Khảo sát sự đa dạng và tập tính ăn máu của muỗi ở vùng lưu hành dịch sốt rét và sốt xuất huyết dengue tại hai tỉnh khánh hòa và bình phước việt nam

ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI LUẬN VĂN THẠC SĨ Khảo sát đa dạng tập tính ăn máu muỗi vùng lưu hành dịch sốt rét sốt xuất huyết dengue hai tỉnh Khánh Hoà Bình Phước, Việt Nam NGUYỄN VI ÁNH Anh.NV211160M@sis.hust.edu.vn Ngành: Cơng nghệ sinh học Giảng viên hướng dẫn: TS Đặng Minh Hiếu TS Trần Vũ Phong Viện: Công nghệ sinh học - Công nghệ thực phẩm HÀ NỘI, 4/2023 ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI LUẬN VĂN THẠC SĨ Khảo sát đa dạng tập tính ăn máu muỗi vùng lưu hành dịch sốt rét sốt xuất huyết dengue hai tỉnh Khánh Hồ Bình Phước, Việt Nam NGUYỄN VI ÁNH Anh.NV211160M@sis.hust.edu.vn Ngành: Công nghệ sinh học Giảng vên hướng dẫn: TS Đặng Minh Hiếu TS Trần Vũ Phong Viện: Chữ ký GVHD Chữ ký GVHD Công nghệ sinh học – Công nghệ thực phẩm HÀ NỘI, 04/2023 CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM Độc lập – Tự – Hạnh phúc BẢN XÁC NHẬN CHỈNH SỬA LUẬN VĂN THẠC SĨ Họ tên tác giả luận văn: NGUYỄN VI ÁNH Đề tài luận văn:” Khảo sát đa dạng tập tính ăn máu muỗi vùng lưu hành dịch sốt rét sốt xuất huyết dengue hai tỉnh Khánh Hịa Bình Phước, Việt Nam.” Chun ngành: Cơng nghệ sinh học Mã số SV: 20211160M Tác giả, Người hướng dẫn khoa học Hội đồng chấm luận văn xác nhận tác giả sửa chữa, bổ sung luận văn theo biên họp Hội đồng ngày… .……với nội dung sau: + Bổ sung cam đoan sử dụng số liệu đề tài + Chỉnh sửa phần tổng quan: Bổ sung thêm đặc điểm hình thái muỗi Aedes, việt hóa bảng 1.2, thay hình 1.19 thành đồ có biển đảo + Bổ sung giống tiết phương pháp vật liệu: Thay đặc điểm tỉnh Khánh Hòa huyện Khánh Vĩnh tỉnh Khánh Hòa.Thay tỉnh Bình Phước huyện Bù Gia Mập tỉnh Bình Phước.Thay sơ đồ địa điểm nghiên cứu đồ có đầy đủ biển đảo -Bổ sung số lượng người tham gia bẫy phương pháp thu mẫu muỗi bẫy lưới đôi dùng mồi người - Thay “chi” “giống” muỗi bảng 2.1 - Bổ sung tên chứng dương chứng âm + Bổ sung kết thảo luận: Tách bảng phân bố giống muỗi theo sinh cảnh xã Đắc- Ơ tỉnh Bình Phước xã Khánh Thành tỉnh Khánh Hòa.Gộp bảng tỷ lệ phần trăm muỗi Anopheles theo sinh cảnh Bình Phước Khánh Hòa - Tách bảng phân bố giống muỗi theo mùa xã Đắc – Ơ, tỉnh Bình Phước xã Khánh Thành tỉnh Khánh Hòa.Gộp bảng tỷ lệ phần trăm muỗi Anopheles theo mùa Khánh Hòa Bình Phước - Tách bảng phân bố giống muỗi theo bẫy xã Đắc – Ơ tỉnh Bình Phước xã Khánh Thành tỉnh Khánh Hòa.Gộp bảng muỗi Anopheles theo bẫy Khánh Hịa Bình Phước - Bổ sung thích Marker vào ảnh điện di + Bổ sung số lượng muỗi hình 3.1, 3.2, 3.3, 3.4, 3.5,3.6 vào phần phụ lục + Sửa chữa số lỗi tả + Việt hóa từ tiếng Anh + Chỉnh sửa tài liệu tham khảo theo quy định Ngày Giáo viên hướng dẫn TS Đặng Minh Hiếu TS Trần Vũ Phong tháng năm 2023 Tác giả luận văn Nguyễn Vi Ánh CHỦ TỊCH HỘI ĐỒNG Phản biện hội đồng PGS.TS Trần Liên Hà TS Nguyễn Văn Dũng LUẬN VĂN THẠC SĨ KHẢO SÁT SỰ ĐA DẠNG VÀ TẬP TÍNH ĂN MÁU CỦA MUỖI Ở VÙNG LƯU HÀNH DỊCH SỐT RÉT VÀ SỐT XUẤT HUYẾT DENGUE TẠI HAI TỈNH KHÁNH HỒ VÀ BÌNH PHƯỚC, VIỆT NAM NGUYỄN VI ÁNH Ngành Công nghệ sinh học Giáo viên hướng dẫn Giáo viên hướng dẫn Đặng Minh Hiếu Trần Vũ Phong LỜI CAM ĐOAN Tôi Nguyễn Vi Ánh, học viên lớp cao