TNU Journal of Science and Technology 226(10) 154 162 http //jst tnu edu vn 154 Email jst@tnu edu vn RESEARCH ON IN VITRO CULTURE OF HOYA MULTIFLORA SPECIES Nguyen Thi Thu Nga*, Soneseo SYHALAHT, Tran[.]
TNU Journal of Science and Technology 226(10): 154 - 162 RESEARCH ON IN VITRO CULTURE OF HOYA MULTIFLORA SPECIES Nguyen Thi Thu Nga*, Soneseo SYHALAHT, Tran Thi Hong TNU – University of Education ARTICLE INFO ABSTRACT Received: 31/5/2021 Hoya multiflora is a beautiful ornamental plant decoration In addition, Hoya multiflora also works very well in treating a number of diseases, which has been scientifically proven The conservation of medicinal plants in general and Hoya multiflora in particular can be done by many traditional methods such as sowing seeds after harvesting old ripe fruits and choosing leaves or old stalks with roots to planted to the ground However, the achieved effect is not high, rarely has ripe fruit to get seeds In this study, we used in vitro culture method to find a culture medium suitable for plant growth and development in vitro The results showed that the medium supplemented with BAP 1.0 mg/l gave the best multi-shoot efficiency in the in vitro concentrations of Hoya multiflora In this medium, green shoots, well developed (3.28 shoots/sample) Optimal medium for the elongation of shoots supplemented with GA3 0.5 mg/l (4.84 cm/sample) The complete plant formation is most suitable on basal MS medium supplemented with α-NAA at a concentration of 0.5 mg/l The number of roots obtained was 4.83 roots/sample after weeks The survival rate of seedlings when planted on natural substrates reached 88.3% Revised: 28/6/2021 Published: 02/7/2021 KEYWORDS Cam cu ten lua Hoya multiflora In vitro Tissue culture Multi-shoots NGHIÊN CỨU NUÔI CẤY IN VITRO CÂY CẨM CÙ TÊN LỬA (Hoya multiflora) Nguyễn Thị Thu Ngà*, Soneseo SYHALAHT, Trần Thị Hồng Trường Đại học Sư phạm – ĐH Thái Nguyên THÔNG TIN BÀI BÁO Ngày nhận bài: 31/5/2021 Ngày hoàn thiện: 28/6/2021 Ngày đăng: 02/7/2021 TỪ KHÓA Cẩm cù tên lửa Hoya multiflora In vitro Môi trường nuôi cấy mô Tạo đa chồi TÓM TẮT Lan Cẩm cù tên lửa (Hoya multiflora) cảnh trang trí đẹp Ngồi cịn có tác dụng tốt chữa số bệnh, khoa học nước chứng minh Việc bảo tồn giống dược liệu nói chung Cẩm cù tên lửa nói riêng thực nhiều biện pháp truyền thống gieo hạt sau thu hái trái chín già, chọn thân già có rễ để giâm xuống đất Tuy nhiên hiệu đạt chưa cao tạo chín để lấy hạt Trong nghiên cứu này, sử dụng phương pháp ni cấy in vitro nhằm tìm mơi trường ni cấy thích hợp cho sinh trưởng phát triển ống nghiệm Kết thu được, môi trường có bổ sung BAP 1,0 mg/l cho tỷ lệ tạo đa