Giáo trình công nghệ sinh học phần 1 ts ngô xuân bình

byt BO GIAO DUC VA DAO TAO TRUONG DAI HOC NONG LAM THAI NGUYEN TS NGO XUAN BINH (CHU BIEN) ThS BUI QUOC HOAN - ThS NGUYEN THUY HA Giáo trình CƠNG NGHỆ SỈNH HỌC (Dùng cho sinh viên ngành Trồng trọt) ` wee Ñ iy NHA XUAT BAN NONG NGHIEP BO GIAO DUC VA DAO TAO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NƠNG LÂM THÁI NGUN TS NGƠ XN BÌNH (Chủ biên) ThS BÙI BẢO HOÀN - ThS NGUYÊN THUÝ HÀ GIÁO TRÌNH CƠNG NGHỆ SINH HỌC (Dùng cho sinh viên chun ngành Trồng trọ) C THÁI NGUYEN HỌ ĐẠIAl h e en NHA XUAT BAN NONG NGHIEP HA NOI - 2003 LOI NOI DAU Con người thực tế sử dụng công nghệ sinh học từ hàng ngàn năm sống hàng ngày, người ý thức sở khoa học công nghệ cách không lâu so với thời gian tồn Đầu năm 70, gần 20 mươi năm sau phát Watson - Crick cấu trúc chuôi xoắn kép phân tứ ADN, hàng loạt phát thành cơng nghiên cứu sinh học phân tử làm bùng nổ cách mạng công nghệ sinh học Một ngành - ngành công nghệ sinh học đại đời Khác với cách mạng xanh năm 70 cách mạng công nghệ sinh học tác động đến nhiều lĩnh vực khác sống Trong nông nghiệp, công nghệ sinh học mang lại nhiều phát triển cải tạo giống vật nuôi trồng Trong y tế sức khoẻ cộng đồng, hàng loạt loại thuốc chữa bệnh có hiệu cao, an tồn đời Các phương pháp trị liệu gen, nuôi cấy nhân tạo ghép quan nội tạng đưa ước mơ sống lâu 100 tuổi người thành thực Trong nhiều lĩnh vực sinh thái môi trường, công nghệ sinh học đưa giải pháp xứ lý rác thải, chất độc hại đường sinh học có hiệu cao an tồn Các kỹ thuật cơng nghệ sinh học trao cho người quyền lực - quyền lực tạo tự nhiên, tạo sinh vật Ngày 11/311994, Thủ tướng phủ định số ISICP phương hướng biện pháp phát triển công nghệ sinh học nước ta từ đến năm 2010 Chính phủ xác định vai trị quan trọng công nghệ sinh học phát triển kinh tế quốc dân Cho đến Việt Nam có khoảng 10 sở nghiên cứu đào tạo cơng nghệ sinh học, có khoảng gần 30 trường Đại học Cao đẳng có ngành liên quan đến công nghệ sinh học Trong tương lai không xa, ngành công nghệ sinh học Việt Nam tiến kịp nước tiên tiến giới Trong nội dung giáo trình, tập thể tác giả cố gắng biên soạn, hệ thống lại kiến thức liên quan đến công nghệ sinh học lĩnh vực cáy trồng Giáo trình gồm chương: Chương 1: Khái niệm chung, nội dung nghiên cứu ứng dụng thành tựu công nghệ sinh học Chương 2: Cơng nghệ tế bào thực vật Trình bày nội dung công nghệ tế bào thực vật như: Kiến thức sinh học tế bào, tính tồn nang di truyền tế bào sinh vật, điều kiện nuôi cấy mô, tế bào thực vát ứng dụng chủ yếu Chương 3: Các phương pháp ứng dụng phân tích genome Nội dung trình bày kiến thức sở sinh học phân tử kỹ thuật di truyền, số phương pháp sử dụng phán tích genome như: tách chiết ADN, xác định trình tự nưcleotide, phương pháp RFLP, PCR phương pháp dựa theo nguyên tắc PCR, phitong phap isoenzyme v.v Chương 4: Các kỹ thuật cải biến di truyền thực vật Nội dung trình bày kiến thức cở sở kỹ thuật cải biến di truyền thực vật, phương pháp cải biến di truyền, đánh giá kết chuyển gen, thành tựu vấn đề nảy sinh thực vật chuyển gen (GMO) Giáo trình phân cơng biên soạn sau: TS Ngơ Xn Bình (chủ biên): Chương 1,3,4 ThS Bui Bao Hoan, ThS Nguyễn Th Hà, TS Ngơ Xn Bình: Chương Giáo trình biên soạn lân dâu, chắn không tránh khỏi thiếu sót, mong dược đóng góp ý kiến bạn đọc, đồng nghiệp để bố sung cho tài liệu ngày hoàn thiện Tập thể tác giả MUC LUC Trang LOI NOI DAU MUC LUC Chuong 1: KHAI NIEM CHUNG, NOI DUNG NGHIEN CUU UNG DUNG VA NHUNG THANH TUU CUA CONG NGHE SINH HOC 1.1 Khái niệm chung công nghệ sinh hoc 1.2 Nội dung nghiên cứu ứng dụng công nghệ sinh học 1.2.1 Công nghệ vi sinh vật 1.2.2 Công nghệ enzyme 1.2.3 Công nghệ tế bào 1.2.4 Kỹ thuật gen di truyền 1.3 Những thành tựu công nghệ sinh học nửa cuối kỷ 20 1.4 Phương hướng phát triển công nghệ sinh học Việt Nam „l.4.1 Công nghệ sinh học phục vụ phát triển sản xuất nông - lâm - ngư “ nghiệp 1.4.2 Công nghệ sinh 1.4.3 Công nghệ sinh sinh vật 1.4.4 Công nghệ sinh 1.4.5 Xây dựng tiềm sinh học học phục vụ bảo vệ sức khoẻ người học phục vụ bảo vệ môi trường sống tài nguyên học phục vụ ngành công nghiệp khác lực khoa học - công nghệ thuộc lĩnh vực công nghệ 1.4.6 Xây dựng ngành công nghệ sinh học 1.5 Giải thích số thuật ngữ khoa học thường sử dụng công nghệ sinh học thực vật Chương 2: CÔNG NGHỆ TẾ BÀO THỰC VẬT 2.1 Vài nét lịch sử phát triển công nghệ tế bào thực vật 2.2 Một số kiến thức tế bào sinh vật 2.2.1 Cấu trúc chức tế bào 2.2.2 Sự sinh trưởng tế bào 2.2.3 Hệ gen (genome) tế bào sinh vật 2.2.4 Tính tồn di truyền tế bào sinh vật 2.3 Những điều kiện nuôi cấy tế bào thực vật 2.3.1 Bảo đảm điều kiện vô trùng 2.3.2 Chuẩn bị môi trường nuôi cấy 11 11 II 12 12 13 l6 17 17 17 18 18 18 19 22 22 23 23 24 25 28 31 31 33 2.3.3 Chọn xử lý vật liệu cấy 2.4 Một số ứng dụng chủ yếu nuôi cấy tế bào thực vật 2.4.1 Nhân giống vơ tính in vitro 2.4.2 Nuôi cấy mô phân sinh đỉnh sinh trưởng để tạo bệnh 2.4.3 Kỹ thuật nuôi cấy mô bảo quản nguồn gene in vitro 2.4.4 Công nghệ phơi vơ tính (Somatic embryo Technology) 2.4.5 Cơng nghệ hạt nhân tạo (synthetic seed) 43 43 43 51 54 ST 59 Chương 3: CÁC PHƯƠNG PHÁP ỨNG DỤNG TRONG PHÂN TÍCH 62 62 63 63 63 66 GENOME 3.1 Khái niệm ADN tái tổ hợp 3.2 Cấu 3.2.1 3.2.2 3.2.3 trúc, chức đặc tính ADN Thành phần ADN Cấu trúc ADN Đặc tính ADN 3.3 Quá trình tổng hợp ADN tế bào sinh vật (DNA replicaftion) 3.3.1 Cơ chế chép bán bảo tồn (semi-conservation) 3.3.2 Nguyên tắc đảm bảo trình chép ADN thành cơng 3.3.3 Q trình chép ADN tế bào sinh vật 3.3.4 ADN thoả mãn yêu cầu vật chất di truyền 3.4 Phương pháp tách chiết ADN 3.4.1 Phương pháp tách chiết ADN 3.4.2 Điện ADN 3.4.3 Thu nhận ADN sau điện di 3.5 Các phương pháp xác định trình tự nucleotide gen 3.5.1 Phương pháp Maxam - Gilbert 3.5.2 Phương pháp dideoxy Sanger 3.6 Phương pháp RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism: hình chiều dài đoạn cắt hạn chế) 6.1 Các enzyme hạn chế (restriction enzyme - RE) 3.6.2 Nguyên lý phương pháp RFLP 3.6.3 Quy trình RFLP 3.6.4 Mot s6 ting dung cla RFLP 3.7 Cac phuong phap lai phan tur (Molecular hybridization) 3.7.1 Khai niém vé lai phan tir 3.7.2 Nguyên tác lai phân tử 3.7.3 Các kiểu lai phân tử 3.7.4 Phương pháp Southern blot (lai ADN) 3.8 Phản ứng PCR (polymerase chain reaction) 3.8.1 Khái niệm phản ứng PCR : đa 69 69 71 72 73 13 75 80 81 81 82 84 84 89 89 91 93 93 94 94 94 GT 97 3.8.2 Nguyên tắc phản ứng PCR 3.8.3 Thành phần phản ứng PCR Sỹ 98 98 100 101 104 3.8.4 Chu kỳ phản ứng PCR 3.8.5 Phản ứng PCR tối ưu hoá nhờ taq polymerase 3.8.6 Các yếu tố ảnh hưởng dén phan tng PCR 3.8.7 Tóm tắt qui trình chuẩn phản ứng PCR 3.8.8 Ưu điểm PCR 3.8.9 Hạn chế PCR 105 106 3.8.10 Ứng dụng phản ứng PCR 107 cua phan tng PCR 3.9.1 Nhóm phương pháp PCR sử dụng mồi đặc hiệu 3.9.2 Nhóm phương pháp APT (Arbitrary Primer Technology: 108 109 3.9 Một số phương pháp phân tích di truyền phân tử dựa nguyên tắc nghệ primer tuỳ ý) 3.10 Phương pháp AFLP 3.10:1 Khái niệm AFLP 3.10.2 Nguyên tắc AFLP 3.10.3 Yếu tố ảnh hưởng đến kết AFLP 3.10.4 Qui trình AFLP 3.10.5 Ứng dụng AFLP Công 114 119 119 119 121 121 3.11.5 Nhược điểm 123 123 123 124 125 126 126 3.11.6 Ứng dụng phương pháp isoenzyme 126 3.11 Phương pháp phân tich isoenzyme (isozyme) 3.11.1 Khái niệm isoenzyme 3.11.2 Nguyên lý phương pháp phân tích isoenzyme 3.11.3 Qui trình phương pháp isoenzyme 3.11.4 Ưu điểm phương pháp isoenzyme Chương KỸ THUẬT CAI BIEN DI TRUYEN Ở THỰC VẬT 4.1 Các vector chuyển gen 4.1.1 Khái niệm vector chuyển gen 4.1.2 Các yêu cầu vector chuyển gen 4.1.3 Ứng dụng vector chuyển gen 4.1.4 Các loại vector chuyển gen 4.1.5 Phương pháp tạo vector tái tổ hợp 4.2 Thư viện gen tạo dòng 4.2.1 Thư viện gen (genome library) 4.2.2 Sự tạo dòng 4.3 Các phương pháp chuyển gen thực vật 129 129 129 129 130 130 134 136 136 136 137 4.3.1 Nguyên tắc chuyển gen thực vật 4.3.2 Phương pháp chuyển gen Ti-plasmid 4.3.3 Kỹ thuật chuyển gen trực tiếp điện trường 4.3.4 Chuyển gen phương pháp bắn gen 4.3.5 Kỹ thuật sử dụng tế bào trần (protoplast) chuyển gen 4.4 Kỹ thuật dung hợp tế bào trần 4.4.1 Khái niệm 4.4.2 Nguyên tắc 4.4.3 Qui trình kỹ thuật 4.5 Đánh giá kết chuyển gen 4.5.1 Mục đích 4.5.2 Yêu cầu hệ thống gen nhận biết (reporter) 4.5.3 Nguyên tắc đánh giá 4.5.4 Đánh giá kết chuyển gen Bằng gen chọn lọc (phương pháp đánh giá hoạt tính gen mơi trường chọn lọc) 4.5.5 Xác định kết chuyển gen gen thị (phương pháp xác định hoạt tính gen qua chuyển màu) 4.5.6 Đánh giá kết chuyển gen gây hoạt tính gen