(Luận văn) phân lập và xác định đặc tính enzyme n acyl l homoserine lactone (ahl) lactonase của vi khuẩn nội sinh sử dụng trong phòng trừ bệnh thối nhũn củ khoai tây

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT *** NGUYỄN THỊ THU HÀ lu an n va p ie gh tn to PHÂN LẬP VÀ XÁC ĐỊNH ĐẶC TÍNH ENZYM N-ACYL-L-HOMOSERINE LACTONE (AHL) LACTONASE CỦA VI KHUẨN NỘI SINH SỬ DỤNG TRONG PHÒNG TRỪ BỆNH THỐI NHŨN CỦ KHOAI TÂY d oa nl w u nf va an lu ll LUẬN VĂN THẠC SỸ SINH HỌC oi m z at nh z m co l gm @ an Lu HÀ NỘI - 2015 n va ac th si BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT *** lu an n va p ie gh tn to PHÂN LẬP VÀ XÁC ĐỊNH ĐẶC TÍNH ENZYM N-ACYL-L-HOMOSERINE LACTONE (AHL) LACTONASE CỦA VI KHUẨN NỘI SINH SỬ DỤNG TRONG PHÒNG TRỪ BỆNH THỐI NHŨN CỦ KHOAI TÂY oa nl w Chuyên ngành: Vi sinh vật học d Mã số: 60420103 va an lu ll u nf LUẬN VĂN THẠC SỸ SINH HỌC oi m z at nh z NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC @ m co l gm TS Hoàng Hoa Long n va ac th an Lu HÀ NỘI - 2015 si MỞ ĐẦU Cây khoai tây (Solanum tuberosum L), thuộc họ Cà (Solanaceae) lồi nơng nghiệp ngắn ngày, trồng lấy củ chứa tinh bột Khoai tây có nguồn gốc vùng cao thuộc dãy núi Andes, Nam Mỹ, người Pháp đưa vào Việt Nam từ năm 1890 Có thời kỳ khoai tây xem lương thực có tầm quan trọng thứ ba sau lúa ngơ Khoai tây có giá trị dinh dưỡng cao khoai tây có chứa vitamin, khống chất, caronoids phenol tự nhiên Khoai tây không lương thực mà lu dược phẩm Một nhà khoa học Viện Thực phẩm Anh phát an khoai tây chứa hợp chất sinh học cucoamin có tác dụng làm giảm huyết áp va n ăn thường xuyên Trong nghiên cứu khác gần đây, GS Venket Rao, Khoa gh tn to Dinh dưỡng Đại học Y Toronto Canada phát thấy khoai tây có nhiều ie chất chống oxy hóa Nó có khả ngăn ngừa q trình lão hóa, hạn chế phát p triển ung thư số bệnh khác nl w Theo thông tin Cục Trồng trọt, Bộ Nông nghiệp Phát triển Nông d oa thơn, Việt Nam quốc gia có khả phát triển mạnh khoai tây, nhiều an lu đồng Bắc Bộ, miền núi phía Bắc, Bắc Trung Bộ Tây Nguyên, với va diện tích ước tính 200.000 Tuy nhiên, diện tích trồng khoai tây ll u nf đạt 30.000-35.000 ha, với suất 10-11 tấn/ha Một oi m nguyên nhân dẫn đến giảm suất diện tích trồng khoai tây tình z at nh trạng gây hại sâu bệnh, đặc biệt bệnh thối nhũn vi khuẩn Erwinia gây ra, phổ biến loài Erwinia carotovora subsp carotovora (Ecc) z Bệnh gây chủ yếu lồi trồng có giá trị kinh tế cao thuộc họ cà, @ gm họ thập tự, họ bầu bí, họ hành, số lồi hoa lan… Bệnh gây hại cho từ m co l cịn trồng ngồi đồng ruộng thu hoạch bảo quản kho Đặc biệt điều kiện thời tiết nóng ẩm mưa nhiều bệnh trở an Lu nên trầm trọng Vi khuẩn Ecc sử dụng Quorum Sensing (QS) n va ac th si chế trao đổi thông tin tế bào phụ thuộc mật độ quần thể để kiểm sốt gen liên quan đến tính độc hoạt động tế bào vi khuẩn Trong chế này, N-acyl-L-homoserine lactones (AHLs) đóng vai trị chất tự cảm ứng (autoinducer) phân tử tín hiệu tổng hợp tiết suốt trình phát triển vi khuẩn Khi nồng độ phân tử AHLs tăng lên với phát triển quần thể vi khuẩn đạt đến ngưỡng định (quorum level), AHLs gây hiệu ứng kiểu hình thơng qua việc điều hịa biểu gen đích, mà vi khuẩn gây bệnh Ecc gen quy định tính độc chủ lu an Hiện nay, biện pháp phòng trừ bệnh chủ yếu dựa vào phương pháp va n truyền thống sử dụng thuốc trừ sâu hóa học Tuy nhiên, biện pháp tn to không mang lại hiệu cao, đặc biệt việc sử dụng thuốc trừ sâu hóa ie gh học gây ảnh hưởng nghiêm trọng đến chất lượng nông sản mơi p trường sống người Do biện pháp phòng trừ sinh học sử dụng nl w vi sinh vật đối kháng tự nhiên ngày đặc biệt quan tâm Nhiều d oa nghiên cứu tự nhiên tồn nhóm vi khuẩn cư trú bên an lu mơ chủ không gây triệu chứng bệnh cho gọi vi va khuẩn nội sinh (bacterial endophyte) Trong số chúng, có vi khuẩn có u nf khả phân hủy AHLs qua chế Quorum