Chẩn đoán bệnh do encephalitozoon cuniculi trên thỏ bằng các phương pháp mô bệnh học

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM PHẠM THỊ THƯỢC CHẨN ĐOÁN BỆNH DO ENCEPHALITOZOON CUNICULI TRÊN THỎ BẰNG CÁC PHƯƠNG PHÁP MÔ BỆNH HỌC Ngành: Mã số: Người hướng dẫn khoa học: Thú y 8.64.01.01 TS Trần Thị Đức Tám NHÀ XUẤT BẢN HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP - 2020 LỜI CAM ĐOAN Tơi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu riêng tôi, kết nghiên cứu trình bày luận văn trung thực, khách quan chưa dùng để bảo vệ lấy học vị Tôi xin cam đoan giúp đỡ cho việc thực luận văn cám ơn, thơng tin trích dẫn luận văn rõ nguồn gốc Hà Nội, ngày… tháng… năm 2020 Tác giả luận văn Phạm Thị Thược i LỜI CẢM ƠN Trong suốt thời gian học tập, nghiên cứu hồn thành luận văn, tơi nhận hướng dẫn, bảo tận tình thầy cô giáo, giúp đỡ, động viên bạn bè, đồng nghiệp gia đình Nhân dịp hồn thành luận văn, cho phép tơi bày tỏ lịng kính trọng biết ơn sâu sắc TS Trần Thị Đức Tám thầy cô môn Giải phẫu - Tổ chức tận tình hướng dẫn, dành nhiều cơng sức, thời gian tạo điều kiện cho suốt trình học tập thực đề tài Tơi xin bày tỏ lịng biết ơn chân thành tới Ban Giám đốc, Ban Quản lý đào tạo, Bộ môn Giải phẫu – Tổ chức, Khoa Thú y - Học viện Nơng nghiệp Việt Nam tận tình giúp đỡ tơi q trình học tập, thực đề tài hồn thành luận văn Tơi xin chân thành cảm ơn tới GS.TS Nguyễn Đăng Hiền tập thể lãnh đạo, cán viên chức Trung tâm nghiên cứu, sản xuất vắc xin sinh phẩm y tế (POLYVAC) giúp đỡ tạo điều kiện cho suốt trình thực đề tài Xin chân thành cảm ơn gia đình, người thân, bạn bè, đồng nghiệp tạo điều kiện thuận lợi giúp đỡ mặt, động viên khuyến khích tơi hồn thành luận văn Hà Nội, ngày… tháng… năm 2020 Tác giả luận văn Phạm Thị Thược ii MỤC LỤC Lời cam đoan i Lời cảm ơn ii Mục lục .iii Danh mục chữ viết tắt v Danh mục bảng vi Danh mục hình vii Trích yếu luận văn ix Thesis abstract x Phần Mở đầu 1.1 Tính cấp thiết đề tài 1.2 Mục tiêu đề tài 1.3 Phạm vi nghiên cứu 1.4 Ý nghĩa đóng góp đề tài Phần Tổng quan tài liệu 2.1 Đặc điểm chung Encephalitozoon cuniculi vi bào tử trùng Microsporidia 2.1.1 Hình thái 2.1.2 Vòng đời phát triển 2.2 Dịch tễ học ký chủ 2.3 Bệnh lý trình sinh lý bệnh 2.4 Một số phương pháp chẩn đoán xác định Encephalitozoon Cuniculi thỏ 2.4.1 Chẩn đoán huyết học 2.4.2 Chẩn đoán sau chết Phần Vật liệu phương pháp nghiên cứu 13 3.1 Đối tượng nghiên cứu 13 3.2 Nội dung nghiên cứu 13 3.3 Thời gian địa điểm nghiên cứu 13 3.4 Thiết bị, nguyên vật liệu, hóa chất 13 3.4.1 Thiết bị, máy móc 13 3.4.2 Nguyên vật liệu hóa chất 14 iii 3.5 Phương pháp nghiên cứu 14 3.5.1 Kiểm tra đại thể 14 3.5.2 Kiểm tra bệnh lý vi thể 15 3.5.3 Nhuộm Gram 16 3.5.4 Nhuộm hóa mô miễn dịch 17 3.5.5 Phương pháp xử lý số liệu 18 Phần Kết thảo luận 19 4.1 Kết kiểm tra đại thể vi thể 19 4.2 Kết kiểm tra bệnh học vi thể 20 4.3 Kết đánh giá bệnh tích vi thể bệnh phẩm nhuộm Gram 30 4.4 Kết đánh giá biến đổi vi thể mẫu bệnh phẩm nhuộm hóa mơ miễn dịch (IHC) 32 4.5 So sánh tác dụng chẩn đoán ba phương pháp chẩn đốn mơ bẹnh học 37 Phần Kết luận kiến nghị 40 5.1 Kết luận 40 5.2 Kiến nghị 40 Tài liệu tham khảo 41 iv DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT Ký hiệu Tiếng Anh Tiếng Việt HE Hematoxylin Eosin staining Phương pháp nhuộm Hematoxylin Eosin IHC Immunohistochemmistory staning Phương pháp nhuộm hóa mơ miễn dịch PBS Phosphate buffer saline Dung dịch muối đệm phốt phát DAB Diamino Bezidin Chất tạo màu PV Parasitophorous vacuoles Không bào ký sinh trùng v DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1 Đặc điểm hình thái siêu cấu trúc số loài vi bào tử trùng gây bệnh phổ biến động vật có vú (Wasson & Peper, 2000) Bảng 4.1 Kết tổn thương đại thể quan 19 Bảng 4.2 Tổn thương mô học não thận 21 Bảng 4.3 Phân bố tổn thương hệ thần kinh trung ương 23 Bảng 4.4 Kết xác định có mặt tổn thương E cuniculi phương pháp nhuộm chẩn đoán 37 vi DANH MỤC HÌNH Hình 2.1 Sơ đồ (bên trái) hình ảnh kính hiển vi điện tử (bên phải) vi bào tử trùng Microsporidia Hình 2.2 Con đường vi bào tử trùng microsporidia xâm nhập vào tế bào ký chủ Hình 4.1 Sung huyết màng não thỏ số 20 Hình 4.2 Bề mặt thận thỏ số 25 xuất lồi lõm dạng điểm màu đỏ lan tỏa 20 Hình 4.3 Não thỏ số 10 U hạt loại 1; u hạt có hoại tử trung tâm (nhuộm HE, thước = 100 µm) 23 Hình 4.4 Não thỏ số 10 U hạt loại 2; u hạt khơng có hoại tử trung tâm, nhuộm HE, thước = 100µm 24 Hình 4.5 Não thỏ số 13, viêm xung huyết màng não, màng não dày lên, nhuộm HE, thước = 100 µm 24 Hình 4.6 Não thỏ số 2, thâm nhiễm tế bào viêm quanh mạch máu (viêm quanh mạch), nhuộm HE, thước = 100 µm 25 Hình 4.7 Não thỏ số 12, khơng bào tế bào ký chủ, nhuộm HE, thước = 20 µm 25 Hình 4.8 Thận thỏ số 5, thâm nhiễm tế bào viêm khu vực kẽ thận (viêm kẽ thận), nhuộm HE, thước = 20 µm 27 Hình 4.9 Thận thỏ số 9, xơ hóa khu vực vỏ thận, nhuộm HE, thước = 200 µm 27 Hình 4.10 Gan thỏ số 17, viêm xơ hóa nặng phá vỡ cấu trúc tiểu thùy gan, nhuộm HE, thước = 200 µm 29 Hình 4.11 Phổi thỏ số 21, viêm u hạt khu trú, nhuộm HE, thước = 100 µm 29 Hình 4.12 Não thỏ số 1, bào tử bắt màu Gam (+) không bào E cuniculi mạng thần kinh, thước = 30 µm 30 Hình 4.13 Não thỏ số 3, bào tử bắt màu Gram (+) tự khu vực hoại tử u hạt, thước = 30 µm 31 Hình 4.14 Thận thỏ số 5, bào tử Gram (+) không bào ký sinh trùng tế bào biểu mô ống thận, nhuộm Gram, thước = 30 µm 31 Hình 4.15 Thận thỏ số 5, bào tử Gram (+) không bào ký sinh trùng tế bào biểu mô ống thận, thước = 30 µm 31 Hình 4.16 Thận thỏ số 5, bào tử Gram (+) xuất tự xoang bowman, thước = 50 µm 32 vii Hình 4.17 Não thỏ số 2, bào tử PV dương tính với kháng thể E cuniculi khu vực mạng thần kinh, nhuộm IHC, thước = 30 µm 33 Hình 4.18 Não thỏ số 25, bào tử PV dương tính với kháng thể E cuniculi gần u hạt, nhuộm IHC, thước = 30 µm 33 Hình 4.19 Não thỏ số 3, bào tử tự dương tính với kháng thể E cuniculi khu vực hoại tử u hạt đại não, nhuộm IHC với chất tạo màu DAB, thước = 50 µm 34 Hình 4.20 Não thỏ số 2, bào tử tự dương tính với kháng thể E cuniculi khu vực chất xám tiểu não, nhuộm IHC với chất tạo màu DAB, thước = 50 µm 34 Hình 4.21 Thận thỏ số 5, bào tử PV dương tính với kháng thể E cuniculi tế bào biểu mơ ống thận, nhuộm IHC, thước = 30 µm 35 Hình 4.22 Thận thỏ số 6, bào tử tự nội bào dương tính với kháng thể E cuniculi khu vực bị viêm, nhuộm IHC, thước = 50 µm 35 Hình 4.23 Thận thỏ số 13, bào tử PV dương tính