(Luận văn) hoàn thiện quy trình sản xuất quy mô công nghiệp vắc xin vô hoạt nhũ dầu phòng hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn tại công ty tnhh mtv avac việt nam

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM LÊ THỊ XIÊM lu HỒN THIỆN QUY TRÌNH SẢN XUẤT QUY MƠ an CƠNG NGHIỆP VẮC XIN VƠ HOẠT NHŨ DẦU PHỊNG n va tn to HỘI CHỨNG RỐI LOẠN SINH SẢN VÀ HÔ HẤP Ở LỢN p ie gh TẠI CÔNG TY TNHH MTV AVAC VIỆT NAM d oa nl w lu Thú Y 8640101 u nf Mã Số: va an Chuyên Ngành: PGS.TS Nguyễn Bá Hiên ll Người hướng dẫn khoa học: oi m z at nh z m co l gm @ an Lu NHÀ XUẤT BẢN HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP - 2019 n va ac th si LỜI CAM ĐOAN Tơi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu riêng tôi, kết nghiên cứu trình bày luận văn trung thực, khách quan chưa dùng để bảo vệ học vị Tôi xin cam đoan giúp đỡ cho việc thực luận văn cám ơn, thơng tin trích dẫn luận văn rõ nguồn gốc Hà Nội, ngày … tháng năm 2019 Tác giả luận văn lu an Lê Thị Xiêm n va p ie gh tn to d oa nl w ll u nf va an lu oi m z at nh z m co l gm @ an Lu n va ac th i si LỜI CẢM ƠN Trong suốt thời gian học tập, nghiên cứu hồn thành luận văn, tơi nhận hướng dẫn, bảo tận tình thầy cô giáo, giúp đỡ động viên bạn bè, đồng nghiệp gia đình Nhân dịp hồn thành luận văn, cho phép tơi bày tỏ lịng kính trọng biết ơn sâu sắc đến PGS.TS Nguyễn Bá Hiên tận tình hướng dẫn, dành nhiều cơng sức, thời gian tạo điều kiện cho suốt q trình học tập thực đề tài Tơi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành tới Ban Giám Đốc, Ban Quản lý đào tạo, Bộ môn Vi sinh Vật – Truyền nhiễm, Khoa Thú y – Học Viện Nơng Nghiệp Việt Nam tận tình giúp đỡ tơi q trình học tập, thực đề tài hồn thành luận văn lu an Tơi xin chân thành cảm ơn tập thể lãnh đạo, cán công nhân viên công ty TNHH thành viên Avac Việt Nam giúp đỡ tạo điều kiện cho tơi suốt q trình thực đề tài n va to tn Xin chân thành cảm ơn gia đình, người thân, bạn bè, đồng nghiệp tạo p ie gh điều kiện thuận lợi giúp đỡ mặt, động viên khuyến khích tơi hồn thành luận văn./ w Hà Nội, ngày … tháng năm 2019 d oa nl Tác giả luận văn an lu ll u nf va Lê Thị Xiêm oi m z at nh z m co l gm @ an Lu n va ac th ii si MỤC LỤC Lời cam đoan i Lời cảm ơn ii Mục lục iii Danh mục chữ viết tắt vi Danh mục bảng vii Danh mục hình viii Trích yếu luận văn ix Thesis abstract xi lu Phần Mở đầu an Tính cấp thıết đề tàı 1.2 Mục tıêu nghıên cứu 1.3 Ý nghĩa khoa học ý nghĩa thực tiễn đề tài n va 1.1 tn to Ý nghĩa khoa học 1.3.2 Ý nghĩa thực tiễn p ie gh 1.3.1 Phần Tổng quan tài liệu Hội chứng rối loạn sınh sản hô hấp lợn 2.1.1 Lịch sử hội chứng rối loạn sinh sản hô hấp 2.1.2 Tình hình phân bố lưu hành hội chứng rối loạn sinh sản hô hấp tại Việt Nam 2.2 Vırus gây hội chứng rối loạn sinh sản hô hấp lợn 2.2.1 Hình thái cấu trúc virus gây hội chứng rối loạn sinh sản hô hấp lợn 2.2.2 Sức đề kháng virus đặc tính ni cấy 2.3 Bệnh học hộı chứng rốı loạn sınh sản hô hấp lợn 2.3.1 Triệu chứng lâm sàng bệnh lý 2.3.2 Bệnh virus gây hội chứng rối loạn sinh sản hô hấp lợn Type II thể độc lực cao 2.4 Miễn dịch virus hội chứng rối loạn sinh sản hô hấp lợn 10 2.5 Vắc xın phịng hộı chứng rốı loạn sınh sản hơ hấp 12 2.5.1 Hiểu biết chung vắc xin 12 d oa nl w 2.1 ll u nf va an lu oi m z at nh z m co l gm @ an Lu n va ac th iii si 2.5.2 Những nguyên tắc để đảm bảo chất lượng sản xuất vắc xin, chế phẩm sinh học quy mô công nghiệp 13 2.5.3 Sản xuất vắc xin phương pháp vô hoạt virus 15 2.5.4 Sản xuất vắc xin phương pháp nhược độc virus môi trường tế bào 16 2.5.5 Phương pháp sản xuất vắc xin hệ 17 2.6 Chất bổ trợ 21 Phần Vật liệu phƣơng pháp nghiên cứu 23 lu an Thời gian nghiên cứu 23 3.2 Địa điểm nghiên cứu 23 3.3 Nguyên vật liệu, đối tượng sử dụng nghiên cứu 23 3.3.1 Đối tượng, vật liệu 23 3.3.2 Hóa chất bất hoạt 23 3.3.3 Chất bổ trợ 23 n va 3.1 tn to Các loại dung dịch, môi trường 23 