Nghiên cứu ảnh hưởng của loại chất mang, tỷ lệ của tế bàochất mang đến hiệu suất cố định và khả năng phân giairhistamin của chủng exiguobacterium profundum ch21

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM KHOA CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM  TRẦN THỊ THU HẰNG KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP NGHIÊN CỨU ẢNH HƯỞNG CỦA LOẠI CHẤT MANG, TỶ LỆ CỦA TẾ BÀO/CHẤT MANG ĐẾN HIỆU SUẤT CỐ ĐỊNH VÀ KHẢ NĂNG PHÂN GIẢI HISTAMIN CỦA CHỦNG Exiguobacterium profundum CH2.1 Hà Nội – 09/2021 HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM KHOA CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM  KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP NGHIÊN CỨU ẢNH HƯỞNG CỦA LOẠI CHẤT MANG, TỶ LỆ CỦA TẾ BÀO/CHẤT MANG ĐẾN HIỆU SUẤT CỐ ĐỊNH VÀ KHẢ NĂNG PHÂN GIẢI HISTAMIN CỦA CHỦNG Exiguobacterium profundum CH2.1 Người thực : Trần Thị Thu Hằng MSV : 620952 Khóa : 62 Ngành : Công Nghệ Thực Phẩm Giáo viên hướng dẫn : PGS.TS Nguyễn Hồng Anh Bộ mơn : Hóa sinh – CNSHTP Hà Nội – 09/2020 LỜI CAM ĐOAN Em xin cam đoan rằng, tất số liệu kết nghiên cứu khóa luận xác trung thực, giúp đỡ cho việc thực khóa luận cảm ơn thơng tin trích dẫn chun đề ghi rõ nguồn gốc Hà Nội, ngày tháng năm 2021 Sinh viên thực Trần Thị Thu Hằng i LỜI CÁM ƠN Để hồn thành khóa luận tốt nghiệp này, bên cạnh nỗ lực thân, em nhận động viên giúp đỡ lớn từ nhiều cá nhân tập thể Lời em xin gửi lời cảm ơn tới thầy cô cán Học viện Nơng nghiệp Việt Nam dạy bảo tận tình tạo điều kiện thuận lợi để em học tập suốt năm học vừa qua Em xin bày tỏ lịng kính trọng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS Nguyễn Hoàng Anh, ThS Phạm Thị Dịu, ThS Nguyễn Thị Hồng, Cử nhân Nguyễn Thị Phương Anh, Cử nhân Nguyễn Thị Huyền phịng thí nghiệm Trung tâm Khoa học Công nghệ thực phẩm - người nhiệt tình hướng dẫn, bảo, giúp đỡ em suốt q trình làm khóa luận Đồng thời em muốn nói lời cảm ơn chân thành bạn nhóm khóa luận ln đồng hành, khích lệ, hỗ trợ em khóa luận Cuối cùng, em tự cảm thấy thân kiến thức, tầm hiểu biết cịn hạn hẹp nên luận chưa thực đầy đủ Em mong nhận đóng góp ý kiến, nhận xét quý thầy cô bạn để luận em hoàn thiện Em xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày tháng năm 2021 Người thực Trần Thị Thu Hằng ii DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT VÀ KÍ HIỆU Tên đầy đủ Chữ viết tắt BME β-mercaptoethanol EDTA Ethylene Diamine Tetracetic Acid FAO Food and Agriculture Organization of the United Nations HA Môi trường Halophilic HPLC High-performance liquid chromatography (Sắc ký lỏng hiệu cao) OPA O-Phthalaldehyde TCVN Tiêu chuẩn Việt Nam iii MỤC LỤC PHẦN I: MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề 1.2 Mục tiêu nghiên cứu đề tài 1.2.1 Mục đính 1.2.2 Yêu cầu PHẦN II: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Nước mắm 2.2 Histamin 2.2.1 Giới thiệu chung histamin 2.2.2 Sự hình thành histamin nước mắm 2.2.3 Tác hại histamin thể người 2.2.4 Phương pháp làm giảm hàm lượng histamin thực phẩm 2.3 Tổng quan phương pháp cố định tế bào 10 2.3.1 Phương pháp hấp phụ 10 2.3.2 Phương pháp liên kết chéo 11 2.4 11 Tổng quan chất mang 2.4.1 Khái niệm chất mang vi sinh vật 11 2.4.2 Yêu cầu lựa chọn chất mang vi sinh vật 11 2.4.3 Chất mang 12 2.4.4 Tỷ lệ tế bào/chất mang 14 2.5 15 Tổng quan vi khuẩn Exiguobacterium profundum PHẦN III: ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1 Đối tượng nghiên cứu 17 17 3.1.1 Địa điểm, thời gian nghiên cứu 17 3.1.2 Thiết bị dụng cụ 17 3.1.3 Hóa chất sử dụng: 18 3.2 Nội dung nghiên cứu 19 3.3 Phương pháp nghiên cứu 19 3.3.1 Phương pháp hoạt hóa chủng vi khuẩn thu hồi sinh khối iv 19 3.3.2 Phương pháp