Xây dựng quy trình phân lập hợp chất murayafoline a từ loài glycosmis stenocarpa (drake) tan ở việt nam

i LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan luận văn khơng trùng lặp với khóa luận, luận văn, luận án cơng trình nghiên cứu cơng bố Ngƣời cam đoan Cao Thị Thu Uyên ii LỜI CẢM ƠN Em xin trân trọng cảm ơn Ban Giám hiệu, Khoa Khoa học Tự nhiên, Trường Đại học Hồng Đức tạo điều kiện thuận lợi suốt q trình học tập nghiên cứu để hồn thành luận văn Em xin chân thành cảm ơn thầy giáo hướng dẫn khoa học TS Trần Quốc Toàn tận tình hướng dẫn, giúp đỡ em q trình hồn thành luận văn thạc sỹ Và cuối cùng, xin cám ơn gia đình, bạn bè, đồng nghiệp cảm thông, ủng hộ giúp đỡ suốt thời gian tác giả học Cao học viết luận văn Thanh Hoá, tháng năm 2019 Tác giả Cao Thị Thu Uyên iii MỤC LỤC Trang MỞ ĐẦU Chƣơng 1: TỔNG QUAN 1.1 Giới thiệu hợp chất Cacbazol ancaloit nguồn thiên nhiên 1.1.1 Các hoạt tính kháng ký sinh trùng, kháng khuẩn, kháng HIV diệt côn trùng 1.1.2 Hoạt tính gây độc tế bào chống u 1.1.3 Hoạt tính chống viêm 1.1.4 Hoạt tính chống oxi hố 1.1.5 Hoạt tính chống kết tụ tiểu cầu chống đông máu 11 1.1.6 Hoạt tính bảo vệ tế bào thần kinh hoạt tính trợ tim 12 1.1.7 Hoạt tính kháng nấm 13 1.2 Giới thiệu loài cơm rượu trái hẹp (Glycosmis stenocarpa (Drake) Tan.) 13 1.3 Giới thiệu hợp chất Murrayafoline A 15 1.3.1 Nguồn gốc hợp chất Murrayafoline A 16 1.3.2 Một số nghiên cứu hoạt tính sinh học Murrayafoline A 16 CHƢƠNG 2: ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 19 2.1 Đối tượng nghiên cứu 19 2.2 Thiết bị, hóa chất thí nghiệm 19 2.3 Phương pháp nghiên cứu 20 2.3.1 Phương pháp chiết xuất dược liệu 20 2.3.2 Phương pháp sắc ký 20 2.3.3 Phương pháp thu thập xử lý mẫu 25 2.3.4 Phương pháp tối ưu hóa thực nghiệm 25 CHƢƠNG THỰC NGHIỆM 32 3.1 Xây dựng quy trình tiền xử lý nguyên liệu 32 3.2 Xây dựng quy trình chiết xuất, phân lập hợp chất Murryafoline A 32 3.3 Định lượng Mu-A sắc ký lỏng hiệu cao (HPLC) 33 iv 3.4 Khảo sát ảnh hưởng yếu tố cơng nghệ đến hiệu suất q trình chiết xuất Murrayafoline A 35 3.4.1 Khảo sát ảnh hưởng nhiệt độ chiết xuất tới hàm lượng Mu-A hiệu suất cao chiết 36 3.4.2 Khảo sát ảnh hưởng thời gian chiết xuất tới hàm lượng Mu-A hiệu suất cao chiết 36 3.4.3 Khảo sát ảnh hưởng tỷ lệ dung môi/nguyên liệu tới hàm lượng Mu-A hiệu suất cao chiết 36 3.5 Xây dựng mơ hình nghiên cứu ma trận kế hoạch thực nghiệm 37 CHƢƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 40 4.1 Kết khảo sát ảnh hưởng yếu tố công nghệ đến hiệu suất chiết xuất 40 4.1.1 Ảnh hưởng nhiệt độ chiết tới hiệu suất chiết xuất 40 4.1.2 Ảnh hưởng thời gian chiết xuất tới hiệu suất chiết