THÔNG TIN TÀI LIỆU
Chuong CAC PHUONG PHAP UNG DUNG TRONG PHAN TICH GENOME 3.1 KHÁI NIỆM VỀ ADN TÁI TỔ HỢP Kỹ thuát tái tổ hợp ADN (Recombinant DNA Technology) thường gọi kỹ thuật di truyền, bao gồm tập hợp hệ thống kỹ thuật, vai trị hàng đầu thuộc tư phương pháp di truyền vị sinh vật, sinh vật học phân tử q trình hố sinh học axit nucleic Cơng nghệ tái tổ hợp ADN phần quan trọng trụ cột ngành công nghệ sinh học, *Công nghệ tái tổ hợp ADN hiểu kỹ thuật nhằm biến đối cấu trúc nhân nhanh hay tổng hợp đoạn ADN phịng thí nghiệm (ng :ài thể sống)” mong muốn điều kiện Cơng nghệ tái tổ hợp ADN hình thức, đời coi vào năm 1972 - 1973 nhóm nghiên cứu Berg, Boyer Cohen (Mỹ) tạo phân tử ADN tái tố hợp đầu tiền phịng thí nghiệm từ ba nguồn vật liệu di truyền khác Sau vào năm 1973 - 1974, nhóm Cohen, Helinski, Boyer lần thu sản phẩm có hoạt tính từ ADN tái tổ hợp phịng thí nghiệm Nhóm Cohen giải nhiệm vụ lớn lắp ghép, tạo dịng ADN Sau nhiều nhà khoa học tham gia vào thí nghiệm nhiều kết có ý nghĩa ứng dụng thực tiễn Trước năm lắp ghép gen nhanh chóng thu 1970, số kỹ thuật di truyền truyền thống ứng dụng chủ yếu cải tạo vật nuôi, trồng Phương pháp di truyền truyền thống sử dụng tác nhản (vật lý, hoá học ) bên thể sinh vật để tạo thể biến đối vẻ di truyền Nhược điểm lớn phương pháp là: việc cải biến truyền mang tính bị động, khó khăn muốn tạo trồng có đặc tính theo chủ ý định trước Kỹ thuật di truyền khác với phương pháp cổ truyền chỗ: biến đổi sen ống nghiệm (in vitro), ghép nối theo chủ ý có lựa chọn từ đoạn vật chất di truyền ADN khác thành dạng ghép nối gọi ADN tái tổ hợp Các đoạn ADN có hoạt tính đưa vào tế bào sống Khái niệm kỹ thuật sen (gene engineering) kỹ thuật di truyền (genetic engineering hay genetic technology) hay kỹ thuật điều khiển gen (gene manipulation) thường hay sử dụng coi đồng nghĩa Kỹ thuật tái tổ hợp ADN gọi kỹ thuật tạo dịng phân tử (molecular cloning) cho phép nhân nhanh thành dịng gồm vơ số ADN giống điều kiện phịng thí nghiệm 62 Trai qua 25 năm phát triển kể từ sau thí nghiệm nhóm Berg (Mỹ) thuật ngữ “kỹ thuật truyền” có nghĩa rộng lớn, bao trùm hơn, gồm thao tác không đoạn gen riêng lẻ mà phần rộng lớn gen bao hàm nhiều hệ thống phương pháp khác Kỹ thuật di truyền thực qua hàng loạt công đoạn với hệ thống phương pháp kỹ thuật tỉnh vi, phức tạp coi ngành cơng nghệ sau thuật ngữ cơng nghệ sinh học “Bio-technology” đời, cơng nghệ AND tái tổ hợp đóng vai trị quan trọng 3.2 CẤU TRÚC, CHỨC NĂNG VÀ ĐẶC TÍNH CỦA ADN 3.2.1 Thành phần ADN Axit nucleic gồm hai loại ADN (axit deoxyribonucleic: ADN, hay goi la deoxyribonucleic acid: DNA) va ARN (axit ribonucleic) Axit deoxyribonucleic tạo nên nối liền nhiều đơn phân (monomer) nucleotide Kết phân tích ADN sinh vật khác cho thấy giống đặc biệt đơn phân hợp thành ADN Thành phần hoá học ADN gồm có gốc phosphoric axit, đường pentose (5C) cịn gọi đường deoxyribose base chứa nitơ Các base ADN gồm hai nhom: base purine 1a adenine (A) va guanine (G); base pirimidine 1a cytosine (C) va thymine (T) ARN, uracil (U) thay cho thymine (T) Dudng pentose (dudéng deoxyribose) gan base nito vi tri C1 sé tao nén nucleoside (nucleozit) Cac nucleoside gan thém nhom phosphate vao vi trí C5 đường pentose tạo nên nucleotide Tính đặc hiệu nucleotide “base” định, nói đến axit nucleic người ta thường dùng base thay cho nucleotide Cách gọi thường cặp base, ký hiệu bp (base pair) hay kb (1 kilobase = 1000 cap base) Nhiéu két nghiên cứu cho thấy phân tử ADN nhỏ chứa vài nghìn base, phân tử lớn tách dài triệu cặp nucleotide Các sinh vật có chung cấu trúc ADN, tính đặc trưng ADN loài biểu trình tự xếp nucleotide dọc theo chiều dài số lượng chúng 3.2.2 Cấu trúc ADN Cấu trúc ADN đa dạng, nhiên cấu trúc theo mơ hình Watson Crick (bậc 2) nghiên cứu nhiều Theo đó, ADN chuỗi xoắn kép gồm 63 hai mach polynucleotide bat cap b6 sung (complementary) tạo thành lò so xoắn kép Hai mạch liên kết với liên kết hydro, base đối diện với theo nguyên tắc bổ sung cặp (hình L) Thymine Adenine NH, al | ° Ny | N N ° | H,N we Ph Guanine ‘4 on C, (đường pentose) T + om a C, l en a C, (đường pentose) Cytosine (đường pentose) Hình 3.1 Vị trí liên kết base phân tử ADN: A bắt cặp với T hai cầu nối hydro, C bắt cặp với G ba cầu nối Đối diện với adenine (A) thymine (T), đối diện với guanine (G) cytosine (C) Watson - Crick kết luận rằng: A bắt cặp với T G bắt cặp với C hoàn toàn dựa tính tốn lý thuyết, điều bất ngờ giải thích phát E Chargaff Mỹ năm 1951 tất loại ADN chứa lượng A-T, G-C giống A-T nối với hai liên kết hydro, C-G nối với ba liên kết hydro Một đặc điểm mơ hình đối song song Để base tương ứng đối diện với nhau, hai mạch cần bố trí đầu mạch đối diện với đầu cuối