Nghiên cứu nuôi cấy in vitro và biểu hiện flavonoid 3’5’ hydroxylase nhằm tăng cường tổng hợp flavonoid ở cây ô đầu (aconitum carmichaelii debx ) TT

1 ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM HỒNG THỊ THU HỒN NGHIÊN CỨU NI CẤY IN VITRO VÀ BIỂU HIỆN FLAVONOID 3’5’ HYDROXYLASE NHẰM TĂNG CƢỜNG TỔNG HỢP FLAVONOID Ở CÂY Ô ĐẦU (Aconitum carmichalii Debx.) Ngành: Di truyền học Mã số: 9420121 T M T T LU N N TI N S THÁI NGUYÊN - 2022 Cơng trình hồn thành tại: Trường Đại học Sư phạm - Đại học Thái Nguyên Người hướng dẫn khoa học: GS.TS Chu Hoàng Mậu TS Nguyễn Thị Ngọc Lan Phản biện 1: ……………………………………… Phản biện 2: ……………………………………… Phản biện 3: ……………………………………… Luận án bảo vệ trước Hội đồng chấm luận án cấp Trường họp tại: Trường Đại học Sư phạm.-.Đại học Thái Nguyên Vào hồi phút, ngày Có thể tìm hiều luận án tại: Thư viện Quốc gia Việt Nam Trung tâm Số - Đại học Thái Nguyên Thư viện Trường Đại học Sư phạm tháng năm 2022 C C CƠNG TRÌNH CÔNG BỐ LIÊN QUAN Đ N LU N N Thi Ngoc Lan Nguyen, Thi Thu Hoan Hoang, Huu Quan Nguyen, Quang Tan Tu, Thi Hong Tran, Thi Mai Thu Lo, Thi Thu Thuy Vu, Hoang Mau Chu (2021), “Agrobacterium tumefaciens–mediated genetic transformation and overexpression of the flavonoid 3′5′-hydroxylase gene increases the flavonoid content of the transgenic Aconitum carmichaelii Debx plant”, In Vitro Cellular & Developmental Biology – Plant; https://doi.org/10.1007/s11627021-10190-4 (SCIE) Yen Thi Hai Nguyen, Hoan Thi Thu Hoang, Anh Thi Hoang Mai, Lan Thi Ngoc Nguyen, Quan Huu Nguyen, Nhan Thi Thanh Pham, Thuong Danh Sy, Mau Hoang Chu (2021), The Aconitum carmichaelii F3’5’H gene overexpression increases flavonoid accumulation in transgenic tobacco plants, Horticulturae, 7(10), 384, https://doi.org/10.3390/horticulturae7100384 (SCIE) Hoàng Thị Thu Hoàn, Hoàng Thị Phương, Đặng Thị Lệ, Nguyễn Thị Ngọc Lan,Chu Hoàng Mậu (2017), “Nghiên cứu đặc điểm hình thái, giải phẫu phân loại học phân tử ô đầu (Aconitum carmichaelii Debx.)”, Tạp chí Khoa học & Cơng nghệ - Đại học Thái Nguyên, 168(08), tr 161 – 167 Hoàng Thị Thu Hoàn, Nguyễn Thị Ngọc Lan, Chu Hoàng Mậu (2020), “Tách dòng phân tử thiết kế vector chuyển gen mang gen flavonoid 3’5’ Hydroxylase phân lập từ ô đầu (Aconitum carmichaelii Debx.), Tạp chí Khoa học & Cơng nghệ - Đại học Thái Nguyên , 225(08), tr 43 – 49 Hoàng Thị Thu Hoàn, Trần Thị Hồng, Nguyễn Hữu Quân, Nguyễn Thị Ngọc Lan, Chu Hoàng Mậu (2021), “Nghiên cứu hệ thống tái sinh in vitro cảm ứng rễ tơ Ô đầu (Aconitum carmichaelii debeaux)”, Tạp chí Khoa học & Cơng nghệ - Đại học Thái Nguyên, 226(05), tr 139 – 146 MỞ ĐẦU Đặt vấn đề Ô đầu, Phụ tử chứa thành phần có độc