xuất 41 4.1.3 Ảnh hưởng tỷ lệ dung môi/nguyên liệu tới hiệu suất chiết xuất 42 4.2 Kết quy hoạch thực nghiệm tối ưu hóa thơng số kỹ thuật quy trình chiết xuất 44 4.3 Kết phân lập hợp chất Murrayafoline A 51 KẾT LUẬN 56 TÀI LIỆU THAM KHẢO 57 v DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT ED50 : Liều lượng hiệu trung bình GI50 : Liều lượng ức chế phát triển 50% tế bào ung thư Hep-G2: Dịng tế bào ung thư biểu mơ gan HCT116 : Dòng tế bào ung thư ruột kết Mu-A: Murrayafoline A UV : Tia tử ngoại HPLC: Sắc ký lỏng hiệu cao TLC: sắc ký lớp mỏng SKPT: Sắc ký pha thường SKPĐ: Sắc ký pha đảo SKPB: Sắc ký phân bố MeOH: Methanol CH2Cl2: Dicholoromethane EtOAc: Ethylacetate C-18: Silicagel pha đảo vi MỤC LỤC BẢNG Trang Bảng 1: Thực 17 thí nghiệm theo ma trận kế hoạch 37 Bảng 2: Các giá trị biến thực biến mã hóa tương ứng 38 Bảng Kết khảo sát nhiệt độ chiết xuất hiệu suất thu hồi MuA, hàm lượng cao chiết tổng 40 Bảng Kết khảo sát thời gian chiết xuất hiệu suất thu hồi MuA, hàm lượng cao chiết tổng 41 Bảng Kết khảo sát tỷ lệ dung môi/nguyên liệu chiết xuất hiệu suất thu hồi MuA, hàm lượng cao chiết tổng 43 Bảng Biến mã hóa mức thí nghiệm 44 Bảng Bảng ma trận kế hoạch trực giao kết thực nghiệm 45 Bảng Bảng phân tích ANOVA hàm Y1 46 Bảng Bảng phân tích ANOVA hàm Y2 47 vii MỤC LỤC HÌNH Trang Hình 1: Hình ảnh cơm rượu trái hẹp Glycosmis stenocarpa 14 Hình 2: Cơng thức cấu tạo murrayafoline A 15 Hình 3: Cách tính giá trị Rf 21 Hình 4: Các bước tiến hành sắc ký mỏng 22 Hình 5: Các bước tiến hành sắc ký cột 23 Hình Sơ đồ hệ thống sắc ký lỏng hiệu cao (HPLC) 25 Hình 7: Sơ đồ quy trình tiền xử lý nguyên liệu 32 Hình 8: Đồ thị đường chuẩn Murrayafoline A 33 Hình 9: Sơ đồ quy trình chiết xuất phân lập Murrayafoline A 34 Hình 10 Đồ thị ảnh hưởng nhiệt độ tới hàm lượng MuA cao chiết tổng 40 Hình 11: Đồ thị ảnh hưởng thời gian chiết tới hàm lượng MuA cao chiết tổng 42 Hình 12: Đồ thị ảnh hưởng tỷ lệ dung môi/nguyên liệu chiết tới hàm lượng MuA cao chiết tổng 43 Hình 13: Điều kiện tối ưu hóa biến cơng nghệ kết tối ưu hóa hàm mục tiêu Y1 Y2 49 Hình 14 Các bề mặt đáp ứng chiều chiều thể tương tác đôi thông số công nghệ 51 Hình 15: Sơ đồ quy trình chiết xuất Murrayafoline A điều kiện tối ưu…… 51 Hình 16: Cấu trúc hợp chất Murrayafoline A 54 Hình 17: Tình thể Mu-A Kết sắc ký lớp mỏng Mu-A 55 MỞ ĐẦU Việt Nam nước nằm vùng khí hậu nhiệt đới gió mùa, độ ẩm cao, lượng mưa trung bình năm lớn tạo điều kiện thuận lợi cho phát triển thảm thực vật Trên nước có khoảng 12.000 lồi thực vật bậc cao, khơng kể đến loài tảo, nấm, rêu nhiều loài bậc thấp khác Nhiều lồi số từ xa xưa tới sử dụng y học cổ truyền mục