NGHIÊN CỨU LÂM SÀNG 41TẠP CHÍ NỘI KHOA VIỆT NAM | SỐ 21/20210 Ngày nhận bài 18/11/2020 Ngày phản biện 16/12/2020 Ngày chấp nhận đăng 30/12/2020 Nghiên cứu đánh giá hoạt tính ức chế sự tăng sinh, di cư[.]
NGHIÊN CỨU LÂM SÀNG Nghiên cứu đánh giá hoạt tính ức chế tăng sinh, di cư xâm lấn prodigiosin dòng tế bào ung thư gan Hep3B in vitro Đỗ Minh Trung1, Đỗ Quyết1, Hồ Anh Sơn1, Phạm Thế Tài1 Nguyễn Lĩnh Toàn1, Đỗ Thị Tuyên2, Mai Thị Minh Ngọc3, Nguyễn Thị Ngọc Hà3 Viện Nghiên cứu Y Dược học Quân sự, Học viện Quân y Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam Trường Đại học Mở Hà Nội TÓM TẮT Mục tiêu: Đánh giá hoạt tính hợp chất prodigiosin (PG) dịng tế bào ung thư gan (Hep3B) Đối tượng phương pháp nghiên cứu: Hợp chất PG tách chiết từ dịch lên men vi khuẩn S marcescens sp HVQY tái tổ hợp sử dụng để đánh giá hoạt tính ức chế tăng sinh, di cư, xâm lấn dòng tế bào Hep3B Hoạt tính PG ức chế tăng sinh tế bào Hep3B đánh giá xét nghiệm MTT tính nồng độ ức chế 50% tế bào (IC50) Đánh giá hoạt tính ức chế khả di cư xâm lấn tế bào cách rạch bề mặt tế bào nuôi cấy dụng cụ chuyên dụng Đo diện tích khoảng trống cịn lại vết rạch sau tế bào ung thư di cư, xâm lấn che phủ giai đoạn (trước tiếp xúc với PG), 24 48 Kết quả: PG làm thay đổi hình dạng tế bào, ức chế mạnh tăng sinh gây chết tế bào ung thư HEP 3B, với IC50 4,8 μg/ml Sau 24 48 giờ, PG ức chế khả di cư xâm lấn tế bào Hep3B thông qua diện tích che phủ bề mặt dụng cụ ni cấy bị giảm so với nhóm đối chứng Kết luận: Prodigiosin ức chế tăng sinh, di cư xâm lấn tế bào ung thư gan Hep3B in vitro Từ khóa: Prodigiosin, Hep3B, Serratia marcescens, Tế bào ung thư ĐẶT VẤN ĐỀ Prodigiosin (PG) chất chuyển hóa alkaloid thứ cấp có màu đỏ, cơng thức hóa học C20H25N3O PG thường tổng hợp vi khuẩn Serratia sp, Pseudomonas sp, Streptomyces sp Vibrio sp [1] PG xác định có hoạt tính kháng kháng khuẩn, kháng nấm kháng tế bào ung thư [2] Từ năm 1952, Wier R.H cộng sử dụng PG thử nghiệm lâm sàng có hiệu điều trị bệnh nhiễm nấm Coccidioidomycosis, gây sốt tổn thương da cho 14 bệnh nhân [3] PG chứng minh có khả gây chết theo chu trình (apoptosis) tế bào Ngày nhận bài: 18/11/2020 Ngày phản biện: 16/12/2020 Ngày chấp nhận đăng: 30/12/2020 TẠP CHÍ NỘI KHOA VIỆT NAM | SỐ 21/20210 41 NGHIÊN CỨU LÂM SÀNG ung thư, đứt gãy DNA thay đổi pH nội bào [4] Nhiều nghiên cứu cho thấy PG có tác dụng kháng mạnh 57 loại tế bào ung thư khác khơng có độc tính tế bào bình thường [5] Trên sở chế phẩm PG tách chiết, tinh từ dịch lên men chủng vi khuẩn S marcescens sp HVQY tái tổ hợp, chế phẩm PG đánh giá hoạt tính PG kháng khuẩn, kháng nấm, ức chế số dòng tế bào ung thư đánh giá tính an toàn chế phẩm PG Trong nghiên cứu này, nhóm tác giả, chế phẩm PG tiếp tục đánh giá hoạt tính ức chế tăng sinh, di cư xâm lấn dòng tế bào ung thư gan Hep3B nhằm định hướng tạo sản phẩm có hoạt tính kháng tế bào ung thư ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Đối tượng nghiên cứu Chế phẩm Prodigiosin thu nhận từ vi khuẩn Serratia sp HVQY tái tổ hợp cung cấp từ đề tài mã số ĐT.07.17/CNSHCB Học viện Qn y chủ trì Dịng tế bào ung thư gan Hep3B (hãng ATCC, Mỹ) sử dụng làm mơ hình đánh giá hoạt tính PG ức chế tăng sinh, di cư xâm lấn in vitro Hóa chất, vật tư tiêu hao Thiết bị nghiên cứu chính: mơi trường RPMI, FBS (Fetal Bovine Serum), Penicillium-Streptomyces, Trypsin-EDTA (Gibco, Mỹ), MTT, DMSO (Sigma, Mỹ), HCl, Isopropanol (Merck, Đức) Flask T75, Plate 96 giếng, Pippet nhựa 5ml, 10ml (Corning, Mỹ) hóa chất vật tư khác cung cấp từ hãng có uy tín giới Kính hiển vi soi ngược Olympus IX83 (Olympus, Nhật Bản), Hệ thống DTX 880 (Backman Coulter, Mỹ), Tủ cấy (Bioair, Mỹ), Tủ ấm CO2 (Nuiair, Mỹ), Bể ổn nhiệt (Shellab, Mỹ), Máy ly tâm Rotanda 460 (Henttich, Đức) Phương pháp nghiên cứu 42 TẠP CHÍ NỘI KHOA VIỆT NAM | SỐ 21/2021 Nuôi cấy tăng sinh tế bào Để sử dụng dòng tế bào ung thư gan Hep3B làm mơ hình đánh giá hoạt tính kháng tế bào ung thư prodigiosin Dòng tế bào Hep3B giải đông cấy chuyển nuôi cấy môi trường RMPI (RMPI bổ sung 10% FBS, 1% penicillin Streptomycin (Gibco, Mỹ), nuôi cấy nhiệt độ 37oC, 5% CO2 Tế bào nuôi cấy đến đạt độ khoảng 80% diện tích bề mặt ni cấy, tiến hành cấy chuyển để tiến hành cho thí nghiệm Đánh giá hoạt tính ức chế tăng sinh tế bào Hep 3B PG kỹ thuật MTT Đánh giá hoạt tính kháng tế bào ung thư prodigiosin dựa Kỹ thuật MTT (dựa theo Mosmann T., 1983 [6]; Đỗ Minh Trung CS., 2018 [7]: Tế bào Hep3B cấy chuyển nuôi cấy đĩa 96 giếng (Corning, Mỹ) Tế bào tiếp xúc với: prodigiosin chuẩn bị nồng độ khác (0,25 µg/ml; 0,5 µg/ml; µg/ ml; µg/ml; µg/ml; µg/ml; µg/ml 10 µg/ ml); DMSO nhóm đối chứng (RPMI) tế bào ni cấy bình thường khơng tiếp xúc với prodigiosin Sau 24 tiếp xúc với PG bổ sung dung dịch MTT mg/ml (Sigma, Mỹ) thêm vào giếng nuôi cấy tế bào Các tế bào sống hoạt động sinh dehydrogenase gây phản ứng khử MTT tạo tinh thể formazan có màu tím Lượng tinh thể formazan tạo trong thử nghiệm nhiều hay phản ánh hoạt tính ức chế tế bào PG mạnh hay yếu Số lượng tinh thể formazan tạo thành đánh giá phương pháp đo mật độ quang OD bước sóng 595nm (Hệ thống DTX 880 - Backman Coulter, Mỹ) Kết đánh giá hoạt tính PG ảnh hưởng đến tế bào ni cấy ngun vẹn hình thái tế bào quan sát kính hiển vi soi ngược (Olympus IX83-Olympus, Nhật Bản) tăng sinh tế bào kết đo OD lượng tinh thể formazan NGHIÊN CỨU LÂM SÀNG phản ứng MTT Các thí nghiệm lặp lại lần (n=6) Tính liều ức chế 50% tế bào (IC50): Căn cứu kết kết thử nghiệm MTT, tính tỷ lệ phần trăm tế bào sống giếng có bổ sung PG tiếp xúc với tế bào so với nhóm chứng không bổ sung PG Dựa tỷ lệ tế bào sống nhóm nghiên cứu nồng độ PG sử dụng, lập phương trình hồi quy tuyến tính tính tỷ lệ tế bào sống (Y, %) nồng độ PG (X, µg/ml) Phương trình hồi quy tuyến tính có dạng: Y = ax + b Từ phương trình hồi quy tuyến