học khóa 2021A- chun ngành cơng nghệ sinh học, trường đại học Bách Khoa hà nội xin cam đoan: Đây luận văn thân tham gia thực hướng dẫn TS Đặng Minh Hiếu TS Trần Vũ Phong Cơng trình khơng trùng lặp với bất ký nghiên cứu khác công bố Việt Nam Các số liệu thông tin, bảng biểu trung thực, xác nhận chấp nhận quan chủ trì đề tài cho phép lấy số liệu Tơi xin hồn tồn chịu trách nhiệm cam kết Hà Nội, ngày tháng năm 2023 Học viên Nguyễn Vi Ánh LỜI CẢM ƠN Trong suốt thời gian học tập, nghiên cứu hoàn thành luận văn, nhận hướng dẫn, bảo tận tình thầy giáo, giúp đỡ, động viên bạn bè, đồng nghiệp gia đình Lời đầu tiên, tơi xin bày tỏ lịng kính trọng biết ơn sâu sắc tới TS Đặng Minh Hiếu TS Trần Vũ Phong tận tình hướng dẫn dành nhiều thời gian, công sức, giúp đỡ động viên tơi suốt q trình thực đề tài hồn thành luận văn Tơi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến anh chị em, bạn bè đồng nghiệp khoa Công trùng Động vật y học giúp đỡ, tạo điều kiện thuận lợi cho suốt thời gian thực đề tài Tôi xin chân thành cảm ơn sâu sắc đến Thầy, cô giáo Viện Công nghệ sinh học – Công nghệ thực phẩm, trường Đại học Bách Khoa Hà Nội tạo điều kiện thuận lợi cho học tập hồn thành luận văn Cuối cùng, tơi xin gửi lời cảm ơn đến tất người thân, bạn bè, người bên cạnh động viên giúp đỡ tơi suốt q trình học tập thực đề tài Xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày tháng năm 2023 Tác giả luận văn Nguyễn Vi Ánh TÓM TẮT NỘI DUNG LUẬN VĂN Việt Nam quốc gia thuộc tiểu vùng sông Mekong lớn (GMS), nơi bệnh sốt rét sốt xuất huyết vấn đề sức khỏe nghiêm trọng cộng đồng Tại tỉnh Khánh Hịa (miền Trung - Đơng Nam) Bình Phước (Tây Nam) Việt Nam, có nhiều khu vực mà bệnh sốt rét sốt xuất huyết đồng lưu hành Trong nghiên cứu trước chúng tôi, thời gian hoạt động tìm kiếm vật chủ cho lồi Anopheles hai tỉnh ghi nhận từ chiều đến sáng Thời gian cao điểm tìm kiếm vật chủ Anopheles kochi, An peditaeniatus An vagus thu thập (từ chiều đến tối), cho thấy có hoạt động sớm chiều, chí vào ban ngày Để xác định tần suất xuất hoạt động ban ngày lồi muỗi, chúng tơi tiến hành nghiên cứu đề tài: “Khảo sát đa dạng tập tính ăn máu muỗi vùng lưu hành dịch sốt rét sốt xuất huyết dengue hai tỉnh Khánh Hồ Bình Phước, Việt Nam.” nơi hoạt động thu thập thực địa 24 thực Nghiên cứu phương pháp mơ tả cắt ngang có phân tích phịng thí nghiệm Muỗi thu thập điều tra mùa: mùa khô: Từ tháng đến tháng 4/2021; mùa mưa từ tháng 9/2021 đến tháng 10/2021 Phương pháp thu thập muỗi trưởng thành phương pháp bẫy (mồi bò mồi người) bắt máy hút muỗi aspirator Cả phương pháp bẫy sẽ tiến hành song song với để so sánh kết Thời gian thu thập mẫu sẽ liên tục 24 (4 chiều - chiều), bắt 15 phút Sau muỗi thu sẽ làm tiêu định loại hình thái dựa khoá định loại muỗi Việt Nam Viện sốt rét – ký sinh trùng – côn trùng Trung Ương (2006) khoá Illustrated key to mosquitoes of Việt Nam Stojanovich CJ Scott HG (1966) Nhóm loài muỗi Anopheles phân loại phương pháp sinh học phân tử (PCR) Kết nghiên cứu: tổng cộng có 12.009 mẫu vật thu thập tỉnh Khánh Hịa Bình Phước, đại diện cho 74 loài phân loài thuộc tám giống: Aedes (15 loài), Anopheles (25 loài), Armigeres (9 loài), Culex (12 loài), giống khác Malaya (1 loài), Mansonia (4 loài), Orthopodomyia sp., Tripteroides (1 loài) Giống Culex chiếm số lượng nhiều (63,6%); giống Armigeres (18,3%); giống Anopheles (11,4%); giống Aedes (3,4%), giống khác (3,3%) Đặc biệt nghiên cứu thu thập số cá thể thuộc loài An barbirotris s.l, An maculatus, An.peditaenitus, An dirus, An.minimus hoạt động khung 06 – 09 phương pháp bẫy mồi bò Điều khác hẳn so với nghiên cứu trước thu thập muỗi Anopheles khung từ 18h-6h Bằng phương pháp sinh học phân tử (PCR) phân loại nhóm lồi Anopheles sau: - An dirus s.l xác định An dirus s.s (91%) - An maculatus s.l xác định An maculatus s.s (67%) An sawadwongporni (18%) An.rampae (2%) - An.minimus s.l xác định An.minimus s.s (50%) - An aconitus xác định An varuna (56%) An harrisoni (15%) Kết cho thấy nghiên cứu thu thập muỗi sốt rét nên mở rộng thời gian thu thập trước tối sau sáng Ngoài ra, cần nghiên cứu thêm tập tính sinh học, sinh thái lồi Anopheles, Aedes q trình thay đổi sinh cảnh từ tự nhiên (rừng) sang khu dân cư tập trung (làng) HỌC VIÊN Nguyễn Vi Ánh MỤC LỤC MỤC LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU CHƯƠNG TỔNG QUAN NGHIÊN CỨU 1.1 Sinh học, sinh thái vai trò truyền bệnh muỗi nghiên cứu 1.1.1 Đặc điểm hình thái, sinh học, sinh thái, phân bố vai trò truyền bệnh muỗi Aedes 1.1.2 Đặc điểm hình thái, sinh học, sinh thái, phân bố vai trò truyền bệnh muỗi Anopheles 1.1.3 Đặc điểm hình thái,sinh học, sinh thái, phân bố vai trò truyền bệnh muỗi Culex 13 1.1.4 Đặc điểm hình thái,sinh học, sinh thái,phân bố vai trò truyền bệnh muỗi Armigeres 18 1.2 Một số nghiên cứu muỗi Anopheles dựa vào vùng ITS2 20 CHƯƠNG PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 23 2.1 Đối tượng nghiên cứu 23 2.2 Thời gian nghiên cứu 23 2.3 Địa điểm nghiên cứu 23 2.3.1 Địa điểm nghiên cứu thực địa 23 2.3.2 Địa điểm nghiên cứu phịng thí nghiệm 25 2.4 Vật liệu nghiên cứu 25 2.4.1 Hóa chất trang thiết bị để phân loại nhóm lồi Anopheles phương pháp sinh học phân tử PCR: 25 2.5 Các phương pháp nghiên cứu 26 2.5.1 Phương pháp thu mẫu muỗi bẫy lưới đôi dùng mồi người 26 2.5.2 Phương pháp thu mẫu muỗi mồi bò 27 2.5.3 Phương pháp làm tiêu bảo quản mẫu: 27 2.5.4 Phương pháp định loại hình thái muỗi 28 2.5.5 Phương pháp phân loại nhóm lồi muỗi Anopheles phương pháp sinh học phân tử 28 2.6 Thiết kế nghiên cứu: 31 e1905, Apr 2012, doi: 10.1371/journal.pntd.0001905 [65] C M Yobo et al., “Evaluation of Human Exposure to Aedes Bites in Rubber and Palm Cultivations Using an Immunoepidemiological Biomarker,” Biomed Res Int., vol 2018, p 3572696, 2018, doi: 10.1155/2018/3572696 [66] S Sungvornyothin et al., “Seasonal Abundance and Bloodfeeding Activity of Anopheles dirus Sensu Lato in Western Thailand,” J Am Mosq Control Assoc., vol 25, no 4, pp 425– 430, Dec 2009, doi: 10.2987/09-5907.1 [67] S S Sahu, K Gunasekaran, P Vanamail, and P Jambulingam, “Seasonal prevalence & resting behaviour of Anopheles minimus Theobald & An fluviatilis James (Diptera: Culicidae) in east-central India.,” Indian J Med Res., vol 133, no 6, pp 655–661, Jun 2011 [68] V V Hưng, Nghiên cứu thành phần lồi, phân bố, tập tính, vai trị truyền sốt rét muỗi Anopheles hiệu lực kem xua, hương xua diệt muỗi NIMPE huyện Đồng Xuân, tỉnh Phú Yên, 2017- 2019 Luận án tiến sĩ chuyên ngành Côn trùng học, Viện sốt