đích khác phục vụ đời sống nhân dân ta Nghiên cứu, tìm kiếm hợp chất có nguồn gốc thiên nhiên có hoạt tính sinh học cao để ứng dụng y học, nông nghiệp mục đích khác đời sống người nhiệm vụ quan trọng nhà khoa học nước quan tâm Các hợp chất thiên nhiên đóng vai trị tối quan trọng đời sống hàng ngày người, hợp chất phân lập từ động thực vật ứng dụng hầu hết lĩnh vực đời sống xã hội, chúng dùng để sản xuất thuốc chữa bệnh, thuốc bảo vệ thực vật, làm nguyên liệu cho ngành công nghiệp thực phẩm, mỹ phẩm, Mặc dù công nghệ tổng hợp hóa dược phát triển mạnh mẽ, tạo nhiều biệt dược khác sử dụng cơng việc phịng, chữa bệnh nhờ giảm tỉ lệ tử vong nhiều, song đóng góp thảo dược khơng mà giá trị chúng phòng điều trị bệnh Chúng sử dụng nguồn nguyên liệu trực tiếp gián tiếp cung cấp chất đầu cho cơng nghệ bán tổng hợp nhằm tìm kiếm dược phẩm cho việc điều trị chứng bệnh thơng thường bệnh nan y Vì vậy, nguồn dược liệu thiên nhiên kho tàng quí giá để khám phá, tìm kiếm nhiều loại thuốc có hiệu lực cao cho cơng tác phịng chữa bệnh thông thường bệnh nan y thời đại tiểu đường, ung thư, cúm gia cầm H5N1, H1N1 Có thể nêu vài ví dụ vinblastin, vincristin hoạt chất phân lập từ Dừa cạn (Catharanthus roseus họ Apocynaceae) chữa bệnh ung thư máu, Taxoter-thuốc chữa ung thư vú, ung thư phổi sản phẩm chuyển hóa số ditecpenoit chiết xuất từ số lồi Taxus họ Thơng (Pinaceae) Gần Tamiflu, loại thuốc có tác dụng điều trị bệnh cúm gia cầm H5N1 cúm H1N1, có thành phần Oseltamivir photphat Chất bán tổng hợp từ axit shikimic, hợp chất phân lập từ hoa Hồi Murrayafoline A alkaloid phân lập từ số loài thuộc họ Rutaceae, hợp chất có nhiều hoạt tính sinh học q báu đặc biệt hoạt tính kháng ung thư Hiện giới có nhiều nhóm nghiên cứu sâu hợp chất Tại Việt Nam, nhóm nghiên cứu PGS TS Nguyễn Mạnh Cường cộng phát có mặt hợp chất loài cơm rượu trái hẹp (Glycosmis stenocarpa thuộc họ Rutaceae) phát hợp chất có hoạt tính kháng ung thư kích thích tim mạch tốt Qua đánh giá nghiên cứu, hàm lượng lớn Murrayafoline A lên tới 0,38% thân rễ khô lồi cơm rượu trái hẹp Chính vậy, luận án tập trung nghiên cứu thực đề tài: “Xây dựng quy trình phân lập hợp chất murrayafoline A từ loài Glycosmis stenocarpa (Drake) Tan” Đối tƣợng nghiên cứu Cây cơm rượu trái hẹp (Glycosmis stenocarpa (Drake) Tan.) thuộc họ Rutaceae Mục tiêu nghiên cứu Xây dựng quy trình cơng nghệ chiết tách phân lập hợp chất murrayfoline A từ loài cơm rượu trái hẹp (Glycosmis stenocarpa (Drake) Tan.) Chƣơng 1: TỔNG QUAN 1.1 Giới thiệu hợp chất Cacbazol ancaloit nguồn thiên nhiên 4a 4b C B A 8a N H 9a 1.1 9H-cacbazol 9H-cacbazol (1.1) lần phân lập từ nhựa than đá năm 1872 Graebe