3.3.3 Trang thiết bị, dụng cụ 25 Nghiên cứu sản xuất vắc xin vơ hoạt nhũ dầu phịng hội chứng rối loạn sinh sản hô hấp lợn quy mô công nghiệp 26 oa nl w 3.4.1 Nội dung nghiên cứu 26 3.4 p ie gh 3.3.4 Kiểm nghiệm vắc xin vô hoạt nhũ dầu phòng hội chứng rối loạn sinh sản hô hấp lợn quy mô công nghiệp 26 3.5 Phương pháp nghiên cứu 26 3.5.1 Quy trình tóm tắt sản xuất vắc xin PRRS quy mô công nghiệp 26 3.5.2 Phương pháp nuôi cấy tế bào 27 3.5.3 Phương pháp gây nhiễm, thu hoạch chuẩn độ virus PRRS 29 3.5.4 Phương pháp cô đặc, vô hoạt, nhũ hóa kiểm tra sau nhũ hóa vắc xin 30 3.5.5 Kiểm tra thành phẩm vắc xin 32 3.5.6 Phương pháp IPMA (Immunoperoxidase monolayer assay): Phương pháp miễn dịch có gắn enzyme thảm tế bào lớp 35 3.5.7 Phương pháp Elisa phát kháng thể hội chứng rối loạn sinh sản hô hấp lợn (theo TCVN 8400-21:2014) 37 3.5.8 Phương pháp phân lập virus gây hội chứng rối loạn sinh sản hô hấp lợn (theo TCVN 8400-21:2014) 38 d 3.4.2 ll u nf va an lu oi m z at nh z m co l gm @ an Lu n va ac th iv si 3.6 Xử lý số liệu 39 Phần Kết thảo luận 40 lu an Tối Ưu trình sản xuất kháng nguyên VIRUS PRRS hệ thống chai roller 40 4.1.1 Tối ưu hóa quy trình ni tế bào Marc – 145 chai roller 40 4.1.2 Tối ưu hóa quy trình gây nhiễm, thu hoạch virus PRRS hệ thống chai roller 45 4.2 Tối ưu trình bất hoạt kháng nguyên sản xuất vắc xin vô hoạt nhũ dầu 48 4.2.1 Nghiên cứu q trình đặc kháng nguyên 48 4.2.2 Nghiên cứu trình bất hoạt kháng nguyên 50 4.2.3 Xác nhận q trình nhũ hóa, bổ sung chất bổ trợ vắc xin 52 4.2.4 Kiểm soát q trình sản xuất vắc xin PRRS vơ hoạt 54 4.3 Kiểm nghiệm thành phẩm vắc xin 58 4.3.1 Kiểm tra cảm quan 58 n va 4.1 tn to Kiểm tra vô trùng 59 4.3.3 Kiểm tra an toàn 60 p ie gh 4.3.2 Kiểm tra hiệu lực 62 4.3.4 nl w Phần Kết luận kiến nghị 69 Kết luận 69 5.2 Kiến nghị 69 d oa 5.1 an lu Tài liệu tham khảo 70 ll u nf va oi m z at nh z m co l gm @ an Lu n va ac th v si DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT lu an n va Nghĩa tiếng Việt BEI Binary Ethylenimine CPE Cytophathogenic Effect DMEM Dulbecco's Modified Eagle's Medium DMSO Dimethyl sulfoxide DNA Deoxyribonucleic acid ĐC Đối chứng ELISA Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay FBS Fetal Bovine Serum FTM Fruit Thioglycolate Agar GMP Good Manufacturing Practices IPC In Process control IPMA Immunoperoxidase monolayer Assay NBCS Newborn Calf Serum ie gh tn to Chữ viết tắt NSP Non structural protein p Optical Density OIE Office International des Epizooties Polymerase Chain Reaction lu Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome va an PRRS d PCR Photphat Buffer Saline oa PBS nl w OD Sample/Positive SD Sabouraud dextrose agar SP Structural protein TCID50 50% Tissue Culture Infective Dose TCVN Tiêu chuẩn Việt Nam TN Thí nghiệm TRS Technical Report Series TSA Trypticase Soy Agar TSB Trypticase Soy Broth WHO World Health Organization XLD Xylose Lysine Deoxycholate ll u nf S/P oi m z at nh z m co l gm @ an Lu n va ac th vi si DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1 Một số tên thường gặp tài liệu Bảng 2.2 Tổng hợp ổ dịch PRRS xảy Việt Nam từ 2007-2016 Bảng 2.3 Các vắc xin thử nghiệm sản xuất 18 Bảng 4.1 Kết kiểm tra khả phát triển tế bào Marc – 145 điều kiện có 5% CO2 khơng có CO2 40 Bảng 4.2 Kết xác định lượng tế bào Marc-145 chai thích hợp 41 Bảng 4.3 Kết xác định tốc độ lăn phù hợp 42 Bảng 4.4 Khả sinh trưởng tế bào Marc – 145 chai roller 2X 44 lu an Bảng 4.5 Kết xác định liều gây nhiễm thích hợp virus PRRS chủng n va KTY-PRRS1 môi trường nuôi cấy tế bào 46 KTY-PRRS-01 môi trường nuôi cấy tế bào 48 gh tn to Bảng 4.6 Kết xác định thời gian thu hoạch thích hợp virus PRRS chủng Bảng 4.7 Hiệu giá virus sau cô đặc phương pháp lọc tiếp tuyến 49 ie p Bảng 4.8 Kiểm tra sản phẩm sau bất hoạt (bằng formaldehyde BEI) 50 w Bảng 4.9 Xác nhận quy trình bất hoạt BEI 52 oa nl Bảng 4.10 Kết