(Đề tài khoa học ) NGHIÊN CỨU BÀO CHẾ VIÊN NANG CHỨA HOẠT CHẤT HUPERZINE A ĐƯỢC TÁCH CHIẾT TỪ MỘT SỐ CHỦNG NẤM PHÂN LẬP TỪ CÂY THẠCH TÙNG RĂNG CƯA

BỘ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC CHƢƠNG TRÌNH KH&CN TRỌNG ĐIỂM CẤP NHÀ NƢỚC KC.10/16-20 “Nghiên cứu ứng dụng và phát triển công nghệ tiên tiến phục vụ bảo vệ và chăm sóc sức khỏe cợng đờng” BÁO CÁO TĨM TẮT KẾT QUẢ KHOA HỌC CÔNG NGHỆ ĐỀ TÀI: NGHIÊN CỨU BÀO CHẾ VIÊN NANG CHỨA HOẠT CHẤT HUPERZINE A ĐƢỢC TÁCH CHIẾT TỪ MỘT SỐ CHỦNG NẤM PHÂN LẬP TỪ CÂY THẠCH TÙNG RĂNG CƢA (Huperzia serrta) MÃ SỚ: KC.10.01/16-20 Cơ quan chủ trì: Viện Công nghệ sinh học Chủ nhiệm đề tài: TS Lê Thị Minh Thành Thời gian thực hiện: 10/2016 – 09/2019 Hà Nợi – 03/2020 BỢ KHOA HỌC VÀ CƠNG NGHỆ VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC CHƢƠNG TRÌNH KH&CN TRỌNG ĐIỂM CẤP NHÀ NƢỚC KC.10/16-20 “Nghiên cứu ứng dụng và phát triển công nghệ tiên tiến phục vụ bảo vệ và chăm sóc sức khỏe cợng đờng” BÁO CÁO TĨM TẮT KẾT QUẢ KHOA HỌC CÔNG NGHỆ ĐỀ TÀI: NGHIÊN CỨU BÀO CHẾ VIÊN NANG CHỨA HOẠT CHẤT HUPERZINE A ĐƢỢC TÁCH CHIẾT TỪ MỘT SỐ CHỦNG NẤM PHÂN LẬP TỪ CÂY THẠCH TÙNG RĂNG CƢA (Huperzia serrta) MÃ SỐ: KC.10.01/16-20 Chủ nhiệm đề tài Cơ quan chủ trì đề tài TS Lê Thị Minh Thành Hà Nội – 03/2020 LỜI CẢM ƠN Tập thể cán thực Đề tài: KC.10.01/16-20 xin chân thành cảm ơn Bộ KH&CN, Vụ Khoa học Công nghệ ngành kinh tế - kỹ thuật, Văn phịng Chương trình trọng điểm cấp Nhà nước , Chương trình h nước C học công nghệ trọng điểm cấp Nhà -20 tin tưởng giao nhiệm vụ thực Đề tài Chúng xin chân thành cảm ơn Lãnh đạo Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam Viện Công nghệ sinh học có quan tâm sâu sắc, đạ thường xuyên tạ điều kiện thuận lợi q trình thực Đề tài Chúng tơi xin cảm ơn hợp tác có hiệu củ qu n tr ng ng ài Viện Công nghệ sinh học cố gắng tập thể cán tham gia thực đề tài TM/Tập thể cán nghiên cứu TS Lê Thị Minh Thành TẬP THỂ CÁN BỘ THAM GIA THỰC HIỆN ĐỀ TAI KC.10.01/16-20 TT Họ tên Chức vụ đề tài Cơ quan TS Lê Thị Minh Thành Chủ nhiệm đề tài Viện Công nghệ sinh học PGS.TS.Nguyễn Phương Nhuệ Thư ký đề tài Viện Công nghệ sinh học PGS.TS Đồng Văn Quyền Thành vi n ch nh Viện Cơng nghệ sinh học ThS Hồng Thị Hồng Anh Thành vi n ch nh Viện Công nghệ sinh học TS Đỗ Thị Tuyên Thành vi n ch nh Viện Công nghệ sinh học GS.TS Phạm Thị Minh Huệ Thành vi n ch nh Đại học Dư c Hà N i PGS.TS Chử Văn Mến Thành vi n ch nh Học viện Qu n Y DS Nguyễn Xn Hồng Thành vi n ch nh Cơng ty IMC TS Lê Thị Bích Thủy Thành vi n ch nh Viện Công nghệ sinh học 10 TS Trịnh Thị Thu Hà Thành vi n ch nh Viện Công nghệ sinh học Và C c thành vi n tham gia kh c CÁC TỪ VIẾT TẮT TTRC Thạch t ng cưa VNNS Vi nấm n i sinh AD Alzheimer AChE Acetylcholinesterase ACh Acetylcholine HPLC High Performance Liquid Chromatography TLC Thin layer chromatography PCR Polemerase Chain Reaction PDA Potato dextrose agar PDB Potato dextrose broth YM Yeast Mould PVP K30 Polyvinylpyrrolidone HPMC Hydroxypropyl Methyl cellulose DTNB 5,5′-Dithiobis (2-nitrobenzoic acid) TC DĐVN Tiru chu n Dư c n Việt Nam KLTB Kh i ng trung ình QCVN Qui chu n Việt Nam LD Lethal dose IC Inhibitory concentration WHO World Health Organization MDA malondialdehyde SOD superoxide dismutase GSH-Px glutathione peroxidase CAT Catalase EDTA Ethylene Diamine Tetracetic Acid C.vT.Bg.Jy.Lj.Tai lieu Luan vT.Bg.Jy.Lj van Luan an.vT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.Lj Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an MỤC LỤC Trang MỞ ĐẦU Chƣơng TỔNG QUAN 1.1 Giới thiệu thạch tùng cưa 1.2 Vi nấm nội sinh thực vật 1.3 Tổng uan v h ạt chất Huperzine A 1.4 Các nghiên cứu nâng cao sinh tổng hợp HupA vi nấm nội sinh 1.5 Các nghiên cứu v tách chiết, tinh sạch, thu nhận hoạt chất HupA Chƣơng VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP 10 2.1 Vật liệu 10 2.2 Hóa chất trang thiết bị thí nghiệm 10 2.3 Phương pháp nghiên cứu 10 2.3.1 Phân lập, tuyển chọn chủng vi nấm nội sinh có khả sinh tổng hợ u in t h h t ng ăng u i s t i t 10 a) Phương ph p thu mẫu 10 ) Phương ph p ph n ập bảo quản nấm n i sinh c) Phương ph p tách chiết Huperzine A 10 10 ) X c định khả sinh tổng h p hoạt chất Hup rzin A: 10 ) X c định hàm ng HupA 10 f) Định danh vi nấm 11 2.3.2 Nghiên cứu nâng cao khả sinh tổng hợp Huperzine A chủng nấ tu ển chọn 11 2.3.3 Nghiên cứu quy trình lên men chủng nấm sản sinh ho t chất Huperzine A qui mô pilot 11 2.3.4 Nghiên cứu quy trình cơng ngh tách chiết, tinh s ch, thu nhận ho t chất Huperzine A t sinh khối nấm 11 a) Phương ph p thu sinh kh i nấm 11 b) Phương ph p ph v tế 11 