với kháng thể E cuniculi biểu mô mạch máu, nhuộm IHC, thước = 30 µm 36 viii TRÍCH YẾU LUẬN VĂN Tên tác giả: Phạm Thị Thược Tên luận văn: Chẩn đoán bệnh Encephalitozoon cuniculi thỏ phương pháp mô bệnh học Ngành: Thú y Mã số: 8.64.01.01 Tên sở đào tạo: Học viện Nơng nghiệp Việt Nam Mục đích nghiên cứu Xác định biến đổi mô bệnh học số quan thỏ trắng New Zaeland nhân nuôi cho kiểm đinh dược phẩm Encephalitozoon cuniculi (E cuniculi) có mặt bào tử E cuniculi mô số phương pháp mô học (HE, Gram, hóa mơ miễn dịch – IHC) Nghiên cứu sở lựa chọn phương pháp chẩn đoán phát E cuniculi bệnh E cuniculi thỏ phù hợp với điều kiện nhân nuôi Việt Nam Phương pháp nghiên cứu Phương pháp mổ khám đánh giá biến đổi đại thể Các mẫu bệnh phầm não, thận, phổi, gan, tim ruột cố định dung dịch formalin 10%, nhuộm Hematoxylin Eosin (HE), nhuộm Gram hóa mơ miễn dịch (IHC) Mức độ tổn thương vi thể xác định tiêu nhuộm HE Sự có măt bảo tử E cuniculi xác định tiêu nhuộm HE nhuộm Gram Phân bố kháng nguyên E cuniculi mẫu mô khẳng định tiêu nhuộm IHC Kết kết luận Trong số 25 thỏ kiểm tra, tổn thương vi thể đặc trưng gồm viêm não u hạt kết hợp với viêm kẽ thận quan sát phát 21 thỏ Những tổn thương hệ thần kinh trung ương gồm viêm u hạt, viêm màng não viêm quanh mạch Cả ba tổn thương xuất chủ yếu đại não, u hạt thấy đại não Mức độ tổn thương từ nhẹ đến trung bình khơng có tổn thương nặng Những tổn thương thận gồm viêm kẽ thận xơ hóa thận Chẩn đốn tác nhân gây bệnh xác định bào tử qua nhuộm HE 2/21 thỏ (chiếm 9,5%); nhuộm Gram với 15/21 thỏ dương tính (71%) IHC cho thấy 17/21 thỏ (chiếm 81%) xuất kháng nguyên E cuniculi mẫu bệnh phẩm Kết nghiên cứu cho thấy, thỏ trắng New Zealand nhiễm E cuniculi với tỷ lệ cao Nhuộm HE sử dụng chẩn đoán sàng lọc phương pháp nhuộm Gram IHC dùng cho khẳng định diện E cuniculi mẫu bệnh phẩm Vì vậy, tùy điều kiện sở cần cân nhắc để lựa chọn phương pháp chẩn đoán phù hợp ix bào, tương bào, bạch cầu dị màu (heterophil) Một số ống mật phình to, biểu mơ ống mật thối hóa hoại tử, bên lòng ống chứa nhiều cầu trùng giai đoạn shelled oocytes Xung quanh oocytes với vỏ bọc có thâm nhiễm loại tế bào đại thực bào, tế bào dạng biểu mô, tế bào khổng lồ đa nhân, tế bào viêm đến để thực bào oocytes Thành ống mật dày lên có tượng viêm, xơ xuất ống mật Một thỏ (số 17) số 23 trường hợp có tổn thương xơ hóa viêm nặng vùng quãng cửa ống mật tiểu thùy gan Tế bào viêm thâm nhiễm chủ yếu lymphocyte, tương bào, tế bào khổng lồ heterophils Khu vực xơ hóa với tăng nhiều nguyên bào sợi collagen Tổn thương xơ hóa mức độ nặng làm phá vỡ cấu trúc tiểu thùy gan (hình 4.10) Tổn thương phổi: Chỉ có 25 thỏ kiểm tra bệnh lý quan sát thấy tổn thương.Tổn thương ổ viêm u hạt khu trú thùy sau phổi phải thỏ số 21 Khu vực viêm quan sát thấy xuất tế bào đại thực bào dạng biểu mơ, lympho bào, tương bào (Hình 4.11) Như số 25 thỏ kiểm tra bệnh lý có 21 thỏ quan sát thấy tổn thương mơ học đặc trưng bệnh Encephalitozoonosis viêm não u hạt kết hợp với viêm kẽ thận; thỏ có tổn thương viêm kẽ thận thỏ có tổn thương phổi (thỏ số 25) Hình 4.10 Gan thỏ số 17, viêm xơ hóa nặng phá vỡ cấu trúc tiểu thùy gan, nhuộm HE, thước = 200 µm Hình 4.11 Phổi thỏ số 21, viêm u hạt khu