nhũ hóa vắc xin dầu khống ISA 201VG 53 d Bảng 4.11 Kết kiểm tra vô trùng vắc xin trước bất hoạt 54 lu an Bảng 4.12 Kết kiểm tra hiệu giá virus trước bất hoạt 55 u nf va Bảng 4.13 Kết kiểm tra q trình vơ hoạt virus vắc xin BEI 56 Bảng 4.14 Kết kiểm tra vô trùng virus vắc xin sau bất hoạt 56 ll oi m Bảng 4.15 Kết kiểm tra vắc xin sau nhũ hóa 57 Bảng 4.16 Kết kiểm tra vô trùng sau nhũ hóa 57 z at nh Bảng 4.17 Kết sản xuất thử nghiệm vắc xin PRRS 58 Bảng 4.18 Kết kiểm tra cảm quan vắc xin PRRS vô hoạt 59 z gm @ Bảng 4.19 Kết kiểm tra vô trùng vắc xin 59 Bảng 4.20 Kết kiểm tra an tồn vắc xin PRRS lợn thí nghiệm 60 l Bảng 4.21 Kết kiểm tra hàm lượng kháng thể phương pháp ELISA 63 m co Bảng 4.22 Kết kiểm tra hàm lượng kháng thể phương pháp IPMA 64 an Lu Bảng 4.23 Kết đánh giá công cường độc 66 n va ac th vii si DANH MỤC HÌNH Hình 2.1 Bản đồ dịch tễ phân bố PRRS Việt Nam từ 2007-2013 Hình 2.2 Hình ảnh hình thái, cấu trúc virus PRRS Hình 2.3 Hình ảnh cấu trúc gen virus PRRS Hình 2.4 Gen từ chủng virus khác 19 Hình 3.1 Sơ đồ sản xuất vắc xin vơ hoạt phịng hội chứng rối loạn sinh sản hô hấp theo quy mô công nghiệp 27 Hình 4.1 Hình ảnh ni cấy tế bào chai roller 2X 43 Hình 4.2 Tế bào Marc-145 qua thời điểm 45 Hình 4.3 CPE virus PRRS đối chứng 47 lu an Hình 4.4 Hiệu giá kháng thể (bằng ELISA, số S/P, tiêm vắc xin thời điểm n va D0, D21 thử thách cường độc thời điểm D49) 51 D0, D21 thử thách cường độc thời điểm D49) 51 gh tn to Hình 4.5 Hiệu giá kháng thể (bằng phương pháp IPMA, tiêm vắc xin thời điểm p ie Hình 4.6 Hình ảnh kiểm tra hạt nhũ hóa kính hiển vi 53 Hình 4.7 Vắc xin PRRS vơ hoạt sau chia liều 58 nl w Hình 4.8 Một số hình ảnh kiểm tra vô trùng sản phẩm 60 oa Hình 4.9 Thân nhiệt lợn kiểm tra an toàn 61 d Hình 4.10 Kiểm tra an toàn vắc xin 61 lu an Hình 4.11 Ảnh lấy máu kiểm tra kháng thể kháng VIRUS PRRS 62 u nf va Hình 4.12 Hình ảnh kiểm tra IPMA 65 Hình 4.13 Lợn trước sau công cường độc 67 ll oi m Hình 4.14 Biến đổi thân nhiệt lợn sau công cường độc 68 z at nh z m co l gm @ an Lu n va ac th viii si TRÍCH YẾU LUẬN VĂN Tên tác giả: Lê Thị Xiêm Tên luận văn: Hồn thiện quy trình sản xuất quy mô công nghiệp vắc xin vô hoạt nhũ dầu phịng Hội chứng rối loạn sinh sản hơ hấp lợn công ty TNHH MTV Avac Việt Nam Ngành: Thú y Mã số: 8640101 Tên sở đào tạo: Học Viện Nơng Nghiệp Việt Nam Mục đích nghiên cứu Chúng áp dụng kết thu từ đề tài cấp nhà nước KC.04.15/11-15 PGS.TS Nguyễn Bá Hiên chủ nhiệm đề Học viện Nơng nghiệp Việt Nam chủ lu an trì “Nghiên cứu cơng nghệ sản xuất vắc xin vơ hoạt phịng hội chứng rối loạn sinh va sản hô hấp lợn”, Tiến hành sản xuất vắc xin quy mô công nghiệp nhà máy n sản xuất vắc xin Avac nhằm hồn thiện quy trình sản xuất quy mô công nghiệp để tạo Phƣơng pháp nghiên cứu ie gh tn to sản phẩm vắc xin thương mại phục vụ cho cơng tác phịng bệnh p Các phương pháp nghiên cứu sử dụng: w Phương pháp sản xuất vắc xin vô hoạt nhũ dầu môi trường tế bào như: Nuôi oa nl cấy tế bào hệ thống chai roller, gây nhiễm, thu hoạch, đặc kháng ngun, vơ d hoạt virus, nhũ hóa vắc xin an lu Phương pháp kiểm nghiệm vắc xin vơ hoạt phịng hội chứng rối loạn sinh sản va hô hấp lợn: kiểm tra cảm quan, vô trùng, khiết, kiểm tra tiêu an toàn hiệu u nf lực theo TCVN 8685-13:2014 ll Kết kết luận m oi Hồn thiện quy trình sản xuất kháng nguyên virus PRRS hệ thống chai roller z at nh với quy mơ 100 lít kháng nguyên/mẻ - Nuôi cấy tế bào Marc-145 hệ thống chai roller tối ưu điều kiện không z CO2 với lượng tế bào ban đầu 1x105 Cells/ml, sau 72h cấy chuyển tế bào lần @ gm tốc độ lăn 0,2 đến 0,3 rpm.Liều gây nhiễm thích hợp virus hội chứng rối l loạn sinh sản hô hấp chủng KTY - PRRS - 01 môi trường nuôi cấy tế bào Marc lượng virus cao, chất lượng tốt sau gây nhiễm virus 72 m co 145 104 TCID50 Thời gian thu hoạch huyễn dịch virus PRRS thích hợp nhất, hàm an Lu - Vắc xin vơ hoạt phịng hội chứng rối