NGHIÊN CỨU
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1 Khái quát về chi Oryza và vị trí cây lúa trồng trong chi Oryza
Chi Oryza lần đầu tiên được Linne mô tả vào năm 1753 Ông chỉ phát hiện ra một loài là O sativa dựa trên các mẫu lúa trồng từ Ethiopia Qua hai thế kỷ sau đó, đã có hơn 100 loài thuộc chi Oryza được các tác giả khác nhau công bố, điều này cho thấy đây là một chi rất phức tạp về mặt phân loại học.
Các loài trong chi Oryza từ lâu đã gây nên sự chú ý của nhiều nhà khoa học vì tầm quan trọng đặc biệt của nó Nhiều nghiên cứu về phân loại học, về chủng loại phát sinh và các mối quan hệ di truyền của các loài trong chi
Oryza đã được tiến hành Chi Oryza vô cùng đa dạng, được thể hiện ở các genome khác nhau, và ở sự khác biệt đáng kể về hình thái trong cùng một loài và giữa các loài Mặt khác sự khác biệt lớn trong chi phân định không rõ ràng giữa một số đơn vị phân loại trong chi Oryza Do đó các tác giả khác nhau cũng đề nghị các hệ thống phân loại khác nhau Điều đó càng làm cho hệ thống phân loại của các loài trong chi Oryza trở nên rắc rối hơn Có thể nói, cho đến nay chưa có hệ thống phân loại nào được tất cả các nhà khoa học trên thế giới công nhận chung.
Chi Oryza L thuộc tộc Oryzeae, họ phụ Oryzoideae, họ hòa thảo Poaceae
(Gramineae) Chi này gồm có: hai loài lúa trồng là O sativa L., O graberrima
Steud., và 22 loài lúa dại phân bố khắp các vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới.
Lúa trồng ở châu Á (O sativa) là cây có ý nghĩa kinh tế quan trọng và bậc nhất vì nó là cây lương thực của hơn một nửa dân số trên thế giới Tất cả các loài lúa trong chi Oryza, bao gồm cả lúa dại và lúa trồng tạo nên một vốn gen (genepool) cực kỳ có giá trị trong việc mở rộng nguồn di truyền trong các chương trình chọn tạo giống lúa.
Hiện nay trên thế giới có hai loài lúa trồng: O.sativa L và O. glaberrima Steud Loài lúa O sativa L được trồng ở châu Á nên được gọi là lúa trồng châu Á Loài O sativa L có hai thứ là O sativa var utitissima A. Camus (lúa tẻ) và O sativa var glutinosa Tanka (lúa nếp) Loài lúa trồng châu Á O sativa L có nguồn gốc từ O perennis Moench (hay O rufipogon). Loài O.glaberrima được thuần hóa ở châu Phi, được trồng ở Tây Phi, xuất hiện vào khoảng 1500 trước công nguyên, có nguồn gốc từ O breviligulata Chev Hai loài lúa trên được thuần hóa thành lúa trồng một cách độc lập với nhau Năm 1930 Kato đã phân biệt trong loài O.sativa có hai loài phụ:
O.sativa ssp Indica Kato và O.sativa ssp Japonica Kato Hai nhóm này khác nhau về hình thái, phân bố địa lý, có hiện tượng khó khăn khi lai giữa hai nhóm cũng như tính bất thụ của con lai tùy theo các dạng bố mẹ đem lai Năm
1954, Morinaga lại xác định trong loài O.sativa có thêm nhóm thứ ba là
O.sativa javanica, được tìm thấy ở Indonesia. Đến nay địa điểm xuất hiện của lúa trồng châu Á được cho là một vết dài từ chân phía Tây Nam và Đông Nam dãy núi Himalaya, qua Assam, tỉnh Yunnan của Trung Quốc, Burma, Lào, biên giới Thái Lan – Miến Điện và vùng Tây Bắc của Việt Nam Có thể có ba trung tâm xuất hiện sớm nhất của cây lúa trồng châu Á: trung tâm Assam, trung tâm biên giới Thái Lan – Miến Điện và trung tâm Tây Bắc Việt Nam Ý kiến này đã được nhiều nhà khoa học trên thế giới về nguồn gốc vùng trồng lúa và cây lúa trồng tán thành. Địa điểm xuất hiện cây lúa trồng châu Phi đơn giản hơn nhiều Đó là vùng đồng bằng Mali, cùng một số nơi khác như vùng đất cao Guinec, đồng bằng ven biển Casamance, thượng lưu sông Niger, phần Tây Nam bờ biển Guinea