rét - Ký sinh trùng - Côn trùng Trung Ương, 2020 [69] S Sungvornyothin et al., “Trophic behavior and biting activity of the two sibling species of the Anopheles minimus complex in western Thailand,” J Vector Ecol., vol 31, no 2, pp 252–261, 2006, doi: 10.3376/10811710(2006)31[252:tbabao]2.0.co;2 [70] S Ohba, N Van Soai, D T Van Anh, Y T Nguyen, and M Takagi, “Study of mosquito fauna in rice ecosystems around Hanoi, northern Vietnam.,” Acta Trop., vol 142, pp 89–95, Feb 2015, doi: 10.1016/j.actatropica.2014.11.002 [71] Q Gao et al., “Comparison of the human-baited double net trap with the human landing catch for Aedes albopictus monitoring in Shanghai, China,” Parasit Vectors, vol 11, no 1, p 483, 2018, doi: 10.1186/s13071-0183053-8 [72] A Ponlawat and L C Harrington, “Blood Feeding Patterns of Aedes aegypti and Aedes albopictus in Thailand ,” J Med Entomol., vol 42, no 68 5, pp 844–849, Sep 2005, doi: 10.1093/jmedent/42.5.844 [73] G Yu et al., “The Anopheles community and the role of Anopheles minimus on malaria transmission on the China-Myanmar border,” Parasit Vectors, vol 6, no 1, p 264, 2013, doi: 10.1186/1756-3305-6-264 [74] H D Trung et al., “Malaria transmission and major malaria vectors in different geographical areas of Southeast Asia.,” Trop Med Int Health, vol 9, no 2, pp 230–237, Feb 2004, doi: 10.1046/j.1365- 3156.2003.01179.x [75] C Tananchai et al., “Species diversity and biting activity of Anopheles dirus and Anopheles baimaii (Diptera: Culicidae) in a malaria prone area of western Thailand,” Parasit Vectors, vol 5, no 1, p 211, 2012, doi: 10.1186/1756-3305-5-211 [76] N K Jeyaprakasam et al., “Blood meal analysis of Anopheles vectors of simian malaria based on laboratory and field studies,” Sci Rep., vol 12, no 1, p 354, 2022, doi: 10.1038/s41598-021-04106-w [77] I N Lyimo and H M Ferguson, “Ecological and evolutionary determinants of host species choice in mosquito vectors,” Trends Parasitol., vol 25, no 4, pp 189–196, 2009, doi: 10.1016/j.pt.2009.01.005 [78] G Molaei, T G Andreadis, P M Armstrong, and M Diuk-Wasser, “Host-feeding patterns of potential mosquito vectors in connecticut, USA: Molecular analysis of bloodmeals from 23 species of Aedes, Anopheles, Culex, Coquillettidia, Psorophora, and Uranotaenia,” J Med Entomol., vol 45, no 6, pp 1143–1151, 2008, doi: 10.1603/0022- 2585(2008)45[1143:HPOPMV]2.0.CO;2 [79] N S Vu et al., “Mosquitoes (diptera: Culicidae) from villages and forest areas of rural communes in khanh hoa and binh phuoc provinces, vietnam,” J Med Entomol., vol 58, no 6, pp 2264–2273, 2021, doi: 10.1093/jme/tjab106 [80] S Boyer et al., “Host-Feeding Preference and Diel Activity of Mosquito Vectors of the Japanese Encephalitis Virus in Rural Cambodia,” Pathogens, vol 10, no 2021 doi: 10.3390/pathogens10030376 69 [81] B St Laurent et al., “Host attraction and biting behaviour of Anopheles mosquitoes in South Halmahera, Indonesia,” Malar J., vol 16, no 1, p 310, 2017, doi: 10.1186/s12936-017-1950-5 [82] S S C Rund, A J O’Donnell, J E Gentile, and S E Reece, “Daily Rhythms in Transmission.,” Mosquitoes Insects, and Their vol 7, Consequences no 2, Apr for Malaria 2016, doi: 10.3390/insects7020014 [83] M D R JONES, M HILL, and A M HOPE, “The