nhận biết xen đoạn 4.5.7 Đánh giá phương pháp PCR đặc hiệu 4.5.8 Đánh giá kết chuyển gen lai phân tử 4.6 Một số kết đạt lĩnh vực chuyển gen thực vật 4.6.1 Khái niệm sinh vật chuyển gen GMO (Genetic Modified Organism, số tài liệu ghi là: Genetic Modification Organism Genetic Modified Object) 4.6.2 Một số kết đạt chuyển gen thực vật 4.7 Những tác động có lợi vấn đề đặt với trồng GMO 4.7.1 Những tác động xem xét theo chiều hướng có lợi trồng GMO 4.7.2 Những vấn đề đặt với trồng GMO TÀI LIỆU THAM KHẢO 137 138 143 145 147 149 149 149 149 151 151 151 151 152 153 154 155 {55 155 155 156 159 159 160 162 Những khả tạo hình 2.4: Vật liệu ban đầu Chồi đỉnh e Nu hoa ™s Qe Đoạn hoa tự Manhla LF”, Oe Bắt đầu nuôi | Cuống Tạo chồi rễ Đoạn thân Đoạn rễ /X Mảnh củ Ươm bầu đất Các phận gần hoa dễ nuôi cấy thành cơng han, hoa bắt đầu chu kỳ đời sống I Hình 2.4 Khả nuôi cấy phận - Giai đoạn (Tạo hồn chính): Khi đạt kích thước định, chồi cấy chuyển từ môi trường giai đoạn sang môi trường tạo rễ Thường sau 2-3 tuần, từ chồi riêng lẻ xuất rễ trở thành hoàn chỉnh Ở giai đoạn này, người ta thường bố sung vào môi trường ni cấy auxin nhóm hormone thực vật quan trọng có chức tạo rễ phụ từ mơ ni cấy Trong nhóm cac chat JAA, IBA, NAA, 2.4-D sử dụng nghiên cứu nhiều để tạo rễ cho chồi in vitro - Giai đoạn 5: Đưa đất Đây giai đoạn đưa hồn chỉnh (có đủ rẻ, thân, lá) từ ống nghiệm đất bước cuối trình nhân giống ¡n vitro bước định khả ứng dụng trình nhân giống in vitro thực tiễn sản xuất, giai đoạn chuyển 47 cảy từ trạng thái dị dưỡng sang tự dưỡng hoàn tồn Do phải bao dam điều kiện ngoại cảnh (nhiệt độ, ánh sáng, ẩm độ, giá thể ) phù hợp để đạt tỷ lé song cao vudn ươm ruộng sản xuất Hình 2.5: Phong lan giai đoạn dua vào nuôi giai doan Nghiên cứu cấu trúc khoai tây nuôi cấy ¡n vitro so sánh với khoai tây trồng điều kiện tự nhiên cho thấy chúng khác cấu trúc mơ số lượng khí khổng Đặc điểm Nuôi ïn vitro Nuôi điều kiện tự nhiên Cấu trúc mơ Khơng chặt chẽ Chặt chẽ Số lượng khí khổng 10 249/cm? (=4,16 lan) 436/cm? Điều chứng tỏ phải tién hanh thich nghi dan dan cay nhan ging in vitro với điều kiện tự nhiên thích nghỉ phải hiểu trình thay đổi đặc điểm sinh lý giải phẫu thân non Thời gian cần cho thích nghi tối thiểu - 10 ngày Trong thời gian non phải giữ ẩm nuôi dưỡng theo chế độ đặc biệt Hiện việc nhân giống in vitro không áp dụng với phận (nhân vơ tính) mà cịn áp dụng cho loại hạt có tỷ lệ nảy mầm thấp điều kiện đồng ruộng như: hạt số lâm nghiệp, số loài liệu hạt phong lan qui trình ni cấy hồn tồn tương tự nhân vơ tính in vitro 48 2.4.1.2 Phương pháp nuôi cấy mô công tác nhân nhanh số giống trồng Nhân giống chuối, gồm bước sau: Bước I: Xử lý cấy mẫu vào môi trường Mẫu đạt tiêu chuẩn giống (có thể trồng ngồi sản xuất) Cắt ngắn bóc lớp bẹ lá, rễ, củ cho gọn nhẹ, rửa đất cát lượt (đốt mẫu Giai đoạn tiến hành tủ cấy: Dùng dao nhỏ bóc lớp bẹ chuối, sau lớp phải thay dao khử lửa đèn cồn) Đỉnh sinh trưởng nuôi có đường kính từ đưa vào nhỏ q khả tái sinh hệ số nhân thấp, to khả nhiễm khuẩn tăng, nên đường kính mẫu đưa vào mẹ khử trùng lần trùng dao cũ - 1,5 cm, néu mẫu đưa vào tuỳ thuộc vào Môi trường để nuôi cấy chuối môi trường MS (MS + đến 7mg/I BAP + 30g đường + 8g thạch + 100ml nước dừa)/lít nước cất Bước 2: Tạo cụm chồi (nhân nhanh) Thường mẫu đưa từ ngồi sau đến tuần có thể mọc thành hồn chỉnh, đồng thời mép củ phần tiếp xúc với môi trường hình thành từ I den nhiều Có thể dùng dao cất bổ nhỏ củ chuối mầm non để cấy sang môi trường Sau tuần, môi trường lại tiếp tục phát chổi Sau tuần, chuyển sang môi trường với mật độ đến 10 cây/bình Chu trình lặp lại liên tục thông thường từ mẹ ban đầu sau đến chu trình người ta chọn khoảng 2000 cây, số lại thải bỏ để tránh đột biến sinh q trình ni cấy Bước 3: Tạo chuối hồn chỉnh Để có chuối hồn chỉnh tạo thành từ cụm chồi, cần phải nuôi dài ngày hơn, thường sau đến tuần đủ tiêu chuẩn đưa Kỹ thuật cấy chuyển sau: - Đưa toàn khay khử trùng - Chọn đủ tiêu chuẩn (3-5 lá) cấy chuyển vào môi trường rễ Môi trường rễ gồm: (MS + 1g than hoạt tính + 20g đường + 8g thạch)/lít nước cất - Các chéi khong đủ tiêu chuẩn cấy trở lại mơi trường tạo cụm chéi 49 - Cây cấy vào môi trường rễ sau 10 đến 15 ngày hình thành rễ hồn chỉnh đưa trồng