Hiện nay, lúa đang được trồng trong những điều kiện sinh thái và khí hậu rất khác nhau Có thể nói, hầu hết các vùng trồng lúa trên thế giới đều là địa bàn của cây lúa châu Á, kể cả ở châu Phi, dồn cây lúa thuần hóa ở lục địa này (O.glaberrima Steud) vào Tây Phi và chỉ chiếm một diện tích nhỏ ở Guyana – Nam Mỹ Điều này đã cho thấy sự đa dạng rất lớn của nguồn gen cây lúa châu Á Đến năm 1995, viện nghiên cứu lúa quốc tế (IRRI) đã có một ngân hàng gen lúa của khắp thế giới với hơn 81000 mẫu giống, trong đó lúa châu Á có 76200 mẫu, lúa châu Phi có 3000 mẫu và lúa dại có 2400 mẫu.
1.2 Kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật
Nuôi cấy mô tế bào thực vật là phạm trù khái niệm chung cho tất cả các loại nuôi cấy nguyên liệu thực vật hoàn toàn sạch các vi sinh vật, trên môi trường dinh dưỡng trong điều kiện vô trùng [18] [20]
Nuôi cấy mô tế bào thực vật bao gồm:
- Nuôi cấy cây non và cây trưởng thành.
- Nuôi cấy cơ quan: rễ, thân, lá, hoa, quả, bao phấn, noãn chưa thụ tinh.
- Nuôi cấy phôi: phôi non và phôi trưởng thành.
- Nuôi cấy mô sẹo (callus).
- Nuôi cấy tế bào đơn (huyền phù tế bào).
- Nuôi cấy protoplast: nuôi cấy phần bên trong tế bào thực vật tách vỏ, còn gọi là nuôi cấy tế bào trần
1.2.2 Cơ sở sinh học của kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật
1.2.2.1 Tính toàn năng của tế bào
Haberlandt (1902) lần đầu tiên đã quan niệm rằng mỗi tế bào bất kỳ của một cơ thể sinh vật đa bào đều có khả năng tiềm tàng để phát triển thành một cá thể hoàn chỉnh Theo quan niệm của sinh học hiện đại thì mỗi tế bào riêng rẽ đã phân hoá đều mang toàn bộ lượng thông tin di truyền cần thiết và đủ của cả sinh vật đó Khi gặp điều kiện thích hợp, mỗi tế bào đều phát triển thành một cá thể hoàn chỉnh Đó là tính toàn năng của tế bào (totipotency).
Như vậy, tính toàn năng của tế bào thực vật là khả năng của các tế bào đã được biệt hóa (trừ một số tế bào đã được biệt hóa sâu như ống mạch, mao dẫn) có khả năng thể hiện toàn bộ hệ thống di truyền và có thể trong điều kiện phù hợp sẽ phát triển theo chu trình giống như sự phát triển phôi dẫn đến sự hình thành cây hoàn chỉnh mới.
Nền tảng quan trọng trên con đường chứng minh toàn diện về tính toàn năng của tế bào soma ở thực vật đã ghi nhận vào những năm 60 khi Steward
(1963) và Wetherell và Halperin (1963) đồng thời cùng thông báo rằng những tế bào cà rốt tự do khi nuôi cấy trên môi trường thạch đã tạo thành hàng nghìn phôi, các phôi này phát triển qua các giai đoạn giống như quá trình tạo phôi bình thường
Từ những khám phá trên, đến nay hàng loạt các thông báo về tính toàn năng của các tế bào soma đã được công bố Dường như tế bào của tất cả các cơ quan đều có khả năng phát triển phôi Phôi soma đã nhận được ở nhiều giống cây trồng như: Atrapoda, Begonia, Citrus, Coffea, Cymbidium,
Hordeum, Kalanchoe, Nicotinana, Panax, Pinus, Ranumculus, Solanum, Oryza, và nhiều loài cây khác nữa.