Quenching (QQ), hoạt ll động xảy tự nhiên có tác dụng chặn đứng bước quan trọng oi m z at nh hệ thống QS hình thành, tích lũy tiếp nhận phân tử tín hiệu Dựa vào cấu trúc phân tử AHLs, nhà khoa học xác định nhóm phân hủy AHLs: AHL-lactonase, AHL-acylase AHL- z enzyme @ gm oxidoreductase Cho đến nay, enzyme AHL-lactonase nghiên cứu nhiều m co l Enzyme phát lần từ chủng vi khuẩn Bacillus sp 240B có khả bất hoạt phân tử AHL Gen mã hóa enzyme an Lu chuyển vào chủng vi khuẩn gây bệnh E carotovora SCG1 làm giảm đáng n va ac th si kể giải phóng AHL, giảm hoạt động enzyme pectolytic ngoại bào giảm độc tính khoai tây, cà, cải bắp, cà rốt,… Kể từ giới, nhiều vi khuẩn có hoạt tính AHL-lactonase miêu tả Bacillus thuringiensis subsp morisoni, Arthrobacter sp., Microbacterium testaceum Tuy nhiên, Việt Nam chưa có nghiên cứu chế gây bệnh vi khuẩn thối nhũn sử dụng chủng vi khuẩn nội sinh (VKNS) đối kháng để phân hủy AHLs vi khuẩn gây bệnh phịng trừ bệnh thối nhũn Do vậy, tơi tiến hành chọn nghiên cứu đề tài “Phân lập xác định đặc tính lu enzyme N-acyl-L-homoserine lactone (AHL) lactonase vi khuẩn nội an sinh sử dụng phòng trừ bệnh thối nhũn củ khoai tây” với hy vọng va n hướng nghiên cứu góp phần đặt viên gạch để thiết lập gh tn to biện pháp phòng trừ hiệu bệnh thối nhũn khoai tây vi khuẩn Ecc ie gây Việt Nam p Mục đích đề tài oa nl w Xác định hoạt tính enzyme phân hủy N-acyl-L- homoserine lactones (AHLs), AHL lactonase chủng vi khuẩn nội sinh d Yêu cầu đề tài u nf va an lu sử dụng phòng trừ bệnh thối nhũn củ khoai tây - Phân lập xác định khả phân hủy AHLs vi khuẩn nội sinh từ ll oi m cà dại enzyme AHL lactonase z at nh - Thử nghiệm ảnh hưởng thời gian ni cấy VKNS đến hoạt tính z - Thử nghiệm loại môi trường nuôi cấy VKNS ảnh hưởng đến hoạt gm @ tính enzyme AHL lactonase l hủy loại AHLs tổng hợp C6, C8 C10 m co - Xác định hoạt tính enzyme AHL lactonase chủng VKNS phân an Lu n va ac th si - Thử nghiệm hiệu phòng trừ bệnh thối nhũn củ khoai tây chủng vi khuẩn nội sinh có hoạt tính enzyme AHL lactonase điều kiện phịng thí nghiệm Ý nghĩa đề tài Ý nghĩa khoa học - Thực đề tài giúp tơi có thêm kinh nghiệm, kiến thức kỹ thuật phân lập, xác định khả phân hủy, xác định hoạt tính enzyme phân hủy AHLs từ vi khuẩn nội sinh, đối tượng quan tâm, ngồi cịn lu cung cấp thêm hiểu biết kỹ thuật khác mà công nghệ sinh học an đại áp dụng va n - Kết nghiên cứu để tài cung cấp vật liệu khởi đầu cho việc to lược phòng trừ bệnh thối nhũn khoai tây an toàn bền vững sau ie gh tn nghiên cứu enzyme phân hủy AHLs tiền đề phát triển chiến p Ý nghĩa thực tiễn nl w Ngoài ý nghĩa khoa học, vấn đề nghiên cứu đề tài cịn có ý d oa nghĩa thực tiễn Các chủng vi khuẩn có ích mang enzyme phân hủy an lu AHLs sử dụng để ức chế phát triển vi khuẩn gây bệnh thối nhũn u nf va nhiều lồi trồng có giá trị chuyển gen mã hóa enzyme vào trồng giúp trồng chống chịu với bệnh hại ll oi m z at nh z m co l gm @ an Lu n va ac th si Chương TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tổng quan khoai tây 1.1.1 Nguồn gốc địa lý phân bố khoai tây Khoai tây có tên khoa học Solanum tuberosum, thuộc họ Cà (Solanaceae) Đây lồi nơng nghiệp ngắn ngày, trồng lấy củ chứa tinh bột Cây khoai tây có nguồn gốc vùng cao thuộc dãy núi Andes, Nam Mỹ du nhập vào Tây Ban Nha vào khoảng năm 1570 Anh Quốc vào năm 1590 Sau đó, lan truyền khắp châu Âu châu Á lu an (Hawkes, 1994) n va Sau nhiều kỷ chọn lọc nhân giống, có tn to nghìn lồi khoai tây khác Hơn 99% loài khoai tây trồng gh tồn cầu có nguồn gốc từ nhiều giống khác vùng đất thấp p ie Trung-Nam Chile, giống di dời từ cao nguyên Andes w Trên giới, khoai tây coi lương thực có tầm quan oa nl trọng đứng hàng thứ tư sau lúa mì, lúa nước ngô (Steveson cs., 2001) d Năm 1890, người Pháp Giám đốc Vườn bách thảo Hà Nội đem lu va an hạt khoai tây trồng thử