đất Bước 4: Đưa trồng đất Cây có rễ hồn chỉnh lấy rửa trồng vào bầu luống đất, ý cần phải trồng nơi râm mát, hàng ngày phải tưới nước giữ độ ẩm (70-80%) Nhân giống dứa Cayenne Quy trình gồm giai đoạn: 1) Chọn mẫu khử trùng 2) Tạo cây, nhân trì chồi 3) Tạo rễ ` 4) Trồng vườn ươm Giai đoạn 1: chon mẫu khử trùng : Tách lấy mầm ngủ chồi thân dứa khử trùng theo trình tự sau: - Ngam cồn 70°2 phút (đối với chồi ngọn), phút (đối với chồi thân) - Hypochlorit canxi 4% 15 phút (đối với chồi ngon) 8% 20 đến 25 phút (đối với chồi thân), trước khử trùng xử lý chồi dung dịch 2.4 D để kích thích sinh trưởng chồi Các vật liệu sau khử trùng đưa vào nuôi cấy mơi trường có chứa NAA va BAP Các chồi thân có kích thước lớn bổ đơi trước cấy để đẩy nhanh trình tạo chồi Kết thúc trình tạo chồi hình thành nhiều chồi nhỏ xếp chồng chất lên thành cụm chồi Sau tách chỏi cụm chỏi cấy chuyển sang môi trường Điều kiện nuôi cấy cường độ ánh sáng 4000 lux,10 gid chiếu sáng/ngày, nhiệt độ 26-28°C, ẩm độ 70-90% Giai đoạn 2: Tạo cây, nhân trì chồi Trong giai đoạn cụm chổi ni mơi trường lỏng có bổ sung IBA Ippm BAP 0,1 ppm cho lít mơi trường Sau 30-45 ngày cấy chuyển sang môi trường Với khoảng thời gian 30-50% số chồi cụm chỏi lớn lên, có đầy đủ hình dáng dứa cấy truyền sang bình tam giác để nuôi môi trường tạo rễ Theo cách hệ số nhân lần cấy chuyển đến 12 lần/năm Nếu kéo dài thời gian nuôi chồi (2 đến tháng) thu hoàn chỉnh Như vậy, tính bình qn số bình tam giác hệ số nhân từ bình chéi sau năm có 3'? bình (khoảng 500.000 cây) 50 Cường độ ánh sáng cần cho giai đoạn 4.000 lux 10 chiếu sáng/ngày Nhiệt độ từ 26 đến 28°C ẩm độ 70 đến 90% Giai đoạn 3: Tạo rễ Các từ cụm chồi tách cấy chuyển sang mơi trường rễ có chất kích thích sinh trưởng [AA từ 0,01-1 ppm có bổ sung 1,5g than hoạt tính/1I mơi trường Sau khoảng tháng ni dưỡng, dứa có từ 6-8 lá, chiều cao 4-5 cm đem trồng vườn ươm Giai đoạn 4: trồng vườn ươm Với điều kiện vườn ươm, cường độ ánh sáng cần điều chỉnh thích hợp với thời kỳ sinh trưởng Vườn ươm cần che mưa mái nhựa mái để tránh mưa nắng Chú ý không trồng sâu để đất vào kẽ làm dễ bị thối úng nhiễm bệnh Chọn loại đất xốp, nhiều mùn, thống khí, giàu dinh dưỡng xử lý đất với thuốc trừ nấm, sâu bọ Cây cần tưới nước vệ sinh chăm sóc hàng ngày Cây đủ tiêu chuẩn xuất vườn có trọng lượng 80g có 8-10 2.4.2 Nuôi cấy mô phân sinh đỉnh sinh trưởng để tạo bệnh 2.4.2.1 Thiệt hại kinh tế bệnh virus thực vát Trong sản xuất nông nghiệp, thiệt hại kinh tế hàng năm nguồn bệnh nói chung (nấm, vi khuẩn, tuyến trùng ) virus nói riêng lớn Ví dụ bệnh virus Tungro phát triển lúa, năm 1971 làm thiệt hại nửa triệu thóc nhân dân Philippine, bệnh virus khảm làm cho suất lúa mì, đại mạch Ở nước Châu Âu (Anh, Pháp) Mỹ giảm tới 20-30% Nhìn chung mức độ gây hại tính nghiêm trọng bệnh virus thể nhóm khác Đối với hàng năm, thiệt hại thể qua việc giảm suất gây mùa toàn vụ Đối với lâu năm, thân gỗ (cam, chanh mận, lê, táo ), bệnh virus làm giảm chất lượng suất bị nhiễm bệnh mà nguy truyền bệnh cho khỏe năm sau Đặc biệt, nhân giống vơ tính, bệnh virus lây lan nhanh, dễ phát triển thành dịch gây hại nghiêm trọng Virus phịng trừ xử lý chất hố học bệnh khuẩn, nấm sâu bọ Cách để loại bỏ virus phải tách chúng khỏi bị bệnh, trả lại cho trồng sống bình thường khỏe mạnh 31 2.4.2.2 Ky thuat lam sach virus - Xử lý nhiệt Đây biện pháp làm bệnh có sở thực tiễn Những mía bị bệnh cho suất cao ngâm nước nóng Nhiều nghiên cứu cho thấy dùng khí nóng thuận lợi đa số trồng chúng chịu đựng tốt virus bị loại Những hiểu biết chế làm bệnh xử lý nhiệt chưa đầy đủ Giả thiết chung virus bị ức chế sinh sản 39-40°C Quá trình sinh trưởng thực vật nhiệt độ cao bị ức chế mức độ thấp hơn, phận sinh trưởng nhanh thường bệnh nghèo virus Nhiều nghiên cứu cho thấy, thể thực vật bảo tồn trạng thái tối thích thời gian dài nhiệt độ cao Quang chu kỳ thích hợp cho xử lý nhiệt cao lốgiờ/ngày Tuy cần than chọn thời gian thích hợp cho loại cây, nhiệt độ cần kiểm tra liên tục, ẩm độ cân giữ 50% Cơ chế trình (theo Kassamis,1957) nhiệt độ cao, trình tổng hợp bị ngừng diễn phân giải chất virus Như vậy, xử lý nhiệt độ 40°C, mô phân sinh phát triển virus ngừng sinh sản chép nhân ARN ADN chúng bị phá vỡ Các đỉnh sinh trưởng (meristem) có