tính cao cho vị thuốc quý, dùng phổ biến y dược học cổ truyền phương Đông Hiện giới có nhiều nghiên cứu chi Aconitum nhằm phát triển sản phẩm theo hướng nâng cao hiệu sử dụng loài thuộc chi phịng trị bệnh Ở Việt Nam, Ơ đầu tìm thấy mọc hoang vùng núi cao phía Bắc Việt Nam sau Ơ đầu đưa vào trồng Hà Giang, Lào Cai, Lai Châu Hiện nay, Ô đầu trồng nhiều huyện Quản Bạ, Đồng Văn, tỉnh Hà Giang Flavonoid hợp chất thứ cấp đóng vai trị quan trọng việc trì cân oxy hóa khử tế bào thực vật Nhiều loại flavonoid có đặc tính kháng khuẩn, chống oxy hóa chống ung thư Flavonoid chi Aconitum quan tâm nghiên cứu phát triển dược phẩm đại, flavonoid 3'5'-hydroxylase (F3'5'H) enzyme chìa khóa xúc tác phản ứng cuối trình sinh tổng hợp hợp chất flavonoid Ô đầu F3′5′H, thành viên họ Cytochrome P450, tham gia phản ứng chuyển naringenin thành flavonoid Sự hydro hóa vị trí 5' F3'5'H phản ứng quan trọng định sản phẩm cuối trình sinh tổng hợp flavonoid thực vật Do đó, việc tăng cường biểu gen F3’5’H làm tăng nồng độ hoạt tính enzyme F3’5’H dẫn đến tăng tích lũy flavonoid thực vật Như vậy, hai cách tiếp cận làm tăng hàm lượng chất có hoạt tính sinh học lựa chọn ứng dụng công nghệ nuôi cấy mô tế bào thực vật làm tăng sinh khối kỹ thuật biểu gen chìa khóa làm tăng tích lũy hàm lượng hợp chất thứ cấp chuyển gen Xuất phát từ lý nên lựa chọn tiến hành đề tài luận án: “Nghiên cứu nuôi cấy in vitro biểu flavonoid 3’5’-hydroxylase nhằm tăng cƣờng tổng hợp flavonoid Ô đầu (Aconitum carmichaelii Debx.)” Mục tiêu nghiên cứu 2.1 Xác định số điều kiện thích hợp ni cấy in vitro cảm ứng tạo rễ tơ Ô đầu 2.2 Chứng minh biểu gen mã hóa Flavonoid 3’5’ hydroxylase Ô đầu (Aconitum carmichaelii Debx.) làm tăng tích lũy flavonoid chuyển gen Nội dung nghiên cứu 1) Nghiên cứu định danh lồi từ mẫu Ơ đầu thu số địa phương tỉnh Hà Giang phương pháp hình thái so sánh mã vạch DNA 2) Nghiên cứu thiết lập hệ thống nuôi cấy in vitro tạo rễ tơ Ô đầu 3) Thiết kế vector biểu gen mã hóa Flavonoid 3’5’hydroxylase tạo chủng Agrobacterium tumefacience mang vector chuyển gen thực vật 4) Nghiên cứu biến nạp biểu gen AcF3’5’H Thuốc 5) Nghiên cứu biến nạp biểu gen AcF3’5’H Ơ đầu Những đóng góp luận án Luận án cơng trình nghiên cứu có hệ thống, từ định danh mẫu Ơ đầu đến thiết lập hệ thống tái sinh in vitro phục vụ chuyển gen đến cảm ứng tạo rễ tơ nhân ni tăng sinh khối rễ tơ lồi Ô đầu Từ tách dòng phân tử gen AcF3’5’H từ Ô đầu thiết kế vector biểu gen thực vật đến nghiên cứu biến nạp di truyền phân tích biểu gen AcF3’5’H chuyển gen Những đóng góp cho khoa học luận án thể cụ thể là: 1) Các mẫu Ô đầu thu huyện Quản Bạ Hồng Su Phì, tỉnh Hà Giang, Việt Nam thuộc