mạch kia, mạch đơn có đầu mang nhóm photpho tự gắn với vị trí cácbon số (C5) đường pentose (deoxyribose) gọi đầu 5” phốtpho tự đầu có nhóm OH vị trí cácbon số (C3) nên gọi đâu 3'OH tự (hình 3.2), hai mạch có đầu ngược nhau, hướng mạch theo chiều 5” > 3’ 64 eee 3SONH 3'OH (S' 3”) se S'P (3° 3U) 5) | O° O Đường pentose (deoxyribose) Hình 3.2 Cấu trúc phản tử ADN với đơn cŠát hợp thành base + đường deoxyribose + phosphafe Mơ hình Watson - Crick đời năm 1953, đến năm 1970 nhờ sử dụng phương pháp phân tích xác, số liệu chỉnh lý Nhiều dạng ADN phát hiện, dạng B theo mơ hình Watson - Crick thường gặp nhiều Theo quan niệm mới, mơi dạng ADN dịng họ phân tử có kích thước dao động quanh trị số trung bình (bảng 3.1 hình 3.3) Hai số dùng để đánh giá là: h: khoảng hai nucleotide kề N: s6 cap nucleotide vong xoan Bảng 3.1 Các dạng cấu trúc khác ADN Kiểu xoấn A Số cặp base Góc xoắn so với mặt 11 vòng xoắn | xxx | có “9 z phẳng base h- khoảng cách | Đường kính chuỗi base kể xoắn kép +32,7° 2,56A° 23A0 10 +36,0° 3,38A° 19A? 1/3 +38,6° 3.32A° 19A° 12 -30,0° 3,71A° 18A° Dang B (Watson - Crick) tổn điều kiện sinh lý bình thường, dạng khác thường tồn điều kiện độ ẩm ion khác Đặc biệt dạng Z có chiêu xoắn ngược bên trái hình zigzag nên gọi hình Z thường xuất dieu Kiện sinh lý đặc biệt Bộ khung ` Đường - phosphate + 20A’ 1vịng xoắn + 34A° Lién két hydro Hình 3.3: Mơ hình cấu tạo dạng xoắn ADN theo Watson-Crick Việc phát dạng ADN khác cho thấy ADN tế bào “khong don điệu” với cấu trúc nhất, mà tuỳ trạng thái sinh lý dạng hay dạng khác 3.2.3 Đặc tính ADN ADN có nhiều đặc tính liên quan đến hoạt động sống thể sinh vật Đặc tính quan trọng liên quan đến cơng nghệ tái tổ hợp ADN hồi tính (hình 3.4) là: biến tính 3.2.3.1 Biến tính (denaturation) Hai mạch ADN gắn với liên kết hydro Nếu có tác động làm đứt liên kết này, hai mạch tách rời Khi đun nóng phân 66 tử ADN nhiệt độ sinh lý (thường khoảng 85 - 95°C) liên kết hydro hai mạch bị đứt chúng tách rời nhau, tượng biến tính ADN Bién tinh Hồi tính Nhờ tăng nhiệt độ Nhờ hạ nhiệt độ Hình 3.4: Hiện tượng biến tính hồi tính ADN > Sự tồn ADN dạng mạch kép hay đơn xác định phương pháp đo mật độ quang (OD: optical density) Phương pháp dựa vào nguyên tắc base purine pyrimidine ADN hấp thụ bước sóng tử ngoại 260 nm Giá trị mật độ quang tăng lên phân tử mạch đôi chuyển thành mạch đơn Trong phân tử ADN mạch đôi, base nằm chồng lên mặt phẳng song song nên che lấp lẫn nhau, khiến chúng hấp thụ ánh sáng so với ADN mạch đơn Nhiệt độ làm hai mạch tách rời gọi điểm nỏng chảy (melting point) gọi nhiét “Tm” (hinh 3.5) Tm cao hay thấp tuỳ thuộc vào thành phần base ADN điều kiện sử dụng biến tính Tm phụ thuộc vào tỷ lệ base G-C, cặp base G-C nối liên kết hydro bền vững cặp A-T có hai liên kết hydro Do loại ADN có nhiều cặp G-C bền vững với nhiệt độ cần nhiều lượng để tách hai sợi phân tử ADN 67 Hàm lượng G-C nhiệt độ tỷ lệ thuận với nhau, hàm luong G-C tang 1% thi Tm tăng 0,4°C Trong dung dịch có điều kiện sinh lý phù hợp Tm thường khoảng 85 - 95°C Trong 0,2M NaCl, Tm xác định theo công thức Tm = 0,41(%G-C) + 69,3 = Mach don xO © 260 nm D c % š | ” = @iso} | = ©- ° Mạch kép | 85-95°C Nhiệt độ Tm Hình 3.5: Đồ thị nhiệt độ Tm biến tính ADN (denaturation) Ở động vật bậc cao (động vật có vú) tỷ lệ G-C thường chiếm 40% phân tử ADN, Tm vào khoảng 87°C điều kiện sinh lý phù hợp Loại ADN có 60% G-C Tm thường vào khoảng 95°C điều kiện sinh lý phù hợp Ngồi Tm cịn phụ thuộc vào nồng độ dung mơi hữu nhân tố biến tính hỗn hợp phản ứng Cứ thêm 1% formamide thi Tm sé giam di 0,72"C, nồng độ NaCl giam 0,1 - 0,01 M Tm giảm khoảng 16°C 3.2.3.2 Hồi tính (renaturation) Sự biến tính ADN thuận nghịch, nghĩa hạ thấp nhiệt độ mạch ADN gắn kết trở lại với thành mạch kép Hiện tượng gọi tượng hồi tính Q trình hồi tính ADN xác định quang phố kế (theo nguyên tắc trình bày trên) đo lượng ánh sáng qua dung dịch kiểm tra kính hiển vi điện tử Khi nhiệt độ hạ xuống đột ngột không xảy q trình hồi tính Q trình hồi tính diễn nhiệt độ hạ xuống từ từ Sự bắt cặp trở lại sợi đơn bổ sung thường xảy nhiệt độ cực thuận 25-30°C Tốc độ phản ứng hồi tính ADN cịn phụ thuộc vào nồng độ ion Nồng độ muối tăng gấp đơi (dưới 0,1M NaCl) làm tăng q trình bắt cặp trở lại từ 5- 10 lần Tóm lại, chế tự chép biến tính ADN ứng dụng rộng rãi công nghệ tái tổ hợp ADN, công nghệ tách gen Đặc biệt sau phương pháp 68 PCR (Polymerase Chain Reaction: Chudi phan ting triing hop) ddi dựa biến tính chế chép ADN cho phép tái tạo hàng triệu ADN mong muốn thời gian vài đồng hồ điều kiện phịng thí nghiệm 3.3 QUÁ TRÌNH TỔNG HỢP ADN TRONG TẾ BÀO SINH VẬT (DNA REPLICATION) 3.3.1 Cơ chế chép bán bảo tồn (semi-conservation) Bản chất tổng hợp