nước ta Điều kiện khí hậu nhiệt đới gió mùa, mùa u nf đơng có nhiệt độ trung bình 15 – 250C, thuận lợi cho khoai tây sinh trưởng ll phát triển Vào năm 1980, Việt Nam trở thành nước sản xuất khoai tây lớn m oi Đông Nam Á với 100.000 diện tích trồng (Batt., 2002) Khoai tây z at nh trở thành lương thực có tầm quan trọng thứ ba sau lúa ngô Việt Nam z Tuy nhiên, theo thống kê Tổ chức Nông lương Liên hợp quốc (FAO), gm @ năm gần diện tích trồng khoai tây dao động khoảng l 35.000 - 40.000 (Bảng 1.1) Trong 90% diện tích tập trung tỉnh m co thuộc đồng Bắc Bộ, số miền núi phía Bắc Trung Bộ, 0,5% an Lu diện tích cịn lại trồng Đà Lạt (Lâm Đồng) (Phạm Xuân Tùng, 2001) n va ac th si Bảng 1.1: Tình hình sản xuất khoai tây Việt Nam giai đoạn 2005-2011 Năm Diện tích (ha) lu an 2005 2006 37.613 11,1 419.161 2007 38.450 11,4 436.710 2008 41.160 11,8 486.184 2009 37.544 11,7 442.791 2010 37.100 12,0 446.200 2011 40.046 11,2 448.710 n va Sản lượng (tấn) 35.000 Năng suất (Tấn/ha) 10,6 370.000 tn to (Nguồn: FAO, 2012) gh Năng suất khoai tây trước thường đạt tấn/ha, cao 18-20 p ie tấn/ha Từ năm 1981 đến nay, suất bình quân đạt gần 12 tấn/ha, cao w đạt 35-40 tấn/ha, có thời điểm khoai tây xuất sang Nga (có năm tới oa nl 1.000 tấn) Khi lương thực lúa gạo ngô dồi khoai tây nghiên d cứu theo hướng chất lượng hiệu lu va an 1.1.2 Đặc điểm nông sinh học Khoai tây u nf Khoai tây thân thảo, tán gọn, ưa lạnh, phát triển khoảng 60 cm chiều cao, ll khoai tây có thời gian sinh trưởng ngắn 80-100 ngày, chết sau hoa Hoa m oi có màu trắng, hồng, đỏ, xanh, màu tím, nhụy hoa màu vàng Khoai tây z at nh thụ phấn chủ yếu côn trùng, ong vò vẽ mang phấn hoa từ đến z khác Sau khoai tây hoa, số giống cho màu xanh giống @ m co l gm màu xanh trái cà chua anh đào, chứa 300 hạt (Wikipedia) an Lu n va ac th si 1.1.3 Vai trò Khoai tây Khoai tây nguồn cung cấp lương thực dồi Theo báo cáo Tổ chức Nông Lương Liên Hợp Quốc (FAO) sản lượng khoai tây toàn Thế giới đến năm 2010 320 triệu tấn, 2/3 thức ăn trực tiếp người, lại thức ăn cho động vật nguyên liệu sản xuất tinh bột Ở Việt Nam, khoai tây nhập vào từ năm 1890 Do có giá trị kinh tế cao, thuộc nhóm ưa lạnh nên có lợi sản xuất vụ đơng, thời gian sinh trưởng ngắn, dễ trồng, tốn cơng chăm sóc, phù hợp với nhiều lu loại đất trồng nên khoai tây trở thành trồng xóa đói giảm nghèo an cho bà nơng dân nhiều địa phương thuộc tỉnh miền Bắc Thái va n Bình, Lạng Sơn, Yên Bái,… (Nguồn báo điện tử: Thái Bình, Lạng Sơn, tn to Yên Bái) ie gh Tuy nhiên, ngành Nông nghiệp Việt Nam cung cấp 80% nhu p cầu tiêu dùng khoai tây nước, phải nhập gần 100.000 w khoai tây hàng năm oa nl Khoai tây thực phẩm có giá trị dinh dưỡng cao, có 2% d protein bao gồm lysine (một axit amin thường khơng có protein thực lu va an vật) nên phối hợp tốt với ngũ cốc Trong protein khoai tây cịn có số axit u nf amin tự chất kiềm purin Giá trị sinh học khoai tây tương đối ll cao lên tới 75% (theo phương pháp Mittchell) Người ta tính khoảng m oi 200g khoai tây nướng vỏ cung cấp 844mg Kali (gấp đôi chuối), 28% z at nh phần sắt hàng ngày, 43% phần vitamin C, 35% phần vitamin B6 nhiều chất khác niacin, thiamin, folat… z gm @ Việc sử dụng khoai tây làm thực phẩm khuyến khích l số nhà khoa học Viện Thực phẩm Anh phát hiện, ăn thường xuyên chữa bệnh “ngủ” Châu Phi m co khoai tây có hợp chất sinh học cucoamin có tác dụng làm giảm huyết áp an Lu n va ac th si Không sử dụng để làm lương thực thực phẩm khoai tây sử dụng y dược Qua nghiên cứu, GS Venket Rao, Khoa Dinh dưỡng Trường đại học Y Toronto, Canada, phát thấy khoai tây có nhiều chất chống oxy hóa Nó có khả ngăn ngừa q trình lão hóa, hạn chế phát triển ung thư số bệnh khác Còn nhà nghiên cứu Đại học Y Harvard, Mỹ, phát người thường xuyên ăn khoai tây có khả giảm ung thư tuyến tiền liệt Bệnh thối nhũn khoai tây 1.2 lu 1.2.1 