tính, tính liều ức chế 50% tế bào (IC50) PG thời điểm 24 48 dòng tế bào ung thư theo cơng thức: IC50= (50-b)/A (a, b lấy từ phương trình hồi quy tuyến tính Y = ax + b) Thời điểm đánh giá: sau 24 cho tế bào tiếp xúc với mẫu nghiên cứu môi trường nuôi cấy Đánh giá hoạt tính PG ức chế khả di cư xâm lấn tế bào ung thư Hep3B Để đánh giá khả xâm lấn di cư tế bào ung thư Nghiên cứu tiến hành theo phương pháp Pordi Pijuan CS [8] có điều chỉnh cho phù hợp với phịng thí nghiệm Tế bào ung thư nuôi cấy tăng sinh đủ số lượng cấy chuyển sang đĩa 24 giếng nuôi cấy đến đạt khoảng 80 -90% diện tích bề mặt ni cấy tiến hành thí nghiệm Hút loại bỏ môi trường cũ sử dụng dụng cụ chuyên dụng để tạo vết rạch bề mặt tế bào Rửa tế bào dung dịch PBS để loại bỏ tế bào bị bong vết rạch Bổ sung PG môi trường vào giếng nồng độ khác nhau: 1µg/ml; 2µg/ml; 4µg/ml; DMSO (dung dịch pha lỗng PG); Đối chứng (ni cấy tế bào mơi trường bình thường khơng tiếp xúc PG DMSO) Quan sát, chụp ảnh đo diện tích vết rạch tế bào giai đoạn giờ, 24 48 Sau 48 tế bào cố định, nhuộm giemsa tế bào đo diện tích Xử lý số liệu: Các số liệu nhập xử lý với phần mềm phần mềm excel phần mềm thống kê GraphPad Prism 8.0 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU Kết đánh giá hoạt tính PG ảnh hưởng đến khả tăng sinh tế bào ung thư gan Hep3B Tế bào Hep3B tiếp xúc với PG với nồng độ: 0,25 µg/ml; 0,5 µg/ml; µg/ml; µg/ml; µg/ml; µg/ml; µg/ml 10 µg/ml Sau 24 tiếp xúc với PG kết thể hình 1, biểu đồ 1và Từ kết hình ảnh thu nhận sau tế bào ung thư Hep3B tiếp xúc với PG Ở thí nghiệm Hep3B tiếp xúc với DMSO (dung dịch pha lỗng PG), tế bào Hep3B khơng ảnh hưởng gây chết tế bào khơng làm thay đổi hình thái tế bào (hình 1-DMSO) Tế bào giếng RMPI tế bào ni cấy mơi trường bình thường, khơng tiếp xúc với PG DMSO, tế bào tăng sinh tốt, mật độ tế bào dày đặc (hình 1-DC) Ở nồng độ PG cao 10 μg/ml, 8μg/ml, μg/ml có thay đổi hình dạng tế bào Hep3B PG ảnh hưởng làm nhiều tế bào Hep3B bị chết (hình 1-6PG, 8PG, 10PG), lượng tinh thể formazan tạo nên hệ số đo OD thấp (biểu đồ 1) Ở nồng độ thấp μg/ml, μg/ml, μg/ml PG có ảnh hưởng đến tế bào Hep3B làm thay đổi hình thái tế bào có tác dụng ức chế khả tăng sinh tế bào Hep3B, lượng formazan tạo sau bổ sung MTT nhiều so với nồng độ 10 μg/ml (biểu đồ 1) Kết đo mật độ quang (OD) lượng tinh thể formazan tạo phản ứng MTT tỷ lệ thuận với mật độ tế bào thơng qua hình ảnh tế bào Từ kết cho thấy PG có khả ức chế khả tăng sinh tế bào Hep3B TẠP CHÍ NỘI KHOA VIỆT NAM | SỐ 21/20210 43 NGHIÊN CỨU LÂM SÀNG DC DMSO 0,25 PG 0,5 PG PG PG PG PG PG 10 PG Hình Tế bào HEP3B tiếp xúc với PG nồng độ khác sau 24 giờ, 100X (DC-Nhóm đối chứng - Tế bào ni cấy bình thường; DMSO: Tế bào nuôi môi trường bổ sung DMSO; 0,25PG -10PG: Tế bào nuôi cấy môi trường có bổ sung PG nồng độ từ 0,25-10µg/µl) Biểu đồ Kết đo phản ứng MTT mẫu tế bào ung Hep3B tiếp xúc với PG nồng độ khác (****P