khả khơng chứa virus Do việc xử lý nhiệt độ cao có ảnh hưởng đến mẫu cây, thời gian nhiệt độ xử lý phải chọn lọc thích hợp cho loại loại virus Ví dụ: để loại virus khoai tây, củ khoai tây xử lý 40°C,16 tiếng, sau 22°C,8 tiếng Tỷ lệ bệnh thu trường hợp cao so với xử lý 40°C với thời gian 20 (Walkey Freeman,1977) Ngồi nhiệt độ thấp có tác dụng ức chế loại bỏ số virus Moskovers (1973) thu khoai tây virus A Y cách ni cấy đỉnh sinh trưởng có xử lý nhiệt độ 5-15°C - Nuôi cấy đỉnh sinh trưởng Limasset Cornnel (1949) chứng minh rằng, nồng độ virus thực vật giảm dần phận gần đỉnh sinh trưởng, riêng đỉnh sinh trưởng có độ virus cao (Morel Martin,1952) Thực tế ứng dụng để làm virus bang cách tách đỉnh sinh trưởng điều kiện vô trùng, nuôi cấy thành hồn chỉnh Việc phan lập đỉnh sinh trưởng có kích thước 0,01-0,lmm khó khăn (Hollings Storie,1964) Do phải lấy mẫu có kích thước lớn hơn, tính bệnh mẫu ni cấy bị giảm xuống tốc độ tái sinh tăng lên Một mẫu đỉnh sinh trưởng qua nuôi từ đến nhiều lần có khả bệnh virus cao phương pháp ứng dụng thực tiễn 32 Khái niệm mô phân sinh mẫu vật ni cấy tách từ đỉnh sinh trưởng có kích thước vịng 0,Imm từ chóp tháp sinh trưởng Trong thực tế, mẫu nuôi cấy tách với kích thước tiến hành ni cấy với mục đích làm virus cho trồng Một số loại trồng ứng dụng nuôi cấy đỉnh sinh trưởng tạo nguồn giống bệnh phong lan, dưa, mía, cam quít đỉnh sinh trưởng tách với kích thước từ 5-10mm, nghĩa tồn mơ phân sinh phần mơ xung quanh Do phải kết hợp yếu tố để tìm phương thức lấy mẫu tối ưu Một đỉnh sinh trưởng ni cấy điều kiện thích hợp phát triển thành hay nhiều chồi chỏi phát triển thành hồn chỉnh Nguồn vật liệu để ni cấy thường là: - Chồi đỉnh (chồi ngọn) - Chồi nách - Chồi phát sinh từ củ từ thân, rễ Để thu bệnh không thiết phải có đỉnh sinh trưởng hồn tồn virus mà làm dần q trình ni cấy Vì thực tiễn phải giới hạn nồng độ virus khối lượng mơ phân hố mức định cần có virus Phối hợp xử lý nhiệt với nuôi cấy đỉnh sinh trưởng phương pháp thường sử dụng thơng qua xử lý nhiệt, trình sinh sản virus chồi bị ức chế mạnh thông qua trình phân hố đỉnh sinh trưởng, tính virus đảm bảo với xác xuất cao Thông thường sử dụng môi trường Murashige Skoog (MS) nuôi cấy bệnh Trong phịng thí nghiệm việc nuôi cấy đỉnh sinh trưởng thực qui mơ lớn cần ý điểm sau đây: - Đảm bảo độ đồng giống tất khâu nuôi cấy - Đảm bảo tốc độ sinh trưởng nhanh số lượng đỉnh sinh trưởng lớn, đồng thời phải đảm bảo độ đồng đưa sản xuất Đỉnh sinh trưởng cần nuôi cấy điều kiện nhiệt độ 22°C l6 chiếu sáng/ngày cường độ 1.000 - 3.000 lux Ngồi mơ phân sinh đỉnh, số mơ tế bào khác nuôi cấy để tạo bệnh bao gồm mô sẹo, tế bào trần mơ quan sinh san Một số cơng trình nghiên cứu thu khoẻ mạnh từ mô sẹo thuốc bị nhiễm bệnh khảm virus (Mori,1977) Nếu đem khối mô sẹo tế bào thuỏc kiểm tra xét nghiệm thấy có khoảng 30-40% tế bào bị nhiễm bệnh Như khối mô sẹo nhiễm bệnh xuất vùng mô bệnh Điều giải thích q trình chép virus chậm phân chia tế bào (Svobodva, 1965) 33 Nuôi cấy tế bào trần để thu bệnh Shepard (1975) thực câv khoai tây Từ tế bào trần bị nhiễm virus X tái sinh khoai tây bệnh; tống số [40 cây, có 7,5% bệnh Việc nuôi cấy mô từ hoa để tạo bệnh áp dụng có kết có múi Một số virus khơng lan truyền qua hạt, phôi tâm túi phôi sử dụng có kết việc tạo bệnh giống thuộc họ cam quýt (Navaro Juaez, 977) 2.4.3 Kỹ thuật nuôi cấy mô bảo quản nguon gen in vitro 2.4.3.1 Khái niệm chung Mục đích bảo quản nguồn tài nguyên di truyền thực vật trì phong phú, đa đạng truyền loài lồi hệ sinh thái nói chung, để qua tìm hiểu đặc điểm sinh trưởng phát triển, làm sở cho việc khai thác sử dụng chúng cho tương lai (Khanna ctv, 1991) Thực tế có nhiều rkiưương pháp bảo quản nguồn gen như: bảo quản hạt bảo quản chỗ việc trì nguồn mẹ vườn sản xuất Ngày với tiên kỹ thuật nuôi cấy tế bào, phương pháp bảo quản nguồn tri su ton tai cua vat chat di truyền thông qua việc bảo quản một khối tế bào quan sinh sản hạt phấn thuật bảo quản nguồn gen theo phương thức gọi quản nguồn øen in vitro gen băng việc phận cây, quan tâm Các kỹ phương pháp bảo Kỹ thuật bảo quản nguồn gen in vitro có nhiều ưu điểm như: - Có thể trì bảo quản thời gian dài, có khả cung cấp nguồn gen bénh cho sản xuất mục đích nghiên cứu - Vật