chồi tốt nồng độ thử nghiệm Trên môi trường này, chồi xanh đậm, phát triển tốt (3,28 chồi/mẫu) Mơi trường tối ưu cho q trình kéo dài chồi MS bổ sung GA3 0,5 mg/l (4,84 cm/mẫu) Mơi trường thích hợp cho tạo hoàn chỉnh MS bổ sung α-NAA với nồng độ 0,5 mg/l Số rễ thu đạt 4,83 rễ/chồi sau tuần Tỷ lệ sống sót trồng giá thể tự nhiên đạt 88,3% DOI: https://doi.org/10.34238/tnu-jst.4571 * Corresponding author Email: ngantt.bio@tnue.edu.vn http://jst.tnu.edu.vn 154 Email: jst@tnu.edu.vn TNU Journal of Science and Technology 226(10): 154 - 162 Đặt vấn đề Lan Cẩm cù tên lửa loại hoa thuộc họ Thiên lý (Asclepiadaceae), có tên khoa học Hoya multiflora Người ta biết tới loại với tên gọi khác lan sao, lan anh đào, trái tim tình nhân, lan cầu lơng… Cẩm cù tên lửa thuộc loại bụi nhỏ gọn, sống lâu năm Cây có thân mềm, đốt có rễ Lá mọc đối, hình bầu dục với đầu thn nhọn Hiện có loại Cẩm cù tên lửa hình trái tim ưa chuộng Cẩm cù tên lửa có hoa mọc nách nên sai hoa, hoa có hình cầu gọi lan cầu Có loại màu trắng, nhụy đỏ nhạt, tràng hoa hình tán, xếp tựa hoa anh đào, có hương thơm, gọi lan anh đào [1]-[4] Cẩm cù tên lửa cảnh trang trí đẹp Ngồi ra, cịn lồi có tác dụng tốt chữa số bệnh, khoa học nước chứng minh Loài hay gặp vùng Ấn Độ – Malaysia, thường gặp mọc leo to, gặp chỗ nắng khu vực núi đá vôi, số nơi Bà Rịa (Núi Dinh) Lâm Đồng (Đà Lạt) [5] Cẩm cù thu hái toàn quanh năm, dùng tươi hay phơi khô Bộ phận dùng: tồn cây, dùng tươi phơi khơ Thành phần hóa học, phận phủ sáp, thân chứa sterol glucosid hoyin (0,76 - 0,83%) Tính vị, tác dụng: vị đắng, tính bình, có tác dụng khư phong trừ thấp, tiêu ung, giải độc, hạ sốt, long đờm Công dụng, định phối hợp: chữa trị bệnh viêm phổi nhẹ, viêm phế quản; viêm não B, trẻ em sốt cao; viêm kết mạc, sưng amydal; thấp khớp tạng khớp; viêm vú, viêm tinh hoàn Liều dùng 60-90 gram tươi giã lấy nước chiết uống Dùng trị đinh nhọt, viêm mủ da, tổn thương Giã tươi đắp vào chỗ đau [1], [2], [6], [7] Việc bảo tồn giống dược liệu nói chung Cẩm cù tên lửa nói riêng thực nhiều biện pháp truyền thống gieo hạt sau thu hái trái chín già chọn thân già có rễ để giâm xuống đất Tuy nhiên hiệu đạt chưa cao, có chín để lấy hạt Sự phát triển ngành công nghệ sinh học, đặc biệt việc áp dụng kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật giúp cho việc bảo tồn, tạo nguồn sản phẩm đáp ứng cho thị trường nước tiến tới xuất Nghiên cứu nuôi cấy in vitro Cẩm cù chưa có cơng trình cơng bố giới Việt Nam Ngoài ra, việc lưu giữ in vitro nhằm bảo tồn nguồn gen quý, nâng cao chất lượng phẩm chất Cẩm cù tên lửa Vật liệu phương pháp nghiên cứu 2.1 Vật liệu môi trường nuôi cấy Mẫu nuôi cấy mô Cẩm cù tên lửa in