cố định tế bào 20 3.3.3 Phương pháp cố định tế bào đến khả phân giải histamin chủng Exiguobacterium profundum CH2.1 3.4 22 Phương pháp xử lý số liệu 24 PHẦN IV: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1 25 Tiến hành cố định tế bào vi khuẩn Exiguobacterium profundum CH2.1 chất mang 4.2 25 Ảnh hưởng chất mang đến hiệu suất cố định khả phân giải histamin chủng Exiguobacterium profundum CH2.1 4.3 26 Ảnh hưởng tỷ lệ tế bào/chất mang đến hiệu suất cố định khả phân giải histamin chủng Exiguobacterium profundum CH2.1 27 PHẦN V: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 32 5.1 Kết luận 32 5.2 Kiến nghị 32 TÀI LIỆU THAM KHẢO 33 v DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1 Hoạt động xúc tác sinh học quan sát dẫn xuất thu với nồng độ khác 3-aminopropyl triethoxysilane (APTES) hấp phụ Hạt nano Magnétic (MNPs) (U = µmol/phút) 15 Bảng 3.1 Thiết bị sử dụng nghiên cứu 17 Bảng 3.2 Danh sách hóa chất sử dụng nghiên cứu 18 Bảng 3.4: Khối lượng tế bào chất mang theo tỷ lệ 21 Bảng 3.4 Chương trình dẫn xuất hóa tự động hệ thống HPLC 22 vi DANH MỤC HÌNH Hình 2.1 Quy trình sản xuất nước mắm (Ngo Dang Nghia cs, 2017) Hình 2.2 Cơng thức cấu tạo Hình 2.3 Cấu trúc khơng gian Hình 2.4 Sự hình thành histamin từ histidine Hình 2.5 Phương pháp hấp phụ tế bào 11 Hình 2.6 Phương pháp liên kết chéo 11 Hình 2.7 Chất mang chitosan qua kính hiển vi 12 Hình 2.8 Chất mang celite qua kính hiển vi 13 Hình 2.9 Chất mang pig bone qua kính hiển vi 14 Hình 2.10 Chất eggshell qua kính hiển vi 14 Hình 4.1 Mẫu chưa sấy đơng khơ 25 Hình 4.2 Mẫu sau sấy đơng khơ 25 Hình 4.3 Mẫu cố định eggshell 26 Hình 4.4 Đồ thị đường chuẩn histamin (mM) 26 Hình 4.5 Ảnh hưởng chất mang đến hiệu suất cố định khả phân giải histamin CH2.1 sau 2h phản ứng 27 Hình 4.6 Ảnh hưởng tỉ lệ tế bào/chất mang đến hiệu suất cố định khả phân giải histamin chất mang eggshell sau 2h phản ứng 28 Hình 4.7 Ảnh hưởng tỉ lệ tế bào/chất mang đến hiệu suất cố định khả phân giải histamin chất mang celite sau 2h phản ứng 29 Hình 4.8 Ảnh hưởng tỉ lệ tế bào/chất mang đến hiệu suất cố định khả phân giải histamin chất mang pig bone sau 2h phản ứng 30 Hình 4.9 Ảnh hưởng tỉ lệ tế bào/chất mang đến hiệu suất cố định khả phân giải histamin chất mang chitosan sau 2h phản ứng vii 30 PHẦN I: MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề Nước mắm loại gia vị truyền thống khơng thể thiếu mâm cơm gia đình Việt Nam Sản phẩm nước mắm hấp dẫn người hương vị đặc biệt giá trị dinh dưỡng cao chứa lượng lớn amino acid như: valin, methionin, lysin… ngồi cịn có vitamin B1, B2 (Lopetcharat cs, 2001) Mặc dù vậy, nước mắm truyền thống có chứa hàm lượng histamin cao làm ảnh hưởng đến sức khỏe người Histamin hình thành trình lên men (Brillantes cs, 2002) Cục quản lý Thực phẩm Dược phẩm Hoa Kì (FDA) cho thấy hàm lượng 50ppm mức gây ngộ độc 500ppm mức gây nguy hiểm đến sức khỏe người sử dụng sản phẩm chứa histamin (Lehane cs, 2000) Trong nước mắm hàm lượng histamin cao gây triệu chứng sau: nhẹ gây sổ mũi, hen suyễn, mề đay nặng gây dãn mạch, co thắt tim (Nguyễn Trần Thị Giáng Hương cs, 2007) Chính cần tìm phương pháp tối ưu nhắm làm giảm lượng histamin nước mắm Histamin hợp chất bền nhiệt, khó để loại bỏ amine khỏi sản phẩm thực phẩm chúng hình thành, chí với việc xử lý nhiệt hấp tiệt trùng Thực tế có nhiều hướng nghiên cứu tiến hành sử dụng phương pháp vật lý hóa học để giảm hàm lượng histamin nước mắm, nhiên chi phí cao nguy ảnh hưởng đến sức khỏe người (Naila cs, 2010; Gardini cs, 2016) Vì vậy, việc ứng dụng vi khuẩn phân giải histamin phương pháp hữu hiệu việc giảm lượng histamin thực phẩm lên men (Leuscher cs, 1998; Mah cs, 2009) Hiện nay, đưa