Glazer [6] Năm 1965, Chakraborty phân lập mơ tả hoạt tính kháng sinh murrayanin (1.3) từ loài Murraya koenigii Spreng [13] Việc phân lập xác định hoạt tính murrayanin (1.3) lần mở hướng nghiên cứu thú vị hoạt tính cacbazol alkaloid Kể từ nhà hố học sinh vật học liên tục công bố nghiên cứu đặc điểm cấu trúc hoạt tính sinh học nhiều cacbazol thiên nhiên Hầu hết cacbazol phân lập từ thực vật bậc cao chi Murraya, Clausena, Glycosmis thuộc họ Cam Quýt (Rutaceae) Trong đó, Murraya coi chi chứa nhiều cacbazol alkaloid [13] Đã có nhiều giả thuyết q trình sinh tổng hợp lớp chất thực vật bậc cao đưa nhà sinh vật học, nhiên thực chưa có nghiên cứu chi tiết trình sinh tổng hợp So sánh đặc điểm cấu trúc cacbazol từ thực vật bậc cao cho thấy 3metylcacbazol chất trung gian “chìa khố” q trình sinh tổng hợp cacbazol alkaloid thực vật bậc cao [13] Cấu trúc cacbazol gồm ba vịng dính kết, ký hiệu chữ A, B, C đánh số vịng A Dựa vào nhóm vòng A người ta phân loại lớp chất Đây loại hợp chất đa dạng hoạt tính 51 Hình 14 Các bề mặt đáp ứng chiều chiều thể tương tác đôi thông số công nghệ 4.3 Kết chiết xuất phân lập hợp chất Murrayafoline A điều kiện tối ƣu  Quy trình chiết xuất phân lập Murrayafoline A điều kiện tối ưu Các bƣớc thực hiện: Bước 1: Chuẩn bị nguyên vật liệu thiết bị + Cân xác 100g bột nguyên liệu (bột rễ cơm rượu trái hẹp) + Chuẩn bị 500 ml dung môi ethanol công nghiệp + Chuẩn bị bình cầu 1000 ml, bếp điện, sinh hàn hồi lưu, giá kẹp 52 Bột nguyên liệu sau xử lý 1.Chiết xuất EtOH + Nhiệt độ: 670C + Thời gian: 165 phút 2.Cô quay thu hồi dung môi + Tỷ lệ chiết: 5/1 (v/w) Cao chiết tổng Chiết phân bố lần với Hòa tan lượng nước tối thiểu EtOH/H2O n- Hexan CH2Cl2 Dịch chiết n- Hexan dịch chiết CH2Cl2 Dịch nước Cô quay đuổi dung môi Cao chiết phân đoạn CC, n-Hexan/EtOAc (v/v, 90/1) Mu-A : 80% Kết tinh lại, n-Hexan/EtOAc (v/v, 20/1) Kiểm tra TLC, HPLC MU-A > 95% Hình 15 Sơ đồ quy trình chiết xuất Murrayafoline A điều kiện tối ưu 53 Bước 2: Tiến hành chiết xuất hồi lưu + Nạp 100g bột nguyên liệu vào bình cầu 1000 ml + Thêm vào bình cầu 500 ml ethanol công nghiệp + Lắp sinh hàn, bật nước, bật bếp điện + Tiến hành chiết xuất 670C thời gian 165 phút Bước 3: Kết thúc trình chiết xuất, thu cao chiết + Tắt bếp điện, ngắt nước sinh hàn + Lọc thu dịch chiết phễu buchner + Cô đặc dịch chiết máy cô quay áp suất giảm + Thu cao chiết Bước 4: Định tính định lượng cao chiết + Định tính, định lượng murrayafoline A sắc ký lớp mỏng sắc ký lỏng hiệu cao + Định lượng hàm lượng cao chiết thu Bước 5: Chiết phân bố với n-Hexan CH2Cl2 + Hịa tan hồn tồn cao chiết lượng vừa đủ dung dịch EtOH/H2O (v/v = 3/1) + Tiến