liệu bảo quản đa dạng gọn nhẹ, dễ dàng vận chuyển, tiết kiệm khơng gian thời gian - Có thể đễ dàng điều tiết môi trường phù hợp với điều kiện bảo quản nên không bị phụ thuộc vào mùa vụ Tuy phương pháp bảo quản in vitro có số hạn chế như: - Đồi hỏi phải có hiểu biết kỹ thuật - Yêu cầu đầu tư thiết bị phí lớn, tốn kém, áp dụng trung tâm khoa học hoäc sở sản xuất tiên tiến 2.4.3.2 Kỹ thuật bảo quản - Mẫu bảo quản: Tuỳ theo thời gian bảo quản dài ngắn mục đích bảo quản, mẫu đưa vào bảo quản đa dạng, tế bào đơn, tế bào huyền phù, mô seo, thân rễ, phơi non hồn chỉnh 54 Thơng thường mẫu bảo quản với phương pháp sau: Bảo quản ngắn hạn Được áp dụng nhiều cho bảo quản non hồn chỉnh, nhóm nơng nghiệp nhân vơ tính khoai lang, khoai tây, sắn, khoai sọ, khoai mài chuối, dứa - Mẫu bảo quản quan sinh sản, phôi, chồi, mầm, xảy biến đị sinh dưỡng trình tạo - Cây đưa vào bảo quản in vitro phải làm bệnh khoẻ mạnh Trong thời gian bảo quản, đặc tính di truyền khơng bị thay đổi - Trong bảo quản, đặt điều kiện ánh sáng, nhiệt độ chế độ dinh dưỡng đặc biệt Tốc độ sinh trưởng, phát triển chúng bị ức chế, giảm 15-20 lần so với tốc độ sinh trưởng điều kiện bình thường Những yếu tố ức chế sinh trưởng sử dụng nuôi cấy bảo quản khác nhau, phụ thuộc vào chất trồng, bao gồm: + Nhiệt độ thấp (6-18°C) + Chất ức chế sinh trưởng (acid abcisic) Những chất làm giảm áp suất thẩm thấu dinh dưỡng oxygen (manitol dầu phủ tăng nồng độ sucrose môi trường nuôi cấy) để làm giảm khả sinh trưởng tế bào + Giảm lượng dinh dưỡng q trình ni cấy Bảng 2.7 Kết bảo quản ngắn hạn số loại trồng Cây trồng Khoai lang(Ipomocea batatus) Điều kiện bảo quản Thời gian cấy chuyển Nhiệt độ 16-18°C 12-18 tháng Sắn (Manihot esculenta) Nhiệt độ 15°C Ánh sáng 1000 lux 18-24 tháng Chuối (Musa spp.) Nhiệt độ 6-10 °%C Ánh sáng 1200 lux 18 tháng Khoai tây (Solanum spp.) Ánh sáng 2000 lux manitol 3% 24 tháng Ánh sáng 1000 lux, Manitol 3% | Bao quan dai han Được áp dụng cho nhiều loại chủ yếu có hạt khơng bảo quản lâu dài nhiệt độ ẩm độ thấp Mẫu đưa vào bảo quản bao gồm phôi mô tế bào, trước đưa vào bảo quản mẫu phải xử lý qua số cơng đoạn: ti tì ể - Trước bảo quản: Xử lý với 5-10% proline 3-6% manitol - Trước bảo quản: Xử lý với 5-10% proline 3-6% manitol - Xử lý chống đông hoá chất: dung dịch DMSO glycerin IM sucrose 2M nồng độ IM có thêm - Bảo quán: Nhiệt độ vào khoảng - 180 đến -196°C việc sử dụng môi trường nitơ lỏng Khi cần phục hồi mẫu bảo quản tiến hành phục hồi sinh trưởng, số mẫu phá băng từ từ nhiệt độ 40°C Trong trình bảo quản, mẫu để nhiệt độ -180 đến -196°C, trình trao đổi chất, sinh trưởng, phát triển bị ngưng trệ Thời gian bảo quản từ 20-30 năm, cần sử dụng, mẫu lấy phục hồi sinh trưởng ni cấy tạo thành hồn chỉnh Han ché cua hai phương pháp - Hai phương phá; bảo quản chưa có đánh giá đầy đủ mối tương tác yếu tố môi trường (thành phân dinh dưỡng môi trường nuôi cấy, chất ức chế sinh trưởng, nhiệt độ, cường độ chất lượng ánh sáng sử dụng), gặp nhiều khó khăn cho việc áp dụng cơng nghệ quy mô lớn cho nhiều loại trồng khác - Chưa xác định khoảng thời gian tối đa bảo quản an tồn trình bảo quản đài hạn cho loại trồng cụ thể Vấn đề quan trọng cho hai hình thức bảo quản xuất biến dị dinh dưỡng thiếu biện pháp để kiểm tra Trong kiến thức hiểu biết liên quan đến ổn định di truyền hình thức bảo quản nói chung chưa nghiên cứu cách nghiêm túc đủ Danh sách trồng bảo quản in vitro | Cay dứa (Annanas spp.) Cay dita (Cocos nucifera) Cay ca phé (Coffe spp.) 10 Khoai mai (Discorea spp.) Cay cao su (Havea brasiliensis) 11 Cay ca cao (Theobroma Cacao) Khoai lang (Ipomoea spp.) 12 Cay nho (Vitis spp.) Khoai tay (Solanum tuberosum) 13 Cay cam (Citrus spp.) San (Manihot spp.) 14 Cay ging, nghé (Cicer arietium) Cay chudi (Musa spp.) 15 Cay co dau (Elaesis guineusi) Cay du du (Carica papaya) 2.4.4 Công nghệ phdi v6 tinh (Somatic embryo Technology) 2.4.4.1 Khái niệm phơi vơ tính Trong tự nhiên, lồi thực vật bậc cao tự trì nịi giống thơng qua sinh sản hữu tính Sau thụ tỉnh, hợp tử phát triển thành phơi phơi gọi phơi hữu tính (zygotic embryo) Phơi hữu tính có cấu trúc phân cực rõ ràng tạo thành hai miền sinh trưởng: miền sinh trưởng rễ miền sinh trưởng Quá trình nẩy mầm hạt, hai miền sinh trưởng đồng thời