loài A carmichaelii, chi Aconitum, họ Hoàng Liên (Ranunculaceae) định danh kết hợp phương pháp hình thái so sánh mã vạch DNA 2) Xác định điều kiện thích hợp cho ni cấy in vitro tạo dịng rễ tơ từ rễ đầu in vitro làm vật liệu phục vụ chọn dòng rễ tơ chuyển gen 3) Lần giới gen AcF3’5’H từ Ô đầu biến nạp biểu thành công Thuốc Ô đầu Sự biểu mạnh gen AcF3’5’H làm tăng hàm lượng flavonoid chuyển gen Kết nghiên cứu luận án báo cáo giới Việt Nam phân tích biểu gen AcF3’5’H Ơ đầu Ý nghĩa khoa học thực tiễn đề tài luận án Về mặt khoa học, kết phân tích biểu gen Thuốc Ô đầu sở cho nghiên cứu tăng cường biểu gen AcF3’5’H loài dược liệu khác mục đích làm tăng tích lũy flavonoid phận thực vật Gen AcF3’5’H từ Ơ đầu nghiên cứu cơng trình coi ứng cử viên để tăng cường tích lũy flavonoid thực vật cơng nghệ gen Kết nghiên cứu nuôi cấy in vitro cảm ứng tạo rễ tơ sở ứng dụng công nghệ vào việc nâng cao hàm lượng hiệu thu nhận hợp chất có hoạt tính sinh học Ơ đầu số loại dược liệu khác Cấu trúc luận án Luận án có 152 trang (kể phụ lục), chia thành chương, phần: Mở đầu (5 trang); Chương 1: Tổng quan tài liệu (37 trang); Chương 2: Vật liệu phương pháp nghiên cứu (18 trang); Chương 3: Kết thảo luận (51 trang); Kết luận đề nghị (2 trang); Các cơng trình cơng bố liên quan đến luận án (2 trang); Tài liệu tham khảo (23 trang); Phụ lục (14 trang) Luận án có 11 bảng, 40 hình, 14 phụ lục tham khảo 183 tài liệu Chƣơng TỔNG QUAN TÀI LIỆU Luận án tham khảo tổng kết 183 tài liệu, có 20 tài liệu tiếng Việt, 162 tài liệu tiếng Anh ba vấn đề bản, là: (1) Cây Ơ đầu; (2) Ni cấy in vitro cảm ứng tạo rễ tơ dược liệu nuôi cấy in vitro; (3) Flavonoid nghiên cứu biểu gen flavonid 3’5’ hydroxylase; Ơ đầu có tên khoa học Aconitum carmichaelii Debx., thuộc chi Aconitum L., chứa hợp chất có hoạt tính sinh học flavonoid có tác dụng giảm đau, tăng cường miễn dịch, chống oxy hóa, chống tăng sinh tế bào, chống ung thư, tác dụng tim mạch, chống viêm, chống tiêu chảy… Hiện nay, chưa có cơng trình nghiên cứu ứng dụng mã vạch DNA (matK, rpoC1, rpoB2) để định danh mẫu Ơ đầu tự nhiên Chính vậy, chúng tơi kết hợp phương pháp hình thái so sánh phương pháp phân loại học phân tử để nhận diện mẫu Ô đầu thu số huyện Hà Giang Flavonoid tổng hợp theo đường phenylpropanoid nói chung nhờ hoạt động phức hợp đa enzyme, bao gồm CHS, CHI, F3H, F3’H, F3’5’H, FLS, FST Hydroxyl hóa vị trí 5' F3'5'H bước đặc biệt quan trọng, xác định sản phẩm cuối tri-hydroxyl vịng B hình thành flavonoid thực vật Ở Ô đầu, gen F3’5’H phân lập từ mRNA Ma cs cơng bố năm 2012 có kích thước 1720 bp, mã hóa cho 506 amino acid, mã số NCBI JN635708 Đã có nghiên cứu chức sinh học gen