1.2.2.2 Sự phản phân hoá và phân hoá của tế bào
Cơ thể thực vật trưởng thành là một nhóm chính thể thống nhất bao gồm nhiều cơ quan chức năng khác nhau, được hình thành từ nhiều loại tế bào khác nhau Tuy nhiên tất cả các loại tế bào đó đều bắt nguồn từ một tế bào đầu tiên (tế bào hợp tử) Ở giai đoạn đầu, tế bào hợp tử tiếp tục phân chia hình thành nhiều tế bào phôi sinh chưa mang chức năng riêng biệt (chuyên hoá). Sau đó từ các tế bào phôi sinh này chúng tiếp tục được biến đổi thành các tế bào chuyên hoá đặc biệt cho các mô, cơ quan có chức năng khác nhau.
Sự phân hoá tế bào là sự chuyển các tế bào phôi sinh thành các tế bào mô chuyên hoá, đảm nhận các chức năng khác nhau Ví dụ: Mô dậu làm nhiệm vụ quang hợp, mô bì làm nhiệm vụ bảo vệ, nhu mô dự trữ làm nhiệm vụ dự trữ, mô dẫn làm chức năng dẫn nước và dẫn dinh dưỡng.
Quá trình phân hoá tế bào có thể biểu thị:
Tế bào phôi sinh Tế bào dãn Tế bào phân hoá có chức năng riêng biệt
ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1 Đối tượng nghiên cứu Đối tượng nghiên cứu là 4 dòng lúa có triển vọng được nhận từ Bộ môn Công nghệ sinh học, Khoa Nông học, Trường Đại học Nông nghiệp I gồm: N46, N18, NV1, N91.
2.1.1 Dòng N18 Được tạo ra khi lai giống Tẻ trung với dòng IRBB4 chứa gen kháng bệnh bạc lá Xa4 Cây cao khoảng 110 cm, thời gian sinh trưởng vụ mùa: 100 – 105 ngày, vụ xuân 135 – 140 ngày Đẻ nhánh trung bình, số nhánh hữu hiệu trên khóm cao Chịu thâm canh vừa phải, thích hợp trên chân đất vàn và vàn cao, đất pha cát, đất cát, đất cằn cỗi Kháng bệnh bạc lá, nhiễm nhẹ khô vằn Khả năng thích ứng chưa cao Bông to, số hạt trên bông khoảng 350 – 450 hạt. Khối lượng 1000 hạt 23g Năng suất bình quân 7,0 – 7,5 tấn/ha/vụ Chất lượng gạo tốt.
Là dòng được tạo ra khi lai giống Lúa tẻ thơm với dòng IRBB7 chứa gen kháng bệnh bạc lá Xa-7 Cây cao khoảng 95 – 100 cm, thời gian sinh trưởng vụ mùa: 100 – 110 ngày, vụ xuân 135 – 145 ngày Là giống chịu thâm canh,kháng bệnh bạc lá, đạo ôn, sâu cuốn lá, cứng cây, bộ lá khỏe, phù hợp trên nhiều chân đất Khả năng đẻ nhánh trung bình, số nhánh hữu hiệu trên khóm cao Bông to, số hạt trên bông khoảng 200 – 250 hạt Tỷ lệ hạt chắc cao, chất lượng gạo tốt, gạo thơm, mềm, ngon hơn gạo tám thơm Năng xuất trung bình đạt 6,5 – 7,0 tấn/ha/vụ, thâm canh tốt có thể đạt 7,5 – 7,8 tấn/ha/vụ.