loạn sinh sản hô hấp bất hoạt theo quy trình thích hợp BEI nồng độ 1mM 24h 370C, hiệu giá virus trước n va ac th ix si 4.3.4 Kiểm tra hiệu lực Để đánh giá khả phịng bệnh, bảo hộ vắc xin cho vật ni, yếu tố hiệu lực vắc xin quan trọng, việc kiểm tra hiệu lực cho loại vắc xin công việc bắt buộc cần thiết Vắc xin vô hoạt PRRS kiểm nghiệm tiêu hiệu lực theo TCVN 8685-13:2014 phương pháp trọng tài Mỗi lơ vắc xin bố trí lơ lợn, lơ thí nghiệm (5 lợn) lơ đối chứng (3 lợn), lơ thí nghiệm tiến hành gây miễn dịch cách tiêm vắc xin lần, lần liều vắc xin, lần lợn 21 ngày, lần lợn 42 ngày tuổi, lợn 70 ngày tuổi lợn thí nghiệm lợn đối chứng tiến hành lấy máu chắt huyết lu công cường độc chủng KTY-PRRS-01: 100 TCID50/con (Phạm Văn Sơn, an va 2018), lấy máu thời điểm lợn 70 ngày 91 ngày tuổi, theo dõi lợn sau n công cường độc 21 ngày p ie gh tn to d oa nl w ll u nf va an lu oi m z at nh z l gm @ m co Hình 4.11 Ảnh lấy máu kiểm tra kháng thể kháng VIRUS PRRS Kết đánh giá hiệu giá kháng thể PRRS phương pháp Elisa lô an Lu PR1-0118, 0119, 0219 thể bảng sau: n va ac th 62 si Bảng 4.21 Kết kiểm tra hàm lượng kháng thể phương pháp ELISA Giá trị S/P Lô vắc xin Nhóm 0dpi 0.06 1.72 0.03 0.87 0.05 1.85 0.07 1.37 0.07 0,96 0.03 0.34 0.03 0.22 0.05 0.18 0,06 1.28 0.07 1.41 0.10 0.97 0.17 1.32 0.12 0.95 0.06 0.12 0.02 0.2 an PR1-0119 Thí nghiệm 21dpi 0.05 0.16 Thí nghiệm 0.03 1.45 0.07 0.87 0.04 1.27 Tỷ lệ dƣơng tính 100% Đ/C lu an va n Thí nghiệm p ie gh tn to PR1-0119 Đ/C d oa nl w 100% lu ll u nf va PR1-0219 m oi 1.55 0.08 1.01 0.25 100% 0.03 0.07 0.004 0.32 l gm @ Đ/C 0.02 z z at nh 0.18 m co an Lu Kết kiểm tra hàm lượng kháng thể kháng virus PRRS phương pháp ELISA cho thấy lô đối chứng khơng phát kháng thể dương tính sau 21 ngày tiêm vắc xin lơ thí nghiệm Trong lơ thí nghiệm 21 ngày n va ac th 63 si sau tiêm cho kết dương tính Như vắc xin vơ hoạt kích thích sản sinh kháng thể kháng PRRS lợn Đồng thời trình kiểm tra hàm lượng kháng thể phương pháp Elisa, chung tiến hành kiểm tra hàm lượng kháng thể phương pháp IPMA lô thí nghiệm, kết thí nghiệm thể bảng sau: Bảng 4.22 Kết kiểm tra hàm lƣợng kháng thể phƣơng pháp IPMA Hiệu giá IPMA Lô vắc xin Nhóm PR1-0119 Thí nghiệm lu an va n Đ/C gh tn to ie Thí nghiệm p PR1-0119 oa nl w d Đ/C PR1-0219 ll u nf va an lu Thí nghiệm 3 3 oi m 21dpi 1/80 1/40 1/40 1/80 1/40 1/80 1/40 1/40 1/40 1/80 1/80 1/160 1/80 1/40 1/80 1/80 1/40 1/40 1/80 1/40 1/80 1/40 1/1280 1/640 1/2560 1/1280 1/1280 1/160 1/160 1/80 1/1280 1/2560 1/640 1/1280 1/640 1/160 1/160 1/80 1/1280 1/640 1/2560 1/1280 1/1280 1/40 1/160 1/80 z at nh Đ/C 0dpi Tỷ lệ dƣơng tính bảo hộ 100% 100% 100% z gm @ m co l Từ kết kiểm tra hàm lượng kháng thể phương pháp IPMA cho thấy lợn đối chứng có hàm lượng kháng thể kháng PRRS mức thấp, an Lu mức bảo hộ (IPMA ≥1/640 (TCVN 8685-13:2014 2014)) lơ thí nghiệm thời điểm 21 ngày sau tiêm có tỷ lệ dương tính bảo hộ (IPMA ≥1/640 (TCVN 8685-13:2014 2014) 100% lơ thí nghiệm n va ac th 64 si 1/80 1/160 1/320 lu 1/40 an n va p ie gh tn to d oa nl w va an lu 1/1280 ll u nf 1/640 oi m z at nh z gm @ 1/5120 m co l 1/2560 Hình 4.12 Hình ảnh kiểm tra IPMA an Lu Từ kết xác định hàm lượng kháng thể kháng VIRUS PRRS phương pháp ELISA IPMA, tiếp tục đánh giá hiệu lực vắc xin n va ac th 65 si vô hoạt PRRS phương pháp công cường độc, 21 ngày sau tiêm sau tiêm mũi 2, tiến hành công cường độc chủng virus PRRS cường độc phân lập Việt Nam cho lợn lơ thí nghiệm đối chứng (chủng KTY-PRRS-01 với liều công 100 TCID50) (Phạm Văn Sơn, 2018) Sau cơng cường độc, theo dõi lợn thí nghiệm triệu chứng lâm sàng, đo thân nhiệt hàng ngày theo dõi tình trạng ăn uống lợn 21 ngày Lợn mổ khám sau 21 ngày thí nghiệm để đánh giá biến đổi bệnh lý Theo dõi triệu chứng lâm sàng biểu phản ứng cục lợn lô thời gian 21 ngày sau công cường độc Kết thể bảng 4.23 Bảng 4.23 Kết đánh giá công cƣờng độc lu an STT va