Circadian Flight Activity of the Mosquito, Anopheles Gambiae: Phase Setting by the Light Regime,” J Exp Biol., vol 47, no 3, pp 503–511, Dec 1967, doi: 10.1242/jeb.47.3.503 [84] S S C Rund, S J Lee, B R Bush, and G E Duffield, “Strain- and sexspecific differences in daily flight activity and the circadian clock of Anopheles gambiae mosquitoes.,” J Insect Physiol., vol 58, no 12, pp 1609–1619, Dec 2012, doi: 10.1016/j.jinsphys.2012.09.016 [85] J E Scanlon and U Sandhinand, “The Distribution And Biology Of Anopheles Balabacensis In Thailand (Diptera: Culicidae),” J Med Entomol., vol 2, no 1, pp 61–69, Apr 1965, doi: 10.1093/jmedent/2.1.61 [86] R Rhosenberg, R G Andre, and L Somchit, “Highly efficient dry season transmission of malaria in Thailand,” Trans R Soc Trop Med Hyg., vol 84, no 1, pp 22–28, Jan 1990, doi: 10.1016/0035-9203(90)90367-N [87] M Casas Martínez et al., “A new tent trap for monitoring the daily activity of Aedes aegypti and Aedes albopictus.,” J Vector Ecol., vol 38, no 2, pp 277–288, Dec 2013, doi: 10.1111/j.1948-7134.2013.12041.x [88] G A H Mcclelland, “Observations on the mosquito, Aedes aegypti , in East Africa I The biting cycle in an outdoor population at Entebbe, Uganda,” Bull Ent Res, vol 50, no 2, pp 227–235, 1959, [Online] Available: https://eurekamag.com/research/025/128/025128659.php [89] A Rohani et al., “Nocturnal man biting habits of mosquito species in Serian, Sarawak, Malaysia,” 2013 [90] G B S Rivas, R Teles-de-Freitas, M G Pavan, J B P Lima, A A Peixoto, and R V Bruno, “Effects of Light and Temperature on Daily 70 Activity and Clock Gene Expression in Two Mosquito Disease Vectors.,” J Biol Rhythms, vol 33, no 3, pp 272–288, Jun 2018, doi: 10.1177/0748730418772175 [91] C Gentile, G B S Rivas, A C A Meireles-Filho, J B P Lima, and A A Peixoto, “Circadian expression of clock genes in two mosquito disease vectors: cry2 is different.,” J Biol Rhythms, vol 24, no 6, pp 444–451, Dec 2009, doi: 10.1177/0748730409349169 [92] C T Ngo et al., “Diversity of Anopheles mosquitoes in Binh Phuoc and Dak Nong Provinces of Vietnam and their relation to disease,” Parasit Vectors, vol 7, no 1, p 316, 2014, doi: 10.1186/1756-3305-7-316 [93] K T Takano et al., “Partial mitochondrial DNA sequences suggest the existence of a cryptic species within the Leucosphyrus group of the genus Anopheles (Diptera: Culicidae), forest malaria vectors, in northern Vietnam,” Parasit Vectors, vol 3, no 1, p 41, 2010, doi: 10.1186/17563305-3-41 [94] H K Phuc et al., “Multiplex PCR assay for malaria vector Anopheles minimus and four related species in the Myzomyia Series from Southeast Asia.,” Med Vet Entomol., vol 17, no 4, pp 423–428, Dec 2003, doi: 10.1111/j.1365-2915.2003.00462.x [95] R E Harbach, C Garros, N D U C Manh, and S Manguin, “Formal taxonomy of species C of the,” Zootaxa, vol 54, pp 41–54, 2007 [96] Nguyễn Thị Hương Bình, Nghiên cứu tính đa hình di truyền vai trị truyền bệnh thành viên nhóm lồi Anopheles maculatus Việt Nam [68] Nguyễn Thị Hƣơng Bình (2009), Nghiên cứu tính đa hình di truyền vai trị truyền bệnh thành viên nhóm lồi Anopheles maculatus Việt Nam, Luận án tiến sỹ sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, 2009 [97] P Somboon, D