trú, nhuộm HE, thước = 100 µm 29 4.3 KẾT QUẢ ĐÁNH GIÁ BỆNH TÍCH VI THỂ TRÊN BỆNH PHẨM ĐƯỢC NHUỘM GRAM Bệnh tích vi thể hệ thần kinh trung ương Trong số 21 thỏ có tổn thương viêm não, mẫu bệnh phẩm từ não 13 thỏ nhuộm Gram xuất vi bào tửvới kích thước khoảng 1x2 µm đó: 12 trường hơp xuất đại não, trường hợp hành não Các bào tử Gram (+) tồn dạng sau: Dạng thứ nằm cấu trúc dạng túi (parasiphorous vacuoles PV), dạng phát gần u hạt xuất khu vực mạng thần kinh (neuropil) nơi khơng có tổn thương (Hình 4.12) Dạng thứ hai bào tử xuất tự Dạng nằm rải rác khu vực hoại tử u hạt loại (Hình 4.13) Bệnh tích thận: Trong 23 thỏ có tổn thương viêm kẽ thận thấy trường hợp có bào tử với kích thước khoảng 1x2 µm, dương tính với nhuộm Gram Các bào tử tập trung không bào E cuniculi tế bào biểu mô ống thận vùng tủy vùng vỏ thận, đặc biệt thường quan sát thấy biểu mơ ống góp thuộc vùng tủy thận (hình 4.14); 01 trường hợp có bào tử xuất tự lịng ống thận (hình 4.15); 01 trường hợp có bào tử xuất tự xoang Bowman cầu thận vùng vỏ (Hình 4.16) Hình 4.12 Não thỏ số 1, bào tử bắt màu Gam (+) không bào E cuniculi mạng thần kinh, thước = 30 µm 30 Hình 4.13 Não thỏ số 3, bào tử bắt màu Gram (+) tự khu vực hoại tử u hạt, thước = 30 µm Hình 4.14 Thận thỏ số 5, bào tử Gram (+) không bào ký sinh trùng tế bào biểu mô ống thận, nhuộm Gram, thước = 30 µm Hình 4.15 Thận thỏ số 5, bào tử Gram (+) không bào ký sinh trùng tế bào biểu mô ống thận, thước = 30 µm 31 Hình 4.16 Thận thỏ số 5, bào tử Gram (+) xuất tự xoang bowman, thước = 50 µm Khi nghiên cứu tổn thương gây E cuniculi thận, tác giả Flatt & Jackson (1970) quan sát thấy cụm bào tử Gram (+) hình que tế bào biểu mô ống thận, thường biểu mô ống góp Các vi bào tử trùng có kích thước khoảng 1x2µm, xuất thành nhóm chứa đầy tế bào chất Khơng có phản ứng viêm liên quan đến không bào ký sinh trùng Thỉnh thoảng lịng ống góp thận có chứa mảnh vụn tế bào nhóm nhỏ vi bào tử trùng Một nghiên cứu gần Mexico Luis & cs (2017) mô tả bào tử E cuniculi nhuộm Gram Nhóm tác giả thực nhuộm hóa mơ với 14 phương pháp nhuộm khác cho mô thận thỏ bị nhiễm E cuniculi Bào tử có cấu trúc hình bầu dục màu xanh đậm màu rõ Cấu trúc bên bào tử quan sát thấy Bệnh tích mẫu bệnh phẩm gan phổi nhuộm Gram Không quan sát thấy tác nhân gây bệnh nhuộm Gram gan tất 21 thỏ phổi thỏ số 25 4.4 KẾT QUẢ ĐÁNH GIÁ BIẾN ĐỔI VI THỂ MẪU BỆNH PHẨM NHUỘM HĨA MƠ MIỄN DỊCH (IHC) Đã phát tín hiệu đặc hiệu (specific signal) não thận não thận thơng qua nhuộm hóa mơ miễn dịch có sử dụng kháng thể E cuniculi 32 Biến đổi vi thể mẫu bệnh phẩm hệ thần kinh trung ương nhuộm IHC: Trong số 21 thỏ nghiên cứu, 13 thỏ phát có xuất kháng nguyên E cuniculi não Cả dạng bào tử quan sát nhuộm Gram quan sát thấy tín hiệu đặc hiệu nhuộm hóa mơ miễn dịch (hình 4.17, 4.18, 4.19) Ngồi ra, cịn thấy dạng bào tử tự lớp hạt tiểu não (hình 4.20) Kháng nguyên E cuniculi quan sát thấy khu vực chất xám vỏ đại não (12/13 trường hợp), hành não (2/13 trường hợp) tiểu não (1/13 trường hợp) Hình 4.17 Não thỏ số 2, bào tử PV dương tính với kháng thể E cuniculi khu vực mạng thần kinh, nhuộm IHC, thước = 30 µm Hình 4.18 Não thỏ số 25, bào tử PV dương tính với kháng thể E cuniculi gần u hạt, nhuộm