vi sinh vật tự vào nước mắm thành phẩm khó để vi khuẩn phân giải histamin cách hiệu mà khơng ảnh hưởng đến chất lượng nước mắm Chính vậy, việc nghiên cứu cố định tế bào vi khuẩn vào chất mang để ứng dụng việc phân giải histamin nói chung nước mắm nói riêng Tế bào cố định có nhiều ưu điểm so với việc sử dụng tế bào tự như: tế bào sau cố định sử dụng nhiều lần, khơng lẫn vào sản phẩm chủ động ngừng phản ứng theo ý muốn Cố định tế bào – phương pháp hiệu để tế bào vi khuẩn phân giải histamin hoạt động tốt mơi trường có nồng độ muối cao (Tapingkae cs, 2010) 15 Hungerford J.M (2010) Scombroid poisoning: a review Toxicon, 56 (231– 243) 16 Jairath G., P K Singh, R S Dabur, M Rani and M Chaudhari (2015) Biogenic amines in meat and meat products and its public health signi cance: A review J Food Sci.Technol, 52 (6835–6846) 17 Kanki M., T Yoda, M Ishibashi, T Tsukamoto (2004) Photobacterium phosphoreum caused a histamine fish poisoning incident Int J Food Microbiol, 92 (79–87 18 Karel, S.F., Libicki, S.B., Robertson, C.R., (1985) The immobilization of whole cells-engineering principles Chem Eng Sci, 40 (1321–1354) 19 M Elakkiya, D Prabhakaran, M Thirumarimurugan (2016) Methods of Cell Immobilization and Its Applications Copyright to IJIRSET 20 Khare, S K., & Nakajima, M (2000) Immobilisation of Rhizopus japonicus lipase on celite and its application for enrichment of docosahexaenoic acid in soybean oil Food Chemistry, 68 (153–157) 21 Kimura B., Y Konagaya and T Fujii (2001) Histamine formation by Tetragenococcus muriaticus, a halophilic lactic acid bacterium isolated fromfish sauce Int J FoodMicrobiol,70 (71–77) 22 Komprda T., J Neznalova, S Standara and S Bover-Cid (2001) Effect of starter culture and storage temperature on the content of biogenic amines in dry fermented sausage polian Meat Sci, 59 (267–276) 23 Kozlyak, E I., Solomon, Z G., Yakimov, M M and Fadyushina, T V (1993) The Sorption of Pseudomonas fluorescens 16n2 cells on various adsorbents Prikl Biokhim Mikrobiol, 29 (138-143) 24 Kuda T., Y Izawa, S Ishii, H Takahashi, Y Torido and B Kimura (2012) Suppressive effect of Tetragenococcus halophilus, isolated from nukazuke, on histamine accumulation in salted and fermented sh Food Chem, 130 (569–574) 25 Lehane L and J Olley (2000) Histamine fish poisoning revisited International Journal of Food Microbiology, 58 (1-37) 26 Leuschner R.G., M Heidel and W.P Hammes (1998) Histamine and tyramine degradation by food fermenting microorganisms International Journal of Food Microbiolog 35 27 Lo´pez-Sabater E I., J J Rodríguez-Jerez, A X Roig-Sague´s and M A T Mora-Ventura (1994) Bacteriological quality of tuna fish (Thunnus thynnus) destined for canning: effect of tuna handling on presence of histidine decarboxylase bacteria and histamine level J Food Prot, 57 (318–323) 28 Lopetcharat, K., Y J Choi, Dr Jae, W Park & Mark, A Daeschel (2001) Fish sauce products and manufacturing Food reviews International, 17 (65-88) 29 Luten, W Bouquet, L.A.J Seuren, M.M Burggraaf, G Riekwel-Booy, P Durand, (1992) Biogenic amines in fishery products: standardization methods within EC.H.H Huss (Ed.), Quality assurance in the fish industry, Elsevier Science Publishers B.V, Amsterdam (427-439) 30 Mah, J H., J B Ahn, J H Park, H C Sung, H J Hwang (2003) Charactrization of biogenic amine-produccing microorganisms isolated from Myeolchi-Jeot., Korean slated and fermented anchovy Journal of Microbiology and Biotechnology, 13 (362699) 31 Mariangela Gallo, Barbara Speranza, Maria Rosaria Corbo, Milena Sinigaglia, and Antonio Bevilacqua (2016) Chapter Novel Microbial Immobilization Techniques Novel Food Fermentation