Thongwat, and R E Harbach, “Anopheles (Cellia) rampae n sp., alias chromosomal form K of the Oriental Maculatus Group (Diptera: Culicidae) in Southeast Asia,” Zootaxa, vol 55, no 2810, pp 47–55, 2011, doi: 10.11646/zootaxa.2810.1.5 [98] W Van Bortel et al., “Malaria transmission and vector behaviour in a 71 forested malaria focus in central Vietnam and the implications for vector control.,” Malar J., vol 9, p 373, Dec 2010, doi: 10.1186/1475-2875-9373 [99] K Morgan et al., “Molecular phylogenetics and biogeography of the Neocellia Series of Anopheles mosquitoes in the Oriental Region,” Mol Phylogenet Evol., vol 52, no 3, pp 588–601, 2009, doi: 10.1016/j.ympev.2009.01.022 [100] R E Harbach, “The Phylogeny and Classification of Anopheles,” Anopheles mosquitoes - New insights into Malar vectors, no June, 2013, doi: 10.5772/54695 [101] S Wu et al., “Anopheles pseudowillmori is the predominant malaria vector in Motuo County, Tibet Autonomous Region.,” Malar J., vol 8, p 46, Mar 2009, doi: 10.1186/1475-2875-8-46 [102] C C M and V C District, “Aedes aegypti and Aedes albopictus Invasive Mosquito and Species Capable of Transmitting Disease.” https://www.contracostamosquito.com/invasive_mosquito_species.htm (accessed Feb 12, 2023) [103] H Kawada, Y Higa, Y T Nguyen, S H Tran, H T Nguyen, and M Takagi, “Nationwide Investigation of the Pyrethroid Susceptibility of Mosquito Larvae Collected from Used Tires in Vietnam,” PLoS Negl Trop Dis., vol 3, no 3, p e391, Mar 2009, [Online] Available: https://doi.org/10.1371/journal.pntd.0000391 72 PHỤ LỤC 1: Các bước tách chiết DNA Cho 2-3 viên bi nghiền 100 µl Buffer ATL vào giếng Plate Thêm 20 µl Proteinase K vào giếng, Nhặt chân muỗi cho vào giếng trên, đóng lắp chặt, nghiền thời gian 3-4 phút Đem ủ 560C thời gian 60 phút (sử dụng máy PCR) Ly tâm plate để tránh mẫu dính thành nắp Thêm vào mẫu 200 µl Buffer AL, trộn 15s ủ 700C 10 phút Ly tâm nhẹ tube 1.5ml loại bỏ giọt dính thành nắp Chuyển mẫu sang tube Eppendorf 1.5ml Thêm vào mẫu 200 µl Ethanol (96-100%), trộn vortex 15s Sau trộn, ly tâm nhẹ tube 1.5ml loại bỏ giọt dính thành nắp Chuyển tồn dung dịch bước vào cột QIAamp (trong ống thu 2ml) Đóng nắp ly tâm (8000 vịng/1’) Đặt cột sang tube thu thập khác (hoặc sử dụng lại tube thu thập cách đổ dung dịch lọc đi) Nếu cịn mẫu nặp lại bước hết mẫu 10 Mở thật cẩn thận cột QIAamp Mini thêm 500 µl Buffer AW1 (AW1 cho thêm cồn) Đóng nắp ly tâm (8000rpm) 1’ Đặt cột quay QIAamp ống thu 2ml loại bỏ ống chứa dịch lọc 11 Mở thật cẩn thận cột QIAamp Mini thêm 500 µl Buffer AW2 ( AW2 cho thêm cồn) Đóng nắp ly tâm tốc độ tối đa (14.000rpm) 3’ 12 Khuyến nghị: Đặt cột QIAamp ống thu 2ml Ly tâm tốc độ tối đa 1’ Bước giúp loại bỏ hội lọt qua Buffer AW2 13 Đặt cột quay QIAamp ống thu tube eppendorf Mở cẩn thận cột quay QIAamp Mini thêm 20 µl Buffer AE nước cất (nhớ cho vào màng lọc/đổi đầu côn cho mẫu khác) Ủ nhiệt độ phịng 1-2 phút sau ly tâm (8000rpm) 1’ 14 Dịch lọc có chứa DNA, thu thập bảo quản -200C sử dụng 73 Phụ lục 2: Số lượng muỗi Aedes thu theo sinh cảnh Khánh Hịa Bình Phước: Giống Aedes Aedes aegypti Aedes albopictus Aedes annandalei Aedes caecus Aedes cancricomes Aedes chrysolineatus Aedes desmotes Aedes laniger Aedes lineatopennis Aedes longirostris