ADN thể sinh vật trình tự chép xác (replication) hay q trình tự nhân đơi (self-duplication) mẫu ADN sản có Bởi nói đến trình tổng hợp ADN thể, người ta gọi q trình chép ADN Sự tổng hợp ADN thực theo kiểu nửa bảo thủ hay gọi bán bảo tồn (semi-conservation) Theo chế này, vào thời điểm ban đầu trình chép chuỗi xoắn kép duỗi xoắn, hai mạch polynucleotide tách rời Mỗi mach đơn trở thành khuôn để tổng hợp mạch bổ sung Vì A gắn với T G gắn với C, kết là: từ phân tử ADN ban dau sé cho đời hai phân tử giống hệt phân tử mẹ, phân tử hình thành từ mạch đơn phân tử mẹ mạch bổ sung vừa tổng hợp Cơ chế bán bảo tồn chứng minh qua thí nghiệm tiếng Meselson Stahl năm 1958 sau: Meselson Stahl nuôi E.coli môi trường nitơ nặng N” Tế bào E.coli sử dụng nguồn N” để tổng hợp ADN Sau chuyển tế bào nuôi sang môi trường nitơ nhẹ NÑ'! Cách khoảng thời gian đặn, người ta lấy tế bào phân tích li tâm gradient tỷ trọng CsCl để xác định ADN có chứa N' ADN chứa N” Kết phân tích phù hợp với kiểu chép bán bảo tồn (hình 3.6) 3.3.2 Nguyên tắc đảm bảo trình chép ADN thành cơng Q trình chép ADN xem xét góc độ sinh học phân tử trình sinh học phúc tạp phải trải qua nguyên tắc chung sau: - Chuỗi xoắn kép duỗi xoắn, liên kết hydro ổn định cấu trúc xoán gắn hai mạch với phải bị phá vỡ tách rời hai mạch - Phải có đoạn mồi (primer) nghĩa đoạn ADN ARN mạch đơn ngắn (từ vài nucleotide đến vài chục vài trăm nucleotide) bất cặp với khuôn (mạch đơn) làm khởi điểm q trình chép 69 Mơ hình bán bảo tồn ` Kết ly tâm oe oc - $e Các mạch bố mẹ tổng hợp (ae NN ` `> trường có NŠ “393 mơi > n-n h Nang (n) Sao chép lần đầu môi trường N VẠCH LAI : Tả —— gs Ỷ Ỷ Sao chép lần hai môi n - nhẹ (nh) VẠCH trường có N” n-nh_ nh-nh Nh - nhẹ n - nh Hình 3.6: Sơ đồ thí nghiệm chế bán bđo tồn chép ADN - Đủ loại nucleotide triphophate bắt cặp với nucleotide mạch khuôn đATTP (deoxyadenosine-5ˆ-triphosphate) dGTP (deoxyguanosine-5’-triphosphate) dTTP (deoxythymidine-5ˆ-triphosphate) dCTP (deoxycytidine-5’-triphosphate) Mạch tổng hợp theo hướng từ đầu 5” dén dau 3’ 70 - Các nucleotide nối lại với liên kết cộng hoá trị để tạo mạch mới, bước điều khiển enzyme đặc hiệu thực cách nhanh chóng, xác : - Quá trình chép sửa chữa tức thời sai sót 3.3.3 Q trình chép ADN tế bào sinh vật Khởi trình chép bắt đầu dũi xoắn ADN, thực nhờ enzyme có tên gọi chung topoisomerase Các enzyme làm cho mạch ADN trạng thái xoắn dudi bat đầu trình tổng hợp - Quá trình tách mạch kép thành hai mạch đơn ADN thực nhờ enzyme có tên gọi chung helicase, sau mạch đơn gắn với protein SSB (Single Strand Binding) Các khong thé bat cặp trở lại protein SSB gắn khắp mạch đơn làm cho hai mạch - Các enzyme helicase phá vỡ liên kết hydro base nhờ lượng giải phóng từ thuỷ phân nucleoside 5° triphophate (NTP) Nhiều loại helicase khác hoạt động đồng thời gắn hai mạch 3'-5" 5-3" - Các enzyme ADN polymerase tổng hợp mạch ADN bổ sung cách nối dài mồi ARN bắt cặp sẵn khuôn Mồi ARN tổng hợp phức hợp protein-enzyme có tên chung primosome Primosome bao gồm enzyme tổng hợp ARN từ khuôn ADN gọi enzyme primase nhiều protein - Trên khuôn 3'—>5' tổng hợp mạch diễn theo chiều 5` ->3”, chiều với hướng tháo xoắn, mạch tổng hợp liên tục gọi mạch tới Mạch khuôn 5'°->3` trình tổng hợp diễn theo hướng 5'—>3” ngược chiều với hướng tháo xoắn Sự tổng hợp mạch xảy đồng thời nhiều điểm khác Đoạn tổng hợp có chiều dài trung bình từ 1000 - 2000 base gọi đoạn okazaki, mạch tổng hợp gọi mạch chậm (hình 3.7) - Sau hệ thống enzyme thuỷ phân ARN, enzyme ADN polymerase kéo dài tiếp đoạn mạch chậm, cuối enzyme ligase nối tất phần gián đoạn lỗ hồng mạch tổng hợp để tạo thành mạch hồn chỉnh - Q trình tổng hợp ADN diễn nhanh, ví dụ E.coli điển với tốc độ 50.000 nucleotide/phút - Ở tế bào vi khuẩn, trình chép bắt đầu điểm (ori: điểm khởi chép) nhiễm sắc thể dạng vịng lan toả hai phía gặp điểm đối diện với điểm khởi đầu chép Ở sinh vật bậc cao, trình chép xẩy với hệ thống enzyme phức tạp Do kích thước lớn gen, chép không xẩy điểm Ví dụ người q trình chép diễn đồng thời 20 - 30.000 điểm đọc theo chiều đài nhiễm sắc thể 71 Bước 3: Nuôi cấy tế bào lai để tạo sẹo Ở bước này, chọn lọc mơ sẹo có mức sinh trưởng tốt để nuôi cấy riêng rẽ môi trường Bước 4: Chuyển mô sẹo sang môi trường tạo chồi, tạo rễ để phát triển thành hoàn chỉnh tiến hành chọn lọc cá thể lai để phát tính trạng tốt 4.5 DANH GIA KET QUA CHUYEN GEN 4.5.1 Muc dich Kỹ thuật sau trình chuyển gen đánh giá kết chuyển gen với hai mục đích: - Xác định việc chuyển gen thành công, nghĩa xác định diện gen cần chuyển mô tế bào - Cần phải nhận biết khối tế bào tiếp nhận gen cần chuyển tách chúng khỏi tế bào khác (khơng chứa gen cần chuyển cịn lại sau q trình chuyển gen) Vấn