Technologies, Food Engineering Series 32 Martuscelli M., M A Crudele, F Gardini and G Suzzi G (2000) Biogenic amine formation and oxidation by Staphylococcus xylosus strains from artisanal fermented sausages Lett Appl Microbiol, 31 (228-232) 33 Mitropoulou, G., Nedovic, V., Goyal, A and Kourkoutas, Y (2013) Review article: Immobilization technologies in Probiotic Food Production J Nutr Metab 34 Murooka Y., N Doi and T Harada (1979) Distribution of membrane bound monoamine oxidase in bacteria Applied and Environmental Microbiology, 38 (565– 569) 35 Naila A., S Flint, G Fletcher, P Bremer and G Meerdink (2010) Control of biogenic amines in food-existing and emerging approaches J Food Sc, 75 (139-150) 36 Negishi, S., Sato, S., Mukataka, S., & Takahashi, J (1989) Utilization of powdered pig bone as a support for immobilization of lipase Journal of Fermentation and Bioengineering, 67 (350–355) 36 37 Ngo Dang Nghia, Trang Si Trung, Pham Van Dat (2017) “Nuoc Mam” Fish Sauce in Vietnam: A Long History from Popular Seasoning to Health Benefit Bioactive Peptides Ann Food Process Preserv, (1017) 38 Nikovskaya, G N (1989) The adhesive immobilization of microorganisms in water purification, Khim Tekhnol Vody, 11 (158-169) 39 Novella-Rodriguez S., Veciana-Nogues M.T., Izquierdo-Pulido M., Vidal-Carou M C (2002) Effect of high hydrostatic pressure treatments on biogenic amine content in goat cheeses during ripening J Agri Food Chem, 50 (7288-7292) 40 Pereira, E B., Zanin, J M., & Castro, H F (2003) Immobilization and catalytic properties of lipase on chitosan for hydrolysis and esterification reactions Brazilian Journal of Chemical Engineering, 20 (343–355) 41 Petkova V., Kostova B., Shopska M., Kadinov G., Baláž M., Baláž P (2017) Behavior of high-energy-milling-activated eggshells during thermal treatment J Therm Anal Calorim, 127 (615–623) 42 Popper, L.; Knorr, D (1990) Combined application of high pressure homogenization and lytic enzymes or chitosan for food stekilization Food Technol, 44 (84-89) 43 Prester L (2011) Biogenic amines in fish, fish products and shelfish: A review Food Add Contam Part A, 28 (1547–1560) 44 Renes E., I Diezhandino, D Fernandez, R E Ferrazza, M E Tornadijo and J.M Fresno (2014) Effect of autochthonus starter cultures on the biogenic amines content of ewe’s milk cheese throughout ripening Food Microbiol, 44 (271-277) 45 Rivas B., R Gonz´alez, J M Landete, R Mu˜noz (2008) Characterization of a second ornithine decarboxylase isolated from Morganella morganii J Food Prot, 71 (657–661) 46 Rodriguez-Navarro, A B., Yebra, A., Nys, Y., Jimenez-Lopez, C., and GarciaRuiz, J M (2007) Analysis of avian eggshell microstructure using X-ray area detectors Eur J Mineral, 19 (391–398) 47 Rollan G.C., E Coton and A Lonvaud-Funel (1995) Histidine decarboxylase activity of Leuconostoc oenos 9204 Food Microbiology,12 (455–461) 48 S Brillantes, s Paknoi, and a Totakien (2002), Histamine Formation in Fish Sauce Production, Vol 67, Nr 6, JOURNAL OF FOOD SCIENCE 37 49 Santos M.H.S (1996) Biogenic amines: their importance in foods Int J Food Microbiol, 29 (213–231 50 Sekiguchi Y., H Makita, A Yamamura and K Matsumoto (2004) A thermostable histamine oxidase from Arthrobacter crystallopoietes KAIT-B-007 Journal of Bioscience and Bioengineering, 97 (104-110) 51 Shalaby A R (1996) Significance of biogenic amines to food safety and human health Food Research International, 29 (675-690) 52 Tapingkae, W., S Tanasupawat, K L Parkin, S Benjakul, W (2010) Visessanguan Whole cell immobilisation of Natrinema gari BCC 24369 for histamine degradation Food Chemistry, 120 (841-849) 53 