Nghiên cứu ảnh hưởng của một số chất trung gian nhằm phân hủy thuốc bảo vệ thực vật chlorpyrifos bởi enzyme laccase từ nấm đảm basidiomycetes (khóa luận tốt nghiệp)

1HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐỀ TÀI: NGHIÊN CỨU ẢNH HƯỞNG CỦA MỘT SỐ CHẤT TRUNG GIAN NHẰM PHÂN HỦY THUỐC BẢO VỆ THỰC VẬT CHLORPYRIFOS BỞI ENZYME LACCASE TỪ NẤM ĐẢM BASIDIOMYCETES HÀ NỘI – 2022 HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM KHOA CƠNG NGHỆ SINH HỌC KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐỀ TÀI: NGHIÊN CỨU ẢNH HƯỞNG CỦA MỘT SỐ CHẤT TRUNG GIAN NHẰM PHÂN HỦY THUỐC BẢO VỆ THỰC VẬT CHLORPYRIFOS BỞI ENZYME LACCASE TỪ NẤM ĐẢM BASIDIOMYCETES Sinh viên thực : Hồng Thị Ngọc Anh Khóa : 63 Ngành : Công nghệ Sinh học Giáo viên hướng dẫn : TS Chu Nhật Huy GS.TS Phan Hữu Tôn HÀ NỘI – 2022 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu khoa học thân Các số liệu, kết trình bày luận văn trung thực chưa cơng bố trước Sinh viên thực Hồng Thị Ngọc Anh i LỜI CẢM ƠN Lời đầu tiên, em xin chân thành cảm ơn TS Chu Nhật Huy tạo điều kiện giúp đỡ em hoàn thành đợt thực tập khóa luận phịng Cơng nghệ Sinh học Tái tạo Môi trường – Viện Công nghệ Sinh học hướng dẫn cho em kỹ thuật, phân tích kết thu Bên cạnh đó, em xin gửi lời cảm ơn đến TS Đào Thị Ngọc Ánh anh chị cán nghiên cứu phòng Công nghệ Sinh học Tái tạo Môi trường tận tình dạy giới thiệu cho em dụng cụ, máy móc phịng hướng dẫn em sử dụng số thiết bị máy móc số kỹ thuật phịng thí nghiệm Em xin gửi lời cản ơn đến GS.TS Phan Hữu Tôn thầy cô môn SHPT CNSH ứng dụng thầy cô khoa Công nghệ Sinh học tạo điều kiện giúp đỡ em hoàn thành đợt thực tập đạt kết cao lần thực tập khóa luận Lời cuối cùng, em xin cảm ơn cha mẹ, bạn bè, người ủng hộ, giúp đỡ em, để em hồn thành khóa luận tốt Em xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, Ngày tháng năm 2022 Sinh viên Hoàng Thị Ngọc Anh ii MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN i LỜI CẢM ƠN ii MỤC LỤC iii DANH MỤC BẢNG v DANH MỤC HÌNH vi DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT vii TÓM TẮT viii PHẦN I MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề 1.2 Mục đích nghiên cứu 1.3 Yêu cầu PHẦN II TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Tổng quan thuốc bảo vệ thực vật chlorpyrifos 2.1.1 Tính chất chlorpyrifos 2.1.2 Ảnh hưởng chlorpyrifos đến môi trường người 2.1.3 Tình hình sử dụng chlorpyrifos Việt Nam 2.2 Tổng quan enzyme laccase 2.2.1 Giới thiệu enzyme lacccaes 2.2.2 Cấu tạo enzyme laccase 2.2.3 Cơ chế xúc tác enzyme laccase 2.2.4 Tính chất enzyme laccase 2.2.5 Sinh tổng hợp enzyme laccase từ vi sinh vật 2.2.6 Vai trò ứng dụng enzyme laccase 10 2.3 Tổng quan nấm đảm basidiomycetes 10 2.4 Tổng quan chất trung gian 11 2.5 Một số nghiên cứu sử dụng enzyme laccase phân hủy chlorpyrifos 13 2.6 Phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao (High Performance Liquid Chromatography) 14 2.6.1 Khái niệm 14 iii 2.6.2 Pha tĩnh sắc ký pha đảo 15 2.6.3 Pha động săc ký pha đảo 15 2.7 Kỹ thuật chiết lỏng – lỏng 16 2.8 Tổng quan vùng ITS 16 PHẦN III VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 18 3.1 Vật liệu hóa chất 18 3.1.1 Vật liệu thiết bị 18 3.1.2 Hóa chất 18 3.2 Phương pháp nghiên cứu 18 3.2.1 Nuôi cấy sinh tổng hợp enzyme laccase 18 3.2.2 Định danh vi nấm 19 3.2.2.1 Tách chiết DNA tổng số từ vi nấm FAL1 19 3.2.2.2 Phương pháp PCR định danh vi nấm 20 3.2.3 Phương pháp xác định hoạt độ laccase sử dụng chất ABTS 22 3.2.4 Phương pháp chiết chlorpyrifos từ môi trường nuôi cấy 24 3.2.5 Ảnh