IHC, thước = 30 µm 33 Hình 4.19 Não thỏ số 3, bào tử tự dương tính với kháng thể E cuniculi khu vực hoại tử u hạt đại não, nhuộm IHC với chất tạo màu DAB, thước = 50 µm Hình 4.20 Não thỏ số 2, bào tử tự dương tính với kháng thể E cuniculi khu vực chất xám tiểu não, nhuộm IHC với chất tạo màu DAB, thước = 50 µm Biến đổi vi thể tiêu bệnh phẩm từ thận nhuộm IHC: Quan sát thấy hình thức tồn kháng nguyên thận Dạng thức thứ vi bào tử trùng khơng bào kí sinh trùng tế bào biểu mơ ống thận tế bào biểu mô mạch máu (đặc biệt biểu mơ ống góp vùng 34 tủy thận) (Hình 4.21, 4.23) Dạng thứ xuất tự lòng ống thận (thỏ số 5) Dạng thứ xuất trung tâm khu vực bị viêm kẽ (thỏ số 7) (Hình 4.22) 9/23 thỏ kiểm tra quan sát kháng nguyên E cuniculi Các vi bào tử trùng quan sát thấy chủ yếu vùng tủy thận (8/9 trường hợp), thấy xuất vùng tủy vỏ thận (1/9 trường hợp) Hình 4.21 Thận thỏ số 5, bào tử PV dương tính với kháng thể E cuniculi tế bào biểu mô ống thận, nhuộm IHC, thước = 30 µm Hình 4.22 Thận thỏ số 6, bào tử tự nội bào dương tính với kháng thể E cuniculi khu vực bị viêm, nhuộm IHC, thước = 50 µm 35 Hình 4.23 Vi bào tử khơng bào dương tính với kháng thể E cuniculi biểu mô mạch máu (mũi tên chỉ, nhuộm IHC, thước = 30 µm Những kết quan sát tác nhân nhuộm đặc hiệu có nhiều điểm tương đồng với số nghiên cứu công bố trước Theo kết nghiên cứu Miriam & cs (2013), nhuộm hóa mơ miễn dịch mẫu mô (não, tim, gan, thận, phổi ruột) thỏ nhiễm bệnh Encephalitozoonosis kháng nguyên E cuniculi quan sát chủ yếu não thận Qua nhuộm hóa mơ miễn dịch quan sát thấy dạng kháng nguyên Dạng thứ nhất, bào tử tồn không bào ký sinh trùng với hình dáng phân biệt Dạng thứ 2, nhiễm sắc chất dạng hạt co cụm, ngoại bào nội bào đến tế bào hoại tử lòng ống thận Dạng thứ dạng hạt trung tâm hoại tử ổ viêm Nghiên cứu Giordano & cs (2005) sử dụng phương pháp hóa mơ miễn dịch để xác định E cuniculi thỏ bị viêm màng hắc mạc Kết cho thấy bào tử phản ứng với kháng huyết kháng E cuniculi tất mẫu Thỉnh thoảng bào tử xuất đại thực bào tế bào biểu mô thủy tinh thể Dựa kết thu được, nhóm tác giả cho nhuộm hóa mơ miễn dịch cơng cụ hữu ích xác định có mặt vị trí khu trú bào tử E cuniculi mẫu mô Flatt & Jackson (1970) cho bào tử tập trung lại với tế bào biểu mô ống thận giải phóng khơng bào ký sinh trùng bị vỡ Sau không bào bị vỡ, chúng xâm nhập vào mơ kẽ khởi phát trình viêm vào lòng ống thận Khi vào lòng ống thận, 36 chúng theo ống thận nhiễm vào tế vào biểu mơ khác vào đường tiết niệu Sau vào đường tiết niệu ngồi bào tử nhiễm vào ký chủ Khi tiêu hóa ký chủ mới, vi bào tử trùng xâm nhập vào niêm mạc đường tiêu hóa sau xâm nhập vào phần khác thể 4.5 SO SÁNH TÁC DỤNG CHẨN ĐỐN CỦA BA PHƯƠNG PHÁP CHẨN ĐỐN MƠ BỆNH HỌC ĐỂ CHẨN ĐOÁN NHIỄM E.CUNICULI Kết phương pháp sử dụng để xác định Encephalitozoon cuniculi thể bảng 4.4 Bảng 4.4 Kết xác định có mặt tổn thương E cuniculi phương pháp nhuộm chẩn đoán STT 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 Tổng số HE + + + + + + + + + + + +, + + + + + + + + + +, + 21/25 Não Nhuộm Gram Nhuộm IHC + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + - + 13/21 + 13/21 HE + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + 23/25 Thận