2.1.3 Dòng N91 Được tạo ra khi lai giống (90-50) với dòng IRBB5 chứa gen kháng bệnh bạc lá Xa-5 Cây cao trung bình 90 – 100cm Thời gian sinh trưởng vụ mùa 105-110 ngày, vụ xuân 130-140 ngày Thân cứng, lá to khỏe chống đổ và kháng bệnh bạc lá rất tốt, chịu thâm canh cao, thích ứng rộng Đẻ nhánh khỏe, tỷ lệ nhánh và bông hữu hiệu trên khóm cao Số hạt chắc trên bông đạt 250-
300 hạt/bông, khối lượng 1000 hạt là 24g Năng xuất đạt 6,7 tấn/ha/vụ, thâm canh tốt có thể đạt 7,3 – 7,5 tấn/ha/vụ.
2.1.4 Giống NV1 Được tạo ra khi lai giống lúa nếp TK90 và Nếp cẩm vở đỏ, sau đó chọn lọc các thể nhiều đời chọn ra dòng nếp đặt tên là NV1 Giống lúa NV1 có thời gian sinh trưởng dài, vụ xuân từ 140 – 150 ngày, vụ mùa 110 – 120 ngày Cây cao khoảng 95 – 100cm, bộ lá đứng, hình lòng mo, chống đổ và chống chịu bệnh bạc lá và đạo ôn khá, đặc biệt chịu rét rất tốt Số hạt trên bông đạt từ 130 – 160 hạt, khối lượng 1000 hạt là 27,0 gram, tỷ lệ gạo xát trên 65%, gạo đẹp, trắng sữa, rất thơm và dẻo.
2.2.1 Phương pháp nuôi cấy mô
Nuôi cấy mô và tế bào thực vật đã được tiến hành ở Việt Nam từ giữa những năm 70 của thế kỷ XX Cơ sở của kỹ thuật nuôi cấy mô, tế bào thực vật là tính toàn năng của tế bào thực vật Tính toàn năng của tế bào thực vật là khả năng của các tế bào đã biệt hoá (trừ một số loại tế bào đã biệt hoá sâu như ống mạch, mao dẫn) có khả năng thể hiện toàn bộ hệ thống di truyền và có thể trong điều kiện phù hợp sẽ phát triển theo chu trình giống như sự phát triển phôi dẫn đến hình thành cây hoàn chỉnh mới.
Trong nghiên cứu này các giống sẽ được tiến hành nuôi cấy In vitro theo quy trình sau:
Trong tối 1 tuần, ra sáng 2 tuần
Hạt khử trùng Môi trường tạo calus Callus
→ Xử lý phóng xạ bằng tia Gamma (Co 60 ) Cấy sẹo sang môi
5 tuần trường tái sinh chồi Chuyển sang môi trường tái sinh rễ
2.2.1.1 Phương pháp khử trùng mẫu vật
Hóa chất và thời gian khử trùng mẫu phải đảm bảo tiêu diệt các nguồn gây nhiễm như nấm và vi khuẩn Các mẫu cấy đã chọn được rửa bằng xà phòng dưới dòng nước chảy rồi mới cho vào ngâm trong dung dịch khử trùng. Để tăng khả năng xâm nhập của chất diệt khuẩn, thông thường người ta xử lí mô nuôi cấy trong cồn 70% trong 30 giây đến 1 phút, sau đó mới xử lí trong dung dịch diệt khuẩn Trong thời gian xử lí, mô cấy phải được ngập hoàn toàn trong dung dịch diệt khuẩn Khi xử lí xong mô cấy được rửa nhiều lần trong nước cất vô trùng (3-5 lần).
Một số hóa chất thường được sử dụng để khử trùng mẫu cấy trong nuôi cấy invitro được trình bày trong bảng 2.1:
Bảng 2.1: Các hóa chất thường được sử dụng trong việc khử trùng mẫu cấy
Stt Hóa chất Nồng độ Thời gian khử trùng
Trong nghiên cứu này, 3 loại hóa chất khử trùng mẫu được sử dụng là:
- Hypochlorite sodium (NaOCl) nồng độ 2,25%.