đề giải thơng qua thong gen chi thi (reporter genes), gen chon loc (selectable marker genes), gọi chung hệ thống øen nhận biết 4.5.2 Yêu câu hệ thống gen nhận biết (reporter) sau: Để nhận biết thuận lợi, hệ thống gen nhận biết phải đảm bảo yêu cầu - Thông qua số kỹ thuật đơn giản quan sát, dễ dàng nhận biết có mặt chúng tế bào chuyển gen - Các gen nhận biết phải gen khơng có máy di truyền tế bào thực vật cần chuyển gen - Các gen nhận biết phải thông dụng, đễ dàng tách lắp ghép Hệ thống gen nhận biết phải gắn sẵn có chủ ý vector chuyển gen 4.5.3 Nguyên tắc đánh giá Xác định kết chuyển gen tiến hành theo nguyên tắc sau: - Xác định hoạt tính hệ thống gen nhận biết Vì gen nhận biết gắn có chủ ý với gen cần chuyển vector xác định, kết chuyển gen xác định có mặt gen nhận biết thơng qua hoạt tính.của chúng Có nhiều phương pháp ứng dụng để xác định hoạt tính hệ thống gen nhận biết như: (1) nuôi cấy tế bào chuyển gen môi trường chọn lọc (áp dụng với gen chọn lọc) (2) xác định biểu gen 151 thông qua màu sắc (thường áp dụng với gen thị), (3) phân tích định lượng enzyme gen nhận biết mã hoá tổng hợp, (4) xác định gen nhận biết bị hoạt tính xen đoạn (áp dụng với hai loại: gen chọn lọc gen thị) - Xác định cấu trúc gen cần chuyển gen nhận biết Xem xét mặt lý thuyết, xác định kết chuyển gen cách dị tìm genome tế bào thực vật đoạn ADN mang cấu trúc gen nhận biết gen cần chuyển Tuy nhiên thực tế, việc dị tìm cấu trúc gen cần chuyển tốn công sức phức tạp đa dạng tính trạng chuyển gen đa dạng loài thực vật chuyển gen Chỉ có số lồi thực vật số tính trạng kiểm tra theo đường hướng Phương pháp dị tìm cấu trúc gen chỗ: gen, nhận biết ứng dụng phổ biến Những thuận lợi đường Số lượng gen nhận biết không nhiều, nghiên cứu tỷ mỉ áp dụng rộng đối tượng chuyển gen Phương pháp chuyển gen theo nguyên tắc thực có hướng vẻ biểu đánh giá kết hiệu phương pháp lai phân tử, phương pháp PCR đặc hiệu v.v 4.5.4 Đánh giá kết chuyển gen gen chọn lọc (phương pháp đánh giá hoạt tính gen môi trường chọn lọc) Gen chọn lọc loại gen thuộc hệ thống gen nhận biết sử dụng kỹ thuật tạo vector tái tổ hợp, tạo dòng chuyển gen Chúng gắn vector chuyển gen, giúp nhận biết diện gen cần chuyển, vector tái tổ hợp đồng thời loại bỏ tế bào không cần thiết (sau chuyển gen) thông qua việc nuôi cấy môi trường chọn lọc Các gen chọn lọc thông thường gen mã hố cho số enzyme có điều kiện tự nhiên khơng có thực vật cần chuyển gen Sau chuyển gen, thấy enzyme gen chọn lọc hoạt động suy diễn vector chuyển gen gắn vào gen thực vật, gen cần chuyển trở thành phần máy di truyền thực vật Gen chon lọc thường chọn sử dụng gen kháng kháng sinh kháng thuốc diệt cỏ (bảng 4.1) Sau kết thúc chuyển gen, tế bào ni cấy mơi trường có chứa kháng sinh, thuốc diệt cỏ tương ứng với gen chọn lọc kháng thuốc Kết là: có tế bào mang gen cần chuyển tồn bình thường Các tế bào lại chưa chuyển gen bị tiêu diệt không chứa gen kháng thuốc Các tế bào nhận gen cần chuyển "chọn lọc" theo cách thức phát triển thành 152 Bảng 4.1 Một số gen chọn lọc thông dụng kỹ thuật chuyển gen Gen Tên enzyme mã hoá Chất dùng để chọn lọc nptll Neomycin phosphotransferase Kanamycin aphlV Hygromycin phosphotransferase Hygromycin Gentamycin-3-N-acetyltransferase Gentamycin Streptomycin phosphotransferase Streptomycin ble Enzyme khang bleomycin Bleomycin tídA 2,4 dichlorophenoxy acetate monooxygenase 2,4-D* bxn Boromoxynil nitrilase Bromoxynil” Phosphinothricin acetyltransferase Phosphinothricin” EDSP EPSP synthase Glyphosate” tet® Enzyme khang tetracyline Tetracyline amp* Enzyme khang ampiciline Ampiciline aacC3 va aacC4 SPT bar * Thuốc diệt cỏ Bảng 4.2: Một số gen thị thông dụng công nghệ chuyển gen Gen Tên enzyme mã hố Chất dùng tể phát | Gus đ - glucuronidase X - Gluc | LacZ f - galactosidase X - Gal | Luc Luciferase Lumis phos | Vi du: (bang 4.1) Gen nptlI ma hod tong hop enzyme neomycin phosphotranferase, la enzyme lam mat hoạt tính số kháng sinh gốc aminoglycoside nhu neomycin, kanamycin Gen nptlI gắn vào vector chuyển gen với gen cản chuyển Kết thúc trình chuyển gen, tế bào ni cấy mói trường chọn lọc chứa kanamycin neomycin Chỉ có tế bào chứa gen cần chuyển tồn bình thường Các tế bào khác bị loại bỏ khơng có gen kháng kanamycin neomycin Gen chọn lọc chất diệt cỏ tiến hành tương tự theo nguyên tắc Các gen chọn lọc vừa có tác dụng gen nhận biết vừa tác nhân chọn lọc để loại bỏ tế bào không chuyển gen nhiễm tạp khác 4.5.5 Xác định kết chuyển gen gen thị (phương pháp xác định hoạt tính gen qua chuyển màu) Tương tự gen chọn lọc, gen thị gắn sẵn vào vèctor chuyển gen sử dụng để nhận biết gen cần chuyển vector tái tổ hợp thông qua phản ứng thay đối màu sắc đặc trưng Các gen thị thông