c) C c phương ph p chiết xuất 11 d) Phân lập Hup A 11 )Phương ph p sắc ký c t si ica g 12 f)Phương ph p sắc ký c t s pha x 12 g)Phương ph p tinh c t than hoạt tính 12 Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhd.vT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.Lj.dtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn C.vT.Bg.Jy.Lj.Tai lieu Luan vT.Bg.Jy.Lj van Luan an.vT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.Lj Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an h)Tinh ằng sắc ký trao đổi anion amberlite IRA400 i)Tinh sắc ký trao đổi anion DEAE-sepharose 12 12 k)X c định đ hàm ng HupA 12 )Phương ph p x c định tồn m thano , thano , tạp chất kh c, kim oại n ng 13 2.3.5 Nghiên cứu u t nh hế v sản uất vi n n ng ứng h hất u ui h ng th nghi 13 2.3.5.1 Nghi n c u ựa chọn t vi n nang c ng t c, xây dựng c ng th c qui trình chế 13 2.3.5.2 Phương ph p đ nh gi đ c t nh c m vi n nang c ng 14 2.3.5.3 Nâng cấp th m định quy trình sản xuất vi n nang c ng quy m 10.000 viên nang/mẻ 14 2.3.5.4 Nghiên c u lựa chọn bao bì thiết kế ao ì đóng gói cấp 15 2.3.5.5 Th o õi đ ổn định vi n nang c ng ch a HupA điều kiện thường lão hóa cấp t c 16 2.3.6 Xây dựng tiêu chuẩn sở bán thành phẩm thành phẩm 18 2.3.6.1 X y ựng ti u chu n sở nguy n iệu HupA 18 2.3.6.2 X y ựng ti u chu n sở thành ph m vi n nang c ng ch a HupA 19 Đánh giá t nh n t n thực nghi m 19 ộc tính) tác dụng hỗ trợ cải thi n trí nhớ 2.3.7.1 Nghiên c u tính an tồn Hup rzin tr n đ ng vật thực nghiệm 19 2.3.7.2 Đ nh gi t c ụng cải thiện trí nhớ, tăng cường khả học tập nhận th c thần kinh trung ương tr n chu t nhắt trắng bị gây thiếu máu não cục b làm giảm hoạt đ ng thần kinh, giảm trí nhớ 20 2.3.7.3 Đ nh gi t c ụng cải thiện trí nhớ, tăng cường khả học tập nhận th c thần kinh trung ương tr n chu t nhắt trắng già 20 2.3.7.4 Nghiên c u chế tác dụng Hup rzin A n tế n o chu t 23 III KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 25 3.1 Phân lập, tuyển chọn chủng vi nấm nội sinh có khả sinh tổng hợp up r in t c hạch tùng cưa up r ia s rrata iệt Nam 25 3.1.1 Thu thập mẫu v thu thậ t i Đ L t v 25 h n ập nấm nội sinh t mẫu i t s t 3.1.2 Xá ịnh khả sinh tổng hợp ho t chất Huperzine A chủng nấm nội sinh phân lậ ợ v tu ển họn ợ hủng sinh tổng hợ u 26 3.1.3 Định danh chủng nấm nội sinh phân lậ ăng 28 Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhd.vT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.Lj.dtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn ợc t Th ch tùng C.vT.Bg.Jy.Lj.Tai lieu Luan vT.Bg.Jy.Lj van Luan an.vT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.Lj Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an 3.2 Nghiên cứu nâng cao khả sinh tổng hợp Huperzine A chủng nấ tu ển chọn 28 Đột biến chủng tia tử ngo i v hóa chất g ột biến nhằm nâng cao khả sinh tổng hợp HupA củ hủng vi nấ tu ển họn 28 2 ghi n ứu th nh h n i t ng v i u i n nu i ấ nhằm nâng cao khả sinh tổng hợp Huperzine A chủng vi nấ tu ển họn 28 3 ghi n ứu i u i n ả sinh u v ổn ịnh gố sản 30 Nghiên cứu quy trình lên men chủng nấm sản sinh hoạt chất Huperzine A qui mô pilot 30 3.3 uản u gi 3 ghi n ứu i t ng nh n giống sản sinh h t hất u in 3.3.2 ghi n ứu ự Huperzine A họn nguồn 333 ghi n ứu ảnh h ởng ủ sinh tổng hợ Huperzine A n hủng giống nấ n th h hợ n v nitơ th h hợ nguồn h hủng nấ 30 h sinh tổng hợ 31 uối h v ti n hất ến 3 ghi n ứu i u i n n n: Độ th ng h tuổi giống h sinh tổng hợ Huperzine A nhi t ộ 3 ghi n ứu ộng thái uá t nh n n sinh tổng hợ ẻ t n thiết ị n n 5-10 80-100 lít u 32 ợng giống 32 in 32 th 3.3.6 X dựng u t nh nh n giống v u t nh n n hủng nấ sản sinh h t hất u in th ẻở u 5-10 lít 80-100 lít 34 3.3.7 ghi n ứu i u i n n n v sản sinh h t hất Huperzine A u 35 3.3.8 L n dựng u t nh n n hủng nấ thiết ị n n 500 t n sản uất Huperzine A 36 3.4 Nghiên cứu u trình công nghệ tách chiết, tinh sạch, thu nhận h ạt chất up r in t sinh khối nấ 37 ghi n ứu ự nhận h t hất u suất 2-3 g ẻ 37 họn i u i n ng ngh tá h hiết tinh s h v thu in t sinh hối nấ th u h ng th nghi ghi n ứu ự họn nhận h t hất u in th i u i n ng ngh tá h hiết tinh s h v thu u i t suất ≥10g ẻ h dõi ộ ổn ịnh củ ngu n i u hóa cấp tốc nguyên li u HupA u i u ki n th ng lão 38 42 3.5 Nghiên cứu u trình chế v sản uất viên nang cứng chứa h ạt chất up ui ô ph ng th nghiệ 45 3.5.1 Nghiên cứu lựa chọn công thức, công ngh bào chế viên nang, lựa chọn thiết kế ng g i sản phẩm 45 3.5.1.1 Nghiên c u lựa chọn t 45 c xây dựng công th c, qui trình bào chế Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhd.vT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.Lj.dtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn C.vT.Bg.Jy.Lj.Tai lieu Luan vT.Bg.Jy.Lj van Luan an.vT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.Lj Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an vi n nang c ng quy mơ phịng thí nghiệm (3000 viên nang/mẻ) 3.5.1.2 Nâng cấp th m định quy trình sản xuất vi n nang c ng quy m 10.000 viên nang/mẻ Sản xuất vi n nang c ng tr n quy m 10.000 vi n nang/mẻ 48 3.5.1.3 Nghiên c u lựa chọn bao bì thiết kế bao bì đóng gói cấp 55 3.5.2 Th o õi đ ổn định vi n nang c ng ch a HupA điều kiện thường lão hóa cấp t c với tiêu: hình th c, hàm ng, đ r / đ hoà tan, giới hạn tạp chất 56 3.6 ựng tiêu chu n s án th nh ph 57 361 X dựng ti u huẩn sở ủ ngu n i u u 362 X dựng ti u huẩn sở ủ vi n n ng ứng 3.7 ánh giá t nh an t thực nghiệ n ộc t nh v tác Đánh giá ộc tính cấ L 50 v chuột cống th ng uống v th nh ph 57 u 59 ng h trợ cải thiện tr nhớ ánh giá ộ t nh án t ng diễn 61 61 3.7.1 Kết nghiên c u đ c tính cấp 61 3.7.1.2 Kết nghi n c u đ c t nh 61 n trường iễn Đánh giá tá dụng hỗ t ợ ải thi n t nhớ t n thự nghi 64 3.7.2.1 Kết đ nh gi t c ụng cải thiện tr nhớ, tăng cường khả học tập nhận th c thần kinh trung ương tr n chu t nhắt trắng ị g y thiếu m u n o cục àm giảm hoạt đ ng thần kinh, giảm tr nhớ 64 3.7.2.2.Đ nh gi t c ụng cải thiện trí nhớ, tăng cường khả học tập nhận th c thần kinh trung ương chu t nhắt trắng già 65 3.7.3.Nghiên cứu hế tác dụng củ 65 u KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhd.vT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.Lj.dtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn in n tế n huột 66 C.vT.Bg.Jy.Lj.Tai lieu Luan vT.Bg.Jy.Lj van Luan an.vT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.Lj Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an DANH MỤC HÌNH Trang Hình 1.1: Hình ảnh Thạch t ng cưa (Huperzia serrata) Hình 1.2: Nấm n i sinh phát tri n rễ C i xay Phong đường Hình 3.1: Cây Huperzia serrata thu thập Vườn qu c gia Hoàng Li n, Sa Pa - Lào Cai 25 Hình 3.2: Cây Huperzia serrata thu thập Lang iang – Đà Lạt (L m Đồng) 25 Hình 3.3: Sắc k đồ x c định hàm ng HupA chủng Tsp 25 m i trường MT (A) chủng LĐL 4.4 tr n m i trường MT (B) 29 Hình 3.4 Quy trình lên men Huperzin A theo mẻ quy mơ 5-10 lít 34 Hình 3.5 Quy trình lên men Huperzin A theo mẻ quy mơ 80-100 lít 34 Hình 3.6 Quy trình lên men Huperzin A theo mẻ quy mơ bình 500 lít 36 Hình 3.7: Sản ph m HupA tinh khiết thu đư c sau tinh HPLC sản ph m HupA tinh 37 Hình 3.8 Quy trình tách chiết, tinh thu nhận HupA tinh khiết từ sinh kh i nấm 38 Hình 3.9 TLC c c ph n đoạn tinh Hup rzin A thu đư c, sản ph m HupA tinh HPLC sản ph m HupA tinh thu đư c 39 Hình 3.10 Quy trình tách chiết, tinh thu nhận Hup rzin A tinh khiết từ sinh kh i nấm qui m pi ot 40 Hình 3.11 HPLC sản ph m HupA tinh thu đư c 40 Hình 3.12 Phổ HPLC mẫu HupA thời m nghiên c u: (A) Ban đầu, (B) Sau tháng bảo quản sau tháng bảo quản (C) 43 Hình 3.13 Hàm ng Huperzin A theo tháng bảo quản 44 Hình 3.14: Bi u đồ d 56 m sau 12 tháng theo dõi điều kiện bảo quản Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhd.vT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.Lj.dtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn C.vT.Bg.Jy.Lj.Tai lieu Luan vT.Bg.Jy.Lj van Luan an.vT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.Lj Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an Nhận xét: kh i ng trung bình c m nang nằm khoảng 550 ± mg/vi n (533,5 ÷ 566,5 mg/vi n) Đ đồng kh i ng: ≤ ± so với KLTB c m nang Bảng 3.22: Kết kiểm tra độ ẩm và độ rã viên Các lô Chỉ tiêu Lô 010918 Lô 020918 Lô 030918 Đ rã (phút) 6-8 6-8 6-8 Đ 1,34 1,42 1,46 m (%) Nhận xét: Đ m c m nang vi n nang c c theo tiêu chu n bán thành ph m ≤ 3,0 , đ r ≤ 30 phút e) Kết đ nh gi c ng đoạn đóng ọ, đóng h p Bảng 3.23: Kết kiểm tra cảm quan độ ẩm đợ kín lọ Lơ 010918 Chỉ tiêu 10 Cảm quan *** *** *** *** *** *** *** *** *** *** Đ kín 5/5 lọ kín 5/5 lọ kín 5/5 lọ kín 5/5 lọ kín 5/5 lọ kín 5/5 lọ kín 5/5 lọ kín 5/5 lọ kín 5/5 lọ kín 5/5 lọ kín Đ 020918 m 1,39 % Cảm quan *** *** *** *** *** *** *** *** *** *** Đ kín 5/5 lọ kín 5/5 lọ kín 5/5 lọ kín 5/5 lọ kín 5/5 lọ kín 5/5 lọ kín 5/5 lọ kín 5/5 lọ kín 5/5 lọ kín 5/5 lọ kín Đ 030918 Lọ m 1,47 % Cảm quan *** *** *** *** *** *** *** *** *** *** Đ kín 5/5 lọ kín 5/5 lọ kín 5/5 lọ kín 5/5 lọ kín 5/5 lọ kín 5/5 lọ kín 5/5 lọ kín 5/5 lọ kín 5/5 lọ kín 5/5 lọ kín Đ m 1,54 % (***) Lọ đủ 60 viên Nắp đậy kín Lọ sạch, khơng s t, v Dán nh n đúng, kh ng ị nhăn chiều nhãn Nhận xét: Bán thành ph m vi n sau