vitro phịng Cơng nghệ tế bào thực vật, Khoa Sinh học, Trường Đại học Sư phạm – Đại học Thái Nguyên cung cấp Thí nghiệm tiến hành môi trường MS (Murashige Skoog, 1962) Các chất kích thích sinh trưởng sử dụng nghiên cứu: BAP, Kinetin, GA3, IBA, NAA Cồn 90°, cồn 70°, thạch agar, đường sucrose, nước cất khử trùng Các loại hóa chất tinh khiết thơng dụng có nguồn gốc từ Đức, Trung Quốc, Ấn Độ, Việt Nam,… 2.2 Phương pháp nuôi cấy in vitro 2.2.1 Phương pháp tạo đa chồi Để thăm dò ảnh hưởng BAP kinetin đến tạo đa chồi mẫu nuôi cấy, chúng tơi sử dụng mơi trường MS có bổ sung sucrose 30 g/l, agar g/l chất kích thích tạo đa chồi BAP, kinetin với nồng độ thay đổi (0,5; 1,0; 1,5; 2,0 mg/l) Mỗi công thức thí nghiệm tiến hành 40 mẫu cấy Đánh giá kết sau tuần, tuần, tuần, tuần nuôi cấy Theo dõi: Số chồi, chiều cao chồi (cm) chất lượng chồi Số chồi trung bình = Tổng số chồi/ Tổng số mẫu thí nghiệm Chiều cao chồi = Tổng kích thước chồi/ Tổng số mẫu thí nghiệm 2.2.2 Phương pháp kéo dài chồi http://jst.tnu.edu.vn 155 Email: jst@tnu.edu.vn TNU Journal of Science and Technology 226(10): 154 - 162 Nghiên cứu sử dụng GA3 để kéo dài chồi mẫu thí nghiệm, tất công thức nuôi cấy sử dụng môi trường MS có bổ sung sucrose 30 g/l, agar g/l chất kích thích kéo dài chồi GA3 với nồng độ 0,3; 0,5; 0,7; 0,9 mg/l Công thức thí nghiệm tiến hành 40 mẫu cấy Thu thập số liệu sau tuần, tuần, tuần, tuần nuôi cấy Các tiêu theo dõi: Chiều cao chồi (cm); Chất lượng chồi Chiều cao chồi = Tổng kích thước chồi/ Tổng số mẫu thí nghiệm 2.2.3 Phương pháp tạo hoàn chỉnh Cẩm cù tên lửa tạo rễ in vitro bổ sung nhóm chất kích thích rễ α-NAA IBA vào mơi trường ni cấy Thí nghiệm sử dụng mơi trường MS có bổ sung sucrose 30 g/l, agar g/l chất kích thích rễ α-NAA, IBA với nồng độ 0,3; 0,5; 0,7; 0,9 mg/l Mỗi cơng thức thí nghiệm tiến hành 40 mẫu cấy Theo dõi, đánh giá kết sau tuần, tuần, tuần, tuần nuôi cấy Các tiêu theo dõi: Số rễ/chồi; Chiều dài rễ (cm); Chất lượng rễ Số rễ trung bình = Tổng số rễ/ Tổng số mẫu theo dõi Chiều dài rễ trung bình = Tổng kích thước rễ/ Tổng số mẫu theo dõi 2.2.4 Phương pháp đưa vườn ươm Sau tạo in vitro hoàn chỉnh (cây rễ) đưa môi trường tự nhiên thử nghiệm trồng giá thể bầu Theo dõi đánh giá đưa vườn ươm Giá thể chứa xơ dừa ngâm khử trùng Tưới nước ngày/lần Theo dõi, đánh giá kết sau tuần, tuần, tuần, tuần Các tiêu theo dõi: Tỉ lệ sống sót, Chiều cao (cm); Số Tỷ lệ sống = Tổng số sống/ Tổng số theo dõi; Chiều cao trung bình = Tổng chiều cao cây/ Tổng số 2.2.5 Phương pháp xử lý số liệu Các số liệu nghiên cứu phân tích xử lý thống kê với phần mềm hỗ trợ máy tính (SPSS) Sử dụng tốn thống kê để xác định số thống kê như: Trung bình