Tapingkae, W., Tanasupawat, S., Parkin, K L., Benjakul, S., & Visessanguan, W., (2010) Degradation of Histamin by extremely halophilic archaea isolated from high salf-fermented fishery products Enzyme and Microbial Technology, 46 (92-99) 54 V M Costa, M C M de Souza, P B A Fechine1, A C Macedo and L R B Gonỗalves (2016) Nanobiocatalytic systems based on lipase-Fe3O4 and conventional systems for isoniazid synthesis: a comparative study Brazilian Journal of Chemical Engineering, 33 (661 – 673) 55 V Pacea, J V Sinisterraa, b and A R Alcántaraa (2010) Celite-Supported Reagents in Organic Synthesis: An Overview Current Organic Chemistry, 14 (23842408) 56 Venkaiah, B., & Kumar, A (1994) Egg shell bound starch phosphorylase packed bed reactor for the continuous production of glucose-1-phosphate Journal of Biotechnology, 36 (11–17) 57 Vishnivetskaya, Tatiana A.; Kathariou, Sophia; Tiedje, James M (May 2009) The Exiguobacterium genus: biodiversity and biogeography Extremophiles 13:541–555 58 Wenqian Wang, Qiuyu Meng, Qi Li, Jinbao Liu, Mo Zhou, Zheng Jin and Kai Zhao (2020) Chitosan Derivatives and Their Application in Biomedicine 59 Yongsawatdigul, J., Y J Choi, S Udomporn (2004) Biogenic amines formation in fish sauce prepared from fresh and temperature-abused Indian anchovy (Stolephorus indicus) Food Chemistry and Toxicology, Journal of Food Science, 69 (312-319) 60 Zhou, J., Wang, S., Nie, F., Feng, L., Zhu, G., and Jiang, L (2010) Elaborate architecture of the hierarchical hen's eggshell Nano Res, (171–179) 38 PHỤ LỤC Phụ lục A: Một số hình ảnh sắc kí đồ histamin Hình : Hình ảnh sắc kí đồ chủng vi khuẩn Exiguobacterium profundum CH2.1 cố định Celite tỷ lệ tế bào/chất mang 1/15 thời điểm Hình : Hình ảnh sắc kí đồ chủng vi khuẩn Exiguobacterium profundum CH2.1 cố định Celite tỷ lệ tế bào/chất mang 1/15 thời điểm 39 Phụ lục B: Xử lý số liệu minitab One-way ANOVA: Hiệu suất cố định (%) versus Chất mang Method Null hypothesis All means are equal Alternative hypothesis Not all means are equal Significance level α = 0.05 Equal variances were assumed for the analysis Factor Information Factor Levels Values Chất mang Celite 1/5, Chitosan 1/5, Eggshell 1/5, Pig bone 1/5 Analysis of Variance Source DF Adj SS Adj MS F-Value P-Value Chất mang 403.821 134.607 122.71 0.000 Error 4.388 1.097 Total 408.209 Model Summary S R-sq R-sq(adj) R-sq(pred) 1.04736 Means 98.93% 98.12% 95.70% Chất mang N Mean StDev 95% CI Celite 1/5 26.793 0.798 (24.736, 28.849) Chitosan 1/5 22.2823 0.0768 (20.2261, 24.3385) Eggshell 1/5 16.497 0.694 (14.441, 18.553) Pig bone 1/5 35.94 1.81 (33.88, 37.99) Pooled StDev = 1.04736 Tukey Pairwise Comparisons Grouping Information Using the Tukey Method and 95% Confidence Chất mang N Mean Pig bone 1/5 35.94 Celite 1/5 26.793 Chitosan 1/5 22.2823 Grouping A B C Eggshell 1/5 16.497 D Means that not share a letter are significantly different Interval Plot of Hiệu suất cố định (%) vs Chất mang 95% CI for the Mean 40 iệ uấ cố H us t đị nh (%) 35 30 25 20 15 Celite 1/5 Chitosan 1/5 Eggshell 1/5 Chất mang The pooled standard deviation is used to calculate the intervals 40 Pig bone 1/5 One-way ANOVA: Khả phân giải sau 2h (%) versus Chất mang Method Null hypothesis All means are equal Alternative hypothesis Not all means are equal Significance level α = 0.05 Equal variances were assumed for the analysis Factor Information Factor Levels Values Chất mang Celite 1/5, Chitosan 1/5, Eggshell 1/5, Pig bone 1/5 Analysis of Variance Source DF Adj SS Adj MS F-Value P-Value Chất mang 347.415 115.805 1233.26 0.000 Error 0.376 0.094 Total 347.791 Model Summary S R-sq R-sq(adj) R-sq(pred) 0.306434 Means 99.89% 