thường cdc gen tong hop mot so enzyme khong có tế bào thực vật enzyme hồ lẫn với chất đặc biệt chúng tạo nẻn biến đối quan sát mắt thường, chủ yếu bị chuyển màu 153 Ví dụ gen gus A (bảng 4.2) mã hoá tổng Hợp enzyme -glucuronidase Khi đưa X - Glus (chất dùng để phát hiện) vào môi trường tế bào chứa B-glucuronidase, dung dịch chuyển màu xanh chàm đặc trưng Qua xác định kết việc chuyển gen Hoặc với gen lacZ (có số vector chuyển gen) mã hố cho q trình tổng hợp enzyme -galactosidase khiến cho vi khuẩn sử dụng làm tế bào chủ có kiểu hình lac+, ủ với X-gal khuẩn lạc chuyển thành màu xanh ` 4.5.6 Đánh giá kết chuyển gen gây hoạt tính gen nhận biết xen đoạn Lầm hoạt tính xen đoạn ứng dụng chủ yếu với gen nhận biết, điểm khác so với hai phương pháp vừa nêu chỗ kiểm tra kết chuyển gen việc xác định gen nhận biết bị hoạt tính Người ta tiến hành gắn gen cần chuyển xen vào trình tự nucleotide gen nhận biết vector Sau kết thúc giai đoạn chuyển gen, tiến hành xác định hoạt tính gen nhận biết Chuyển gen thành cơng xác định việc hoạt tính gen nhận biết bị xen đoạn Phương pháp ứng dụng hiệu với vector chuyển gen có mang gen thị mang hai hay nhiều gen chọn lọc Ví dụ: Các vector chuyển gen mang gen lacZ plasmid dòng họ pÚC, với plasmid dòng họ pBR (pBR322) mang hai nhiều gen kháng thuốc kháng sinh Với vector chứa gen lacZ (các gen thị khác tương tự), đoạn ADN cần chuyển gan xen, gen lacZ sé bi sai hỏng hoạt tính khơng cịn kha nang tong hop enzyme ÿ-galactosidase Khuẩn lạc không xuất màu xanh mà có màu trắng ủ với X-gal Tế bào chuyển gen nhận biết dễ dàng mắt thường Với vector chứa gen kháng thuốc kháng sinh (hoặc thuốc diệt cỏ), ADN cần chuyển gắn xen vào trình tự nucleotide gen kháng thuốc Do cấu trúc gen kháng thuốc bị phá huỷ nên tế bào mang gen cần chuyển khơng cịn khả tồn mơi trường có loại thuốc Ta xem xét ví dụ cụ thể: Trên plasmid pBR322 có chứa hai gen kháng kháng sinh là: gen tet° gen kháng tetracycline) gen amp" (gen kháng ampicilline) Giả thiết đoạn ADN (gen) cần chuyển gắn vào vị trí gen tet* chuyển nạp, tế bào chủ (tế bào thực vật) có kiểu sau: - Tế bào nhận không nhận vector, tế bào nhạy cảm với ampicilline tetracycline, chúng mọc mơi trường có chứa hai loại kháng sinh nêu - Tế bào nhận vector khơng chứa đoạn ADN cần chuyển, kiểu hình mọc hai môi trường chứa ampicilline tetracycline 154 - Tế bào tiếp nhận vector có mang đoạn ADN cần chuyển, kiểu hình tế bào khơng mọc mơi trường có tetracycline mọc mơi trường chứa ampicilline Đây tế bào cần chọn kết chuyển sen thành công 4.5.7 Đánh giá bàng phương pháp PCR đặc hiệu Kết chuyển gen đánh giá phan tng PCR Moi (primer) phản ứng thiết kế để bát cặp đặc hiệu với gen nhạn biết thân gen cần chuyển Dấu ấn ADN điện di cho biết kết việc chuyển gen 4.5.8 Đánh giá kết chuyển gen bàng lai phân tử Sau kết thúc chuyển gen, sử dụng phương pháp lai phân tử (lai ADN) để xác định kết chuyển gen Sử dụng mẫu ADN đặc hiệu dị tìm cấu trúc bổ sung gen cần chuyển gen nhận biết Phương pháp lai phân tử sử dụng phổ biến là: lai chỗ (in situ hybridization) lai Southern blot (lai pha rắn) Các phương pháp đánh giá kết chuyển gen ứng dụng tương tự cho vector tái tổ hợp thư vién genome va su tao dong 4.6 MỘT SỐ KẾT QUÁ ĐẠT ĐƯỢC TRONG LĨNH VỤC CHUYỂN GEN Ở THỰC VẬT 4.6.1 Khái niệm sinh vật chuyển gen GMO Cùng với phát triển công nghệ sinh học có kỹ thuật cải biến di truyền, nhiều vật nuôi trồng chuyển nạp gen mang tính trang tot ma bang phương pháp truyền thống (lai tạo, đột biến) thực Thông thường sinh vật tạo kỹ thuật cải biến di truyền biến đổi hai tính trạng quan trọng Do hạn chế kỹ thuật trình tiếp nhận gen thể sinh vật, thí nghiệm vẻ cải biến di truyền nhiều tính trạng cho lồi sinh vật cụ thể thường không mang lại kết mong đợi Để phân biệt với giống vật nuôi trồng tạo phương pháp truyền thống, thuật ngữ đời sử dụng cho sinh vật biến đối gen, thuật ngữ: "sinh vật biến đổi gen hay gọi đơn giản là: sinh vật chuyển gen”, Theo tiếng Anh thuật ngữ gọi là: Genetic Modified Organism (sinh vật biến đối gen) hay: Genetic Modified Object (vật biến đổi gen) viết tắt GMO Như hiểu GMO sinh vật biến đổi gen phương pháp cải biến di truyền ứng dụng công nghệ sinh học 4.6.2 Một số kết đạt chuyển gen thực vật Cây trồng GMO bắt đầu thực từ năm 1982, đến năm 2001 diện tích trồng GMO giới lên đến 52.6 triệu Ở nước phát triển, theo dự báo diện tích trồng GMO cịn tiếp tục tăng mạnh (bảng 4.3) Thu nhập từ trồng GMO tăng nhanh năm gần Năm 1995 tổng thu nhập từ trồng GMO giới 75 triệu USD, năm 1999 tăng lến đến 2.3 tỷ USD Theo dự báo đến năm 2010, giá trị loại sản phẩm đạt 25 tỷ USD Các nước có diện tích trồng GMO hàng đầu giới Mỹ, Achentina, Trung Quốc (bảng 4.4) Bảng 