Nhóm TN Triệu chứng lâm sang Lợn ăn uống bình thường, có biểu mệt mỏi trở lại bình thường sau – ngày Lợn sốt cao, chảy nước mũi, ho, sưng mí mắt Lợn sau cơng cường độc 12h có phản xạ chậm chạp, sốt nhẹ (39,5 0C), 2-3 ngày sau hoạt động bình thường Lợn sốt cao, bỏ ăn, vận động, ho Lợn sốt nhẹ (390C), ăn uống bình thường Lợn bỏ ăn, sốt cao (40 - 41,50C), mệt mỏi, vận động, da mẩn đỏ vùng da mỏng, khó thở n Lơ 0118 tn to Đ/C TN p ie gh Lô 0119 Đ/C TN Lô 0219 oa nl w Đ/C d Từ bảng 4.23 cho thấy lô vắc xin với lợn thí nghiệm tiêm vắc xin sau 21 ngày sau Cơng cường độc tồn lợn khỏe mạnh khơng biểu triệu chứng bệnh tích PRRS tỷ lệ bảo hộ đạt 100% Ở lô đối chứng tất lợn ốm nặng (với biểu lâm sàng: bỏ ăn, sốt cao, tiêu chảy…) Tổn thương đại thể điển hình phổi hạch lympho, hạch lympho sung huyết, xuất huyết kết hợp hoại tử (hạch hàm, hạch bẹn nông, hạch ruột, hạch phổi…), viêm phổi kẽ Các tổn thương quan sát thấy mổ khám lợn hoàn toàn giống với tổn thương lợn mắc PRRS tự nhiên số nghiên cứu trước công bố (Nguyễn Thị Lan, 2012) ll u nf va an lu oi m z at nh z m co l gm @ Để có thêm thông tin nghiên cứu hiệu lực vắc xin, tiến hành mổ khám để kiểm tra bệnh tích lợn chết thời gian thí nghiệm hết 21 ngày thí nghiệm Bệnh tích lợn thí nghiệm chúng tơi tổng hợp sau: an Lu Lợn nhóm khơng tiêm vắc xin: Bệnh tích đặc trưng thấy chủ yếu phổi hạch lympho Tồn nhóm lợn phổi bị viêm nặng, có n va ac th 66 si đám viêm lan tràn nên làm cho phổi có màu đỏ, xám, chắc, đặc Lợn nhóm tiêm vắc xin không thấy biến đổi quan tổ chức lợn Một số hình ảnh mổ khám lợn lu an n va p ie gh tn to d oa nl w ll u nf va an lu oi m z at nh z gm @ Lợn sau công cường độc m co l Lợn trước cơng cường độc Hình 4.13 Lợn trƣớc sau công cƣờng độc an Lu n va ac th 67 si BIẾN ĐỔI THÂN NHIỆT CỦA LỢN SAU CÔNG CƯỜNG ĐỘC 41 40.5 40 39.5 39 38.5 38 37.5 lu an 37 n va 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 PR 1-0119 TN PR1-0219 TN PR1-0118 DC PR 1-0119 DC PR1-0219 DC Hình 4.14 Biến đổi thân nhiệt lợn sau công cƣờng độc p ie gh tn to PR1-0118 TN d oa nl w Từ kết đánh giá công cường độc, đánh giá hiệu giá kháng thể hội chứng rối loạn sinh sản hô hấp phản ứng ELISA phản ứng IPMA tham chiếu với tiêu chuẩn TCVN 8685-13:2014 quy trình kiểm nghiệm va an lu vắc xin vơ hoạt phịng bệnh hội chứng rối loạn sinh sản hô hấp lợn (PRRS) (TCVN 8685-13:2014 2014) vắc xin vơ hoạt phịng hội chứng rối loạn u nf sinh sản hô hấp lợn đạt tiêu hiệu lực thành phẩm ll Tổng kết thí nghiệm kiểm nghiệm vắc xin thành phẩm vơ hoạt phịng hội chửng rối loạn sinh sản hơ hấp lợn sản xuất quy mô công nghiệp đạt yêu cầu chất lượng theo quy định TCVN 8685-13:2014 (TCVN 8685- oi m z at nh 13:2014 2014) z m co l gm @ an Lu n va ac th 68 si PHẦN KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 5.1 KẾT LUẬN 5.1.1 Hồn thiện quy trình sản xuất vắc xin phòng hội chứng rối loạn sinh sản hô hấp lợn hệ thống chai roller với quy mơ 100 lít kháng ngun/mẻ lu an n va p ie gh tn to - Nuôi cấy tế bào Marc-145 hệ thống chai roller tối ưu điều kiện không CO2 với lượng tế bào ban đầu 1x105 Cells/ml, sau 72h cấy chuyển tế bào lần tốc độ lăn 0,2 đến 0,3 rpm - Liều gây nhiễm thích hợp virus hội chứng rối loạn sinh sản hô hấp chủng KTY - PRRS - 01 môi trường nuôi cấy tế bào Marc - 145 là: 104 TCID50 - Thời gian thu hoạch huyễn dịch virus PRRS thích hợp nhất, hàm lượng virus cao, chất lượng tốt sau gây nhiễm virus 72 - Bất hoạt, nhũ hóa vắc xin vơ hoạt nhũ dầu phịng PRRS, sản xuất thành công 03 lô liên tiếp quy mô tối thiểu 20.000 liều/mẻ - Vắc xin vơ hoạt phịng hội chứng rối loạn sinh sản hô hấp bất hoạt theo quy trình thích hợp BEI nồng độ 1mM 24h 370C, hiệu giá virus trước bất hoạt 108 TCID50/ml nhũ hóa dầu khoáng ISA 201 VG w d oa nl 5.1.2 Kiểm nghiệm vắc xin phòng hội chứng rối loạn sinh sản hô hấp lợn theo quy mô công nghiệp Vắc xin sản xuất đạt chất lượng theo tiêu