99.81% 99.57% Chất mang N Mean StDev 95% CI Celite 1/5 33.9280 0.0819 (33.3264, 34.5296) Chitosan 1/5 26.1704 0.0124 (25.5688, 26.7720) Eggshell 1/5 19.5879 0.0289 (18.9863, 20.1895) Pig bone 1/5 36.268 0.607 (35.667, 36.870) Pooled StDev = 0.306434 Tukey Pairwise Comparisons Grouping Information Using the Tukey Method and 95% Confidence Chất mang N Mean Pig bone 1/5 36.268 Celite 1/5 33.9280 Chitosan 1/5 26.1704 Grouping A B C Eggshell 1/5 19.5879 D Means that not share a letter are significantly different Interval Plot of Khả phân giải sau 2h (%) vs Chất mang 95% CI for the Mean hâ iả nă ng p n g i sau 2h (%) 35.0 K 37.5 20.0 32.5 30.0 27.5 25.0 22.5 Celite 1/5 Chitosan 1/5 Eggshell 1/5 Pig bone 1/5 Chất mang The pooled standard deviation is used to calculate the intervals One-way ANOVA: Hiệu suất cố định (%) versus Eggshell 41 Method Null hypothesis All means are equal Alternative hypothesis Not all means are equal Significance level α = 0.05 Equal variances were assumed for the analysis Factor Information Factor Levels Values Eggshell Eggshell 1/10, Eggshell 1/15, Eggshell 1/20, Eggshell 1/5 Analysis of Variance Source DF Adj SS Adj MS F-Value P-Value Eggshell 218.752 72.9174 111.51 0.000 Error 2.616 0.6539 Total 221.368 Model Summary S R-sq R-sq(adj) R-sq(pred) 0.808647 Means 98.82% 97.93% 95.27% Eggshell N Mean StDev 95% CI Eggshell 1/10 22.696 0.221 (21.109, 24.284) Eggshell 1/15 12.5749 0.0890 (10.9873, 14.1625) Eggshell 1/20 8.52 1.44 (6.93, 10.10) Eggshell 1/5 16.497 0.694 (14.910, 18.085) Pooled StDev = 0.808647 Tukey Pairwise Comparisons Grouping Information Using the Tukey Method and 95% Confidence Eggshell N Mean Eggshell 1/10 22.696 Eggshell 1/5 16.497 Eggshell 1/15 12.5749 Grouping A B C Eggshell 1/20 8.52 D Means that not share a letter are significantly different Interval Plot of Hiệu suất cố định (%) vs Eggshell 95% CI for the Mean nh (%) 15 đị 20 iệ uấ cố H us t 25 10 Eggshell 1/10 Eggshell 1/15 Eggshell 1/20 Eggshell The pooled standard deviation is used to calculate the intervals One-way ANOVA: Khả phân giải sau 2h (%) versus Eggshell Method 42 Eggshell 1/5 Null hypothesis All means are equal Alternative hypothesis Not all means are equal Significance level α = 0.05 Equal variances were assumed for the analysis Factor Information Factor Levels Values Eggshell Eggshell 1/10, Eggshell 1/15, Eggshell 1/20, Eggshell 1/5 Analysis of Variance Source DF Adj SS Adj MS F-Value P-Value Eggshell 365.278 121.759 395.01 0.000 Error 1.233 0.308 Total 366.510 Model Summary S R-sq R-sq(adj) R-sq(pred) 0.555198 Means 99.66% 99.41% 98.65% Eggshell N Mean StDev 95% CI Eggshell 1/10 23.496 0.483 (22.406, 24.586) Eggshell 1/15 11.5040 0.0891 (10.4140, 12.5940) Eggshell 1/20 6.206 0.995 (5.116, 7.296) Eggshell 1/5 19.5879 0.0289 (18.4979, 20.6779) Pooled StDev = 0.555198 Tukey Pairwise Comparisons Grouping Information Using the Tukey Method and 95% Confidence Eggshell N Mean Eggshell 1/10 23.496 Eggshell 1/5 19.5879 Eggshell 1/15 11.5040 Grouping A B C Eggshell 1/20 6.206 D Means that not share a letter are significantly different Interval Plot of Khả phân giải sau 2h (%) vs Eggshell 95% CI for the Mean 20 15 10 K hâ iả nă ng p n g i sau 2h (%) 25 Eggshell 1/10 Eggshell 1/15 Eggshell 1/20 Eggshell The pooled standard deviation is used to calculate the intervals One-way ANOVA: Hiệu suất cố định (%) versus Celite Method Null hypothesis All means are equal 43 Eggshell 1/5 Alternative hypothesis Not all means are equal Significance level α = 0.05 Equal variances were assumed for the analysis Factor Information Factor Levels Values Celite Celite 1/10, Celite 1/15, Celite 