Tác nhân gây bệnh tác hại bệnh an Trong điều kiện thời tiết khí hậu nước ta năm gần nắng va n nóng, mưa nhiều đan xen nhiều bão liên tục điều kiện thuận lợi cho gh tn to loài vi khuẩn gây bệnh trồng Bệnh vi khuẩn gây nguy hiểm ie gây nhiều khó khăn cho cơng tác phòng trừ bảo quản Thời gian ủ bệnh p khó phát gây thiệt hại lớn thời kỳ sinh trưởng nl w thời gian bảo quản, lưu trữ nông phẩm Đối với khu d oa vực sản xuất thuộc vùng nhiệt đới bệnh thối nhũn khoai tây, cà rốt, hành an lu tây, bắp cải….chủ yếu vi khuẩn Erwinia gây nên Những nghiên cứu u nf va trước kết luận vi khuẩn gây thối nhũn khoai tây có ba lồi: Erwinia carotovora pv carotovora (Ecc), Erwinia carotovora pv atroseptica ll oi m (Eca) E chrysanthemi (Ech) Trong Ecc lồi chủ yếu gây bệnh thối z at nh nhũn củ khoai tây (Jerenial), (Randall cs) Vi khuẩn phổ biến bề mặt, vết thương củ khoai tây sau thu hoạch Ecc gây bệnh z vùng khí hậu ơn đới nhiệt đới, có phổ ký chủ rộng Ecc cư trú đất, @ l gm nước sông, hồ chí đại dương Vi khuẩn nhân lên tồn m co vùng rễ nhiều chủ chủ nhiều loài cỏ dại Hai loài Eca Ech tác nhân gây bệnh thối đen an Lu n va ac th 10 si KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ I KẾT LUẬN Từ 06 mẫu Cà dại bệnh phân lập 70 chủng VKNS Sau tiến hành tuyển chọn khả phân hủy AHLs xác định 09 chủng có khả phân hủy AHLs có 02 chủng có khả phân hủy mạnh BGCSL1-2 BGCR1-4 Hoạt tính enzyme AHL lactonase hai chủng VKNS thể mạnh lu an sau 6h nuôi cấy môi trường YPD bổ sung AHL tổng hợp C6- n va HSL 28oC phương pháp lây nhiễm VKNS trước vi khuẩn gây bệnh Ecc cho hiệu ức chế bệnh thối nhũn lát cắt củ khoai tây cao nhất, trọng p ie gh tn to Trong số phương pháp lây nhiễm VKNS vi khuẩn gây bệnh Ecc, nl w lượng mô thối giảm tới 50% so với công thức đối chứng xử lý vi d oa khuẩn gây bệnh Ecc an lu Mật độ VKNS vi khuẩn gây bệnh Ecc không thay đổi đáng kể sau u nf va lây nhiễm lát cắt củ khoai tây chứng minh chế phân hủy ll AHL VKNS liên quan đến phá vỡ hệ thống QS vi khuẩn gây oi m bệnh Ecc Đây 02 chủng VKNS có triển vọng phịng trừ thối z at nh nhũn khoai tây nguồn vật liệu để sản xuất chế phẩm sinh học phục vụ cho sản xuất nông nghiệp z @ KIẾN NGHỊ gm phương hướng nghiên cứu cụ thể sau: m co l Từ kết nghiên cứu thu được, tơi có kiến nghị cho an Lu n va ac th 52 si - Tiếp tục nghiên cứu sinh thái chủng VKNS đặc tính có lợi cho trồng mức độ phân tử - Tìm hiểu chế khác liên quan đến khả phân hủy AHLs làm giảm tính độc vi khuẩn gây bệnh - Nghiên cứu việc sử dụng VKNS để sản xuất chế phẩm sinh học phòng trừ bệnh thối nhũn khoai tây phục vụ nhu cầu sản xuất nông nghiệp lu an n va p ie gh tn to d oa nl w ll u nf va an lu oi m z at nh z m co l gm @ an Lu n va ac th 53 si TÀI LIỆU THAM KHẢO TÀI LIỆU TRONG NƯỚC Bản tin Nông nghiệp giống công nghệ cao, số 2/2004 “Những thay đổi hệ thống sản xuất khoai tây giống Việt Nam” Nguyễn Thị Thanh Hà (2006), “Phát vi khuẩn Erwinia carotovora subsp.carotovora địa lan (Cymbidium) phương pháp PCR” Luận văn tốt nghiệp đại học quy, Trường Đại học Nơng Lâm TP Hồ Chí Minh lu an Nguyễn Thanh Hà, Nguyễn Thị Thu Hà, Phạm Xuân Hội, Hoàng Hoa n va Long (2013), “Nghiên cứu xác định tác nhân gây bệnh thối nõn địa lan gh tn to Sa Pa, Lào Cai”, Tạp chí Nơng nghiệp Phát triển Nơng thơn, Bộ Khoa học Công nghệ, (2), tr35-40 p ie Lê Lương Tề Vũ Triệu Mân, 1999, “Bệnh vi khuẩn virus hại w trồng” Nhà xuất Giáo dục, Hà Nội, tr 7-118 oa nl Phạm Xuân Tùng (2000), “Sản xuất khoai tây Việt Nam”, Trung tâm d nghiên cứu Lương thực Đà Lạt lu va an Phạm Xuân Tùng (2001), “The late blight disease of potato in Vietnam”, u nf Journal of Agricultural University of Henei ll Trần Thị Thúy “Bệnh thối nhũn vi khuẩn Erwinia carotovora hại rau oi m sau thu hoạch” z at nh Tiêu chuẩn quốc gia “Củ giống khoai tây phương pháp kiểm nghiệm” z TCVN 8549-2011 gm @ Vũ Quốc Trung (2005) “Bảo quản khoai tây giống” Khoa học đời 10.https://vi.wikipedia.org/wiki/Khoai_t%C3%A2y m co l sống 14(1732) an Lu 11 http://baothaibinh.com.vn/4/24484/hieu_qua_kinh_te_tu_khoai_tay_vu_dong n va ac th 54 si 12.http://baolangson.vn/tin-bai/Kinh-te/trong-cay-khoai-tay-som-o-quan-bancach-lam-hieu-qua-can-duoc-nhan-rong/30-29-118889:55 13.http://www.baoyenbai.com.vn/12/91949/Cay_khoai_taytren_dong_dat_Tr an_Yen.htm 14.http://www.cuctrongtrot.gov.vn/Tech_Science.aspx?index=detail&type=a &idtin=20 TÀI LIỆU NƯỚC NGOÀI 15 Allen C., Bent A and Charkowski A (2009), “Underexplored niches in lu an research on plant pathogenic bacteria”, Plant Physiol, 150, 1631-1637 n va 16 Agror G N (2006), “Bacterial soft rots”, 5th Edn, Acadimic, Press, San tn to Diego ie gh 17 Balus S.B and Dahiru B (2006), “Efficacy of some plant extracts on the p control of potato tubers soft rot caused by Erwinia carotovora ssp w Carotovora”, Journal of plant protection research, 46 (3) oa nl 18 Barnard A.M.L and Salmond G.P.C (2006), “Quorum sensing in d Erwinia species”, Anal Bioanal Chem, 387, pp 415-423 lu va an 19 Batt P J (2002), “Final report for Deutsche Gesellschaft fur Technische u nf Zusammenarbeit (GTZ) on the market for seed potatoes frest potatoes ll and processed potato products in Vietnam, Hanoi” m oi 20 Bokhove C (2010), “Implementing feedback in a digital tool for symbol z at nh sense”, International Journal for Technology in Mathematics Education, z 17(3), 121-126 @ gm 21 Carlier A et al (2003), “The Ti plasmid of Agrobacterium tumefaciens l harbors an attM-paralogous gene, aiiB, also encoding N-acyl homoserine m co lactonase activity”, Appl Environ Microbiolo, 69, pp 4989-4993 an Lu n va ac th 55 si 22 Coutteau P and Goossens T (2013), “Funtional Feeds as effective strategies against EMS”, Aquaculture Asia Pacific, 9(4), pp 31-33 23 Czajkowski R and Jafra S (2009), “Quenching of acyl-homoserine lactone dependent quorum sensing by enzymatic disruption of signal molecules”, Acta Biochimica Polonicol 2009, 56, pp 1–16 24 Dong Y.H., Xu J.L., Li X.Z., Zhang L.H (2000), “AiiA, an enzyme that inactivates the acylhomoserine lactone quorum-sensing signal and attenuates the virulence of Erwinia carotovora”, Proc Natl Acad Sci lu USA 2000, 97, 3526–3531 an 25 Dong Y.H., Wang L.H., Zhang L.H (2007), “Quorum-quenching va n microbial infections: mechanisms and implications”, Philos T Roy Soc to gh tn B, 362, 1201–1211 ie 26 Dong Y.H., Wang L.H., Xu J.L., Zhang H.B., Zhang X.F., Zhang L.H p (2001), “Quenching quorum sensing dependent bacterial infection by an nl w N-acyl homoserine lactonase”, Nature, 411, pp 813–817 d oa 27 Elizabeth Ngadze (2012), “Identification and control of potato soft rot an lu and blackleg pathogen in Zimbabwe” u nf va 28 Engebrecht J., Nealson K.H and Silverman M (1983), “Bacterial bioluminescence: isolation and genetic analysis of functions from Vibrio ll oi m fischeri”, Cell, 32, pp 773-781 z at nh 29 Fang Chen., Yuxin Gao., Xiaoyi Chen., Zhimin Yu and Xianzhen Li (2013), “Quorum Quenching Enzymes and Their Application in z @ Degrading Signal Molecules to Block Quorum Sensing-Dependent l gm Infection”, Int J Mol Sci, 14(9), pp 17477-17500 m co 30 Farrar J J et al (2009), “Losses due to lenticels rot are an increasing concern for Karen County potato growers”, California Agricultural, 63: 127-130 an Lu n va ac th 56 si 31 Furuya N., Taura S., Thuy B.T., Matsumoto M., Aye S.S and Ton P.H (2002), “Isolation and preservation of Santhomonas oryzae pv Oryzae from Vietnam in 2001-2002”, Bull Inst Trop Agr, Kyushu Univ, 25, pp 43-50 32 Han Y., Chen F., Li N., Zhu B., Li X (2010), “Bacillus marcorestinctum sp nov a novel bacterium quenching acylhomoserine lactone quorumsensing signal from soil”, Int J Mol Sci, 