đóng ọ đ k n, đ m n đạt tiêu cảm quan, Qu trình đóng h p đóng th ng đư c tiến hành th o quy trình Quy c ch đóng gói: th ng 60 h p, h p 01 lọ 60 viên Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhd.vT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.Lj.dtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn 53 C.vT.Bg.Jy.Lj.Tai lieu Luan vT.Bg.Jy.Lj van Luan an.vT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.Lj Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an Tổng s ọ đóng gói đạt 03 : 504 ọ tương đương 30.240 vi n f) Hình ảnh viên nang, lọ đựng 60 viên h p 01 lọ Viên nang Huperzine A Hộp BTP lọ đ dán nh n g) Kết ki m tra thành ph m vi n nang c ng ch a HupA sản xuất, qui mô 10.000 viên/lô Thành ph m lô ki m tra theo tiêu tiêu chu n thành ph m Kết thu đư c đư c trình bày bảng sau: Bảng 3.24: Kết kiểm tra lô thành phẩm Số lô Tên tiêu 010918 020918 TT Cảm quan Đ * * * 1,35 1,48 1,51 6-8 6-8 6-8 96,03 94,48 95,27 92,11÷103,58 93,15÷103,96 m (%) Đ rã (phút) Định ng HupA (µg/viên) 030918 Đồng hàm ng HupA (%) 93,78÷104,32 Giới hạn VSV Tổng s VKHK Đạt Đạt Đạt Tổng s nấm men nấm m c Đạt Đạt Đạt Coliforms Đạt Đạt Đạt E coli Đạt Đạt Đạt S aureus Đạt Đạt Đạt Salmonella Đạt Đạt Đạt B cereus Đạt Đạt Đạt Cl perfringens Đạt Đạt Đạt Đạt Đạt Đạt Đạt Đạt Đạt Đạt Đạt Đạt Giới hạn KLN Pb Hg Cd Chú th ch: * : Vi n nang màu vàng nâu s C m nang màu trắng, kh tơi Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhd.vT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.Lj.dtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn 54 C.vT.Bg.Jy.Lj.Tai lieu Luan vT.Bg.Jy.Lj van Luan an.vT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.Lj Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an Nhận xét: Kết ki m tra thành ph m ba lô quy mô 10000 viên/lô đạt tiêu chu n thành ph m đ x y ựng 3.5.1.3 Nghiên cứu lựa chọn bao bì thiết kế a ì ng g i cấp Sau tháng theo dõi điều kiện LHCT, kết ki m tra mẫu sử dụng lọ thủy tinh vỉ nhôm/nhôm cho thấy: Các tiêu chất ng: cảm quan, đ m, đ kín, đ r , định ng, vi sinh vật nằm giới hạn tiêu chu n dự kiến Đ m viên bao bì lọ thủy tinh vỉ nh m/nh m tăng n kh ng đ ng k Như vậy, bao bì cấp lọ thủy tinh vỉ nhôm/nhôm bảo quản t t Tuy nhiên sử dụng lọ thủy tinh đóng gói 60 viên thuận tiện, đơn giản qu trình sản xuất Do đó, ọ thủy tinh đư c lựa chọn làm bao bì đóng gói cấp cho sản ph m  Hình ảnh thiết kế vỏ h p đựng 01 lọ  Hình ảnh thiết kế nhãn lọ đựng 60 viên Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhd.vT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.Lj.dtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn 55 C.vT.Bg.Jy.Lj.Tai lieu Luan vT.Bg.Jy.Lj van Luan an.vT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.Lj Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an  Hình ảnh thiết kế nh n n tr n th ng đựng 60 h p 3.5.2 h õi ộ ổn ịnh viên nang cứng chứa up hóa cấp tốc với tiêu: hình thức, h ượng, ộ r chất  Các tiêu vật lý i u kiện thường lão ộ hoà tan, giới hạn tạp - Về cảm quan: Kh ng có thay đổi đ ng k m t cảm quan sau thời gian 12 tháng bảo quản điều kiện 30oC ± 2oC, RH = 75% ± 5% Viên nang s màu vàng nâu Viên lành l n, khơng giịn nang C m nang màu trắng, khơ, khơng có mùi m c Lọ ch a 60 viên ngun v n, khơng có dấu hiệu kh c thường - Về đ r : sau 12 th ng th o õi, đ rã vi n nang kh ng thay đổi đạt ≤ 30 phút Về đ m: Đ m sản ph m có thay đổi trình bảo quản gi trị thay đổi kh ng đ ng k , nằm giới hạn tiêu chu n, đ m ưới 3,0% 3.50 m( ) 3.00 2.50 2.00 Đ 1.50 1.00 0.50 0.00 To 3T 6T 9T 12T Thời m th o õi điều kiện ảo quản Lô 010918 Lô 020918 Lơ 030918 Limit Hình 3.14: Biểu đờ dợ ẩm sau 12 tháng theo dõi điều kiện bảo quản  Các ti u định ng - Hàm ng Huperzine A: Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhd.vT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.Lj.dtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn 56 C.vT.Bg.Jy.Lj.Tai lieu Luan vT.Bg.Jy.Lj van Luan an.vT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.Lj Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an Kết ki m tra hàm ng Huperzine A kh ng có thay đổi, hàm ng t gii hn cho phộp 90 ữ 120,0 àg/viờn Bảng 2.25: Hàm ƣợng Huperzine A đánh giá theo dõi ĐKBQ Thời điểm - Hàm ƣợng Huperzine A (µg/viên) 010918 020918 030918 To 96,03 94,48 95,27 T3 96,37 95,62 94,78 T6 94,84 94,39 95,01 T9 95,43 93,52 94,59 T12 94,26 94,13 93,46 Đồng hàm ng Kết ki m tra đồng hàm ng Huperzine A sau 12 tháng theo dõi ba mẫu nằm giới hạn cho phép Bảng 3.26: Đồng đều hàm ƣợng Huperzine A mẫu theo dõi ĐKBQ Thời điểm Đồng đều hàm ƣợng