hành chiết phân bố dung dịch với n-Hexan CH2Cl2 Chiết lần; tỷ lệ chiết lần (v/v = 1/1) + Kiểm tra định tính Mu-A sắc ký lớp mỏng phân đoạn + Gom dịch chiết phân bố phân đoạn n-Hexan CH2Cl2 (2 phân đoạn chứa Mu-A), bỏ phân đoạn nước (không chứa Mu-A) + Cô đặc máy cô quay áp suất giảm thu cao chiết tổng phân đoạn nHexan CH2Cl2 Bước 6: Tiến hành sắc ký cột + Chuẩn bị cột sắc ký silica gel pha thường 54 + Dung môi rửa giải hệ n-Hexan/EtOAc (v/v, 90/1) + Thu hứng dung dịch khỏi cột, kiểm tra Mu-A sắc ký lớp mỏng (TLC) + Gom phân đoạn chứa Mu-A + Cô quay thu hỗn hợp Mu-A độ tinh khoảng 80% Bước 7: Kết tinh thu Mu-A tinh + Hịa tan hồn tồn hỗn hợp vào dung dịch n-Hexan/EtOAc (v/v, 20/1) + Kết tinh lại nhiệt độ 4-60C, thời gian 10 Bước 8: Thu sản phẩm + Lọc rửa tinh thể n-Hexan + Sấy khô dung môi n-Hexan thu tinh thể Mu-A + Kiểm tra sắc ký lớp mỏng (TLC) sắc ký lỏng hiệu cao (HPLC) + Mu-A thu có độ tinh khiết 95% Sau tiến hành chiết xuất mẫu dược liệu điều kiện tối ưu Thực giai đoạn để phân lập thu hợp chất Murrayafoline A độ tinh 95% Kết từ 100g bột dược liệu ban đầu, trải qua công đoạn chiết xuất phân lập thu 250 mg Murrayafoline A Hiệu suất phân lập tinh trình đạt 65% Hình 16: Cấu trúc hợp chất Murrayafoline A 55 Tinh thể Mu-A kết tinh Hấp thụ UV Hiện màu Mu-A bước sóng Thuốc thử 254nm Dragendoff Hình 17: Tình thể Mu-A Kết sắc ký lớp mỏng Mu-A Kết nghiên cứu phổ cộng hưởng từ hạt nhân cho thấy sản phẩm thu có tín hiệu proton cacbon phù hợp với liệu phổ hợp chất MuA H NMR (500MHz, CDCl3), δH (ppm): 2,65 (s, H); 4,06 (s, H); 6,83 (s, H); 7,28–7,35 (m, H); 7,48–7,50 (m, H); 7,60 (s, H); 8,14 (d, J = 7,8 Hz, H), 8,27 (br s, H) 13 C NMR (125 MHz, CDCl3), δC(ppm): 22,4; 55,9; 108,2; 111,4; 113,0; 119,6; 120,9; 124,0; 124,8; 125,9; 128,5; 129,9; 139,9; 145,8 56 KẾT LUẬN Luận án tiến hành nghiên cứu xây dựng quy trình chiết xuất phân lập hợp chất Murrayafoline A từ rễ cơm rượu trái hẹp Glycosmis stenocarpa Một số kết đạt cụ thể sau: Đã tiến hành xây dựng đường chuẩn hợp chất Murrayafoline A phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao (HPLC) Dựa vào đường chuẩn này, chúng tơi xác định xác hàm lượng Mu-A có dược liệu đem chiết xuất Khảo sát, đánh giá ảnh hưởng yếu tố cơng nghệ q trình chiết xuất nhiệt độ chiết, thời gian chiết tỷ lệ dung môi/nguyên liệu Tối ưu hóa quy trình chiết xuất tại: + Nhiệt độ chiết xuất: 670C + Thời gian chiết xuất: 165 phút + Tỷ lệ dung môi/nguyên liệu: 5/1 Hàm lượng Mu-A 37.9266 mg/g dược liệu khô lượng cao chiết tổng đạt 34.3441% so với khối lượng mẫu khô đem chiết Từ 100g bột dược liệu ban đầu, qua trình chiết xuất, phân lập tinh thu 250 mg murrayafoline