chuẩn TCVN 8685-13:2014 an lu ll u nf va - Vắc xin đạt cảm quan, không lắng cặn, không đơng vón, màu trắng sữa - Vắc xin đạt u cầu vô trùng, không bị tạp nhiễm vi khuẩn nấm mốc - Vắc xin đạt yêu cầu an toàn tiêm gấp liều sử dụng - Văc xin đạt yêu cầu hiệu lực đánh giá tiêu ELISA, IPMA công cường độc oi m z at nh 5.2 KIẾN NGHỊ z - Tiến hành thử nghiệm vắc xin thực địa nhằm đánh giá hiệu lực việc sử dụng vắc xin vô hoạt phịng hội chứng rối loạn sinh sản hơ hấp lợn - Đánh giá độ dài miễn dịch lợn sau tiêm vắc xin, xác định thời gian tái chủng phù hợp - Nghiên cứu hạn sử dụng vắc xin vơ hoạt phịng hội chứng rối loạn sinh sản hơ hấp điều kiện lão hóa cấp tốc, điều kiện khắc nghiệt m co l gm @ an Lu - Đưa vắc xin vào sản xuất thương mại n va ac th 69 si TÀI LIỆU THAM KHẢO I Tài liệu tiếng Việt: Bộ Khoa học Cơng nghệ (2014) TCVN 8685-13:2014 Quy trình kiểm nghiệm - phần 13: Vắc xin vơ hoạt phịng bệnh hội chứng rối loạn sinh sản hô hấp lợn (PRRS) Việt Nam: Bộ Y Tế (2018) Nguyên tắc, tiêu chuẩn thực hành tốt sản xuất thuốc tổ chức y tế giới 35/2018/TT-BYT B Y Tế Chăn nuôi Việt Nam (2018) Thống Kê Chăn Nuôi Việt Nam 01/10/2018 Truy cập 20/03/2019, 2019 http://channuoivietnam.com/thong-ke-chan-nuoi/ Cục Thú Y (2007) Báo cáo tình hình dịch bệnh lợn tỉnh đồng lu Sông Hồng an n va Cục Thú Y (2018) Báo cáo tổng kết Cục thú y 2018 Feng Y., T Zhao, N Tùng, K Inui, Y Ma, N T Hoa, Nguyễn Văn Cảm, D Liu, to biến chủng virus gây hội chứng rối loạn sinh sản hô hấp Việt Nam Trung Quốc năm 2007" Khoa học thú y XVI (1) Kamakawa A., Hồ Thị Viết Thu S Yamada (2006) "Epidemiological survey p ie gh tn Bùi Quang Anh, Tô Long Thành, C Wang, K Tian and G F Gao (2009) "Các nl w of viral diseases of pigs in the Mekong delta of Vietnam between 1999 and 2003." oa Vet Microbiol 118(1-2).tr 47-56 Nguyễn Bá Hiên Trần Thị Lan Hương (2010) Miễn Dịch Học Ứng Dụng Nhà d lu va an xuất nông nghiệp, Hà Nội Nguyễn Ngọc Tiến (2011) "Tình hình dịch lợn tai xanh (PRRS) Việt Nam u nf cơng tác phịng chống dịch" Tạp chí Khoa học kỹ thuật thú y 1.tr 18 ll Nguyễn Lương Hiền Ngô Thành Long., (2001) Bước đầu khảo sát hội chứng oi m 10 z at nh rối loạn sinh sản hô hấp số trại heo giống thuộc vùng thành phố Hồ Chí Minh Báo cáo khoa học, phần chăn nuôi thú y 1999-2000.tr 224-227 11 Nguyễn Bá Hiên, Trần Xuân Hạt, Phạm Quang Thái, Hồng Văn Năm., (2010) z @ Cơng nghệ chế tạo sử dụng vắc xin thú y Nhà xuất Nông Nghiệp, Hà Nội Nguyễn Bá Hiên Huỳnh Thị Mỹ Lệ (2013), Bệnh truyền nhiễm động vật l gm 12 nuôi biện pháp khống chế Nhà xuất Nông nghiệp, Hà Nội m co 13 Nguyễn Thị Lan (2012) "Đặc điểm bệnh lý Hội chứng rối loạn sinh sản hô hấp huỳnh quang" Tạp chí Khoa học Kỹ thuật thú y 19 (3) an Lu (PRRS) lợn sau cai sữa lợn choai xác định kỹ thuật miễn dịch n va ac th 70 si 14 Phạm Văn Sơn (2018) Nghiên cứu tạo giống gốc thử nghiệm sản xuất vacxin vơ hoạt phịng hội chứng rối loạn sinh sản hô hấp lợn từ chủng virus phân lập việt nam Luận án tiến sĩ, Học Viện Nông Nghiệp Việt Nam 15 Phạm Văn Sơn, Nguyễn Thị Lan, Nguyễn Văn Cảm Nguyễn Bá Hiên (2017) "Nghiên cứu ổn định số đặc tính sinh học sinh học phân tử chủng virus KTY-PRRS-01 phân lập Việt Nam" Tạp chí Khoa học Nơng nghiệp Việt Nam 15(2).tr 13 16 Tô Long Thành Nguyễn Văn Long (2007) “Hội chứng rối loạn sinh sản hô hấp lợn”, Khoa học kỹ thuật thú y." Khoa học kỹ thuật thú y XIV (3).tr 17 Wiliam T, Christianson H S Joo (2001) "Hội chứng sinh sản hô hấp lợnPorcine reproductive and respiratory syndrome (PRRS)." Khoa học thú y VIII lu an (2).tr.74-87 n va II Tài liệu tiếng Anh: tn to 18 Allende R., G F Kutish, W Laegreid, Z Lu, T L Lewis, D L Rock, J Friesen, J A Galeota, A R Doster and F A Osorio (2000) "Mutations in the genome of p ie gh porcine reproductive and respiratory syndrome virus responsible for the attenuation phenotype." Arch Virol 145(6) pp 1149-1161 An T.-Q., Z.-J Tian, C.