Huperzine A (%) 010918 020918 030918 To 93,78÷104,32 92,11÷103,58 93,15÷103,96 T6 95,68÷104,08 93,58÷103,81 94,05÷103,36 T12 94,39÷103,76 95,01÷104,31 94,16÷104,82  Các tiêu vi sinh kim loại n ng Sau 12 tháng theo dõi, sản ph m đạt ti u đ nhiễm vi sinh kim loại n ng Như vậy, 03 lô viên nang Huperzine A sản xuất tr n quy m 10.000 vi n/ đư c theo dõi đ ổn định điều kiện lão hóa cấp t c tủ vi khí hậu, nhiệt đ 40oC ± 2oC, RH 75 ± điều kiện bảo quản nhiệt đ 30oC ± 2oC, RH = 75% ± 5% Các liệu nghiên c u đ ổn định c c điều kiện cho thấy, sản ph m sau tháng thử nghiệm điều kiện lão hóa cấp t c 12 tháng điều kiện bảo quản đạt tiêu theo tiêu chu n thành ph m đ x y ựng Với điều kiện th o õi tr n, sản ph m đảm bảo chất ng trình vận chuy n với c c điều kiện khắc nghiệt Sản ph m ổn định thời gian 12 tháng theo dõi điều kiện bảo quản nhiệt đ o 30 C ± 2oC, RH = 75 ± n n chúng t i đưa hạn dùng sản ph m 24 tháng 3.6 dựng tiêu chuẩn sở bán thành phẩm và thành phẩm 3.6 ựng tiêu chu n s ngu ên iệu up * Công thức phân tử, trọng ƣợng phân tử Bằng phương ph p quang phổ kh i (ESI-MS) - phân tích phổ c ng hưởng từ hạt nhân - NMR (Phổ 1H-NMR), tiến hành đo c c phổ mẫu nguy n iệu HupA ao gồm: Đo phổ 1H, phổ 13C (t >2h), phổ DEPT (t>2h), phổ COSY (t >2h), phổ Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhd.vT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.Lj.dtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn 57 C.vT.Bg.Jy.Lj.Tai lieu Luan vT.Bg.Jy.Lj van Luan an.vT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.Lj Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an HMBC (t >2h), phổ HSQC (t>2h), phổ NOESY (t >2h), HPLC, phổ MS So sánh liệu đo c c phổ, đ c iệt phổ 1H-NMR HPLC, MS, UV-VIS mẫu HupA nghi n c u cho thấy trùng khớp với liệu phổ hoạt chất Hup rzin A đ đư c c ng (Liu t a , 1986, Can J Ch m, 64, 837-839) Kết cho thấy: - C ng th c ph n tử chất HupA nghi n c u à: C15H18N2O - Trọng ng ph n tử: 243,2  Tính chất: Bằng cảm quanvà kế thừa c c kết N i ung (t ch chiết, tinh thu nhận HupA ằng c oroform, m thano , thano ) cho thấy: - B t HupA nghi n c u thu đư c t tinh th màu trắng, mịn - Hòa 100 mg HupA 1m c oroform/ m thano / thano / nước cất v tr ng Kết HupA tan hoàn toàn c oroform, m thano , thano tạo c c ung m i tinh khiết, su t Tuy nhi n, hòa nước cất v tr ng HupA nhiều hạt tinh th , kh ng tan hết * Nhiệt đợ nóng chảy: Thử th o DĐVN V, phụ lục 6.7 Nhiệt đ nóng chảy Huperzine A 227,7oC  Độ ẩm: Thử th o DĐVN V, phụ lục 9.6 Đ m HupA đạt 4,3%  Định tính định ƣợng: Phương ph p sắc ký lỏng hiệu cao - Thử th o DĐVN V - Phụ luc 5.3  Hàm ng HupA mẫu thử đạt 93, 4% * Hoạt tính sinh học: khả c chế enzym AChE theo Atta-ur-Rahman et al (2001) Tính họat tính kìm hãm AChE mẫu thử th o c ng th c sau: Ađ i ch ng – Athử I% = x 100 (%) Ađ i ch ng Trong đó:Athử Ađ i ch ng lần t đ hấp thụ mẫu thử mẫu đ i ch ng Vẽ đồ thị bi u diễn m i quan hệ hoạt tính kìm hãm AChE logarit nồng đ chất ki m tra mẫu thử phần mềm Exc X c định khoảng tuyến tính phương trình i u diễn m i quan hệ tuyến tính hoạt tính kìm hãm logarit nồng đ Huperzine A Từ phương trình suy đư c nồng đ IC50 Từ IC50 => = 0,4995 => IC50 = 3,16 µg/ml  Tờn dƣ dung mơi: Thử th o DĐVN V - Phụ luc 10.14 Phương ph p sắc ký khí Hàm ng tồn ung m i M thano , Ethano , Ac ton , Ety ac tat 1.043, 1.174, 1.006 ppm ần t 0.945,  Tồn dƣ kim oại nặng: Phương ph p phổ hấp thụ nguy n tử AAS Acid nitric 65%: Dùng loại suprapur, 65%-70% HNO3 Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhd.vT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.Lj.dtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn 58 C.vT.Bg.Jy.Lj.Tai lieu Luan vT.Bg.Jy.Lj van Luan an.vT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.Lj Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an Bảng 3.27: Hàm ƣợng kim loại tồn dƣ Kim loại Hàm ƣợng (ppm) Al 7,3 As 0,02 Cd 0,10 Hg 0,03 Pb 0,76 Độ nhiễm khuẩn: Tiến hành thử th o DĐVN V, phụ lục 13.6 - Thử giới hạn nhiễm khu n , phương ph p đĩa thạch Kết không phát đư c chủng vi sinh ki m định E coli, Samonella sp., S aureus, P aeruginosatrong 1,0g mẫu thử 3.6.2 ựng tiêu chu n s án th nh ph chứa HupA a) Tiêu chuẩn chất ợng nguyên vật li u b) v th nh ph viên nang cứng Bảng 3.28 Tiêu chuẩn chất ƣợng nguyên vật liệu sản xuất viên nang STT Tên nguyên vật liệu Tiêu chuẩn áp dụng Huperzine A Tiêu chu n sở Theo N i dung 6.1 Lactose monohydrat Dư c n Việt Nam V Polyvinylpyrrolidone K30 Dư c n Mỹ 40 Ethanol 96% Dư c n Việt Nam V Microcrystall cellulose PH102 Dư c n Mỹ 40 Natri crosscarmelose Dư c n Mỹ 40 Magnesi