- Chlorua thủy ngân (HgCl2) nồng độ 0,1%
Các hóa chất trên có thể sử dụng độc lập để khử trùng (khử trùng đơn) hoặc được phối hợp với nhau (khử trùng kép) Thí nghiệm khử trùng mẫu trong nghiên cứu này được bố trí theo bảng 2.2:
Bảng 2.2: Các thí nghiệm công thức khử trùng
Phương pháp Hóa chất Thời gian khử trùng (Phút)
NaOCl 2,25% + NaOCl 2,25% 10 + 15; 12 + 18; 15 + 20 HgCl2 0,1% + NaOCl 2,25% 7 + 15; 10 + 20; 10 + 25 HgCl2 0,1% + HgCl2 0,1% 5 + 7; 7 + 9
Các công thức khử trùng trên được tiến hành ở tất cả các dòng lúa nghiên cứu, riêng dòng N46 được tiến hành thêm một công thức khử trùng là: HgCl2 0,1% + HgCl2 0,1% trong thời gian 10 + 15 phút.
Trong mỗi thí nghiệm, chúng tôi tiến hành theo dõi các chỉ tiêu:
Qua đó đánh giá hiệu quả của công thức khử trùng đối với từng dòng.
2.2.1.2 Phương pháp nghiên cứu môi trường nuôi cấy phù hợp a) Nghiên cứu môi trường tạo sẹo (Callus)
Tạo calus là bước đầu tiên và cũng là bước quan trọng nhất trong một chu kỳ nuôi cấy mô thực vật nói chung và nuôi cấy mô lúa nói riêng Do đó, việc lựa chọn được môi trường tạo callus phù hợp đóng vai trò quyết định đến việc thành bại của thí nghiệm Trên cơ sở những nghiên cứu của Shazia Bano và cộng sự (2005)[38], Lê Xuân Đắc (2007)[7], Lã Thị Luyến (2008)[12], Nguyễn Đức Thành [20], chúng tôi tiến hành thí nghiệm trên các môi trường sau:
(C1): MS + 3% Sucrose + 0,8% Agarose + 1mg/l NAA + 0,2 mg/l BAP
(C2): MS + 3% Sucrose + 0,8% Agarose + 1mg/l 2,4D + 0,2 mg/l BAP
(C4): MS + 3% Sucrose + 0,8% Agarose + 0,1mg/l αNAA + 0,2mg/l BAP + 2mg/l 2,4D
(C5): MS + 3% Sucrose + 0,8% Agarose + 0,1mg/l αNAA + 0,2mg/l BAP + 2,5mg/l 2,4D
Hạt lúa đã tách vỏ sau khi được khử trùng, đặt lên giấy thấm vô trùng, chờ cho khô mẫu, sau đó mẫu được cấy vào trong môi trường tạo mô sẹo với mật độ
10 – 15 hạt/1 bình tam giác 250ml và để vào tối ở nhiệt độ 25 0 C Một tuần sau khi cấy khối mô sẹo đạt kích thước khoảng 1-2 mm thì đưa ra chỗ sáng với cường độ 2000 lux, thời gian chiếu sáng 10 giờ/ngày Để đánh giá mức độ phù hợp của môi trường, chúng tôi tiến hành theo dõi tỷ lệ phần trăm mô sẹo được tạo ra.
Số mô sẹo được tạo ra
Tỷ lệ mô sẹo được tạo ra = x 100%
Tổng số hạt được cấy vào
Ngoài ra hình thái của mô sẹo tạo thành cũng là một chỉ tiêu để chúng tôi đánh giá sự phù hợp của môi trường.
Sau 3 tuần nuôi cấy, mô sẹo được đem chiếu xạ tia gamma (Co 60 ) với 4 liều chiếu khác nhau: 0,5kr; 1 kr, 1,5kr; 2 kr.