F3’5’H cho thấy rằng, gen F3’5’H enzyme F3’5’H có chức quan trọng trình sinh tổng hợp anthocyanin, delphinidin định sắc tố Các kết nghiên cứu biểu gen F3’5’H khẳng định biểu mạnh gen F3’5’H làm tăng hàm lượng flavonoid Như việc tác động đến enzyme F3’5’H làm tăng tích lũy flavonoid Tuy nhiên, nghiên cứu biểu gen mã hóa enzyme liên quan đến tổng hợp flavonoid, có F3’5’H Ơ đầu cịn mẻ chưa tìm thấy cơng bố phân tích biểu AcF3’5’H từ Ô đầu Trên giới, có nghiên cứu cảm ứng tạo rễ tơ thu nhận camptothecin hạnh phúc (Lorence cs 2004); alkaloid rễ tơ thuốc phiện (Le cs, 2004), β-carboline bạch tật lê (Sara cs, 2014) Ở Việt Nam, Hà Thị Loan cs (2014) Ninh Thị Thảo cs (2015) tạo rễ tơ Sâm Ngọc Linh Đan sâm để thu nhận saponin, Vũ Thị Như Trang cs (2017) tạo rễ tơ thổ nhân sâm để tăng cường hàm lượng flavonoid Tuy nhiên, giới Việt Nam chưa thấy nghiên cứu công bố hệ thống tái sinh phục vụ chuyển gen cảm ứng tạo rễ tơ Ô đầu (Aconitum carmichaelii Debx.) Chƣơng V T LIỆU VÀ PHƢƠNG PH P NGHIÊN CỨU 2.1 V T LIỆU, H A CHẤT, THI T BỊ NGHIÊN CỨU Vật liệu nghiên cứu: Củ Ô đầu thu thập từ tỉnh Hà Giang, trồng Vườn thực nghiệm Khoa Sinh học, Trường Đại học Sư phạm - Đại học Thái Nguyên để định danh lồi, tách chiết DNA làm ngun liệu ni cấy in vitro Giống Thuốc K326 (Nicotiana tabacum), vector sử dụng nghiên cứu bao gồm: vector pBT, pRTRA7/3, pCB301và chủng vi khuẩn E coli DH5α, Agrobacterium tumefaciens CV58, Agrobacterium rhizogens ATTC 15834 Các cặp mồi PCR sử dụng nghiên cứu thể bảng 2.1 Bảng 2.1 Các trình tự mồi sử dụng nghiên cứu Cặp mồi ITS-F/ITS-R rpoC1-F/ rpoC1-R rpoB2-F/ rpoB2-R matK-F/ matK-R F3’5’H-NcoI-F /F3’5’H-NotI-R F3’5’H-NcoI-F /F3’H-SacI-R Trình tự nucleotide 5’  3’ ACGAATTCATGGTCCGGTGAAGTGTTCG TAGAATTCCCCGGTTCGCTCGCCGTTAC GTGGATACACTTCTTGATAATGG TGAGAAAACATAAGTAAACGGGC AAGTGCATTGTTGGAACTGG GATCCCAGCATCACAATTCC CGATCTATTCATTCAATATTTC TCTAGCACACGAAAGTCGAAGT AGCCATGGATGTTGTCTACCAGAGAACTTG TCGCTGCAGCGATCATTTTTTTCATT ATGCGGCCGCGACTACATAAGCAGAGGGTG AGCCATGGATGTTGTCTACCAGAGAACTTG TCGCTGCAGCGATCATTTTTTTCATT TAGAGCTCCGCTGATGTATTCGTCTCCCAC Sản phẩm (bp) 630 543 471 822 1536 1611 2.2 PHƢƠNG PH P NGHIÊN CỨU 2.2.1 Nhóm phƣơng pháp định danh lồi Ơ đầu Phương pháp định danh mẫu Ơ đầu phương pháp hình thái so sánh theo Phạm Hoàng Hộ (1999), Đỗ Tất Lợi (2004), tra cứu trang web Tropicos phương pháp phân loại học phân tử dựa vào số mã vạch DNA vùng ITS, đoạn gen matK, rpoC1, rpoB2 2.2.2 Nhóm phƣơng pháp ni cấy in vitro cảm ứng tạo rễ tơ in vitro Nghiên cứu hệ thống tái sinh in vitro phục vụ chuyển gen phương pháp cảm ứng rễ tơ, nhân nuôi rễ tơ xác định khối lượng rễ khơ 2.2.3 Nhóm phƣơng pháp tách dòng