hưởng chất trung gian đến phân hủy chlorpyrifos 25 3.2.6 Xác định hàm lượng chlorpyrifos phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao (HPLC) 27 3.2.7 Phân tích số liệu 28 PHẦN IV KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 29 4.1 Xác định hoạt tính enzyme laccase từ chủng nấm sưu tập giống 29 4.2 Định danh vi nấm 30 4.3 Xây dựng đường chuẩn chlorpyrifos 33 4.4 Phương pháp chiết xuất chlorpyrifos 35 4.5 Khả phân hủy ảnh hưởng chất trung gian đến phân hủy chlorpyrifos enzyme laccase 39 PHẦN V KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 43 TÀI LIỆU THAM KHẢO 44 iv DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1 Trình tự mồi khuếch đại vùng ITS 17 Bảng 3.1 Trình tự mồi sử dụng phản ứng PCR 21 Bảng 3.2 Thành phần phản ứng PCR 21 Bảng 3.3 Chu kỳ nhiệt phản ứng PCR 21 Bảng 3.4 Thành phần phản ứng xác định hoạt tính enzyme 23 Bảng 3.5 Thành phần phản ứng chọn phương pháp chiết 24 Bảng 3.6 Thành phần phản ứng nghiên cứu ảnh hưởng chất trung gian 26 Bảng 3.7 Thành phần phản ứng ảnh hưởng chất trung gian (set đối chứng) 27 Bảng 4.1 Hoạt tính laccase chủng nấm hoạt hóa 29 Bảng 4.2 Kết độ xác phương pháp phân tích 34 Bảng 4.3 Tỷ lệ thu hồi CPF phương pháp chiết xuất 36 Bảng 4.4 Khả phân hủy CPF laccase ảnh hưởng chất trung gian nồng độ 6mM 41 v DANH MỤC HÌNH Hình 2.1 Cơ chế xúc tác laccase Hình 2.2 Sơ đồ vị trí mồi rDNA 17 Hình 4.1 Sản phẩm DNA tổng số tách từ mẫu nấm FAL1 30 Hình 4.2 Sản phẩm PCR khuếch đại sử dụng cặp mồi ITS1/ITS4 31 Hình 4.3 Hình thái chủng nấm FAL1 32 Hình 4.4 Hình thái khuẩn lạc FAL1 32 Hình 4.5 Sắc ký đồ Chlorpyrifos 34 Hình 4.6 Đồ thị đường chuẩn CPF thể tương quan nồng độ chất phân tích diện tích peak trung bình 35 Hình 4.7 Sắc ký đồ phương pháp chiết 37 Hình 4.8 Mẫu sử dụng phương pháp chiết n-hexane với ACN n-hexane với isopropanol sau để tĩnh 30 phút 38 Hình 4.9 Biểu đồ thể hoạt tính enzyme laccase ngày ủ 40 vi DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT ABTS 2,2′-Azino-bis (3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic axit) ACN Acetonitrile BVTV Bảo vệ thực vật CPF Chlorpyrifos HBT 1-hydroxybentotriazole HPLC High Performance Liquid Chromatography ITS Internal Transcribed Spacer NCBI National Center for Biotechnology Information SKPĐ Sắc ký pha đảo SKPT Sắc ký pha thuận TCMP 3,5,6-trichloro-2-methoxypyridine TCP 3,5,6-trichloro-2-pyridinol TMP 3,5,6-trichloro-2-methypyridine vii TÓM TẮT Nghiên cứu thực nhằm xác định số chất trung gian giúp tăng cường khả phân hủy chlorpyrifos enzyme laccase từ nấm đảm Basidiomycetes Trong bốn chủng nấm đảm Basidiomycetes ni cấy, hoạt hóa mơi trường thạch PDA lên men môi trường PDARb, chủng Pycnoporus FAL1 chọn làm nguồn enzyme để thực phản ứng phân hủy enzyme có hoạt tính cao chủng hoạt hóa Phương pháp chiết chlorpyrifos thực với hai loại dung môi nhexane ethyl acetate Phản ứng phân hủy chlorpyrifos thực với bốn loại chất trung gian violuric acid, syringaldehyde, acetosyringone, 1hydroxybentotriazole (HBT) nồng độ mM, nồng độ chlorpyrifos 20 ppm, lượng enzyme cố định 800 µl, ủ đệm citrate phosphate điều kiện bóng tối 30℃, pH 5.0 Kết ghi nhận HBT chất trung gian giúp làm tăng khả phân hủy enzyme laccase, đạt 9,25 % ba chất trung gian lại, đặc biệt acetosyringone, làm ức chế khả phân hủy chlorpyrifos enzyme laccase từ chủng FAL1 viii Trình tự ITS sử dụng phổ biến cho nghiên cứu phân tử thực vật nấm Nghiên cứu sử dụng trình tự ITS xác định lồi họ hàng nhiều nhóm nấm khác chúng có tốc độ tiến hố nhanh, mức độ da dạng cao nhiều lần vùng DNA ty