4.3: Diện tích trồng GMO giới từ 1996 - 2001 (triệu ha) Khu vực 1997 weer: 9,5 Các nước phát triển P 1998 23,4 (86%) ¬ (84%) 1,5 Các nước phát triển Tổng số 44 1999 2000 32,8 2001 33,5 39,1 (82%) (76%) (74%) 7,1 10,7 13,5 (14%) (16%) (18%) (24%) (26%) 11,0 27,0 39,9 44,2 52,6 Bảng 4.4: Diện tích trồng GMO số quốc gia giới (triệu ha) Quốc gia 1999 2000 2001 28,7 30,3 35,7 Achentina 6,7 10,0 11,6 Canada 4,0 3,0 8.2 0,3 0,5 1,5 Các nước khác 0,2 0,4 0,6 Tổng cộng 39,9 44,2 52,6 Mỹ Trung Quốc Cho đến có khoảng 60 lồi trồng chuyển gen với gần khoảng 200 tính trạng biển đổi di truyền Tuy có 12 loại trồng thương mại hố Trong ngơ chiếm 36%, cải dầu 17%, cà chua 13%, bơng 11%, phần cịn lại loại đậu tương, khoai tây, thuốc lá, đu đủ loại hoa (bảng 4.5) Ngoài trồng dược liệu có giá trị kinh tế cao quan tâm Những đặc tính chuyển gen quan tâm nhiều chiếm 90% tổng số dự án chuyển gen xếp theo thứ tự là: Tính kháng thuốc diệt cỏ, chất lượng trồng, kháng virus gây bệnh, kháng côn trùng bên cạnh nhiều tính trạng khác chống chịu quan tâm 156 Bảng 4.5 Một số loài cáy trồng chuyển gen Cây trồng Lúa (Oryza sativa) Ngô (Zea mays) Tài liệu tham khảo Shimamoto et al.(1989), Data et ai.(1990) Donn et al.(1990), From et a/.(1990) Lúa mi (Triticum aestivum) Vasil and Vasil (1992) Đậu tương (Glycine max) Hinchee et a/.(1988), Chistou (1992) Bông (Gossypium hirsutum) Firoozabada et al.(1987), Perlak et a/.(1990) Khoai tây (Solanum tuberosum) Ca chua (Lycopersicon esculentum) Cai dau (Brassica napus) Đậu Ha lan (Pisum sativum) Degreef et al.(1989), Lawson et a/.(1990) Tumer et al.(1987), Smith et a/.(1988,1990) Guerche et al.(1987), Radke et al (1988) Pounti-Kaerlas et ai.(1990) Bap cai (Brassica oleracea) Du dt (Carica papaya) Torlyama et a/.(1991) Tao tay (Malus pumila) James et a/.(1989), Lambert (1991) Cỏ đuôi trau (Festuca arundinacea) Cỏ nón (Dactylis glomerata) Wang et al.(1992) Linh lăng (Medicago sativa) Shahin et a/.(1986), Hill et al.(1991) Rau diép (Lactuca sativa) Chupcau et a/.(1989) Nho (Vitis rupestris; V vinifera) Mullins et a/.(1990) Man (Prunus domestica) Mante et al (1991) Dương (Pepulus alba X grandidentata) Pythoud et a/ (1987) Ĩc chó (Juglans regia) McGranahan et al (1988) Cẩm chướng (Dianthus caryophyllus) Lu et al (1991) Dã yên (Petunia hybrida) Van der Krol et a/ (1988) Fitsch et al.(1990) Horn et a/.(1988) 4.6.2.1 Tính kháng thuốc diệt cỏ Bảng 4.6: Một số loại trồng GMO phổ biến năm 2000 (triệu ha) Đậu tương chịu thuốc diệt cỏ 25,6 Ngô Bt 8,8 Cải dầu chịu thuốc diệt cỏ 2,8 Ngô chịu thuốc diệt cỏ 21 Bông chịu thuốc diệt cỏ 21 Bông Bt/chịu thuốc diệt cỏ Tứ Bông Bt 1,5 Ngô Btchịu thuốc diệt cỏ 14 Thuốc diệt cỏ thường có tác dụng lên q trình chuyển hố trồng quang hợp, tổng hợp protein Những trình tồn trồng cỏ đại Việc tạo loại thuốc diệt cỏ mà hại cho trồng khó khăn Kỹ thuật chuyển gen giải khó khăn với hai đường hướng chuyển 157 gen: (1) Vat chất di truyền trồng biến đổi trở nên bên vững với thuốc (tăng khả kháng thuốc); (2) Đưa vào trồng gen mã hoá enzyme phân giải thuốc Cho đến nhà khoa học tạo trồng kháng thuốc trừ có kháng thuốc: Glyphosate, sulphonylurea, triazine, phosphinoricin, bromoxynil,2,4-D Các trồng chuyển gen kháng thuốc diệt cỏ chủ yếu loại lương thực ngô, lúa loại công nghiệp bông, cải dầu v.v (bảng 4.6) 4.6.2.2 Cải thiện chất lượng trồng Tính trạng chất lượng trồng đa dạng phụ thuộc vào loài mục đích gieo trồng Đó khả chín sớm, muộn, suất cao, hàm lượng protein thành phần dinh dưỡng khác, hàm lượng dược liệu, hàm lượng thương phẩm cải thiện Để đạt mục đích tiêu dùng, nhà khoa học chuyển gen mã hoá cho enzyme tổng hợp chất mong muốn hay ức chế tạo sản phẩm không mong muốn Ngồi nhiều đặc tính cảnh, tính bắt dục đực, quan trọng ngày gen để sản xuất protein trồng quan tâm như: Màu sắc lá, hoa khả chịu lạnh, không hạt Một ứng dụng quan tâm có triển vọng việc sử dụng chuyển hợp chất có giá trị kinh tế cao khơng có nguồn gốc thực vật sản xuất: - Nhựa chịu nhiệt có nguồn gốc từ vi khuẩn - Vacxin chống sốt rét kháng thể xúc tác dùng điều trị ung thư thuốc Nicotiana tabacum sản xuất - Vacxin dịch tả (loại dùng để uống) cay khoai tay (Solanum tuberosum) san xuất - Leu-enkephalin - peptide thần kinh có nguồn gốc từ người cải dầu san xuat (Brassica napus) 4.6.2.3 Tinh khang virus Các bệnh vius gây nên làm thất thoát lượng lớn sản phẩm trồng Chỉ riêng cà chua, hàng năm thiệt hại virus gây lên tới 50 triệu đô la Cây kháng bệnh tạo dựa tượng tự nhiên virus, có tên "bảo vệ chéo” (cross - protection) Theo đó, bị nhiễm chủng virus định khơng bị nhiễm chủng khác có quan hệ họ hàng gần Người ta chuyển cho thể gen mã hoá tổng hợp vỏ bọc protein virus khơng có khả gây