gen thiết kế vector chuyển gen Phân lập gen tách dòng phân tử: Từ thơng tin trình tự gen F3’5’H Ơ đầu mang mã số JN635708.1 GenBank, cặp mồi F3’5’H-NcoI-F/F3’5’H-NotI-R thiết kế nhân đoạn mã hóa gen AcF3’5’H RNA tổng số tách kít GeneEluteTM Total RNA Miniprep hãng Sigma cDNA tổng hợp từ RNA tổng số kít SuperScript™ VILO™ cDNA Synthesis Nhân gen AcF3’5’H thực PCR với cặp mồi thiết kế F3’5’H-NcoI-F/F3’5’H-NotI-R Sản phẩm PCR điện di gel agarose 1,0% tinh theo kít GenJET PCR Purification hãng Fermentas Kỹ thuật tách dòng gen thực theo Sambrook cs Tách chiết plasmid kít Plasmid Extraction theo dẫn nhà sản xuất Các plasmid tái tổ hợp mang gen AcF3’5’H xác định máy đọc trình tự tự động ABI PRISM 3100 Avant Gentic Analyzer Trình tự nucleotide gen phân tích, so sánh phần mềm BLAST BioEdit Thiết kế vector biểu gen: Các thí nghiệm thiết kế vector thực theo sơ đồ hình 2.2 Hình 2.2 Sơ đồ thí nghiệm thiết kế vector chuyển gen pCB301_AcF3’5’H Tạo Agrobacterium tumefaciens tái tổ hợp: Biến nạp vector pCB301_AcF3’5’H vào tế bào khả biến A tumefaciens CV58 tiến hành chọn dòng vi khuẩn mang vector tái tổ hợp pCB301_AcF3’5’H colony-PCR 2.2.3 Nhóm phƣơng pháp chuyển gen phân tích chuyển gen Biến nạp di truyền vào Thuốc lá: Chuẩn bị khuẩn lây nhiễm, chuyển gen AcF3’5’H vào thuốc thông qua A tumefaciens Biến nạp di truyền vào Ô đầu: Tạo nguyên liệu biến nạp gen, thiết lập thí nghiệm chuyển gen thông qua chuyển gen thị uidA Ô đầu, Chuyển cấu trúc CaMV35S_AcF3’5’H_cmyc_polyA vào Ô đầu Phân tích chuyển gen: Cây Thuốc chuyển gen Ô đầu chuyển gen trồng nhà kính sử dụng để phân tích diện biểu gen chuyển chuyển gen PCR, RT-PCR, Western blot ELISA Xác định hàm lượng flavonoid tổng số Thuốc Ô đầu kỹ thuật quang phổ hấp thụ 2.2.5 Xử lý số liệu thống kê Các số liệu xử lý phần mềm Microsoft Excel phần mềm Statistical Package for the Social Science (SPSS) để xác định trị số thống kê như: giá trị trung bình, phương sai, độ lệch chuẩn, sai số trung bình mẫu Sự khác biệt giá trị trung bình kiểm tra Duncan với P < 0,05; 0,01; 0,001 2.3 ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU Các thí nghiệm thực từ tháng 2016 đến tháng 12 2020 Các thí nghiệm nuôi cấy in vitro chuyển gen vào Thuốc lá, Ơ đầu thực Phịng thí nghiệm Cơng nghệ tế bào thực vật, Khoa Sinh học, Trường Đại học Sư phạm - Đại học Thái Nguyên Các thí nghiệm phân tích chuyển gen tiến hành phịng Cơng nghệ ADN ứng dụng, phịng Cơng nghệ Tế bào thực vật Phịng thí nghiệm trọng điểm Công nghệ gen thuộc Viện Công nghệ sinh học - Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam Các thí nghiệm phân tích hàm lượng flavonoid tổng số Thuốc lá, Ô đầu thực Phịng