Sau khi chiếu xạ, các mẫu được đặt dưới ánh sáng với cường độ 2000lux, sau 1 tuần các khối mô sẹo được tách ra và cấy chuyển sang môi trường tái sinh chồi. b) Nghiên cứu ảnh hưởng của BAP đến khả năng tái sinh chồi
Chúng tôi sử dụng 4 công thức môi trường sau:
(R1): MS + 3% Sucrose + 0,7% Agarose + 0,1 mg/l αNAA + 1 mg/l BAP(R2): MS + 3% Sucrose + 0,7% Agarose + 0,1 mg/l αNAA + 2 mg/l BAP(R3): MS + 3% Sucrose + 0,7% Agarose + 0,1 mg/l αNAA + 3 mg/l BAP(R4): MS + 3% Sucrose + 0,7% Agarose + 0,1 mg/l αNAA + 4 mg/l BAP Để đánh giá sự phù hợp của môi trường tái sinh chồi, chúng tôi tiến hành theo dõi hệ số tạo chồi của các giống.
Số mô sẹo có chồi tạo thành
Hệ số tạo chồi = x 100% Tổng số mô sẹo được cấy vào môi trường
Môi trường tái sinh chồi còn được sử dụng để nhân chồi nhằm tăng số lượng cây in vitro, qua đó cũng đánh giá được hệ số nhân chồi của từng giống nghiên cứu.
Tổng số chồi được tạo thành
Hệ số nhân chồi Tổng số chồi được cấy vào môi trường
2.2.2 Phương pháp chiếu xạ hạt nảy mầm
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
3.1 Kết quả nghiên cứu nuôi cấy mô
3.1.1 Kết quả nghiên cứu công thức khử trùng
Thí nghiệm khử trùng mẫu được tiến hành như mô tả ở mục 2.2.1.1. Kết quả được trình bày trong bảng 3.1:
Bảng 3.1: Kết quả nghiên cứu công thức khử trùng
Công thức khử trùng Thời gian (phút)
Mẫu sống Mẫu chết Mẫu nhiễm
Sử dụng các tiêu chuẩn: Tỷ lệ mẫu nhiễm thấp, tỷ lệ mẫu sống cao, hình thái mô sẹo tạo thành lớn, màu vàng nâu, dạng nốt chắc, để đánh giá một công thức khử trùng phù hợp, thấy rằng:
- Các dòng khác nhau phản ứng không như nhau trước cùng một công thức khử trùng
- Đối với dòng N18: Tỷ lệ mẫu nhiễm thấp nhất ở thí nghiệm khử trùng bằng phối hợp HgCl2 0,1% với NaOCl 2,25% trong thời gian 10 ’ + 20 ’ (IX) và
10 ’ + 25 ’ (X) cùng cho tỷ lệ nhiễm thấp 6,7% Điều này cho thấy liều lượng khử trùng ở hai thí nghiệm này đã đem lại hiệu quả làm giảm tỷ lệ mẫu nhiễm, tuy nhiên tỷ lệ mẫu chết ở hai thí nghiệm này còn lớn: ở thí nghiệm IX là 18,7% và ở thí nghiệm X là 30% Trong khi đó, ở thí nghiệm khử trùng bằng phối hợp HgCl2 0,1% với NaOCl 2,25% trong thời gian 7 ’ + 15 ’ (VIII) tỷ lệ mẫu nhiễm có cao hơn một chút 8,0%, nhưng tỷ lệ mẫu chết giảm đáng kể 9,3% Như vậy, công thức khử trùng số VIII (khử trùng kép bằng HgCl2 0,1% + NaClO 2,25% với thời gian 7 + 15 phút) là phù hợp nhất đối với giống N18.
- Đối với dòng NV1: Tỷ lệ mẫu nhiễm thấp nhất ở thí nghiệm số IX và thí nghiệm số X là 7,3% Tuy nhiên ở thí nghiệm số X tỷ lệ mẫu chết nhiều hơn so với thí nghiệm số IX Do đó có thể kết luận rằng công thức khử trùng số IX (khử trùng bằng kết hợp HgCl2 0,1% với NaOCl 2,25% trong thời gian
10 ’ + 20 ’ ) là phù hợp với giống NV1.