stearat Dư c n Việt Nam V Silicon dioxyd Dư c n Mỹ 40 Vỏ nang s Tiêu chu n nhà sản xuất c) Tiêu chuẩn chất ợng nguyên li u bao gói Bảng 3.29 Tiêu chuẩn chất ƣợng nguyên liệu bao gói TT Tên nguyên liệu Tiêu chuẩn áp dụng Lọ nắp lọ, dung tích 120ml Tiêu chu n sở Nhãn lọ h p Tiêu chu n sở Thùng carton Tiêu chu n sở Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhd.vT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.Lj.dtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn 59 C.vT.Bg.Jy.Lj.Tai lieu Luan vT.Bg.Jy.Lj van Luan an.vT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.Lj Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an d) Tiêu chuẩn chất ợng bán thành phẩm Bảng 3.30: Tiêu chuẩn kiểm tra bán thành phẩm Tên BTP Tiêu chu n Hình th c: C m màu trắng, kh , tơi Mất kh i ng o àm kh : ≤ 3,0 Tỷ trọng bi u kiến: 0,5 – 0,7g/ml Phân b k ch thước ti u phân: Trên 90% từ 355-800µm Hàm ng Huperzine A: 495,0 ữ 605 àg/g Hỡnh th c: C m màu trắng, kh , tơi Mất kh i ng o àm kh : ≤ 3,0 Tỷ trọng bi u kiến: 0,5 – 0,7g/ml Phân b k ch thước ti u phân: Trên 90% từ 355-800 µm Hình th c: C m màu trắng, khô, tơi Mất kh i ng o àm kh : ≤ 3,0 Tỷ trọng bi u kiến: 0,5 – 0,7g/ml Hàm ng ng Huperzine A: 163,64 ữ 200,00àg/g ng u hàm ng Huperzine A: 85,0-115,0% Ki m tra cảm quan: Viên nang s màu vàng nâu, c m nang màu trắng, kh , tơi KLTB c m nang: 550 ± 3% mg/viên (533,5 ÷ 566,5 mg/viên) Đ đồng kh i ng: ± 5% so với KLTB c m nang Đ r ≤ 30 phút Mất kh i ng sấy khô c m nang: ≤ 3,0 Lọ đủ 60 viên Nắp đậy kín Lọ sạch, khơng s t, v D n nh n đúng, kh ng bị nhăn n chiều nhãn Đ kín: 5/5 lọ kín C m HupA C m lactose C m tr n ngoài- Viên nang Lọ - e) Tiêu chuẩn chất ợng thành phẩm Bảng 3.31: Tiêu chuẩn thành phẩm STT Tên tiêu Cảm quan Đ m Đơn vị % Mức công bố Viên nang s màu vàng nâu C m nang màu trắng, kh tơi ≤ 3,0 Đ rã Định ng Huperzine A Đồng hàm ng HupA Giới hạn nhiễm vi sinh vật Tổng s vi khu n hiếu khí Tổng s nấm men nấm m c Coliforms E.coli phút µg/viên % ≤ 30 90,0-120,0 ± 15% so với kết trung bình viên CFU/g CFU/g MNP/g CFU/g ≤ 104 ≤ 102 ≤ 10 Không phát S.aureus Cl Perfringens MNP/g MNP/g ≤ ≤ 10 CFU/25g Không phát Salmonella Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhd.vT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.Lj.dtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn 60 C.vT.Bg.Jy.Lj.Tai lieu Luan vT.Bg.Jy.Lj van Luan an.vT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.Lj Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an Đơn vị Mức công bố CFU/g ≤ 10 Cd (Cadimi) mg/kg ≤ 1,0 Pb (Chì) mg/kg ≤ 3,0 Hg (Thủy ngân) mg/kg ≤ 0,1 STT Tên tiêu B.cereus Giới hạn nhiễm kim loại n ng 3.7 Đánh giá tính an toàn (đợc tính) tác dụng hỗ trợ cải thiện trí nhớ thực nghiệm 3.7.1 ánh giá ộc tính cấp L 50 v ánh giá ộc t nh án trường diễn chuột cống th ường uống Chu t nhắt trắng đư c u ng thu c thử với c c m c iều kh c từ iều thấp 1500 µg/kg th trọng đến iều cao 3000 µg/kg th trọng, 0,2mL/10g, ần 24 Chu t đ u ng đến iều 3000 µg/kg th trọng iều t i đa có th ng đư c ằng đường u ng đ đ nh gi đ c t nh cấp thu c thử kh ng có chu t chết, kh ng xuất triệu ch ng ất thường 72 sau u ng thu c ần cu i su t ngày sau u ng thu c Như vậy, kh ng x c định đư cLD50 vi n nang Hup rzin A th o đường u ng chu t nhắt trắng Với m c liều cao có th cho chu t u ng 24h 3000 µg/kg th trọng khơng xuất đ c tính cấp Liều ự kiến có t c ụng tr n người µg/kg, quy đổi iều tr n chu t nhắt 96 µg/kg Chu t đ u ng đến iều 3000 µg/kg, gấp 31,25 ần iều ự kiến có t c ụng mà chu t kh ng có chết, kh ng thấy có i u ất thường Kết ch ng tỏ vi n nang Hup rzin A có t nh an toàn với khoảng an toàn r ng nghi n c u đ nh gi đ c t nh cấp tr n đường u ng chu t nhắt trắng Bảng 3.32 Đ c t nh cấp đường u ng vi n nang Hup rzin A tr n chu t nhắt trắng Th t ch cho u ng S chu t s ng/chết sau 72 S chu t s ng/chết sau ngày 1500 0,2 mL/10g x ần 10/0 10/0 10 1800 0,2 mL/10g x ần 10/0 10/0 Lô 10 2100 0,2 mL/10g x ần 10/0 10/0 Lô 10 2400 0,2 mL/10g x ần 10/0 10/0 Lô 10 2700 0,2 mL/10g x ần 10/0 10/0 Lô 10 3000 0,2 mL/10g x ần 10/0 10/0 Lô chu t S chu t th nghiệm Liều dùng(µg/kg thể trọng) Lô 10 Lô 3.7 .2 ết uả nghiên cứu ộc t nh án trường iễn ình trạng chung: Chu t c ng trắng đư c th o õi hàng ngày tình trạng chung gồm hoạt đ ng, ăn u ng, tình trạng ng, a, ni m mạc, chất tiết C c chu t ch ng c c ng viên Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhd.vT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.Lj.dtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn 61 C.vT.Bg.Jy.Lj.Tai lieu Luan vT.Bg.Jy.Lj van