A độ tinh 95%, hiệu suất trình đạt 65% Độ tinh Mu-A kiểm tra sắc ký lớp mỏng (TLC) HPLC 57 TÀI LIỆU THAM KHẢO TIẾNG VIỆT Lê Đức Anh, Trương Ngọc Hùng, Nguyễn Thị Nga, Lê Mai Hương, Nguyễn Mạnh Cường, Vũ Thị Hà, Lưu Văn Chính (2015), “Tổng hợp đánh giá hoạt tính kháng khuẩn số dẫn xuất murrayafoline A”, tạp chí Hóa học, tuyển tập 53 (5e1), 162-167 Bộ môn Bào chế - Trường Đại học Dược Hà Nội (2005), “Một số chuyên đề bào chế đại”, NXB Y học, tr 158 – 187 Nguyễn Mạnh Cường, Trần Thu Hường, Bùi Hữu Tài, Trần Quốc Toàn, Trần Văn Sung, Nguyễn Quyết Chiến (2010), “Thành phần hóa học số lồi chi Glycosmis”, Hội nghị Khoa học kỷ niệm 35 năm Viện Khoa học Công nghệ Việt Nam, Hà Nội T10, tr 83-87 Nguyễn Minh Đức, Trương Công Trị (2010), “Tiểu phân nano: Kỹ thuật bào chế, phân tích tính chất ứng dụng ngành dược”, Nhà xuất Y học chi nhánh TP HCM, tr 45-55 Phạm Hoàng Hộ, “Cây cỏ Việt Nam”, Xuất lần thứ 2, 2000, Tập 2, trang 421, Nhà xuất trẻ, Thành phố Hồ Chí Minh Trần Quang Hưng, “Nghiên cứu thành phần hóa học hoạt tính sinh học cơm rượu trái hẹp Glycosmis stenocarpa (Drake) Tan.”, Họ Cam Quýt, Luận văn thạc sĩ khoa học hóa học, 2005 TIẾNG ANH Ahmad., K.; Tan., S-P.; Sukari M A.; Ali., A M.; Nafiah., M A., 2014, Cytotoxic and Anti- Tumour Promoting Actives of Carbazole Alkaloid from Malayan Murraya koenigii (L.) Spreng American Journal of Plant Sciences, 5, 2869-2877 Bedford R.B., Betham M., 2006, “N-H Carbazole Synthesis from 2Chloroanilines via Consecutive Amination and C−H Activation”, J Org Chem 71 (25), pp 9403–9410 58 Benavides A., Peralta-J, Delgado F., Tamariz J., 2004, “Total synthesis of the natural carbazoles murrayanine and murrayafoline A, based on the regioselective Diels-Alder addition of exo-2-oxazolidinone dienes”, Synthesis, pp 2499–2504 10 Cuong, N M.; Hung, T Q.; Sung, T V.; Taylor, W C A,, 2004, “New Dimeric Carbazole Alkaloid from Glycosmis stenocarpa Roots” Chem Pharm Bull, 52, 1175 11 Choi., H.; Gwak., J.; Cho., M.; Ryu., M.-J.; Lee., J.-H.; Kim., S K.; Kim., G –Y.; Yun., M –Y.; Cuong., N M.; Shin., J –G.; Song., Oh., S., 2010, “Murrayafoline A attenuates the promoting intracellular β-catenin the degradation of Wnt/b-catenin pathway by proteins” Biochemical and Biophysical Research Communications 391,915–920 12 Gerhard Bringmann, Ledermann A., Holenz J., Kao M T., Antiplasmodial activity of mono – and dimeric carbazoles, Plant Medica, 1998, 64,54-57 13 Hans-Joachim Knolker KethiriR.Reddy, Isolation and Synthesis of Biologically Active Carbazole Alkaloids, Chem.Rev., 2002, 102, 4303-4427 14 Hook DJ, Yacobucci JJ, O’Connor S, Lee M, Kerns E, Krishnan B, Matson