Hình 3.1 Giống N18 khử trùng theo công thức số VIII
Hình 3.2: Giống N18 khử trùng theo công thức số X
- Đối với dòng N91: So với 3 giống kia tỷ lệ mẫu nhiễm luôn thấp nhất trong các thí nghiệm công thức khử trùng Tỷ lệ mẫu nhiễm thấp nhất ở thí nghiệm số VII với tỷ lệ nhiễm là 2,7% Do đó có thể xác định công thức khử trùng kép bằng NaOCl 2,25% trong thời gian 15 ’ + 20 ’ là phù hợp nhất đối với dòng N91 Ngoài ra công thức khử trùng số IX và số X cũng khá phù hợp với tỷ lệ mẫu nhiễm thấp là 3,3%, tuy nhiên tỷ lệ mẫu chết vẫn còn khá cao.
Hình 3.3: Dòng N91 khử trùng theo công thức số VII
Hình 3.4: Dòng N91 khử trùng theo công thức số IX
- Đối với dòng N46: Việc tìm ra công thức khử trùng phù hợp gặp nhiều khó khăn nhất Sau khi tiến hành ở tất cả các thí nghiệm khử trùng với các dòng
N18, N91, NV1 tỷ lệ mẫu nhiễm ở dòng N46 còn rất cao, tỷ lệ nhiễm thấp nhất đạt được ở thí nghiệm số XII là 14,7% Thí nghiệm khử trùng số XIV (khử trùng kép bằng HgCl2 trong thời gian 10 ’ + 15 ’ ) với dòng N46 đã cho kết quả giảm rõ rệt, tỷ lệ mẫu nhiễm còn 3,3% Do đó công thức khử trùng kép bằng HgCl2 trong thời gian 10 ’ + 15 ’ là phù hợp đối với dòng N46.
- Kết quả ở bảng 3.1 cũng cho thấy khử trùng kép đem lại hiệu quả cao hơn so với khử trùng đơn Phối hợp giữa HgCl2 và NaOCl trong khử trùng mẫu đã đem lại hiệu quả cao Có thể NaOCl có tác dụng khử trùng bề mặt mẫu, còn HgCl2 có khả năng thấm sâu do đó có khả năng tiêu diệt tất cả các vi sinh vật nhiễm sâu hơn.
Nhận xét: Công thức khử trùng phù hợp với từng dòng lúa nghiên cứu như sau:
Biểu đồ 3.1: Hiệu quả khử trùng hạt lúa đối với dòng N18
I II III IV V VI VII VIII IX X XI XII XIII
Mẫu sống Mẫu chết Mẫu nhiễm
Biểu đồ 3.2: Hiệu quả khử trùng hạt lúa đối với dòng N91
Biểu đồ 3.3: Hiệu quả khử trùng hạt lúa đối với dòng NV1
I II III IV V VI VII VIII IX X XI XII XIII
Mẫu sống Mẫu chết Mẫu nhiễm
I II III IV V VI VII VIII IX X XI XII XIII
Mẫu sống Mẫu chết Mẫu nhiễm
Biểu đồ 3.4: Hiệu quả khử trùng hạt lúa đối với dòng N46
3.1.2 Kết quả nghiên cứu môi trường tạo callus
Nghiên cứu về môi trường nuôi cấy giữ một vị trí quan trọng trong lịch sử phát triển nuôi cấy mô và tế bào Cơ sở cho việc xây dựng các môi trường nuôi cấy là việc xem xét các thành phần cho sự sinh trưởng và phát triển của cây Những nghiên cứu của Miller và Skoog (1963) đã cho thấy không phải các chất kích thích sinh trưởng ngoại sinh tác dụng độc lập với các hoocmon sinh trưởng nội sinh Phân chia tế bào, phân hóa và biệt hóa được điều khiển bằng sự tác động tương hỗ giữa các loại hoocmon sinh trưởng ngoại sinh và nội sinh Tác động phối hợp của auxin và cytokinin có tác dụng quyết định đến sự phát triển và phát sinh hình thái của tế bào và mô Những nghiên cứu của Skoog cho thấy tỷ lệ auxin/cytokinin cao kích thích cho sự hình thành rễ,
I II III IV V VI VII VIII IX X XI XII XIII VIV
Mẫu sống Mẫu chết Mẫu nhiễm tỷ lệ này sẽ kích thích quá trình phát sinh chồi Nếu tỷ lệ này ở mức độ cân bằng thì thuận lợi cho phát triển mô sẹo (callus) [2], [8], [9], [20].