11, 507–520 33 Harshad Lade., Diby Paul and Ji Hyang Kweon (2014), “Quorum Quenching Mediated Approaches for Control of Membrane Biofouling”, lu International Journal of Biological Sciences, 10(5): 550-565 an and Yoichi Takanami (2003), “Isolation of Endophytic Bacteria from n va 34 Hoang Hoa Long, Naruto Furuya, Daisuke Kurose, Minoru Takeshita tn to Solanum sp and Their Antibacterial Activity against Plant Pathogenic p ie gh Bacteria”, J.Fac.Agr., Kyushu Univ., 48 (1-2), 21-28 d oa nl w 39 Hawkes J.G (1994), “Origin of the cultivated potatoes and species relationships”, In: Bradshaw J.E., Mackay G.R.(eds.), Potato Genetics, CAB International, Wallingford, 3–42 lu va an 35 Kay H McClean., Michael K Winson., Leigh Fish., Adrian Taylor., Siri Ram Chhabra., Miguel Camara., Mavis Daykin., John H Lamb., u nf ll Simon Swift., Barrie W Bycroft., Gordon S A B Stewart., Paul m oi Williams (1997), “Quorum sensing and Chromobacterium violaceum: z at nh exploitation of violacein production and inhibition for the detection of Nacylhomoserine lactones”, Microbiology, 143, 3703-3711 z @ gm 36 Lee S J et al (2002), “Gene encoding the N-acyl homoserine lactone- l degrading enzyme are widespread in many subspecies of Bacillus m co thuringiensis”, Applied and environmental microbiology, 68(8): 3010-3924 an Lu n va ac th 57 si 37 Lin Y.H., Xu J.L., Hu J., Wang L.H., Ong S.L., Leadbetter J.R and Zhang L.H (2003), “Acyl-homoserine lactone acylase from Ralstonia strain XJ12B represent a novel and potent class of quorum quenching enzymes”, Molecular Microbiology, 47, pp 849-860 38 Leadbetter J.R., Greenberg E.P (2000), “Metabolism of acyl-homoserine lactone quorum-sensing signals by Variovorax paradoxus”, J Bacteriol, 182:6921–6926 39 Marshall J (2013), “Quorum sensing”, Proc Natl Acad Sci USA lu 013;110:2690 an 40 Molina L., Rezzonico F., Défago G., Duffy B (2005), “Autoinduction in va n Erwinia amylovora: Evidence of an acyl-homoserine lactone signal in the to gh tn fire blight pathogen”, J Bacteriol 2005, 187, 3206–3213 p ie 41 Molina L., Constantinuescu F., Michel L., Reimmann C., Duffy B and w Défago G (2003), “Degradation of pathogen quorum-sensing molecules oa nl by soil bacteria: a preventive and curative biological control mechanisn”, d FEMS Microbiology Ecology, 45, pp 71-81 lu lactone regulates u nf acyl-homoserine va an 42 Morohoshi T., Kato M., Fukamachi K., Kato N and Ikeda T (2008), “Nviolacein production in ll Chromobacterium violaceum type strain ATCC12472”, FEMS Microbiol oi m Lett, 279(1), pp 124-130 z at nh 43 Morohoshi T., Someya N., Ikeda T (2009), “Novel N-Acyl homoserine z lactone-degrading bacteria isolate from the leaf surface of Solanum @ l gm tuberosum and their quorum quenching properties”, Bioscience Biotechnology Biochemistry, 73, pp 2124-2127 m co 44 Mei G.Y., Yan X.X., Turak A., Luo Z.Q., Zhang L.Q (2010), “AidH, an an Lu alpha/beta-hydrolase fold family member from an Ochrobactrum sp n va ac th 58 si strain, is a novel N-acylhomoserine lactonase”, Appl Environ Microbiol, 76, 4933–4942 45 Nasser W., Boulliant M.L., Salmond G and Reverchon S (1998), “Characterization of the Erwinia chrysanthemi expI-expR locus directing the synthesis of two N-acyl-homoserine lactone signal molecules”, Mol Microbiol, 29, pp 1391-1405 46 Park S Y et al (2003), “AhID, an N-acylhomoserine lactonase in Arthrobacter sp., and predicted homologues in other bacteria”, lu Micriobiology, 149: 1541-1550 an va 47 Park J.Y., Lee Y.H., Yang K.Y., Kim Y.C (2010), “AiiA-mediated n quorum quenching does not affect virulence or toxoflavin expression in to gh tn Burkholderia glumae SL2376”, Lett Appl Microbiol, 51:619–624 p ie 48 Prajapat R., Marwal A.and Jha P.N (2013), “Erwinia carotovora associated with Potato: A Critical Appraisal with