Aedes macfarlanei Aedes mediopunctatus Aedes prominens Aedes vigilax Aedes vittatus Aedes sp Làng 56 0 0 0 0 13 Rừng 17 100 1 13 42 1 140 Tổng 24 156 1 14 47 1 153 74 Phụ lục 3: Số lượng muỗi Anopheles thu theo sinh cảnh Khánh Hịa Bình Phước: Giống Anopheles Anopheles aconitus Anopheles argyropus Anopheles barbirotris s.l Anopheles barbumbrosus Anopheles bengalensis Anopheles crawfordi Anopheles dirus Anopheles harrisoni Anopheles karwari Anopheles kochi Anopheles jamesii Anopheles maculatus Anopheles minimus Anopheles nivipes Anopheles peditaeniatus Anopheles philippinensis Anopheles rampae Anopheles sawadwongporni Anopheles separatus Anopheles sinensis Anopheles splendidus Anopheles takasagoensis Anopheles tessellatus Anopheles vagus Anopheles varuna Anopheles sp Làng 82 11 21 40 21 61 45 Rừng 96 55 61 29 98 288 Tổng 178 66 64 21 69 119 349 50 12 21 33 21 45 54 11 63 38 30 103 16 84 1 83 34 157 75 Phụ lục 4: Số lượng muỗi Aedes theo mùa Khánh Hịa Bình Phước: Giống Aedes Aedes aegypti Aedes albopictus Aedes annandalei Aedes caecus Aedes cancricomes Aedes chrysolineatus Aedes desmotes Aedes laniger Aedes lineatopennis Aedes longirostris Aedes macfarlanei Aedes mediopunctatus Aedes prominens Aedes vigilax Aedes vittatus Aedes sp Mùa mưa 17 103 0 Mùa khô 53 Tổng 14 14 46 0 0 47 2 150 0 1 153 24 156 1 76 Phụ lục 5: Số lượng muỗi Anopheles theo mùa Khánh Hịa Bình Phước Giống Anopheles Anopheles aconitus Anopheles argyropus Anopheles barbirotris s.l Anopheles barbumbrosus Anopheles bengalensis Anopheles crawfordi Anopheles dirus Anopheles harrisoni Anopheles karwari Anopheles kochi Anopheles jamesii Anopheles maculatus Anopheles minimus Anopheles nivipes Anopheles peditaeniatus Anopheles philippinensis Anopheles rampae Anopheles sawadwongporni Anopheles separatus Anopheles sinensis Anopheles splendidus Anopheles takasagoensis Anopheles tessellatus Anopheles vagus Anopheles varuna Anopheles sp Mùa mưa Mùa khô 0 Tổng 70 108 178 1 48 19 40 45 189 44 0 62 16 29 74 160 66 64 21 69 119 349 50 15 18 33 16 3 1 60 34 81 81 0 23 76 16 84 1 83 34 157 77 Phụ lục 6: Số lượng muỗi Aedes theo bẫy Khánh Hòa Bình Phước: Giống Aedes Aedes aegypti Aedes albopictus Aedes annandalei Aedes caecus Aedes cancricomes Aedes chrysolineatus Aedes desmotes Aedes laniger Aedes lineatopennis Aedes longirostris Aedes macfarlanei Aedes mediopunctatus Aedes prominens Aedes vigilax Aedes vittatus Aedes sp Mồi bò 70 Mồi người 23 86 12 14 12 35 47 1 2 82 0 71 1 153 Tổng 24 156 1 78 Phụ lục 7: Số lượng muỗi Anopheles theo bẫy Khánh Hịa Bình Phước: Giống Anopheles Bẫy bị Anopheles aconitus Anopheles argyropus Anopheles barbirotris s.l Anopheles barbumbrosus Anopheles bengalensis Anopheles crawfordi Anopheles dirus Anopheles harrisoni Anopheles karwari Anopheles kochi Anopheles jamesii Anopheles maculatus Anopheles minimus Anopheles nivipes Anopheles peditaeniatus Anopheles philippinensis Anopheles rampae Anopheles sawadwongporni Anopheles separatus Anopheles sinensis Anopheles splendidus Anopheles takasagoensis Anopheles tessellatus Anopheles vagus Anopheles varuna Anopheles sp 178 64 55 21 69 118 340 49 Bẫy người 0 0 0 0 33 33 16 82 10 1 79 33 152 0 16 84 10 1 83 34 157 Tổng 178 66 64 21 69 119 349 50 