Cơng nghệ Thực phẩm – Viện kiểm nghiệm vệ sinh an toàn thực phẩm Quốc gia, Bộ Y tế Chƣơng 3.1 T QUẢ VÀ THẢO LU N T QUẢ ĐỊNH DANH LỒI Ơ ĐẦU (Aconitum carmichaelii) 3.1.1 Đặc điểm hình thái mẫu Ô đầu thu Hà Giang Kết so sánh hai mẫu Ô đầu thu từ thu từ lồi huyện Hồng Su Phì Quản Bạ, tỉnh Hà Giang cho thấy mẫu Ô đầu giống hình thái, gồm rễ, thân, lá, hoa (Hình 3.1) Sau đối chiếu đặc điểm hình thái quan sát mẫu Ô đầu với đặc điểm Ơ đầu theo mơ tả Phạm Hồng Hộ (1999), Đỗ Tất Lợi (2004) đồng thời tra cứu trang web Tropicos cho thấy mẫu Ô đầu thu huyện Hồng Su Phì Quản Bạ, tỉnh Hà Giang thuộc chi Ơ đầu (Aconitum L), họ Hồng Liên (Ranunculaceae), Hoàng Liên (Ranunculales), phân lớp Hoàng Liên (Ranunculidae), lớp Hai mầm (Magnoliopsida), ngành Thực vật có hoa; Mộc lan; Hạt kín (Magnoliophyta) Hình 3.1 Cây Ô đầu A: Hình vẽ Ô đầu theo Đỗ Tất Lợi (2004); B: Ơ đầu gồm rễ hình thành củ; C: Cây Ô đầu gồm củ mẹ, củ con; D: Lá Ô đầu cuống lá; E: Cành mang hoa hoa Ô đầu; G: Các phận hoa Ơ đầu; H: Quả Ơ đầu; I: Quả khơ hạt Ô đầu (B, C, D, E, G, H, I: Ảnh tác giả chụp) 3.1.2 Đặc điểm trình tự nucleotide vùng ITS đoạn gen matK, rpoC1, rpoB2 3.1.2.1 Đặc điểm trình tự vùng ITS Kết kiểm tra sản phẩm PCR gel agarose 0,8 % cho thấy chạy xuất băng với kích thước khoảng 600 bp, tương ứng với kích thước dự kiến vùng ITS (Hình 3.2) Hình 3.2 Điện di đồ sản phẩm PCR nhân vùng ITS M: Marker kb; 1: Mẫu Ơ đầu Hồng Su Phì (HSP); 2: Mẫu Ơ đầu Quản Bạ (QB) Hình 3.4 Điện di đồ sản phẩm PCR nhân đoạn gen matK M: Marker kb; 1: matKQB, 2: matK-HSP Kết giải trình tự nucleotide xác định vùng ITS có kích thước 630 bp Bằng phần mềm BLAST NCBI cho thấy vùng ITS phân lập từ mẫu nghiên cứu Ô đầu Hà Giang, Việt Nam (ITS-QB, ITS-HSP) có tỷ lệ tương đồng 98,41%, 98,25 % (đối với ITS phân lập từ mẫu QB), 97,94%, 97,78% (đối với ITS phân lập từ mẫu HSP) với hai trình tự ITS A carmichaelii (mã số 10 carmichaelii) giải pháp phân tích tiến hóa phát sinh lồi phân tử chi Aconitum 3.2 T QUẢ THI T L P HỆ THỐNG NUÔI CẤY IN VITRO VÀ TẠO RỄ TƠ Ở CÂY Ô ĐẦU 3.2.1 Thiết lập hệ thống nuôi cấy in vitro phục vụ chuyển gen Ô đầu 3.2.1.1 Tạo vật liệu khởi đầu cho nuôi cấy in vitro từ đoạn thân Ô đầu Kết nghiên cứu ảnh hưởng thời gian khử trùng HgCl2 0,1% đến trình tạo vật liệu khởi đầu cho nuôi cấy in vitro từ đoạn thân Ô đầu cho thấy thời gian khử trùng phút thích hợp thể tỷ lệ mẫu nảy chồi không bị nhiễm cao chồi mầm có chất lượng tốt so với cơng thức lại 3.2.1.2 Cảm ứng đa chồi tạo Ô đầu in vitro Ảnh hưởng BAP kinetin đến phát sinh chồi Ô đầu Nồng độ BAP 1,5 mg/l kinetin 1,0 mg/l thích hợp cho tái sinh đa chồi in vitro từ mẫu cấy đoạn thân mang đốt (p