respect to Indian oa nl w perspective”, Int.J.Curr Microbiol App Sci, 2(10), pp 83-89 d 49 Prajapati N., Purohit S.S., Sharma A.K and Kumare T.A (2003), Agrobios p 484 u nf va an lu Handbook of Medicinal plants: A complete source book st ed Jodhpur: 50 Prombelon M.C.M (2002), “Potato diseases caused by soft rot erwinias: ll oi m an overview of pathogenesis”, Plant Pathol, 51, pp 1-12 z at nh 51 Prombelon M.C.M and Salimond G.P.C (1995), “Bacterial soft rot Pathogenesis and host specificity in plant diseases”, 1, pp 1-17 z gm @ 52 Pérombelon M.C.M and Kelman A (1987), "Blackleg and other potato diseases caused by soft rot erwinia”, Proposal for revision of m co l terminology, Plant Disease 71, pp 283-285 an Lu n va ac th 59 si 53 Randall C E et al., “Blackleg, aerial stem rot, and tuber soft rot of potato Extension FactSheet”, The Ohio State University, HYG-3106-95 54 Rasmussen T.B., Givskov M (2006), “Quorum-sensing inhibitors as antipathogenic drugs”, Int J Med Microbiol, 296, 149–161 55 Robert Czajkowski and Sylwia Jafra (2009), “Quenching of acyl-homoserine lactone-dependent quorum sensing by enzymatic disruption of signal molecules”, Acta Biochimica Polonica, Vol 56, No 1/2009, 1-16 56 Robert Czajkowski., Michel C M Perombelon., Johannes A van Veen., lu Jan M van der Wolf (2011), “Control of blackleg and tuber soft rot of an potato caused by Pectobacterium and Dickeya species”, a review Plant va n Pathology (2011) human holocytochrome c-type synthetase gene (HCCS) isolated from the ie gh tn to 57 Schaefer L et al (1996), “Cloning and characterization of a putative p critical region for microphthalmia with linear skin defects (MLS)”, oa nl w Genomics, 34(2):166-72 d 58 Stevenson W.R., R Loria., G D France., and D P Weingartner., French E R (2001), “Brown spot and black pit”, Pp18-19 in: “Compendium of Potato Diseases”, 2nd Ed, American Phytopathological Society, St Paul, MN u nf va an lu 66 Struik P.C & Wiersema S.G (1999), “Seed potato technology”, ll oi m Wageningen, The Netherlands: Wageningen Pers z at nh 59 Toth I.K., Bell K.S., Holeva M.C and Birch P.R.J (2003), “Soft rot erwiniae: from genes to genomes”, Molecular Plant Pathology, 4, pp.17-30 z gm @ 60 Tsror L et al (1993), “A years monitoring study of diseases on potato l seed tubers imported to Israel”, Phytoparasitica 21(4): 321-328 m co 61 Tsror L et al (1999), “Survey of bacterial and fungal seedborne diseases in an Lu imported and domestic potato seed tubers”, Phytoparasitica 27(3): 1-12 n va ac th 60 si 62 Uroz S., D’Angelo-Picard C., Carlier A., Elasri M., Sicot C., Petit A., Oger P., Faure D and Dessaux Y (2003), “Novel bacteria degrading N-acylhomoserine lactones and their use as quenchers of quorum-sensing regulated functions of plant pathogenic bacteria”, Microbiology 149, pp 1981-1989 63 Uroz et al (2008), “A Rhodococcus qsd-A-encoded enzyme defines a novel class of large-spectrum quorum quenching lactonases”, Appl Environ Microbiol 74: 1357-1366 64 Val D.L and Cronal J.E.Jr (1998), “In vivo evidence that S-adenosyl lu methionine and fatty acid synthesis intermediates are the substrates for the an LuxI family of autoinducer synthase”, J BacteriolI, 180, pp 2644-2651 va n 65 Vanneste J.L., Yu J and Cornish D.A (1998), “Biological control of to gh tn bacterial soft rot”, Acta Hort (ISHS) 464 : pp 519-19 p ie 66 Wang W Z et al (2010), “AiiM, a novel class of N-acylhomoserine w lactonase from the leaf-associated bacterium Microbacterium testaceum”, oa nl Applied and environmental microbiology, 76(8): 2524-2530 d 67 Won-Suk Cheong., Chi-Ho Lee., Yun-Hee Moon., Hyun-Suk Oh., Sang- lu an Ryoung Kim., Sang H Lee., Chung-Hak Lee and Jung-Kee Lee (2013), u nf va “Isolation and Identification of Indigenous Quorum Quenching Bacteria, ll Pseudomonas sp 1A1, for Biofouling Control in MBR”, Ind Eng Chem m oi Res, 52 (31), pp 10554–10560 z at nh 68 Whitehead N.A., Barnard A.M., Slater H., Simpson N.J and Salmond G.P.