bệnh lồi, hình thành vỏ protein ức chế virus hại phát sinh Chuyển gen kháng virus thực thành công nhiều loài virus gây bệnh virus khảm thuốc lá, dưa chuột, khoai tây, cà chua v.v 158 4.6.2.4 Tính kháng trùng Chuyển gen kháng trùng quan tâm đặc biệt nhiều lý do: Tránh hao tốn chi phí thời gian phun thuốc sâu Bảo vệ trùng có ích khơng phải dùng thuốc trừ sâu An tồn với môi trường bảo vệ sức khoẻ người Cho đến nay, nhà khoa học thành cơng việc tạo tính kháng trùng chuyển gen có nguồn gốc từ vi khuẩn BT (Bacillus thuringiensis) Gen mã hoá tổng hợp loại protein gây độc cho côn trùng tách chiết từ vi khuẩn BT chuyển vào trồng Một số loại trồng chuyển gen vi khuẩn BT phố biến đại trà như: Bông, khoai tây, ngô 4.7 NHỮNG TÁC ĐỘNG CÓ LỢI VÀ VẤN ĐỀ ĐẶT RA VỚI CÂY TRỒNG GMO Cây trồng GMO xuất thời gian gần đây, tác động trái chiều mang tính tích cực tiêu cực GMO đánh giá cách thận trọng Những thông tin cung cấp mang tính chất đánh giá số nhà khoa học dư luận xã hội chưa có nghiên cứu tổng kết cụ thể thời gian xuất trồng GMO chưa dài 4.7.1 Những tác động xem xét theo chiều hướng có lợi GMO Tác động mang tính tích cực trồng GMO đánh giá theo hướng sau: Tác động đến phát triển nông nghiệp bền vững Một nông nghiệp phát triển bền vững cần phải đáp ứng đủ yêu cầu sinh thái, kinh tế, cơng nghệ thích hợp công nghệ sinh vitro) trao đối nguồn xã hội, phát triển nhân văn sở khoa học toàn điện Trong lĩnh vực cải biến di truyền thực vật phương pháp học ứng dụng như: Bảo tồn quï gen (bảng phương pháp in gen, lai xa, xây dựng thư viện ADN, tạo dong bién di soma, chuyển gen trực tiếp vào trồng Như thành cơng nghệ sinh.học trồng GMO góp phần vào phát triển nơng nghiệp bền vững nhiều khía cạnh khác nhau: trao đổi tài nguyên di truyền, quĩ gen, tạo trồng có suất chất lượng cao góp phần đảm bảo phát triển bền vững Đặc biệt trồng GMO cứu giúp cho sản xuất nhiều loại trồng có nguy suy giảm bị sâu bệnh phá hoại mạnh bơng Ngồi ra, theo đánh giá từ nhiều nguồn thông tin, cay GMO tàng mơi trường, góp phần giảm xói mịn, cải thiện chất lượng rừng nơi cư trú động vật hoang dã Cây trồng GMO góp phần phục hồi nguồn gen thực vật q có nguy diệt chủng có lợi ích tiềm nước, cải thiện bảo tồn Tuy nhiên, tác 159 động trồng GMO đến môi trường gây nhiều lo ngại mức độ khác trình bày cụ thể mục 4.7.2 4.7.2 Những vấn dé dat véi cay GMO Công nghệ chuyển gen thực vật chi thực phát triển mạnh 20 năm trở lại Bất kỹ thuật, ngành công nghệ người tạo dẫn đến tác động ngược chiều Hiện chưa có nghiên cứu báo cáo cụ thể tác hại công nghệ chuyển gen thực vật, chiều hướng gây tác hại xem xét nghiêm túc Có thể tóm tắt thành nhóm sau: 4.7.2.1 Những tác động đến sinh thái môi trường Nguy tác động đến môi trường đa dạng, bao gồm khả phát tán gen chuyển sang loài hoang dại, khả tạo sâu bệnh vi khuẩn kháng thuốc, khả gây hại cho hệ động vật tự nhiên Những tượng xảy tượng cỏ dại, trồng chuyển gen vùng này, q trình di chuyển cỏ dại vùng khác Gần đây, nhiều báo cáo khoa học cho thấy lồi trồng lai với lồi hoang dại có họ hàng gần Cây cải dầu (Brassica napus) lai với cải hoang dai (Brassica Cam pesfris) Hiện tượng tương tự phát củ cải đường, cỏ linh lăng, lúa, ngô, hướng dương Các nghiên cứu cải dầu đồng ruộng chứng minh có chuyển gen từ trồng GMO sang bình thường thơng qua lai hữu tính Vấn đề cần phải suy ngãm chưa thể đánh giá hết hậu tượng cân sinh thái môi trường Với kỹ thuật chuyển gen kháng côn trùng, số trồng GMO cho thấy gây hại với trùng có ích cải dầu GMO với số loại ong Một số trồng GMO khác lại tác dụng làm tăng kháng thuốc số lồi sâu hại ví dụ báo cáo cho thấy tăng tính kháng thuốc trừ sâu sinh học BT loài sâu gây bệnh ngô chuyển gen BT xuất dòng kháng thuốc 4.7.2.2 Những tác động đến sức khoẻ người tiêu dùng Những nguy tác động đến sức khoẻ người tiêu dùng chưa nghiên cứu chứng minh cụ thể, tác động xấu có sức khoẻ người tiêu dùng đặt cách nghiêm túc Phần lớn gen nhận biết trình chuyển gen gen kháng thuốc kháng sinh, điều tạo điều kiện cho xuất ngày nhiều dòng vi khuẩn kháng thuốc Tuy chưa có chứng cụ thể, nhà khoa học khắc phục cách hạn chế đến mức thấp việc sử dụng gen nhận biết cát gen kháng thuốc kháng sinh Thay vào việc sử dụng gen kháng thuốc diệt cỏ, gen tạo màu Hoặc bố trí gen nhận biết kháng thuốc kháng sinh vị trí dễ dàng loại bỏ chúng khỏi 160 trồng Ở Vương quốc Anh, phủ cấm việc sử dụng sản phẩm cà chua chuyển gen chưa qua chế biến, lý nêu tổ hợp gen chuyển gen thị gen kháng thuốc kanamycin, có khả tác nhân gây bệnh người hấp thụ trở nên kháng thuốc 4.7.2.3 Những tác động đến nước phát triển Cây chuyển gen có tác động không tốt đến nước thuộc giới thứ Các sản phẩm kết kỹ thuật chuyển gen thay sản phẩm thu