Luan an.vT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.Lj Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an nang Huperzine A hoạt đ ng ình thường Chu t ăn u ng ình thường, ph n thành khu n ự tha ổi thể trọng chuột: Tại thời m an đầu, th trọng chu t c c ng mư t, a ni m mạc ình thường, tương đương ( p > 0,05) - So s nh c c thời m sau so với trước thấy th trọng chu t a nghi n c u tăng, thay đổi có ý nghĩa th ng k với p< 0,01 - Tại thời m sau sau tuần, tuần 12 tuầnu ng thu c, th trọng chu t lơ cho u ng Huperzine A khơng có khác biệt so với lô ch ng sinh lý(p> 0,05) Như vi n nang Hup rzin A kh ng ảnh hưởng đến phát tri n th trọng chu t Ảnh hư ng viên nang up r in ối với iện ti chuột: So s nh c c với c ng m t thời m, tần s i n đ điện tim chu t kh ng có thay đổi có ý nghĩa th ng k (p> 0,05) - So sánh c c thời m th nghiệm, tần s i n đ điện tim chu t kh ng có thay đổi ý nghĩa th ng k (p> 0,05) - Kh ng có sóng ất thường tr n điện tim c c chu t c c thời m nghi n c u Như vi n nang Hup rzin A với c c m c iều thời gian sử ụng nghi n c u chưa thấy g y c c thay đổi tr n điện tim chu t Ảnh hư ng viên nang up r in ối với ột số tiêu hu ết học chuột: - So s nh c c với c ng m t thời m, s ng hồng cầu hàm ng huyết sắc t m u chu t thay đổi kh ng có ý nghĩa th ng k (p> 0,05) - So sánh c c thời m th nghiệm, s ng hồng cầu hàm ng huyết sắc t m u chu t thay đổi kh ng có ý nghĩa th ng k (p> 0,05) Như vi n nang Hup rzin A với c c m c iều thời gian sử ụng nghi n c u chưa thấy g y c c thay đổi tr n c c ti u s ng hồng cầu hàm ng huyết sắc t m u chu t - So s nh c c với c ng m t thời m, h matocrit th t ch trung ình hồng cầu m u chu t thay đổi kh ng có ý nghĩa th ng k (p> 0,05) - So sánh c c thời m th nghiệm, h matocrit th t ch trung ình hồng cầu m u chu t thay đổi kh ng có ý nghĩa th ng k (p> 0,05) Như vi n nang Hup rzin A với c c m c iều thời gian sử ụng nghi n c u chưa thấy g y c c thay đổi tr n c c ti u h matocrit th t ch trung ình hồng cầu m u chu t - So s nh c c với c ng m t thời m, s ng ạch cầu s ng ti u cầu m u chu t thay đổi kh ng có ý nghĩa th ng k (p> 0,05) - So sánh c c thời m th nghiệm, s ng ạch cầu s ng ti u cầu m u chu t thay đổi kh ng có ý nghĩa th ng k (p> 0,05) Như vi n nang Hup rzin A với c c m c iều thời gian sử ụng nghi n c u chưa thấy g y c c thay đổi tr n c c ti u s ng ạch cầu s ng ti u cầu m u chu t Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhd.vT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.Lj.dtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn 62 C.vT.Bg.Jy.Lj.Tai lieu Luan vT.Bg.Jy.Lj van Luan an.vT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.Lj Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an * ánh giá ức ộ hủ h ại tế gan ùng viên nang up r in i ng Bảng 3.33 Ảnh hưởng vi n nang Hup rzin A đ i với hoạt đ AST ALT (n = Thời điểm N Trƣớc thí nghiệm (a) Sau tuần (b) Sau tuần (c) Sau 12 tuần (d) ptrong lơ Trƣớc thí nghiệm (a) Sau tuần (b) Sau tuần (c) Sau 12 tuần (d) ptrong lô 10, x ± SD) L ch ng (1) Lô trị (2) Lô trị (3) Hoạt độ AST (UI/ ) 98,29 ± 28,22 99,81 ± 17,74 96,31 ± 20,58 97,39 ± 28,40 95,48 ± 22,02 98,32 ± 14,44 95,45 ± 21,14 99,45 ± 17,26 98,04 ± 19,66 96,89 ± 16,95 99,05 ± 13,16 97,77 ± 15,58 pb,c,d-a > 0,05;pc,d-b > 0,05;pd-c > 0,05 Hoạt độ ALT (UI/ ) 75,67 ± 21,65 85,29 ± 22,73 71,36 ± 17,31 79,10 ± 17,93 81,86 ± 20,20 83,30 ± 14,07 74,62 ± 20,88 77,59 ± 15,22 71,21 ± 14,91 71,67 ± 18,72 67,63 ± 13,62 85,75 ± 14,69 pb,c,d-a > 0,05;pc,d-b > 0,05;pd-c> 0,05 pgiữa lô p2-1> 0,05 p3-2> 0,05 p3-1> 0,05 - p2-1> 0,05 p3-2> 0,05 p3-1> 0,05 - - So s nh c c với c ng m t thời m, hoạt đ c c nzym AST ALT m u chu t thay đổi kh ng có ý nghĩa th ng k (p> 0,05) - So sánh c c thời m th nghiệm, hoạt đ c c nzym AST ALT máu chu t thay đổi kh ng có ý nghĩa th ng k (p> 0,05) Như vi n nang Hup rzin A với c c m c iều thời gian sử ụng nghi n c u kh ng àm thay đổi hoạt đ c c nzym AST ALT có ý nghĩa th ng k , cho thấy vi n nang Hup rzin A kh ng g y hủy hoại tế gan tr n chu t nghi n c u * ánh giá ảnh hư ng ên chức gan ùng viên nang up r in i ng Bảng 3.34 Ảnh hưởng viên nang Huperzine A n c c s a umin bilirubin toàn phần m u (n = 10, x ± SD) Thời điểm N L ch ng (1) Lô trị (2) Lô trị (3) pgiữa lô A bumin hu ết tƣơng (g/ ) Trƣớc thí nghiệm (a) 21,61 ± 3,36 22,14 ± 4,52 22,18 ± 2,84 Sau tuần (b) 22,16 ± 2,66 21,94 ± 3,26 22,01 ± 2,82 Sau tuần (c) 21,80 ± 2,20 21,51 ± 5,08 20,91 ± 2,66 Sau 12 tuần (d) 22,42 ± 2,61 21,37 ± 5,00 21,49 ± 2,97 pb,c,d-a > 0,05;pc,d-b > 0,05;pd-c> 0,05 ptrong lô p2-1> 0,05 p3-2> 0,05 p3-1> 0,05 - Bi irubin