1/20, Celite 1/5 Analysis of Variance Source DF Adj SS Adj MS F-Value P-Value Celite 250.161 83.3870 213.66 0.000 Error 1.561 0.3903 Total 251.722 Model Summary S R-sq R-sq(adj) R-sq(pred) 0.624728 Means 99.38% 98.91% 97.52% Celite N Mean StDev 95% CI Celite 1/10 28.4992 0.0814 (27.2727, 29.7257) Celite 1/15 34.637 0.234 (33.411, 35.864) Celite 1/20 18.959 0.929 (17.732, 20.185) Celite 1/5 26.793 0.798 (25.566, 28.019) Pooled StDev = 0.624728 Tukey Pairwise Comparisons Grouping Information Using the Tukey Method and 95% Confidence Celite N Mean Grouping Celite 1/15 34.637 Celite 1/10 28.4992 B Celite 1/5 26.793 B A Celite 1/20 18.959 C Means that not share a letter are significantly different Interval Plot of Hiệu suất cố định (%) vs Celite 95% CI for the Mean đị nh (%) 36 32 iệ uấ cố H us t 28 24 20 Celite 1/10 Celite 1/15 Celite 1/20 Celite The pooled standard deviation is used to calculate the intervals One-way ANOVA: Khả phân giải sau 2h (%) versus Celite Method Null hypothesis All means are equal Alternative hypothesis Not all means are equal 44 Celite 1/5 Significance level α = 0.05 Equal variances were assumed for the analysis Factor Information Factor Levels Values Celite Celite 1/10, Celite 1/15, Celite 1/20, Celite 1/5 Analysis of Variance Source DF Adj SS Adj MS F-Value P-Value Celite 652.819 217.606 1152.89 0.000 Error 0.755 0.189 Total 653.574 Model Summary S R-sq R-sq(adj) R-sq(pred) 0.434452 Means 99.88% 99.80% 99.54% Celite N Mean StDev 95% CI Celite 1/10 34.919 0.754 (34.066, 35.772) Celite 1/15 41.5396 0.0745 (40.6867, 42.3925) Celite 1/20 17.059 0.418 (16.206, 17.912) Celite 1/5 33.9280 0.0819 (33.0751, 34.7809) Pooled StDev = 0.434452 Tukey Pairwise Comparisons Grouping Information Using the Tukey Method and 95% Confidence Celite N Mean Grouping Celite 1/15 41.5396 Celite 1/10 34.919 B Celite 1/5 33.9280 B A Celite 1/20 17.059 C Means that not share a letter are significantly different Interval Plot of Khả phân giải sau 2h (%) vs Celite 95% CI for the Mean 40 35 30 25 20 K nă hâ iả ng p n g i sau 2h (%) 45 15 Celite 1/10 Celite 1/15 Celite 1/20 Celite The pooled standard deviation is used to calculate the intervals One-way ANOVA: Hiệu suất cố định (%) versus Pig bone Method Null hypothesis All means are equal Alternative hypothesis Not all means are equal 45 Celite 1/5 Significance level α = 0.05 Equal variances were assumed for the analysis Factor Information Factor Levels Values Pig bone Pig bone 1/10, Pig bone 1/15, Pig bone 1/20, Pig bone 1/5 Analysis of Variance Source DF Adj SS Adj MS F-Value P-Value Pig bone 348.660 116.220 68.40 0.001 Error 6.796 1.699 Total 355.456 Model Summary S R-sq R-sq(adj) R-sq(pred) 1.30346 Means 98.09% 96.65% 92.35% Pig bone N Mean StDev 95% CI Pig bone 1/10 38.239 1.128 (35.680, 40.798) Pig bone 1/15 45.079 0.312 (42.520, 47.638) Pig bone 1/20 26.63 1.47 (24.07, 29.19) Pig bone 1/5 35.94 1.81 (33.38, 38.49) Pooled StDev = 1.30346 Tukey Pairwise Comparisons Grouping Information Using the Tukey Method and 95% Confidence Pig bone N Mean Grouping Pig bone 1/15 45.079 Pig bone 1/10 38.239 B Pig bone 1/5 35.94 B A Pig bone 1/20 26.63 C Means that not share a letter are significantly different Interval Plot of Hiệu suất cố định (%) vs Pig bone 95% CI for the Mean 50 iệ uấ cố H us t đị nh (%) 45 40 35 30 25 Pig bone 1/10 Pig bone 1/15 Pig bone 1/20 Pig bone The pooled standard deviation is used to calculate the intervals One-way ANOVA: Khả phân giải sau 2h (%) versus Pig bone Method Null hypothesis All means are equal Alternative hypothesis Not all means are equal 46 Pig bone 1/5 Significance level α = 0.05 Equal variances were