J, Hesler G., Identification of the inhibitory activity of carbazomycins B and C against 5- lipoxygenase, a new activity for these compounds, J Antibiot., 1990, 43(10), 1347-1348 15 Ito C, Katsuno S, Itoigawa M, Ruangrungsi N, Mukaimaka T, Okuda M, Kitagawa Y, Tokuda H, Nishino H, Furukawa H, New carbazole alkaloids from Clausena anisata with antitumor promoting acticity, J Nat Prod 2000, 63(1), 125-128 16 Ito, C., Itoigawa, M.; Sato, A.; Hansan, C M; Rashid, M A.; Tokuda H.; Mukainaka, T.; Nishino, H.; Furukawa, H.; Chemical Constituents of Glycosmis arbore: Three New Carbazole Alkaloids and Their Bioagical Acticityl, J Nat Prod., 2004, 67(9), 1488-1491 59 17 Itoigawa M, Kashiwada Y, Ito C, Furukawa H, Tachibana Y, Bastow KW, Lee KH, Antitumor agents 203 Carbazole alkaloid murrayaquinone A and related synthentic carbazolequinones as cytotoxic agents, J Nat Prod., 2000 63(7), 893-897 18 Jusong Wang, Yongtang Zheng, Thomas Efferth, Ruirui Wang, Yuemao Shen and Xiaojiang Hao, Indole and carbazole alkaloids from Glycosmis montana with weak anti- HIV and cytotoxic activities, Phytochemistry, 2005, 66(6), 697-701 19 Jusong Wang, Yongtang Zheng, Thomas Efferth, Ruirui Wang, Yuemao Shen and Xiaojiang Hao, Indole and carbazole alkaloids from Glycosmis montana with weak anti- HIV and cytotoxic activities, Phytochemistry, 2005, 66(6), 677-678 20 Kaneda M, Naid T, Kitahara T, Nakamura S, Hirata T, Suga T., Carbazomycins G and H, novel carbazomycin- congeners containing a quinol moiety, J Antibiot, 1988, 41(5), 605-608 21 Kato S, Shindo K, Kataoka Y, Yamagishi Y, Mochizuki J., Studies on free radical scavenging substances from microorganisms II Neocarazostatins A,B and C, novel free radical scavengers, J Antibiot., 1991; 44(8), 903-907 22 Kato S, Kawasaki T, Urata T, Mochizuki J., In vitro and ex vivo free radical scavenging activities of carazostatin, carbazomycin B and their derivatives, J Antibiot., 1993, 46(12), 1859-1865 23 Kim, J.-C Wang, J., Son, M.-J., Cuong, N.M., Woo, S.-H., 2015, “Sensitization of cardiac Ca2+ release sites by protein kinase C signaling: evidence fro action of murrayafoline A” Pflügers Arch - Eu J Physiol 467, 1607-1621 24 Knolker HJ, Knoll J., First total synthesis of the neuronal cell protecting carbazole alkaloid carbazomadurin A by sequential transition metalcatalyzed reactions, Chem Commun., 2003, 21(10), 1170-1171 60 25 Masanori Somei, Fumio Yamada, Simple indole alkaloids and those with dimeric carbazole alkaloid from Murraya koenigii, Fitoterapia, 1999, 70(2), 130-133 26 Mo CJ, Shin -ya K, Furihata K, Furihata K, Shimazu A, Hayakawa Y, Seto H., Isolation