đường truyền thống Điều làm giảm nguồn thu ỏi nước phát triển vốn dựa vào việc xuất sản phẩm Ví dụ: Dầu cải chiết xuất từ hạt cải dầu chuyển gen thay nguồn dầu dừa xuất nước Đông Nam Á Hơn chương trình chuyển gen trồng với chi phí tốn lại khơng quan tâm đầu tư đến trồng có ý nghĩa sống cịn nước phát triển Ví dụ như: Cây sắn, nguồn lương thực chủ yếu 500 triệu người dân châu Phi, chưa có dự án quốc tế chuyển gen Tóm lại: Kỹ thuật chuyển gen từ đời gây lo ngại vẻ tác động bất lợi xẩy người mơi trường sinh thái Tuy chưa có chứng cụ thể mối nguy hiểm trồng chuyển øen, song nhiều nước giới trước, đặt qui chế nghiêm ngặt trồng chuyển gen nói riêng với GMO nói chung 161 TAI LIEU THAM KHAO Tài liệu tiếng Việt Dai Duy Ban, Lữ Thị Cẩm Vân (1992): Công nghệ gen công nghệ sinh học ứng dụng nông nghiệp đại Nhà xuất Nơng nghiệp, Hà Nội Lê Trần Bình, Hồ Hữu Nhị, Lê Thị Muội (1995): Công nghệ sinh học cải tiến giống trồng Nhà xuất NN, Hà Nội Bùi Chí Bửu, Nguyễn Thị Lạng (2000): Di truyền phán tử (tập 2) Nhà xuất Nơng nghiệp, TP Hồ Chí Minh Trịnh Mạnh Dũng, Nguyễn Văn Uyển trưởng hạt lúa Tạp chí sinh học tập (1985): Gây cụm chồi tiếp từ đỉnh sinh Lê Đình Lượng, Phan Cự Nhân (2001): Cơ sở truyền Nhà xuất Giáo dục, Hà Nội Hồ Huỳnh Thuỳ Dương (1998): Sinh học phân tử Nhà xuất giáo dục, TP Hồ chí Minh Nguyễn Như Hiền (2002): Di truyền công nghệ tế bào Nhà xuất KHKT Hà Nội , Pham Thanh H6 (2001): Di truyén hoc Nha xuat ban Gido duc, TP Hé Chi Minh Phan Cự Nhân (2000): Di truyền học động vật ứng dụng Nhà xuất Giáo dục, Hà Nội 10 Lê Duy Thành KHKT, Hà Nội 11 Phạm (2001): Cơ sở di truyền chọn giống thực vật Nhà xuất Chí Thành (1976): Ảnh hưởng giai đoạn phát triển hạt phấn lúa lên khả tạo mô sẹo nuôi cấy bao phấn in vitro Báo cáo nghiên cứu khoa học 12 Nguyễn Văn Thiết (2001): Các trình sinh học tảng cở sở phán tử marker di truyền Bài giảng dự án sản xuất giống chất lượng cao, Hà Nội 13 Nguyễn Văn Uyển (1995): Những phương pháp công nghệ sinh học thực vật Nhà xuất Nông nghiệp, TP Hồ chí Minh 14 Nghiêm Thị Như Vân (1993): Kỹ thuật nuôi cấy bao phấn lúa ứng dụng chọn giống Luận án Phó Tiến sĩ khoa học Tài liệu tiếng nước Abed Chand Hury, Wo Ming, Stuart Craing, Liz Demis and Jim Peacook (1996) Apomixis, its genetic control and potential appliacation in plant breeding Abstracts of the third Asia - Pacific confenrence on Agricultural Biotechnology, 162 Nr Bajaj Y.P.S and M.Bidan (1980): Differentation of geneticcally variable plants from embryo - divived callus culture of rice Phytomorphology,290-294 Brar D.S, D.H Ling and Yoshida (1984): Plant regenration in Biotechnology international Agriculture Reseach (BIAR), IRRI, Philippines 108-1 10 Chaleff, P.S (1981) Genetic university Press, Cambrige, 184 of plant application of cell culture Chen C.C (1976): Studies on the anther culture of rice pollen temperature treament Nat Sci Coun.Monthly (Taipei),99-105 stage Cambrige and low Chen C.C, Chiu W.L, Yu LJ, Ren S.S, Yu W.J (1983): Genetic anmallysic of anther-divived plants of rice: Independent assortment of unlinked — gens Can.J.Genet Cytol 25:320-330 7, Chen C.M, Chen C.C, Lin M.H (1982): Genetic analysis of anther divived plant of rice J.Hered 73:45-55 Chen L.J, Lai P.C, Liao C.H, Tsay H.S (1982): Medium evaluation for rice anther culture In: Fujiwara A(ed) plant tissue culrure 1982,5th and Cell cult Abe photo printing Co, Tokyo,551-553 Intl Cong Plant tissue Chu C.C (1978): The N6 medium and its application to anther culture of cereal crops In: Proc of Symp On plant tissue culture Science press, Beijing China, 43-50 10 Chu C.C (1978) Wang C.C, Sun C.S (1976): Development of the pollen embryo of rice and wheat on the medium devoid of hormones Acta bot Sinica 18,230 - 250 11 B Alberts, D., Bray, J., Lewis, J D., Watson (1994): Molecular Biology of the ~ Cell Garland Publishing, Inc 12 James D Watson (1997): Molecular biology of the gene 4" Benjamin/cummings Publishing Company, Inc Menlo Park California, USA ed the 13 K W., Adolph (1995): Methods in molectulars genetic Vo 6, Academic Press 14 T.A Brow (1999): Genome Wiley-and Sons, Inc., Publication, New York, USA 163 Chịu trách nhiệm xuất ban NGUYỄN CAO DOANH Phụ trách thảo BÍCH HOA - LÊ LÂN - HỒI ANH Trình bày bìa ĐỖ THỊNH NHÀ XUẤT BẢN NÔNG NGHIỆP 167/6 Phương Mai - Đống Đa - Hà Nội ĐT: 8524501 - 8521940 Fax: 04.5760748 CHI NHÁNH NXB NÔNG NGHIỆP 58 Nguyễn Binh Khiêm - Q.1, Tp Hồ Chí Minh ĐT: 08.8299521 - 8297157 Fax: 08.09101036 In 215 bản, khổ 19 x 27cm Chế in Xí nghiệp in 15 Bộ Cơng nghiệp Giấy chấp nhận đăng ký KHXB số 283/313 Cục Xuất cấp ngày 11/4/2003 In xong nộp lưu chiểu quý IV/2003 —283/313-03
Ngày đăng: 25/07/2023, 16:07
Xem thêm: