc - Khảo sát độc tính cấp tinh dầu vỏ Chúc - Khảo sát độc tính chỗ tinh dầu vỏ Chúc