Nghiên cứu và đánh giá khả năng tạo callus thực hiện trên 5 loại môi trường khác nhau:
(C1): MS + 3% Sucrose + 0,8% Agarose + 1mg/l NAA + 0,2 mg/l BAP
(C2): MS + 3% Sucrose + 0,8% Agarose + 1mg/l 2,4D + 0,2 mg/l BAP
(C4): MS + 3% Sucrose + 0,8% Agarose + 0,1mg/l αNAA + 0,2mg/l BAP + 2mg/l 2,4D
(C5): MS + 3% Sucrose + 0,8% Agarose + 0,1mg/l αNAA + 0,2mg/l BAP + 2,5 mg/l 2,4D
Kết quả được trình bày trong bảng 3.2 và biểu đồ 3.5.
Bảng 3.2: Kết quả nghiên cứu môi trường tạo callus
Dòng Tổn g số mẫu cấy
Tỷ lệ mẫu tạo callus trên môi trường Môi trường
Biểu đồ 3.5: Hiệu quả tạo callus trên các môi trường nuôi cấy của 4 dòng lúa N18, N46, N91 và NV1
Kết quả ở bảng 3.2 và biểu đồ 3.5 cho thấy:
- Trên các môi trường thử nghiệm, cả 4 dòng nghiên cứu đều có khả năng tạo callus Tỷ lệ callus tạo ra ở các môi trường khác nhau và ở các dòng khác nhau trên cùng loại môi trường là khác nhau.
- Trên môi trường MS có bổ sung 1mg/l NAA và 0,2 mg/l BAP (môi trường C1), tỷ lệ auxin/cytokinin = 1 : 0,2 mô sẹo có tạo ra nhưng tỷ lệ thấp, tính chung cho các dòng là 43,83%
- Ở môi trường C2: MS có bổ sung 1mg/l 2,4D và 0,2 mg/l BAP (so với môi trường C1, NAA được thay bằng 2,4D), tỷ lệ mô sẹo tạo ra cũng không thay đổi nhiều so với môi trường C1, tính chung cho cả 4 dòng là 46,17%.
- Ở môi trường C3: MS có bổ sung 2mg/l 2,4D, thấy rằng: Tỷ lệ tạo mô sẹo tăng hơn hẳn so với công thức môi trường C1 và C2 Có thể thấy hàm
N18N46N91NV1 lượng cytokinin nội sinh ở hạt lúa là lớn Tuy nhiên, hình thái mô sẹo tạo ra trên môi trường C3 chưa tốt, sẹo tạo thành nhỏ, không chắc, dạng bở…
- Hiệu quả tạo callus cao nhất trên môi trường C4 (MS có bổ sung 0,1 mg/l αNAA, 0,2 mg/l BAP và 2 mg/l 2,4D) với tỷ lệ mẫu tạo callus của từng dòng là: dòng N18 – 75,33%, dòng N46 – 80%, dòng N91 – 90%, dòng NV1 còn khá thấp 53,33% Hình thái mô sẹo tạo thành lớn, chắc, màu vàng sáng…
Sự tác động qua lại giữa auxin ngoại sinh, auxin nội sinh và kết hợp với cytokinin có thể đã cảm ứng tạo mô sẹo và duy trì mô sẹo Như vậy, trong 5 loại môi trường thử nghiệm thì môi trường C4 là phù hợp nhất đối với các dòng N18, N46 và N91 trong việc tạo callus Với dòng NV1 môi trường C4 có thể chưa phù hợp, hiệu quả tạo callus thấp và các nghiên cứu thêm đã được tiến hành, sử dụng môi trường C5.