(2001), “Quorum-sensing in Gram-negative bacteria”, FEMS z gm @ Microbiol, 25, pp 365-404 l 69 Yi-Hu Dong., Lian-Hui Wang and Lian-Hui Zhang (2007), “Quorum- an Lu Trans R Soc B 362, pp 1201-1211 m co Quenching microbial infections: mechanisms and implications”, Phil n va ac th 61 si 70 Yi-Hu Dong and Lian-Hui Zhang (2005), “Quorum Sensing and Quorum-Quenching Enzymes”, The Journal of Microbiology, 43(S), 101-109 71 Yang F., Wang L-H., Wang J., Dong Y-H., Hu J.Y and Zhang L-H (2005), “Quorum quenching enzyme activity is widely conserved in the sera of mammalian species”, FEBS Lett, 579, pp 3713-3717 72 Zhang et al (2002), “Genetic control of quorum-sensing signal turnover in Agrobacterium tumefaciens”, Proc Natl, Acad Sci USA 99: 4638- lu 4643 an 73 FAOSTAT (2014), http://faostat.fao.org/ n va p ie gh tn to d oa nl w ll u nf va an lu oi m z at nh z m co l gm @ an Lu n va ac th 62 si PHỤ LỤC Phụ lục 1.1 : Danh sách chủng VKNS phân lập từ Cà dại TT Ký hiệu Tròn to, trong, vàng nhạt, mép khuẩn lạc không mịn BGCR 1.2 Elip, đục trắng, nhỏ BGCR 1.3 Tròn, đen trắng, nhỏ BGCR 1.4 Tròn, trắng sữa, nhỏ BGCR 1.5 Tròn, trắng sữa, nhỏ BGCR 2.1 Tròn, nhỏ, màu vàng pha đen BGCR 2.2 Khơng định hình, vàng nhạt BGCR 2.3 Tròn, nhỏ, vàng cam nhạt, lu BGCR 1.1 gh Hình thái màu sắc khuẩn lạc an n va tn to p ie BGCR 2.4 Tròn, trong, trắng, nhỏ BGCR 2.5 Trịn, to trung bình,vàng 11 SSR 8.1 12 SSR 8.2 13 SSR 8.3 14 30.1 Trịn, trắng đục, nhỏ 15 30.2 Khơng định hình, vàng nhạt 16 30.3 To, trong, khơng định hình, vàng nhạt 17 30.4 Nhỏ, trong, khơng định hình 18 DR Trắng sữa d 10 ll oa nl w lu Trịn, trắng trong, nhỏ trung bình u nf va an Trịn, to trung bình, vàng nhạt oi m Trịn, nhỏ, vàng hồng z at nh z m co l gm @ an Lu n va ac th 63 si an Trắng 20 DR3 Trắng đục, chảy 21 DSL1 Trịn, vàng nhạt, 22 DSL Khơng định hình, trắng đục, nhỏ 23 DSL Trịn, vàng nhạt 24 DSL Tròn to, trong, chảy 25 DSL Trắng hồng, khơng định hình, 26 DSL Nhỏ, không mịn, vàng nhạt, 27 DSR Tròn, trong, trắng, to 28 DSR Vàng nhạt, trong, tròn DSR Elip, trắng trong, nhỏ n va DR gh lu 19 tn to 30 p ie 29 Elip vàng, trong, nhỏ 31 DSR Trắng đục, chảy 32 DSR 33 DSR 34 DSR 35 DSR Khơng định hình, trắng 36 DSR 10 Trắng đục, tròn, chảy 37 BGCR1-1 Vàng, nhẵn, nhỏ 38 BGCR1-2 Phớt hồng, lồi, nhỏ 39 BGCR1-3 Trắng trong, dẹt, nhỏ 40 BGCR1-4 Vàng nhạt quầng trong, dẹt, nhỏ DSR d oa nl w Chấm vàng nhạt u nf va an lu Chấm trắng nhỏ Tròn, viền vàng ll oi m z at nh z m co l gm @ an Lu n va ac th 64 si an Trắng đục, lồi, nhỏ 42 BGCR2-2 Trắng đục, dẹt, nhỏ 43 BGCR2-3 Trắng trong, chảy, nhỏ 44 BGCR2-4 Trắng dẹt, nhỏ 45 BGCR2-5 Hồng nhạt, dẹt, nhỏ, không chuẩn mực 46 H1 Trắng đục, tròn, nhỏ 47 H2 Trắng trong, chảy, nhỏ 48 H3 Trắng trong, dẹt, nhỏ 49 H4 Trắng đục, tròn, khô 50 H5 Vàng nhạt, lồi, nhỏ H6 Vàng nhạt, khô, không chuẩn mực n va BGCR2-1 gh lu 41 tn to p ie 51 H7 Trắng trong, lồi, nhỏ 53 H8 Trắng trong, dẹt, nhỏ 54 H9 55 H10 56 S1 57 S2 Vàng đậm, lồi, nhỏ 58 S3 Trắng trong, dẹt, nhỏ 59 S4 Trắng đục, lồi, to, không chuẩn mực 60 S5 Trắng trong, chảy, nhỏ 61 S6 Vàng, chảy, nhỏ 62 S7 Không định hình, trắng oa nl w 52 d Trắng đục, lồi, nhỏ u nf va an lu Trắng trong, chảy, nhỏ Vàng nhạt, khô, không chuẩn mực ll oi m z at nh z m co l gm @ an Lu n va ac th 65 si lu an 63 S8 Khơng định hình, trắng 64 S9 Trịn, dịch trắng viền mép 65 S 10 Tròn to, dịch trắng 66 BGCSL1-1 Khơng định hình, trắng đục có gợn 67 BGCSL1-2 Trịn, trắng trong, chảy 68 BGCSL1-3 Trịn, trắng, có chấm trắng tâm 69 BGCSL1-4 Trắng đục, khơng định hình 70 BGCSL1-5 Trịn, trắng sữa n va p ie gh tn to d oa nl w ll u nf va an lu oi m z at nh z m co l gm @ an Lu n va ac th 66 si