thể Vì vậy, ITS đề xuất vùng DNA chuẩn cho định danh nấm Trong nghiên cứu này, hai mồi ITS1 ITS4 sử dụng để khuếch đại vùng ITS1-5,8S-ITS2 Sản phẩm PCR với cặp mồi ITS1/ITS4 sau tinh giải trình tự Viện Công nghệ Sinh học – Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam Tuy nhiên, chưa có kết trình tự thời gian nghiên cứu giới hạn, trình tự so sánh với trình tự ngân hàng gen thuộc NCBI (Genbank), khẳng định định loại xác chủng nấm Dựa vào đặc điểm hình thái vi nấm, ta tạm kết luận loài gỗ mục trắng thuộc họ Polyporaceae, chi Pycnoporus Một số loài nấm thuộc chi Pycnoporus Pycnoporus coccineus, Pycnoporus sanguineus, Pycnoporus cinnabarinus, Pycnoporus puniceus lồi có đại diện với khả sinh laccase với hoạt tính cao Nấm Pycnoporus sử dụng nhiều cơng nghiệp khả tạo enzyme phân hủy lignin polysaccharide gỗ giấy Trong điều kiện thích hợp Pycnoporus tạo nồng độ lớn enzyme laccase Pycnoporus tạo metalloenzyme đồng sắt có liên quan đến q trình biến đổi hóa học hợp chất thơm có thành tế bào thực vật 4.3 Xây dựng đường chuẩn chlorpyrifos Để xác định hàm lượng CPF có mẫu nghiên cứu, đường chuẩn CPF xây dựng dựa điểm nồng độ 20 ppm, 40 ppm, 80 ppm 100 ppm, định lượng phân tích hệ thống máy HPLC có cột phân tích C18 dài 150 mm, với điều kiện phân tích bước sóng 288 nm, pha động có tỷ lệ 84 ACN: 16 H2 O, tốc độ dòng 0.2 ml/phút nhiệt độ buồng cột 40℃ Kết sắc ký đồ (hình 4.5) thực máy HPLC cho thấy thời gian 33 lưu CPF vào khoảng từ 3,818 – 3,845 phút Các đỉnh peak khơng bị dính vào nhau, cân khơng có nhiều đỉnh phụ Trong đó, độ xác, độ lặp lại tốt Độ hấp thụ (mAU) (bảng 4.2), nồng độ thực nghiệm tiệm cận nồng độ theo tính tốn lý thuyết Thời gian (phút) Hình 4.5 Sắc ký đồ Chlorpyrifos Bảng 4.2 Kết độ xác phương pháp phân tích STT Nồng độ lý thuyết (ppm) Diện tích peak trung bình (mAU.s) Độ lệch chuẩn (%) Độ lệch chuẩn trung bình RSD (%) 20 184.675 0.285 0.154 40 373.957 0.416 0.111 80 738.087 2.422 0.328 100 905.800 2.339 0.258 34 Dựa vào nồng độ diện tích peak điểm nồng độ, ta lập đồ thị đường chuẩn Từ đồ thị ta có phương trình đường chuẩn y = 9.0319x + 8.7164, R2 = 0.9996 Trong đó, y (mAU.s) diện tích peak trung bình, x (ppm) nồng độ mẫu phân tích Diện tích peak trung bình (mAU.s) Đường chuẩn CPF 1000 y = 9.0319x + 8.7164 R² = 0.9996 900 800 700 600 500 400 300 200 100 0 20 40 60 80 100 120 Nồng độ (ppm) Hình 4.6 Đồ thị đường chuẩn CPF thể tương quan nồng độ chất phân tích diện tích peak trung bình 4.4 Phương pháp chiết xuất chlorpyrifos Qua nhiều nghiên cứu, người ta thấy n-hexane cho hiệu cao trình chiết, nhiên, n-hexane tạo tượng nhũ hóa nghiêm trọng Một biện pháp đưa để khắc phục tượng sử dụng số dung môi phá nhũ methanol, ACN, isopropanol, … Brzak & cs (1998) chọn 0.25 ml metanol làm dung môi phá nhũ kết hợp với 1.5 ml nhexan để chiết xuất CPF chất chuyển hóa từ máu Yoshie Yamazaki & cs (1999) sử dụng ethyl acetate để chiết CPF mẫu cam Xinhua Dai & cs (2016) sử dụng ml hexane 0.5 ml dung môi phá nhũ acetonitrile để chiết chlorpyrifos từ mẫu máu Dựa nghiên cứu đó, n-hexane ethyl acetate kết hợp với dung môi phá nhũ ACN isopropanol chọn để thử nghiệm chiết CPF nghiên cứu 35 Nhằm tối ưu hiệu chiết CPF, hai dung môi chiết ethyl acetate, nhexan, hai chất phá nhũ ACN isopropanol sử dụng nghiên cứu chọn lựa phương pháp chiết phù hợp Sự kết hợp dung môi chất phá nhũ tạo bốn tổ hợp chiết khác nhau: n-hexan kết hợp với ACN; n-hexan kết hợp với isopropanol; ethyl acetate kết hợp với ACN ethyl acetate kết hợp với isopropanol CPF bổ sung vào môi trường lên men PDSRb, hỗn