-L Leng, J.-M Peng and G.-Z Tong (2011) "Highly nl w 19 Bahnemann H G (1990) "Inactivation of viral antigens for vaccine preparation with d 20 oa pathogenic porcine reproductive and respiratory syndrome virus, Asia." lu Bautista E M., S M Goyal, I J Yoon, H S Joo and J E Collins (1993) u nf va 21 an particular reference to the application of binary ethylenimine" Vaccine 8(4): 299-303 "Comparison of porcine alveolar macrophages and CL 2621 for the detection of ll oi m porcine reproductive and respiratory syndrome (PRRS) virus and anti-PRRS antibody" J Vet Diagn Invest 5(2) pp 163-165 z at nh 22 Beura L K., S N Sarkar, B Kwon, S Subramaniam, C Jones, A K Pattnaik and F A Osorio (2010) "Porcine reproductive and respiratory syndrome virus z @ nonstructural protein 1beta modulates host innate immune response by 23 l gm antagonizing IRF3 activation" J Virol 84(3) pp 1574-1584 Bloemraad M., E P de Kluijver, A Petersen, G E Burkhardt and G Wensvoort m co (1994) "Porcine reproductive and respiratory syndrome: temperature and pH pigs" Vet Microbiol 42(4) pp 361-371 an Lu stability of Lelystad virus and its survival in tissue specimens from viraemic n va ac th 71 si 24 Burch R A., E E Maso, P R Pujadas and N S Roca (1999) Attenuated strain of the virus causing the porcine reproductive respiratory syndrome (PRRS), and vaccines, Google Patents 25 Chand R J., B R Trible and R R Rowland (2012) "Pathogenesis of porcine reproductive and respiratory syndrome virus." Curr Opin Virol 2(3): 256-263 26 Charerntantanakul W (2012) "Porcine reproductive and respiratory syndrome virus vaccines: Immunogenicity, efficacy and safety aspects." World journal of virology 1(1): 23 27 Charerntantanakul W., R Platt, W Johnson, M Roof, E Vaughn and J A Roth (2006) "Immune responses and protection by vaccine and various vaccine lu adjuvant candidates to virulent porcine reproductive and respiratory syndrome an virus" Vet Immunol Immunopathol 109(1-2) pp 99-115 va n 28 Collins J (1991) "Newly recognized respiratory syndromes in North American to tn swine herds." American Association of Swine Practitioners Newsletter 3(7): Collins J E., D A Benfield, W T Christianson, L Harris, J C Hennings, D P ie gh 29 p Shaw, S M Goyal, S McCullough, R B Morrison, H S Joo and et al., (1992) w "Isolation of swine infertility and respiratory syndrome virus (isolate ATCC VR- oa nl 2332) in North America and experimental reproduction of the disease in gnotobiotic pigs." J Vet Diagn Invest 4(2) pp 117-126 d De Lima, M., A K Pattnaik, E F Flores and F A Osorio (2006) "Serologic an lu 30 va marker candidates identified among B-cell linear epitopes of Nsp2 and structural ll u nf proteins of a North American strain of porcine reproductive and respiratory Delrue I., P L Delputte and H J Nauwynck (2009) "Assessing the functionality oi 31 m syndrome virus" Virology 353(2) pp 410-421 z at nh of viral entry-associated domains of porcine reproductive and respiratory syndrome virus during inactivation procedures, a potential tool to optimize z 32 gm @ inactivated vaccines" Veterinary research 40(6) pp 1-15 Duan, X., H J Nauwynck and M B Pensaert (1997) "Virus quantification and l identification of cellular targets in the lungs and lymphoid tissues of pigs at m co different time intervals after inoculation with porcine reproductive and respiratory 33 an Lu syndrome virus (virus PRRS)." Vet Microbiol 56(1-2) pp 9-19 EC (1991) "New Pig Disease" European Parliament Technical sheet Strasburd: n va ac th 72 si 34 Feng Y., T Zhao, T Nguyen, K Inui, Y Ma, T H Nguyen, V C Nguyen, D Liu, Q A Bui, L T To, C Wang, K Tian and G F Gao (2008) "Porcine respiratory and reproductive syndrome virus variants, Vietnam and China, 2007" Emerg Infect Dis 14(11) pp 1774-1776 35 Goyal S M (1993) "Porcine reproductive and respiratory syndrome." J Vet Diagn