79 TÓM TẮT LUẬN VĂN THẠC SĨ Đề tài: Khảo sát đa dạng tập tính ăn máu muỗi vùng lưu hành dịch sốt rét sốt xuất huyết dengue hai tỉnh Khánh Hịa Bình Phước, Việt Nam Tác giả luận văn:Nguyễn Vi Ánh Khóa: 2021A Người hướng dẫn: TS Đặng Minh Hiếu TS Trần Vũ Phong Từ khóa (Keyword): Muỗi, Anopheles; bẫy mồi bò; bẫy mồi người; Khánh Hòa; Bình Phước Nội dung tóm tắt: Việt Nam quốc gia thuộc tiểu vùng sông Mekong lớn (GMS) , nơi bệnh sốt rét sốt xuất huyết vấn đề sức khỏe nghiêm trọng cộng đồng Tại tỉnh Khánh Hịa (miền Trung - Đơng Nam) Bình Phước (Tây Nam) Việt nam, có nhiều khu vực mà bệnh sốt rét sốt xuất huyết đồng lưu hành Trong nghiên cứu trước chúng tôi, thời gian hoạt động tìm kiếm vật chủ cho lồi Anopheles hai tỉnh ghi nhận từ chiều đến sáng Thời gian cao điểm tìm kiếm vật chủ Anopheles kochi, An peditaeniatus An vagus thu thập (từ chiều đến tối), cho thấy có hoạt động sớm chiều, chí vào ban ngày Để xác định tần suất xuất hoạt động ban ngày lồi muỗi, chúng tơi tiến hành nghiên cứu đề tài: “Khảo sát đa dạng tập tính ăn máu muỗi vùng lưu hành dịch sốt rét sốt xuất huyết dengue hai tỉnh Khánh Hoà Bình Phước, Việt Nam.” nơi hoạt động thu thập thực địa 24 thực Nghiên cứu phương pháp mơ tả cắt ngang có phân tích phịng thí nghiệm.Muỗi thu thập điều tra mùa: mùa khô: Từ tháng đến tháng 4/2021; mùa mưa từ tháng 9/2021 đến tháng 10/2021 Phương pháp thu thập muỗi trưởng thành phương pháp bẫy (mồi bò mồi người) bắt máy hút muỗi aspirator Cả phương pháp bẫy sẽ tiến hành song song với để so sánh kết Thời gian thu thập mẫu sẽ liên tục 24 (4 chiều - chiều), bắt 15 phút Sau muỗi thu sẽ làm tiêu định loại hình thái dựa khoá định loại muỗi Việt Nam Viện sốt rét – ký sinh trùng – côn trùng Trung Ương (2006) khoá Illustrated key to mosquitoes of Việt Nam Stojanovich CJ Scott HG (1966) Nhóm lồi muỗi Anopheles phân loại phương pháp sinh học phân tử (PCR) 80 Qua kết nghiên cứu , tổng cộng có 12.009 mẫu vật thu thập tỉnh Khánh Hịa Bình Phước, đại diện cho 74 loài phân loài thuộc tám chi: Aedes (15 loài), Anopheles (25 loài), Armigeres (9 loài), Culex (12 loài), giống khác Malaya (1 loài), Mansonia (4 loài), Orthopodomyia sp., Tripteroides (1 loài) Giống Culex chiếm số lượng nhiều (63,6%); giống Armigeres (18,3%); giống Anopheles (11,4%); giống Aedes (3,4%), giống khác (3,3%) Đặc biệt nghiên cứu thu thập số cá thể thuộc loài An barbirotris s.l, An maculatus, An.peditaenitus, An dirus, An.minimus hoạt động khung 06 – 09 phương pháp bẫy mồi bò Điều khác hẳn so với nghiên cứu trước thu thập muỗi Anopheles khung từ 18h-6h Bằng phương pháp sinh học phân tử (PCR) phân loại nhóm lồi Anopheles sau: - An.dirus s.l định An dirus s.s (91%) - An.maculatus s.l xác định An maculatus s.s (67%) An.sawadwongporni (18%) An.rampae (2%) - An.minimus s.l xác định An.minimus s.s (50%), - An aconitus xác định An varuna (56%) An harrisoni (15%) Kết cho thấy nghiên cứu thu thập muỗi sốt rét nên mở rộng thời gian thu thập trước tối sau sáng Ngoài ra, cần nghiên cứu thêm tập tính sinh học, sinh thái lồi Anopheles, Aedes trình thay đổi sinh cảnh từ tự nhiên (rừng) sang khu dân cư tập trung (làng) Giảng viên hướng dẫn Học viên ( Ký ghi rõ họ tên) ( Ký ghi rõ họ tên) TS Đặng Minh Hiếu TS.Trần Vũ Phong Nguyễn Vi Ánh 81 82