assumed for the analysis Factor Information Factor Levels Values Pig bone Pig bone 1/10, Pig bone 1/15, Pig bone 1/20, Pig bone 1/5 Analysis of Variance Source DF Adj SS Adj MS F-Value P-Value Pig bone 411.582 137.194 193.40 0.000 Error 2.837 0.709 Total 414.420 Model Summary S R-sq R-sq(adj) R-sq(pred) 0.842244 Means 99.32% 98.80% 97.26% Pig bone N Mean StDev 95% CI Pig bone 1/10 36.752 0.393 (35.099, 38.406) Pig bone 1/15 43.571 0.590 (41.917, 45.224) Pig bone 1/20 23.701 1.403 (22.047, 25.354) Pig bone 1/5 36.268 0.607 (34.615, 37.922) Pooled StDev = 0.842244 Tukey Pairwise Comparisons Grouping Information Using the Tukey Method and 95% Confidence Pig bone N Mean Grouping Pig bone 1/15 43.571 Pig bone 1/10 36.752 B Pig bone 1/5 36.268 B A Pig bone 1/20 23.701 C Means that not share a letter are significantly different Interval Plot of Khả phân giải sau 2h (%) vs Pig bone 95% CI for the Mean 40 35 30 25 K nă hâ iả ng p n g i sau 2h (%) 45 20 Pig bone 1/10 Pig bone 1/15 Pig bone 1/20 Pig bone The pooled standard deviation is used to calculate the intervals One-way ANOVA: Hiệu suất cố định (%) versus Chitosan Method Null hypothesis All means are equal Alternative hypothesis Not all means are equal 47 Pig bone 1/5 Significance level α = 0.05 Equal variances were assumed for the analysis Factor Information Factor Levels Values Chitosan Chitosan 1/10, Chitosan 1/15, Chitosan 1/20, Chitosan 1/5 Analysis of Variance Source DF Adj SS Adj MS F-Value P-Value Chitosan 339.259 113.086 129.01 0.000 Error 3.506 0.877 Total 342.765 Model Summary S R-sq R-sq(adj) R-sq(pred) 0.936259 Means 98.98% 98.21% 95.91% Chitosan N Mean StDev Chitosan 1/10 30.38 1.62 (28.55, 32.22) Chitosan 1/15 17.230 0.512 (15.392, 19.068) Chitosan 1/20 12.869 0.776 (11.031, 14.707) 95% CI Chitosan 1/5 22.2823 0.0768 (20.4442, 24.1204) Pooled StDev = 0.936259 Tukey Pairwise Comparisons Grouping Information Using the Tukey Method and 95% Confidence Chitosan N Mean Chitosan 1/10 30.38 Chitosan 1/5 22.2823 Chitosan 1/15 17.230 Grouping A B C Chitosan 1/20 12.869 D Means that not share a letter are significantly different Interval Plot of Hiệu suất cố định (%) vs Chitosan 95% CI for the Mean iệ uấ cố H us t đị nh (%) 35 30 25 20 15 10 Chitosan 1/10 Chitosan 1/15 Chitosan 1/20 Chitosan The pooled standard deviation is used to calculate the intervals One-way ANOVA: Khả phân giải sau 2h (%) versus Chitosan Method Null hypothesis All means are equal Alternative hypothesis Not all means are equal 48 Chitosan 1/5 Significance level α = 0.05 Equal variances were assumed for the analysis Factor Information Factor Levels Values Chitosan Chitosan 1/10, Chitosan 1/15, Chitosan 1/20, Chitosan 1/5 Analysis of Variance Source DF Adj SS Adj MS F-Value P-Value Chitosan 649.152 216.384 223.23 0.000 Error 3.877 0.969 Total 653.029 Model Summary S R-sq R-sq(adj) R-sq(pred) 0.984556 Means 99.41% 98.96% 97.62% Chitosan N Mean StDev 95% CI Chitosan 1/10 32.227 0.867 (30.294, 34.160) Chitosan 1/15 17.036 0.803 (15.103, 18.969) Chitosan 1/20 8.51 1.57 (6.57, 10.44) Chitosan 1/5 26.1704 0.0124 (24.2374, 28.1033) Pooled StDev = 0.984556 Tukey Pairwise Comparisons Grouping Information Using the Tukey Method and 95% Confidence Chitosan N Mean Chitosan 1/10 32.227 Chitosan 1/5 26.1704 Chitosan 1/15 17.036 Grouping A B C Chitosan 1/20 8.51 D Means that not share a letter are significantly different Interval Plot of Khả phân giải sau 2h (%) vs Chitosan 95% CI for the Mean 30 25 20 15 10 K nă hâ iả ng p n g i sau 2h (%) 35 Chitosan 1/10 Chitosan 1/15 Chitosan 1/20 Chitosan The pooled standard deviation is used to calculate the intervals 49 Chitosan 1/5