phát triển để tạo thành Nguồn dinh dưỡng ban đầu cung cấp cho hạt nẩy mầm huy động từ nội nhũ Trong nhiều loại trồng, dạng phơi khác hình thành từ tế bào soma hồn tồn khơng qua thụ tinh, phơi gọi phơi vơ tính hay phơi dinh dưỡng, phơi soma (somatic embryo) Phơi vơ tính tồn với phơi hữu tính hạt nhiều lồi thực vật, chúng hồn tồn giống với phơi hữu tính hình thái, q trình phát triển sinh lý khác nguồn gốc di truyền Như hiểu: phơi vơ tính dạng phơi (thể tồn nịi giống) hình thành từ tế bào soma, không thông qua thụ tinh có di truyền hồn tồn giống với tế bào soma phát sinh Ở lồi trồng mang hạt đa phơi (trong thường có phơi hữu tính phơi triển mọc nhiều phơi vơ hữu tính Cơ quan nội nhũ mạnh phơi vơ tính, từ phơi vơ tính chiếm tỷ lệ Năm tính), phơi vơ tính thường phát triển mạnh lấn át nguồn dinh dưỡng chủ yếu cho phôi nẩy mầm phát điều lý giải mang hạt đa phôi, cao 1958 hai nhà khoa học có tên Street Reinert phát thấy rằng: q trình ni cấy mơ thực vật, số mẫu nuôi cấy phân chia tế bào vô tổ chức tạo nên mô sẹo, nuôi cấy mơ sẹo mơi trường thích hợp tạo phơi vơ tính Hai nhà khoa học lần thành cơng tạo phơi vơ tính từ tế bào đơn cà rốt Phơi vơ tính tạo nuôi cấy mô tế bào xét mặt hình thái hồn tồn giống với phơi hữu tính vơ tính có tự nhiên, điểm khác biệt chúng khơng có nội nhữ, gieo cấy điều kiện bình thường phơi khơng khó khăn để phát triển thành hồn chỉnh Việc ni cấy phơi vơ tính đóng vai trị quan trọng, tạo quần thể đồng hình thái di truyền, hệ số nhân giống cao, có khả cơng nghiệp hố để sản xuất số lượng lớn 2.4.4.2 Qui trình tạo phơi vơ tính Bước I: Chọn mẫu ni cấy môi trường tạo phôi Mẫu chọn nuôi cấy phải xử lý vơ trùng, có nhiều loại mẫu khác sử dụng để nuôi cấy tạo phôi tuỳ loại trồng Về mặt lý thuyết, hầu hết Sử phận trồng (ngoại trừ phần gỗ tế bào chết) sử dụng nuôi cấy tương tự nhân giống ¡n vitro Tuy nhiên muốn xác định loại mẫu nuôi cấy thích hợp cần phải qua thực nghiệm Ví dụ, kết thực nghiệm cho thấy, đu đủ, mẫu nuôi cấy tốt phần thân non mâm hạt Đối với cà phê, mẫu tốt bánh tẻ - Sau vô trùng, mẫu cất thành phần nhỏ, nuôi cấy môi trường tạo phôi (môi trường tạo phôi chủ yếu dựa vào MS với chút thay đối thành phần nồng độ tuỳ thuộc loại mẫu) - Ni cấy mẫu bình tam giác nhỏ, nhiệt độ 27 - 30°C, điều chỉnh ánh sáng thích hợp với loại mẫu cấy Ví dụ mẫu cấy thân non mầm hạt đu đủ, ni điều kiện bóng tối, mẫu cấy cà phê cần nuôi cấy cường độ ánh sáng khoảng 3000 lux với thời gian - 10 giờ/ngày Thời gian xuất phôi vào khoảng từ - tuần tuỳ loại trồng loại mẫu Bước 2: Nhân nhanh Kết thúc bước 1, đưa phơi ni cấy mơi trường tạo chồi, rễ để tạo hồn chỉnh Trường hợp muốn nhân nhanh tạo số lượng lớn phôi đồng nhất, cần thiết phải đưa phôi sang bước để nhân nhanh Các cụm phôi mọc từ mẫu ni cấy dễ dàng phát qua màu sắc hình thái, phơi thường có màu trắng đục, hình cầu, trái tim dạng hạt Đưa cụm phôi sang môi trường nhân nhanh giống môi trường bước khơng có thạch (agar) nên trạng thái lỏng Giai đoạn thiết phải giữ phôi trạng thái chuyển động máy lắc Phôi chuyển động máy lắc tốc độ 20 - 40 vịng/phút Thời gian bước hai từ vài ngày đến tuần nhiều tuỳ thuộc vào nhu cầu số lượng phơi cần có Ở trạng thái chuyển động, phơi sau hình thành tách rời khỏi khối tế bào mẹ vào dung dịch giống bào tử nấm phát tán nước Do phơi nhận dinh dưỡng nhiều hơn, sinh sản nhanh đồng Trong trình phơi phân chia tạo thành phơi mới, chọn lọc phơi có kích thước phù hợp (khơng lớn nhỏ) cách lọc dung dịch ni cấy chứa phơi qua lưới lọc có kích thước phù hợp Như giúp tạo quần thể đồng sau Bước 3: Tái sinh phơi thành hồn chỉnh Chuyển phơi sang mơi trường tạo chồi rễ để phát triển thành hoàn chỉnh Thanh phan co ban môi trường tạo chồi rễ giống MS, có điều chỉnh tỷ lệ, nồng độ chất kích thích sinh trưởng phù hợp với loại trồng 58 Cũng tạo phơi vơ tính từ tế bào trần dạng huyền phù, bước tiến hành tương tự nuôi cấy-trên môi trường lỏng 2.4.4.3 Ứng dime phơi vơ tính - Sản xuất hạt nhân tạo - Nhân giống vơ tính mức độ công nghiệp - Ứng dụng bảo quản nguồn gen in vitro - Ứng dụng chuyển gen thực vật 2.4.5 Công nghệ hạt nhân tạo (synthetic seed) 2.4.5.1 Khái niệm hạt nhân tạo Trong thực tế sản xuất nông lâm nghiệp, vấn đề lớn đặt làm để có số lượng hạt giống lớn, đồng