hợp sử dụng làm mẫu nghiên cứu Mỗi phương pháp chiết lặp lại lần (Xinhua Dai & cs., 2017) Các mẫu sau chiết cho bay hết dung môi hệ thống máy quay, sau hịa tan ACN định lượng máy HPLC Kết định lượng CPF trình bày bảng 4.3 Bảng 4.3 Tỷ lệ thu hồi CPF phương pháp chiết xuất STT Mẫu Tỷ lệ thu hồi (%) E+I 95,2 E+A 86,3 H+I 100 H+A 98,9 (Chú thích: E: Ethyl acetate; I: isopropanol; H: n-hexane; A: Acetonitrile) Bảng 4.3 cho thấy tỷ lệ thu hồi CPF phương pháp chiết, tổ hợp chiết ethyl acetate kết hợp với isopropanol đạt tỷ lệ thu hồi 95,2 %, n-hexan kết hợp với ACN đạt tỷ lệ thu hồi 98,9 % n-hexan kết hợp với isopropanol đạt tỷ lệ thu hồi cao đạt 100 % Tổ hợp chiết ethyl acetate kết hợp với ACN cho tỷ lệ thu hồi thấp đạt 86,3 % Có thể thấy phương pháp chiết sử dụng dung mơi n-hexane cho hiệu chiết tốt so với phương pháp chiết sử dụng dung môi ethyl acetate 36 B A C D Hình 4.7 Sắc ký đồ phương pháp chiết (Chú thích: A: Ethyl acetate + ACN, B: Ethyl acetate + isopropanol, C: nhexane + ACN, D: n-hexane + isopropanol) 37 Trong trình chiết, phương pháp chiết sử dụng n-hexane cho thấy khả huyền phù phân lớp tốt ethyl acetate, thời gian phân lớp hoàn toàn n-hexane tiếng, ethyl acetate phải tiếng để phân lớp rõ ràng Kết sắc ký đồ n-hexane cho thấy đỉnh peak cân đối đỉnh phụ so với sắc ký đồ ethyl acetate (hình 4.7) Trong hai phương pháp sử dụng n-hexane kết hợp với dung môi phá nhũ ACN phương pháp sử dụng n-hexane kết hợp với isopropanol, phương pháp có sử dụng ACN thể khả phá nhũ tốt so với isopropanol Sau để lắng 30 phút, mẫu n-hexane ACN phân lớp tốt hơn, pha chiết hơn, mẫu n-hexane isopropanol lâu phân lớp hơn, pha chiết đục (hình 4.8) Khi hịa tan CPF để lập đường chuẩn hòa tan CPF sau quay dùng ACN Do đó, phương pháp chiết sử dụng dung môi n-hexane kết hợp với chất phá nhũ ACN chọn để thực chiết CPF thí nghiệm Hình 4.8 Mẫu sử dụng phương pháp chiết n-hexane với ACN n-hexane với isopropanol sau để tĩnh 30 phút 38 4.5 Khả phân hủy ảnh hưởng chất trung gian đến phân hủy chlorpyrifos enzyme laccase Theo nghiên cứu trước đây, enzyme laccase từ chủng nấm đảm basidiomycetes ứng dụng nhiều vào việc phân hủy thuốc trừ sâu hữu CPF Shanthi Kumari & cs (2019), sử dụng nấm gỗ mục trắng Stereum ostrea để phân hủy CPF 10 ngày Pycnoporus sanguineus Trametes maxima nghiên cứu để phân hủy CPF Wiberth cộng năm 2019 Pravin D Patil & cs (2021) nghiên cứu chủng nấm Trametes hirsute MTCC-1171 để phân hủy CPF, đạt hiệu phân hủy 95% vòng 16 ủ Trametes versicolor chủng nấm basidiomyces mà Xiaoting Jin & cs (2016) sử dụng để phân hủy CPF 2, 6, 10 ngày, có sử dụng chất trung gian vanillin, HBT, acetosyringone, syrigaldehyde, violurric acid, ABTS để nghiên cứu ảnh hưởng chúng đến phân hủy CPF Từ nghiên cứu này, lựa chọn bốn loại chất trung gian HBT, acetosyringone, syrigaldehyde, violurric acid để tiến hành thí nghiệm phân hủy CPF tác động chất trung gian ngày ủ Mỗi phản ứng với chất trung gian lặp lại lần Tốc độ phân hủy định lượng cách sử dụng hệ thống máy HPLC Khả phân hủy CPF enzyme laccase ảnh hưởng chất trung gian đến trình phân hủy tiến hành nghiên cứu Bốn chất trung gian nghiên cứu HBT, acetosyringone, syrigaldehyde, violurric acid nồng độ mM, lượng enzyme chủng FAL1 cố định 800 µl, nồng độ CPF 20 ppm, phản ứng diễn môi trường đệm citrate phosphate pH = 5.0, ủ bóng tối nhiệt độ 30℃ (Xiaoting Jin & cs., 2016) Mỗi phản ứng lặp lại lần Ngồi ra, q trình ủ, hoạt tính enzyme laccase xác định ngày để kiểm tra trình hoạt động enzyme (hình 4.9) Từ hình 4.9 ta thấy hoạt tính enzyme sau