and structural elucidation of antioxidative agents, antiostatins A1 to A4 and B2 to B5, J Antibiot., 1990, 43(10),1337-1340 27 P Bhattacharyya, P K Chakrabartty and B K Chowdhury, Gylcozolidol, an antibacterial carbazole alkaloid from Glycosmis pentaphylla, Phytochemistry, 1985, 24(4), 882-883 28 Ramsewak RS, Nair MG, Strasburg GM, DeWitt DL, Nitiss JL, Biologically active carbazole alkaloids from Murraya koenigii, J Agric Food Chem., 1999, 47(2), 444-447 29 Roy MK, Thalang VN, Trakoontivakorn G, Nakahara K., Mahanine, a carbazole alkaloid from Micromelum minutum, inhibits cell growth and induces apoptosis in U937 cells through a mitochondrial dependent pathway, Br J.Pharmacol 2005, 145(2), 145-155 30 Shin – ya, K., Tanaka, M., Furihata, K., Hayakawa, Y., Seto, H., Structure of carquinostatin a, a new neuronal cell protecting substance produced by Streptomyces exfoliatus, Tetrahedrom Letters, 1993, 34(31), 4943-4944 31 Shin – ya, K., Shimizu S, Kunigami T, Furihata, K, Furihata, K, Seto, H., A new neuronal cell protecting substance, lavanduquinocin, produced by Streptomyces viridochromogenes, J Antibiot., 1995, 48(7), 574-578 32 Sunthitikawinsakul A, Kongkathip N, Kongkathip B, Phonnakhu S, Daly JW, Spande TF, Nimit Y, Rochanaruangrai S., Coumarins and carbazoles from Clausena excacvata exhibited antimycobacterial and antifungal activities , Planta Med., 2003, 69(2), 155, 157 33 Son., M J; Chidipi., B.; Kim., J-C.; Huong., T T.; Tai., B H.; Kim., Y H.; Cuong., N M,; Woo., S H, 2014, “Alterations of contractions and L-type 61 Ca2+currents by murrayafoline-A inr at ventricular myocytes”, European Journal of Pharmacology 740, pp 81–87 34 Tanaka M, Shin-ya K, Furihata K, Seto H., Isolation and structural elucidation of antioxidative substances, carbazoquinocins A to F, J Antibiot., 1995, 48(4), 326-328 35 Tachibana Y, Kikuzaki H, Lajis NH, Nakatani N., Comparison of antioxidative properties of carbazole alkaloids from Murraya koenigii leaves, J Agric Food Chem., 2003, 51(22), 6461- 6467 36 Tian- Shung, W., Shiow-Chyn, H., Pei-Lin, W., Carbazole alkaloids from Murraya koenigii, J Nat Prod., 2003, 66(3), 416- 418 37 Takeya K, Itoigawa, M., Furukawa, H., Triphasic intropic response of guinea-pig papillary muscle to murrayaquinone –A isolated from Rutaceae, Eur J Pharmacol., 1989, 169(1), 137-145 38 Wu, T.-S., Huang, S.-C., Wu, P., Lee, K.-H., Structure and synthesis of clausenaquione-a A novel carbazolequinone alkaloid and bioactive principle from Clausena, Bioorg Med Chem Lett., 1994, 4(20), 2395-2398 P1 PHỤ LỤC PHỔ HPLC CỦA MU-A VÀ CÁC PHÂN ĐOẠN CAO CHIẾT CHỨA MU-A P2 P3 P4