mẫu, phương sai, độ lệch chuẩn sai số trung bình mẫu với n ≥ 30, α = 0,05 Các số liệu xử lí máy tính chương trình SPSS [8] Kết thảo luận 3.1 Kết nghiên cứu ảnh hưởng BAP, kinetin đến khả tạo đa chồi mẫu nuôi cấy BAP, kinetin chất kích thích sinh trưởng (KTST) thuộc nhóm cytokinin sử dụng phổ biến ni cấy mô tế bào thực vật Các chất ảnh hưởng rõ rệt đặc trưng đến cảm ứng tạo chồi, kéo dài thời gian hoạt động mô phân sinh, hạn chế hóa già tế bào; đồng thời thúc đẩy phân hóa chồi, kích thích chồi phát triển nhiều loài thực vật khác Trong thí nghiệm này, chúng tơi sử dụng đoạn thân in vtro Cây in vitro sử dụng thí nghiệm khoảng 60 ngày tuổi (tính từ thời điểm vào mẫu in vitro), giai đoạn mô chưa hóa gỗ hồn tồn, phần mơ phân sinh tiếp xúc với chất KTST biệt hóa tạo chồi bất định Thân mầm cắt thành đoạn có chiều dài từ cm trước chuyển vào môi trường ni cấy có bổ sung KTST với nồng độ khác Theo dõi thí nghiệm đánh giá kết sau khoảng thời gian nuôi cấy Kết theo dõi tiêu thí nghiệm trình bày bảng hình Kết nghiên cứu sau tuần cho thấy, môi trường nuôi cấy có bổ sung BAP kinetin nồng độ khác cho kết theo dõi khác Số chồi thu cao nồng độ BAP 1,0 mg/l với tỷ lệ 3,28 chồi/mẫu cấy, tăng nồng độ BAP lên thành 1,5 mg/l số chồi giảm 2,86 chồi/mẫu, nồng độ 2,0 mg/l 2,46 chồi/mẫu Tất cơng thức thí nghiệm mơi trường có BAP cho kết cao so với môi trường bổ sung kinetin so với môi trường đối chứng http://jst.tnu.edu.vn 156 Email: jst@tnu.edu.vn TNU Journal of Science and Technology 226(10): 154 - 162 Bảng Ảnh hưởng BAP kinetin đến tạo đa chồi mẫu nuôi cấy Số chồi/mẫu (Chồi) Chất lượng chồi Sau tuần BAP Kinetin BAP Kinetin ĐC 1,02 ± 0,59a 1,02 ± 0,59a + + CT1 0,5 1,25 ± 0,28a 1,25 ± 0,03a + ++ CT2 1,0 1,45 ±0,05b 1,27 ±0,14a ++ ++ a CT3 1,5 1,10 ± 0,07 1,12 ± 0,03a + ++ CT4 2,0 1,41 ± 0,08b 1,12 ± 0,03a ++ + Sau tuần BAP Kinetin BAP Kinetin ĐC 1,57 ± 0,84a 1,07 ± 0,84a + + CT1 0,5 2,35 ± 0,14b 1,26 ± 0,07b + + CT2 1,0 2,79 ± 0,00b 1,29 ± 0,07b +++ ++ CT3 1,5 2,51 ± 0,02b 1,17 ± 0,03a + + CT4 2,0 2,69± 0,03b 1,18 ± 0,02a +++ + Sau tuần BAP Kinetin BAP Kinetin ĐC 1,62± 0,82a 1,07± 0,82a + + CT1 0,5 2,57 ± 0,03b 1,26 ± 0,07b + + CT2 1,0 2,93 ± 0,19b 1,29 ± 0,03b +++ ++ CT3 1,5 2,51 ± 0,02b 1,17 ± 0,03a + + b CT4 2,0 2,88 ± 0,07 1,18 ± 0,14a +++ ++ Sau tuần BAP Kinetin BAP Kinetin ĐC 1,62± 0,82a 1,08 ± 0,82a ++ ++ CT1 0,5 2,48 ± 0,02b 1,27 ± 0,07b + + CT2 1,0 3,28 ± 0,16c 1,31 ± 0,07b +++ ++ CT3 1,5 2,86 ± 0,09a 1,18 ± 0,03ab ++ ++ CT4 2,0 2,46 ± 0,09b 1,19 ± 0,08ab +++ + Ghi chú: (+): chồi nhỏ, xanh nhạt; (++): chồi mập, xanh nhạt; (+++): chồi mập, xanh đậm a, b, c: kí hiệu có hay khơng khác biệt có ý nghĩa thống kê (p