Nhuộm Gram + + + + - Nhuộm IHC + + + + + + - + + - + + 6/21 + 9/21 Trong - : khơng tổn thương đặc trưng khơng có vi bào tử trùng kháng nguyên E cuniculi + : có tổn thương đặc trưng có vi bào tử trùng kháng nguyên E cuniculi 37 Kết từ bảng 4.4 cho thấy phương pháp nhuộm HE phát 21 thỏ có tổn thương đặc trưng Encephalitozoonosis (viêm não màng não kết hợp với viêm kẽ thận), có thỏ (thỏ số 12 25, chiếm 9,5%) quan sát vi bào tử trùng E cuniculi cho kết dương tính nhuộm Gram hóa mơ miễn dịch 15/21 trường hợp (chiếm 71%) quan sát vi bào tử trùng nhuộm Gram não thận não thận 17/21 trường hợp (chiếm 81%) kháng nguyên Encephalitozoon cuniculi phát nhuộm IHC não thận não thận Như vậy, tỷ lệ quan sát bào tử/kháng nguyên E cuniculi mẫu mô thỏ nhiễm bệnh Encephalitozoonosis theo phương pháp nhuộm HE thấp nhất, sau đến nhuộm Gram có cao phương pháp nhuộm IHC Nhuộm HE xem phương pháp nhuộm thường quy để kiểm tra mẫu mô thỏ bị nhiễm tác nhân E cuniculi Những biến đổi bệnh lý quan sát (chủ yếu viêm não u hạt khơng có mủ viêm kẽ thận) dấu hiệu bệnh Encephalitozoonosis thỏ Tuy nhiên, phương pháp khó xác định bào tử tác nhân có kích thước nhỏ bào tử xuất có màu từ hồng đến tím (Luis & cs., 2017) dễ lẫn với màu Trong với phương pháp nhuộm Gram, bào tử E cuniculi xuất với cấu trúc hình bầu dục màu xanh đậm bật màu màu hổ phách dễ quan sát Tác giả La’toya & cs (2014) cho bào tử E cuniculi xác định không bào ký sinh trùng phương pháp nhuộm Gram cho kết tốt Ngoài ra, nhuộm Gram sử dụng chẩn đốn phân biệt E cuniculi với T gondii, Sarcocystis spp, Pneumocystis spp, Cryptosporidium cuniculi Neospora caninum Những tác nhân gây tổn thương mơ học có hình dạng tương tự E cuniculi, lại không làm màu Gram (La’toya & cs., 2014) Trong nghiên cứu gần tác giả Luis & cs (2017) sử dụng 14 phương pháp nhuộm hóa mơ (bao gồm alcian blue, calcofluor white, Giemsa, Gram, Grocott, HE, Luna, Luxol fast blue, Masson trichorome, modified trichorome stain, periodic acid Schiff reaction (PAS), Van Gieson, Warthin Starry Ziehl – Neelsen) để nhuộm bào tử E cuniculi chứng minh nhuộm Gram phương pháp nhuộm cho kết tốt 38 Qua phương pháp nhuộm IHC quan sát thấy kháng nguyên E cuniculi với tỷ lệ cao mô não thận Đồng thời, qua nhuộm IHC quan sát thấy vị trí khu trú tác nhân Do đó, chúng tơi cho q trình chẩn đốn bệnh Encephalitozoonosis thỏ sau chết cần phải thực phương pháp nhuộm Gram nhuộm hóa mơ miễn dịch kết hợp đồng thời với nhuộm HE 39 PHẦN KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 5.1 KẾT LUẬN Tổn thương bệnh lý vi thể đặc trưng bệnh E cuniculi viêm não màng não u hạt kết hợp với viêm kẽ thận quan sát 21/25 thỏ kiểm tra Những tổn thương hệ thần kinh trung ương bao gồm viêm u hạt, viêm màng não viêm quanh mạch Cả tổn thương xuất chủ yếu đại não, đặc biệt u hạt thấy đại não khu vực khác tiểu não, hành não, tủy sống không thấy xuất Mức độ tổn thương 21 thỏ từ nhẹ đến trung bình khơng có trường hợp nặng Những tổn thương thận gồm viêm kẽ thận xơ hóa thận Trong chẩn đoán tác nhân gây bệnh, phương pháp nhuộm Hematoxylin eosin có độ nhậy thấp nhất, phát mầm bệnh 9,5% số thỏ bệnh, hai kỹ thuật Gram hóa mơ miễn dịch có độ nhạy cao hơn, tương ứng 71 81% Trong