toàn phần (µmo /L) Trƣớc thí nghiệm (a) 50,60 ± 11,50 51,46 ± 9,98 50,42 ± 15,86 Sau tuần (b) 52,35 ± 17,40 52,48 ± 17,39 53,09 ± 7,49 Sau tuần (c) 51,27 ± 13,62 53,66 ± 10,87 53,15 ± 15,86 Sau 12 tuần (d) 55,21 ± 21,44 52,73 ± 12,89 53,39 ± 10,80 ptrong lô pb,c,d-a > 0,05;pc,d-b > 0,05;pd-c> 0,05 p2-1> 0,05 p3-2> 0,05 p3-1> 0,05 - Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhd.vT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.Lj.dtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn 63 C.vT.Bg.Jy.Lj.Tai lieu Luan vT.Bg.Jy.Lj van Luan an.vT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.Lj Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an - So s nh c c với c ng m t thời m, c c s a umin bilirubin toàn phần m u chu t thay đổi kh ng có ý nghĩa th ng k (p> 0,05) - So sánh c c thời m th nghiệm, c c s a umin bilirubin toàn phần m u chu t thay đổi kh ng có ý nghĩa th ng k (p> 0,05) Như vi n nang Hup rzin A với c c m c iều thời gian sử ụng nghi n c u kh ng àm thay đổi c c s a umin bilirubin toàn phần m u chu t nghi n c u * ánh giá ảnh hư ng ên ch st r t n phần áu ùng viên nang up r in A dài ngày - So s nh c c với c ng m t thời m, c c s Cho st ro toàn phần m u chu t thay đổi kh ng có ý nghĩa th ng k (p> 0,05) - So sánh c c thời m th nghiệm, c c s Cho st ro toàn phần m u chu t thay đổi kh ng có ý nghĩa th ng k (p> 0,05) Như vi n nang Hup rzin A với c c m c iều thời gian sử ụng nghi n c u kh ng àm thay đổi c c s Cho st ro toàn phần m u chu tnghi n c u * ánh giá ảnh hư ng ên chức thận ùng viên nang up r in dài ngày - So s nh c c với c ng m t thời m, hàm ng cr atinin m u chu t thay đổi kh ng có ý nghĩa th ng k (p> 0,05) - So sánh c c thời m th nghiệm, hàm ng cr atinin máu chu t thay đổi kh ng có ý nghĩa th ng k (p> 0,05) Như vi n nang Hup rzin A với c c m c iều thời gian sử ụng nghi n c u kh ng àm thay đổi hàm ng cr atinin m u chu t nghi n c u * Kết uả nh họ t ng ủ huột th nghi Quan s t đại th ằng mắt thường ưới k nh úp có đ phóng đại 25 ần thấy: màu sắc, hình th i gan, ch thận hai ng viên nang Huperzine A kh ng kh c so với ch ng C c ti u ản m ệnh học đọc B môn khoa Giải phẫu bệnh – Pháp y, bệnh viện Quân y 103 Kết nghi n c u m ệnh học gan, ch, thận chu t cho thấy vi n nang Hup rzin A ng đường u ng với iều 0,28g/kg/24h iều 0,84g/kg/24h i n tục 90 ngày, kh ng g y tổn thương tr n gan, thận, ch chu t 3.7.2 Đánh giá tác dụng hỗ trợ cải thiện trí nhớ thực nghiệm 3.7.2 ết uả ánh giá tác ng cải thiện tr nhớ, tăng cường khả học tập v nhận thức thần kinh trung ương chuột nhắt trắng ị g thiếu áu n c c ộ giả h ạt ộng thần kinh, giả tr nhớ Huperzine A liều 96µg/kg/ngày 192µg/kg/ngày có tác dụng cải thiện trí nhớ, àm tăng cường khả học tập nhận th c thần kinh trung ương tr n chu t nhắt trắng bị gây thiếu máu não cục b tương đương với tacrin 2,5 mg/kg/ngày Cụ th : Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhd.vT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.Lj.dtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn 64 C.vT.Bg.Jy.Lj.Tai lieu Luan vT.Bg.Jy.Lj van Luan an.vT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.Lj Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an - Trong thử nghiệm bảng đục lỗ (ho oar ) àm tăng hoạt đ ng thần kinh trung ương th qua s àm tăng s lần thò đầu xu ng lỗ s lần di chuy n vị trí (p < 0,05 so với lơ mơ hình) - Trên mơ hình m cung nước Morris àm tăng khả học tập ghi nhớ th qua s rút ngắn thời gian chu t tìm thấy ch n đế tập có bến đỗ tăng thời gian v ng có phao tập khơng có bến đỗ (p < 0,05 so với lơ mơ hình) 3.7.2.2 ánh giá tác d ng cải thiện trí nhớ, tăng cường khả học tập nhận thức thần kinh trung ươngtrên chuột nhắt trắng già Huperzine A liều 96µg/kg/ngày 192µg/kg/ngày có tác dụng cải thiện trí nhớ, tăng cường khả học tập nhận th c thần kinh trung ương tr n chu t nhắt trắng già tưong đương với tacrin 2,5 mg/kg/ngày Cụ th : - Trong thử nghiệm đánh giá tác dụng phản xạ có điều kiện tìm th c ăn mê l àm tăng khả học tập ghi nhớ thông qua s àm tăng t c đ hình thành phản xạ t c đ đ phản xạ bền vững, rút ngắn s lần không củng c đ dập tắt phản xạ(p < 0,05 so với lơ mơ hình) - Trong thử nghiệm tránh né chủ đ ng (activ acvoi ant) àm tăng khả học tập ghi nhớ thông qua s àm tăng s thử nghiệm có đ p ng tránh s c (p < 0,05 so với lô mơ hình) 3.7.3 ết uả nghiên cứu chế tác ng up r in ên tế n chuột + V khả ức chế enzym acetylcholinesterase (AChE) ex vivo Hoạt tính enzym acetylcholinesterase vỏ não hồi hải mã não chu t gây thiếu máu não cục b ( m hình) tăng cao có ý nghĩa th ng kê so với lô ch ng (p