mặt di truyền đáp ứng yêu cầu sản xuất rừng, dược liệu, công nghiệp cần trồng diện tích lớn Dựa thành tựu công nghệ tế bào thực vật, nhà nghiên cứu sản xuất hạt điều kiện phịng thí nghiệm cơng nghiệp hố (ngồi thể sống) Hạt sản xuất theo phương pháp gọi hạt nhân tạo Sản xuất hạt nhân tạo phôi vô tính nhìn chung có chung số ứng dụng nhân nhanh tạo số lượng lớn đồng hình thái di truyền So với phơi vơ tính, hạt nhân tạo có nhiều ưu điểm hơn, bảo quản với thời gian dài mà không cần điều kiện chăm sóc đặc biệt Có thể vận chuyển dễ dàng, việc gieo cấy tiện lợi Tuy nhiên tuỳ vào điều kiện cụ thể, tuỳ thuộc vào mục đích nghiên cứu sản xuất chọn hai phương pháp 2.4.5.2 Nguyên tắc sản xuất hạt nhân lạo _ - Hạt nhân tạo phải sản xuất điều kiện vô trùng cao để tránh phơi hạt bị phá huỷ - Hạt phải đảm bảo có tỷ lệ nẩy mầm cao, quần thể đồng hình thái di truyền - Hạt phải có điều kiện tối thiểu dinh dưỡng điều kiện khác để đảm bảo cho phơi nẩy mầm phát triển thành cách dễ dàng 2.4.5.3 Cấu tạo hạt nhán tạo Để đảm bảo cho hạt nẩy mầm phát triển thành hạt nhân tạo phải có đủ phận giống hạt trồng tự nhiên bao gồm: 59 - Phôi hạt: Phôi hạt nhân tạo tuỳ mục đích sử dụng lấy từ nguồn khác nhau, thông thường phôi vơ tính sản xuất phương pháp ni cấy mơ tế bào Mỗi hạt thường có phơi, phơi sàng lọc kích thước để tạo đồng - Phần thay cho nội nhũ cung cấp dinh dưỡng cho phơi nẩy mầm (hay cịn gọi phần vỏ hạt) Vỏ bọc bên ngồi phơi bao gồm số thành phần dinh dưỡng chủ yếu giúp cho phôi nẩy mầm sinh trưởng giai đoạn đầu Như ta biết, phơi vơ tính thu qua ni cấy khơng có nội nhũ nên phần vỏ bọc quan trọng, vừa phần cung cấp dinh dưỡng, vừa phần bảo vệ cho phôi Thành phần vỏ bọc chủ yếu thành phân dinh dưỡng môi trường MS có chứa khống đa lượng, vi lượng, nước dừa, chất sinh trưởng, đường Ngồi cịn có chất kết dính sinh học Chất kết dính thường polyme tự nhiên, hợp chất alginat sử dụng có hiệu phổ biến Alginat polyme sinh học chiết xuất từ rong biển Alginat phân tử axit manuronic gắn với nhau, giống phân tử glucose kết gắn tạo nên cellulose Đặc điểm quan trọng alginat sử dụng làm chất kết dính là: Tan nước kết hợp với anion hoá trị I (Na'!, Ka*! ) bị kết tủa gặp anion hoá trị (Ca**, Mg**, AI* ) Nếu ta nhỏ giọt dung dịch Alginat natri (bên có chứa nhân phơi vơ tính) vào dung dịch clorua canxi, alginat natri phần diện tích bên ngồi chuyển hố thành alginat canxi tạo nên mang khơng thấm nước bao bọc bên Như nguyên tắc hình thành hạt nhân tạo Lớp alginat canxi tạo thành màng bảo vệ cho hạt không bị thấm nước Khi hạt nảy mầm phá vỡ lớp vỏ chui ngồi Lượng đường có hạt nhân tạo đóng vai trị quan trọng cho phôi nẩy mầm mọc khỏi hạt Đường thay vai trị nội nhũ chứa tỉnh bột có hạt tự nhiên Tuy nhiên hàm lượng cao, phôi hạt rễ bị nhiễm khuẩn tỷ lệ mọc thấp đưa vào môi trường không vô trùng Hiện nhược điểm khắc phục cách trộn alginat với tinh bột qua xử lý để làm vỏ bọc cho hạt Phơi hạt nhân tạo có khả tiết amilase để phân huỷ tinh bột dùng làm lượng nẩy mầm 2.4.5.4 Kỹ thuật sản xuất hạt nhân tạo Với đối tượng trồng khác nhau, kỹ thuật tiết có đơi chút khác nhìn chung qua bước sau: Bước ï: Tạo phơi vơ tính Bước 2: Tạo hạt nhân tạo Bước 3: Bảo quản kỹ thuật gieo hạt 60 Dưới ví dụ qui trình sản xuất hạt cà phê phân viện công nghệ sinh hoc miền Nam Bước 1: Tạo phôi Phôi nuôi cấy môi trường lỏng máy lắc, phôi tốt có kích thước khoảng 0,5 - mm Bước 2: Tạo hạt - Hoà 100 ml dung dịch alginat natri 4% mơi trường MS có chứa phơi vơ tính - Dùng ống pipet hút lấy dung dịch alginat có chứa l phơi cà phê - Nhỏ giọt alginat có chứa phơi nhẹ nhàng vào dung dịch clorua canxi đựng bình lớn Dung dịch clorua canxi khuấy nhiệt độ thấp - Quan sát thu hạt nhân tạo sau ngâm clorua canxi 30 phút Bước 3: Bảo quản gieo hạt - Rửa hạt nhân tạo nước cất bảo quản nhiệt độ 5°C nước cất Vô trùng - Khi sử dụng, hạt gieo đĩa petri có đệm giấy lọc thấm nước nhiệt độ 30°C Hat sé mọc mầm cách tự phá vỡ vỏ màng alginat canxi, sau cà phê đưa gieo cát Khi bát đầu phát triển, chúng chuyển trồng bầu đất có chứa mùn dinh dưỡng Qui trình kỹ thuật phương pháp thủ công Thực tế, theo nguyên tac việc sản xuất hạt nhân tạo tự động hố thiết bị cơng nghiệp có khả tạo hạt nhân tạo với kích thước chất lượng đồng 6]