ngày bắt đầu giảm mạnh dần ổn định qua ngày sau Ở thời điểm ban đầu, ba loại chất 39 trung gian violurric acid, syrigaldehyde, acetosyringone cao so với mẫu đối chứng, cao mẫu sử dụng violurric acid có hoạt tính 1347 U/L HBT làm ức chế enzyme laccase làm giảm hoạt tính enzyme 1049 U/L Sau ngày hoạt độ enzyme mẫu giảm đáng kể, hoạt tính enzyme laccase mẫu sử dụng violurric acid thấp nhất, tiếp HBT, acetosyringone cuối syrigaldehyde Từ ngày 2, hoạt tính enzyme ổn định dần Điều chứng tỏ có tác động chất trung gian đến hoạt độ laccase HOẠT ĐỘ LACCASE TRONG NGÀY Ủ ViO Syr Mẫu ĐC Ace 743.056 680.555 111.111 59.028 420.138 436.805 693.75 671.528 635.417 629.861 NGÀY Ủ 141.666 62.5 130.556 156.944 72.917 329.861 451.389 554.167 756.25 745.139 691.667 747.917 350 189.583 781.25 1347.222 1236.111 1305.556 1208.333 HOẠT ĐỘ (U/L) 1048.611 HBT Hình 4.9 Biểu đồ thể hoạt tính enzyme laccase ngày ủ ảnh hưởng loại chất trung gian 40 Lượng CPF lại mẫu sau ngày ủ 30 oC định lượng máy HPLC, từ tính toán tỷ lệ phân hủy mẫu Kết phân hủy CPF laccase ảnh hưởng chất trung gian đến laccase thể bảng 4.4 Bảng 4.4 Khả phân hủy CPF laccase ảnh hưởng chất trung gian nồng độ mM STT Mẫu Tỷ lệ phân hủy (%) ĐC (-) 0d ĐC (-) 5d ĐC (+) 5d 7,53 HBT 9,25 Vio 5,88 Syr 5,28 Ace 2,61 (Chú thích: ĐC (-) 0d: mẫu đối chứng âm chiết ngày 0; ĐC (-) 5d: mẫu đối chứng âm chiết ngày 5; ĐC (+) 5d: mẫu đối chứng dương (có bổ sung laccase) chiết ngày 5; HBT: mẫu phân hủy có ảnh hưởng 1hydroxybenzotriazole; ViO: mẫu phân hủy có ảnh hưởng violuric acid; Syr: mẫu phân hủy có ảnh hưởng syringaldehyde; Ace: mẫu phân hủy có ảnh hưởng acetosyringone) Từ bảng 4.4, kết phân hủy cho thấy so với mẫu đối chứng âm enzyme laccase bị bất hoạt, mẫu đối chứng dương có mặt enzyme laccase cho kết phân hủy 7,53 %, mẫu có ảnh hưởng HBT cho kết phân hủy 9,25 %, mẫu violurric acid 5,88 %, mẫu syrigaldehyde 5,28 %, mẫu acetosyringone 2,61 % Tỷ lệ phân hủy CPF enzyme laccase không cao so với số nghiên cứu khác (Pravin D & cs., 2021; Jaiswal & cs., 2017; Xiaoting Jin & cs., 2016) Tuy nhiên thời gian trình phân hủy sau năm ngày, khoảng thời gian không dài so với nghiên cứu phân hủy 41 chất ô nhiễm bền vững Tỷ lệ cao thời gian phân hủy kéo dài, nhiên khn khổ đồ án khơng cho phép nên khơng có điều kiện thử nghiệm thời gian dài Khi so sánh kết phân hủy mẫu có ảnh hưởng chất trung gian với mẫu có laccase (ĐC +), ta thấy mẫu HBT có tỷ phân hủy CPF cao nhất, mẫu có ảnh hưởng acetosyringone, syrigaldehyde, violurric acid cho tỷ lệ phân hủy không cao thấp mẫu có laccase, mẫu có tỷ lệ phân hủy thấp mẫu có mặt acetosyringone Do đó, kết luận điều kiện phân hủy pH = 5, 30℃ bóng tối, nồng độ chất trung gian mM HBT làm tăng hiệu phân hủy CPF enzyme laccase tốt chất trung gian khác làm ức chế trình Cả ba chất trung gian acetosyringone, syrigaldehyde, violurric acid làm giảm khả phân hủy CPF enzyme, chất ức chế nhiều acetosyringone 42 PHẦN V KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 5.1 Kết luận - Chủng FAL1 sinh laccase cao chủng hoạt hóa sàng lọc, đạt 3201 U/L - Chủng nấm FAL1 thuộc loài gỗ mục trắng thuộc họ Polyporaceae, chi Pycnoporus - Đã xác định chất trung gian có khả tăng cường khả phân hủy chlorpyrifos enzyme laccase HBT đạt 9,25 %, chất trung gian làm giảm khả phân hủy enzyme laccase acetosyringone, syrigaldehyde, violurric acid 5.2 Kiến nghị - Nghiên cứu điều kiện lên men nhằm tăng khả sinh tổng hợp laccase chủng FAL1 - Tối ưu điều kiện phân hủy chlorpyrifos laccase nồng độ chất trung gian, nồng độ chlorpyrifos, thời gian phân hủy, hoạt tính laccase ban đầu, … để tăng hiệu suất phân hủy chlorpyrifos enzyme laccase từ chủng FAL1 43 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tham khảo tiếng Việt Bộ Nông nghiệp Phát triển nông thôn (2018) Thuốc bảo vệ thực vật - xác định hàm lượng hoạt chất chlorpyrifos ethyl Tiêu chuẩn quốc gia Truy cập từ: https://luattrongtay.vn/ViewFullText/Id/6fba4065-d71c-492b-a9e9-92baf8766a37 Ngày truy cập: 25/02/2022 Khuyết danh (2012) Kỹ thuật chiết lỏng – lỏng Truy cập https://xetnghiemdakhoa.com/diendan/thread-75.html Ngày truy cập: 20/2/2022 từ: Nguyễn Bá Phú, Nguyễn Bảo Vệ, Bùi Thị Cẩm Hường & Trần Nhân Dũng (2011) Nhận diện xác định mối quan hệ di truyền hai cá thể quýt đường không hột phát đồng sông cửu long dấu phân tử DNA Tạp chí Khoa học Đại học Cần Thơ 2011 20a: 108-118 Nguyễn Diễm (2021) Một số đặc điểm kinh doanh thuốc bảo vệ thực vật? Truy cập từ: https://luatminhkhue.vn/mot-so-dac-diem-ve-kinh-doanh-thuoc-bao-ve-thuc-vat.aspx Ngày truy cập: 25/02/2022 Nguyễn Thị Anh Thư (2014) Khảo sát khả phân hủy yếm khí chlorpyrifos ethyl cộng đồng vi khuẩn đất canh tác chuyên canh lúa đồng sông Cửu Long Tạp chí khoa học Trường Đại học Cần Thơ 8-45 Phạm Minh Đức Trần Ngọc Tuấn (2012) Định danh nấm thủy mi (achlya bisexualis) khảo sát hóa chất kháng vi nấm Tạp chí Khoa học Đại học Cần Thơ 2012 22c: 165172 Phịng Phân tích Sắc Ký (CASE) (2012) Phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao (HPLC) Truy cập từ: https://www.case.vn/vi-VN/34/96/118/details.case Ngày truy cập: 25/02/2022 Phùng Khắc Huy Chú (2018) Nghiên cứu khả loại màu thuốc nhuộm, hoạt tính phân hủy chất diệt cỏ/dioxin vi sinh vật sinh enzyme laccase Học viện Khoa học Công nghệ Truy cập từ: http://gust.edu.vn/media/26/uftai-ve-tai-day26170.pdf Ngày truy cập: 20/02/2022 Quốc hội (2013) Luật bảo vệ kiểm định thực vật Luật số 41/2013/QH13 Truy cập từ: https://vbpl.vn/TW/Pages/vbpq-van-ban-goc.aspx?ItemID=32909 Ngày truy cập: 25/02/2022 10 Vũ Thị Thu (2018) Nghiên cứu đệm sinh học phân hủy hóa chất bảo vệ thực vật (chlorpyrifos) Luận văn thạc sĩ khoa học Trường Đại học Khoa học Tự nhiên 38-93 11 Rainforest Alliance (2016) Quản lý thuốc bảo vệ thực vật Truy cập từ: https://www.rainforest-alliance.org/wp-content/uploads/2020/06/Annex-7-PesticidesManagement_VN.pdf Ngày truy cập: 25/02/2022 44 Tài liệu tham khảo tiếng Anh Akbar & Sultan (2016) Soil bacteria showing a potential of chlorpyrifos degradation and plant growth enhancement Brazilian Journal of Microbiology 47(3): 563–570 DOI: https://doi.org/ 10.1016/j.bjm.2016.04.009 Anh T.N Dao, Jet Voncka, Thierry K.S Janssens, Ha T.C Dang, Abraham Brouwer & Tjalf E de Boer (2018) Screening white-rot fungi for bioremediation potential of 2,3,7,8tetrachlorodibenzo-p-dioxin Industrial Crops & Products 128: 153 - 161 DOI: 10.1016/j.indcrop.2018.10.059 Begerow, D., Nilsson, H., Unterseher, M., & Maier, W (2010) Current state and perspectives of fungal DNA barcoding and rapid identification procedures Appl Microbial Biotechnol 87(1): 99–108 DOI: http://doi.org/ 10.1007/s00253-010-2585-4 Bellemain, E., Carlsen, T., Brochmann, C., Coissac, E., Taberlet, P., & Kauserud, H (2010) ITS as an environmental DNA barcode for fungi: an in silico approach reveals potential PCR biases BMC Microbiology 10:189 DOI: http://doi.org/10.1186/1471218010-189 Bouchard MF, Chevrier J, Harley KG, Kogut K, Vedar M, Calderon N & Eskenazi B (2011) Prenatal exposure to organophosphate pesticides and IQ in 7-year-old children Env Heal Perspect 119:1189 DOI: https:// doi.org/10.1289/ehp.1003185 Griza & Ortiz & Geremias & D Thiesen (2008) Avaliaỗao da contaminaỗ ao por organofosforados em aguas superficiais no município de Rondinha - Rio Grande Sul Quim Nova 31: 1631–1635 DOI: https://doi.org/10.1590/S0100-40422008000 700006 Hasanuzzaman & Rahman & Islam & Salam & Nabi (2018) Pesticide residues analysis in water samples of Nagarpur and Saturia Upazila, Bangladesh Applied Water Science 8:8 DOI: https://doi.org/10.1007/s13201-018-0655-4 Hasanuzzaman, Rahman, Islam, Salam, Nabi (2018) Pesticide residues analysis in water samples of Nagarpur and Saturia Upazila, Bangladesh Applied Water Science 8:8 DOI: https://doi.org/10.1007/s13201-018-0655-4 Hongsibsong, S., Prapamontol, T., Xu, T., Hammock, B.D., Wang, H., Chen, Z.-J., Xu, Z.- L (2020) Monitoring of the organophosphate pesticide chlorpyrifos in vegetable samples from local markets in northern Thailand by developed immunoassay International Journal of Environmental Research and Public Health 17: 4723 DOI: https://doi.org/10.3390/ijerph17134723 10 Kathy A Brzak, Daniel W Harms, Michael J Bartels, Richard J Nolan (1998) Determination of chlorpyrifos, chlorpyrifos oxon, and 3,5,6-trichloro-2-pyridinol in rat and human blood Journal of Analytical Toxicology 22(3):203–210 DOI: https://doi.org/10.1093/jat/22.3.203 11 Koshlukova, S.E., Reed, N.R (2014) Chlorpyrifos Encyclopedia of Toxicology 3:930– 934 DOI: https://doi.org/10.1016/B978-0-12-386454-3.00115-9 12 Liaquat, F., Khan, Q.M., Khalid, Z.M., Iqbal, S (2009) Biodegradation of chlorpyrifos and its hydrolysis product 3,5,6-trichloro-2-pyridinol by Bacillus pumilus strain C21 Journal of Hazardous Materials DOI: https://doi.org/10.1016/j jhazmat.2009.02.059 45 13 Maura Téllez, Elba C, Lourdes Acosta (2016) Fungi of Pycnoporus: Morphological and molecular identification, worldwide distribution and biotechnological potential Mycosphere Essay 7(10): 11 14 Maya, K., Upadhyay, S.N., Singh, R.S., Dubey, S.K (2012) Degradation kinetics of chlorpyrifos and 3,5,6-trichloro-2-pyridinol (TCP) by fungal communities Bioresour Technol 126: 216–223 DOI: https://doi.org/10.1016/j.biortech.2012.09.003 15 Muhammad Bial, Hafiz Iqbal, Barcelo (2019) Persistence of pesticides-based contaminants in the environment and their effective degradation using laccase-assisted biocatalytic systems Science of the TotalEnvironment 695(2019): 133896 DOI: https://doi.org/10.1016/j.scitotenv.2019.133896 16 Nabil, S.A., Hussein, H.S., Salah, E.M.A.A., Reda, A.B (2011) Isolation, characterization and fingerprinting of some chlorpyrifos - degrading bacterial strains isolated from Egyptian pesticides-polluted soils African Journal of Microbiology Research 5(18):2855-2862 DOI: https://doi.org/10.5897/ ajmr11.044 17 Nilsson, R H., Ryberg, M., Abarenkov, K., Sjökvist, E., & Kristiansson, E (2009) The ITS region as a target for characterization of fungal communities using emerging sequencing technologies FEMS Microbiology Letters 296(1): 97–101 DOI: http://doi.org/ 10.1111/j.1574-6968.2009.01618.x 18 Nurrahmi Dewi Fajarningsih (2016) nternal Transcribed Spacer (ITS) as Dna Barcoding to Identify Fungal Species: A Review Postharvest and Biotech 11 (2) 2016, 37-44 DOI: 10.15578/squalen.v11i2.213 19 Pravin D Patil, Avnish A Singh & Ganapati D Yadav (2021) Biodegradation of organophosphorus insecticide chlorpyrifos into a major fuel additive 2,4-bis (1,1 dimethylethyl) phenol using white-rot fungal strain Trametes hirsuta MTCC-1171 Journal of the Indian Chemical Society 98(2021): 100120 DOI: https://doi.org/10.1016/j.jics.2021.100120 20 Richard E Mauldin, Thomas M Primus, Theresa A Buettgenbach, John J Johnston & G.M Linz (2006) A Simple HPLC Method for the Determination of Chlorpyrifos in Black Oil Sunflower Seeds USDA National Wildlife Research Center Staff Publications Paper 424 DOI: 10.1080/10826070500451863 21 Sakshi Jaiswal, Jyoti Kiran Bara, Ritu Soni, Khyati Shrivastava (2017) Bioremediation of Chlorpyrifos Contaminated Soil by Microorganism International Journal of Environment Agriculture and Biotechnology 2:1624–1630 DOI: 10.22161/ijeab/2.4.21 22 Samson, R A., Houbraken, J., Thrane, U., Frisvad, J C., & Andersen, B (2010) Food and Indoor Fungi Utrecht: CBS-KNAW Fungal Biodiversity Center 23 Sanchali Bose, P Senthil Kumar & Dai-Viet N Vo (2021) A review on the microbial degradation of chlorpyrifos and its metabolite TCP Science Direct 283: 131447 DOI: https://doi.org/10.1016/j.chemosphere.2021.131447 24 Shanthi Kumari, K Praveen, KY Usha, Kanderi Dileep Kumar, G Praveen Kumar Reddy & B Rajasekhar Reddy (2019) Ligninolytic behavior of the white-rot 46 fungus Stereum ostrea under influence of culture conditions, inducers and chlorpyrifos Biotech 9: 424 DOI: https://doi.org/10.1007/s13205-019-1955-6 25 Shraddha, Ravi Shekher, Simran Sehgal, Mohit Kamthania & Ajay Kumar (2011) Laccase: Microbial Sources, Production, Purification, and Potential Biotechnological Applications Enzyme Research 2011: 217861 DOI: :10.4061/2011/217861 26 Silambarasan & Abraham (2014) Efficacy of Ganoderma sp JAS4 in bioremediation of chlorpyrifos and its hydrolyzing metabolite TCP from agricultural soil Journal Basic Microbiol 54(1):16 DOI: https://doi.org/10.1002/jobm.201200437 27 Wang H, Zhang W, Zhao J, Xu L, Zhou C, Chang L, Wang L (2013) Rapid decolorization of phenolic azo dyes by immobilized laccase with Fe3O4/SiO2 nanoparticles as support Ind Eng Chem Res 2013; 52: 4401–7 DOI: https://doi.org/10.1021/ ie302627c 28 Wiberth, Citlalli Casandra, Fan Zhiliang & Heredia Gabriela (2019) Oxidative enzymes activity and hydrogen peroxide production in white-rot fungi and soil-borne micromycetes co-cultures Annals of Microbiology 69: 171-181 DOI: https://doi.org/10.1007/s13213018-1413-4 29 Xiaoting Jin, Xiangyang Yu, Guangyan Zhu, Zuntao Zheng, Fayun Feng, Zhiyong Zhang (2016) Conditions Optimizing and Application of Laccase-mediator System (LMS) for the Laccasecatalyzed Pesticide Degradation Scientific RepoRts 6:35787 DOI: 10.1038/srep35787 30 Xinhua Dai, Fei Fan, Yi Ye, Fan Chen, Zhigui Wu, Xiang Lu, Qingtao Wei, Jianxia Chen, Youyi Yan, Linchuan Liao (2017) Determination of Chlorpyrifos in Human Blood by Gas Chromatography‑Mass Spectrometry Journal of Forensic Science and Medicine 101.96.120.8 DOI: 10.4103/jfsm.jfsm_2_17 31 Xu, F., Chang, X., Lou, D., Wu, Q., Zhou, Z (2012) Chlorpyrifos exposure causes alternation in dopamine metabolism in PC12 cells Toxicology Mechanisms and Methods 22(2012) DOI: https:// doi.org/10.3109/15376516.2012.657260 32 Yamazaki & Ninomiya (1999) Determination of Benomyl, Diphenyl, o-Phenylphenol, Thiabendazole, Chlorpyrifos, Methidathion, and Methyl Parathion in Oranges by SolidPhase Extraction, Liquid Chromatography, and Gas Chromatography Journal of aoac international 82:6 33 Zhang YH, Liu SS, Song XQ, Ge HL (2008) Prediction for the mixture toxicity of six organophosphorus pesticides to the luminescent bacterium Q67 Ecotoxicol Environ Saf 71: 880 – 888 DOI: https://doi.org/10 1016/j.ecoenv.2008.01.014 47