nghiên cứu này, kiểm tra bệnh lý ngẫu nhiên 25 thỏ thấy có 21 thỏ có biến đổi bệnh lý vi thể đặc trưng bệnh Encephanitozoonosis Do đó, chúng tơi cho nguy nhiễm E.cuniculi đàn thỏ lớn Để chẩn đoán Encephalitozoonosis thỏ sau chết nên sử dụng phương pháp nhuộm hóa mơ miễn dịch nhuộm Gram kết hợp với nhuộm HE để mang lại hiệu chẩn đoán cao Tùy điều kiện sở nhân nuôi, cần cân nhắc để lựa chọn phương pháp chẩn đoán phù hợp 5.2 KIẾN NGHỊ Áp dụng phương pháp chẩn đoán E cuniculi thỏ Việt Nam bao gồm nhuộm HE mẫu mô não thận để xác định tổn thương mô học bệnh lý đặc trưng bệnh, đồng thời nhuộm hóa mơ miễn dịch nhằm xác định xác kháng nguyên E cuniculi mẫu mô nhuộm Gram xác định tác nhân gây bệnh nhằm đem lại hiệu chẩn đoán cao 40 TÀI LIỆU THAM KHẢO Boot R, Hansen C, Nozari N, Thuis H (2000) Comparison of assays for antibodies to Encephalitozoon cuniculi in rabbits Lab Anim 34(3):281–289 Canning E & Lom J (1986) The Microsporidia of vertebrates Academic, London Chalupsky J., Vavra J & Gaudin J (1990) Mise en evidence serologique de la presence d‘encephalitozoonose et de toxoplasmose chez le lapin de Gareene (Oryctolagus cuniculus) en France Bull Soc Franc Parasitol 8: 91-95 Cox & Gallichio H A (1978) Serological and histological studies on adult rabbits with recent naturally acquired encephalitozoonosis Research in Veterinary Science (UK) Cox H., Hamilton R C & Attwood H D (1979) An investigation of the route and progression of Encephalitozoon cuniculi infection in adult rabbits The Journal of Protozoology 26(2): 260-265 Cox J & Ross J (1980) A serological survey of Encephalitozoon cuniculi infection in the wild rabbit in England and Scotland Res Vet Sci 28: 396 Csokai J., Gruber A., Künzel F., Tichy A & Joachim A (2009) Encephalitozoonosis in pet rabbits (Oryctolagus cuniculus): pathohistological findings in animals with latent infection versus clinical manifestation Parasitol Res 104: 629-635 Didier E., Orenstein J M., Aldras A., Bertucci D., Rogers L B & Janney A (1995a) Comparison of three staining methods for detecting microsporidia in fluids J Clin Microbiol 33: 3138-3145 Eröksüz Y., Eröksüz H., Özer H., Cevik A & Ünver Ö (1999) A survey of Encephalitozoon cuniculi infection in rabbit colonies in Elazig, Turkey: pathomorphologic and serologic (carbonimmunoassay test) studies Isr J Vet Med 54: 73-77 Flatt R E & Jackson S J (1970) Renal nosematosis in young rabbits Path Vet 7: 492-497 Franzen C (2005) How microsporidia invade cells? Folia parasitologica 52(1/2): 36 Franzen C (2008) Microsporidia: a review of 150 years of research (2008 Jan 17) The Open Parasitology Journal 2(1) Fujikawa T., Hovel G J R, HäNninen O K & World H.O ( 1993) Veterinary Public Health Unit Guidelines for breeding and care of laboratory animals World Health Organization 169: 65-68 41 Giordano C., Weigt A., Vercelli A., Rondena M., Grilli G & Giudice C (2005) Immunohistochemical identification of Encephalitozoon cuniculi in phacoclastic uveitis in four rabbits Veterinary ophthalmology 4: 271-275 Harcourt-Brown F (2002) Textbook of rabbit medicine Butterworth-Heinemann Oxford Harcourt-Brown F M (2004) Encephalitozoon cuniculi infection in rabbits Semin Avian Exot Pet Med 13: 86-93 Harcourt-Brown F M & Holloway H K R (2003) Encephalitozoon cuniculi in pet rabbits Veterinary Record 152: 427-431 Igarashi M., Oohashi E., Dautu G., Ueno A., Kariya T & Furuya K (2008) High seroprevalence of Encephalitozoon cuniculi in pet rabbits in Japan J Vet Med Sci 70(12): 1301-1304 Jordan CN, Zajac AM, Lindsay DS (2006) Encephalitozoon cuniculi infection in rabbits Compend Contin Educ Vet 28:108–116 Künzel F & Joachim A (2010) Encephalitozoonosis in rabbits Parasitol Res 106 299-309 La’toya V L., Charles W B & Nicole R W (2014) Encephalitozoon cuniculi in pet rabbits: diagnosis and optimal managemen Veterinary Medicine: Research and Reports 5: 169-180 Luis R.-T L E., Villarreal-Marroquín A & Nevárez-Garza A.M (2017) Histochemical study of Encephalitozoon cuniculi spores in the kidneys of naturally infected New Zealand rabbits J Vet Diagn Invest 29(3): 269-277 Mathis A (2000) Microsporidia: emerging advances in understanding the basic biology of these unique organisms Int J Parasitol 30: 795-804 Mathis A., Weber R & Deplazes P (2005) Zoonotic potential of the microsporidia Clin Microbiol Rev 18: 423-445 Miriam L, Kaspar M, Heinz Rinder Value of histopathology, immunohistochemistry, and realtime polymerase chain reaction in the confirmatory diagnosis of Encephalitozoon cuniculi infection in rabbits J Vet Diagn Invest, 2013; 25(1):16-26 Nast R, Middleton DM, Wheler CL (1996) Generalized encephalitozoonosis in a Jersey wooly rabbit Can Vet J 37:303–305 Pakes SP, Gerrity LW (1994) Protozoal Diseases In: Manning PJ, Ringler DH, Newcomer CE (eds) The biology of the laboratory rabbit, 2nd edn Academic, London, pp 205–224 Pan Y., Wang S., Liu X., Li R., Sun Y & Gadahi J A (2015) Seroprevalence of Encephalitozoon cuniculi in Humans and Rabbits in China 10(2): 290-295 42 Phạm Thị Thược, Ikeda Manabu, Nguyễn Đăng Hiền, Nguyễn Thúy Hường, Ngô Thu Hường, Nguyễn Thị Nguyệt & Phạm Hữu Tiến (2018) Nhiễm trùng Encephalitozoon cuniculi thỏ thí nghiệm sơ chăn ni Việt Nam năm 2015 Tạp chí y học dự phòng 28(1): 68-76 Shadduck J A., Watson W T., Pakes S P & Cali A (1979) Animal infectivity of Encephalitozoon cuniculi J Parasitol 65: 123-129 Shin J C., Kim D.G., Kim S.H., Kim S & Song K.H (2014) Seroprevalence of Encephalitozoon cuniculi in Pet Rabbits in Korea Korean J Parasitol 52(3): 321-323 Stephen W B., Stephen M G & Dean H P (2016) Pathology of laboratory rodents and rabbits Fourth edition Wiley-Blackwell 293-295 Suckow M A., Stevens K.A & Wilson R.P (2012) The Laboratory Rabbit, Guinea Pig, Hamster, and Other Rodents 1st Edition The American College of Laboratory Animal Medicine 424-426 Tee K Y., Kao J.P., Chiu H.Y., Chang M.H., Wang J.H., Tung K.C., Cheng F.P & Wu J.T (2011) Serological survey for antibodies to Encephalitozoon cuniculi in rabbits in Taiwan Vet Parasitol 83(1-2): 68-71 Wasson K & Peper R L (2000) Mammalian microsporidiosis Vet Pathol 37(113-128) Wesonga H O & Munda M (1992) Rabbit encephalitozoonosis in Kenya Laboratory animals 26(3): 219-221 Wilson J M (1979) Encephalitozoon cuniculi in wild European rabbits and a fox Research in veterinary science 26(1): 114-114 43