Invest 5(4) pp 656-664 36 Gulyaeva A., M Dunowska, E Hoogendoorn, J Giles, D Samborskiy and A E Gorbalenya (2017) "Domain Organization and Evolution of the Highly Divergent 5' Coding Region of Genomes of Arteriviruses, Including the Novel Possum Nidovirus." J Virol 91(6) 37 Halbur P G., P S Paul, M L Frey, J Landgraf, K Eernisse, X J Meng, J J lu an Andrews, M A Lum and J A Rathje (1996) "Comparison of the antigen va distribution of two US porcine reproductive and respiratory syndrome virus n isolates with that of the Lelystad virus" Vet Pathol 33(2) pp 159-170 Halbur P G., P S Paul, M L Frey, J Landgraf, K Eernisse, X J Meng, M A gh Lum, J J Andrews and J A Rathje (1995) "Comparison of the pathogenicity of tn to 38 ie two US porcine reproductive and respiratory syndrome virus isolates with that of p Keffaber K (1989) "Reproductive failure of unknown etiology." American nl 39 w the Lelystad virus." Vet Pathol 32(6) pp 648-660 Kim H S., J Kwang, I J Yoon, H S Joo and M L Frey (1993) "Enhanced an lu 40 d oa Association of Swine Pracitioners Newletter 1: 10 replication of porcine reproductive and respiratory syndrome (PRRS) virus in a va Kim H., H K Kim, J H Jung, Y J Choi, J Kim, C G Um, S B Hyun, S Shin, ll 41 u nf homogeneous subpopulation of MA-104 cell line." Arch Virol 133(3-4) pp 477-483 oi m B Lee, G Jang, B K Kang, H J Moon and D S Song (2011) "The assessment z at nh of efficacy of porcine reproductive respiratory syndrome virus inactivated vaccine based on the viral quantity and inactivation methods." Virol J 8: 323 42 Kimman T G., L A Cornelissen, R J Moormann, J M Rebel and N Stockhofe- z gm @ Zurwieden (2009) "Challenges for porcine reproductive and respiratory syndrome virus (VIRUS PRRS) vaccinology." Vaccine 27(28) pp 3704-3718 l 43 Labarque G., S Van Gucht, K Van Reeth, H Nauwynck and M Pensaert (2003) m co "Respiratory tract protection upon challenge of pigs vaccinated with attenuated an Lu porcine reproductive and respiratory syndrome virus vaccines." Vet Microbiol 95(3) pp 187-197 n va ac th 73 si 44 Lee J A., B Kwon, F A Osorio, A K Pattnaik, N H Lee, S W Lee, S Y Park, C S Song, I S Choi and J B Lee (2014) "Protective humoral immune response induced by an inactivated porcine reproductive and respiratory syndrome virus expressing the hypo-glycosylated glycoprotein 5." Vaccine 32(29) pp 3617-3622 45 Lopez O J and F A Osorio (2004) "Role of neutralizing antibodies in VIRUS PRRS protective immunity." Vet Immunol Immunopathol 102(3) pp 155-163 46 Loula T (1991) "Mystery pig disease." Agri-Practice (USA) 47 Martelli P., P Cordioli, L G Alborali, S Gozio, E De Angelis, L Ferrari, G Lombardi and P Borghetti (2007) "Protection and immune response in pigs intradermally vaccinated against porcine reproductive and respiratory syndrome lu (PRRS) and subsequently exposed to a heterologous European (Italian cluster) an field strain." Vaccine 25(17) pp 3400-3408 va n 48 Morrison R B., J E Collins, L Harris, W T Christianson, D A Benfield, D W to Chladek, D E Gorcyca and H S Joo (1992) "Serologic evidence incriminating a respiratory syndrome (SIRS)." J Vet Diagn Invest 4(2) pp 186-188 p ie gh tn recently isolated virus (ATCC VR-2332) as the cause of swine infertility and Murtaugh M P., M R Elam and L T Kakach (1995) "Comparison of the w 49 oa nl structural protein coding sequences of the VR-2332 and Lelystad virus strains of the PRRS virus." Arch Virol 140(8) pp 1451-1460 d Murtaugh M P., Z Xiao and F Zuckermann (2002) "Immunological responses an lu 50 va of swine to porcine reproductive and respiratory syndrome virus infection." Viral OIE (2015) "Porcine reproductive and respiratory syndrome." (cited 2019 20/03/2019); ll 51 u nf immunology 15(4) pp 533-547 m oi Available from: http://www.oie.int/standard-setting/terrestrial-manual/access-online/ z at nh 52 Ostrowski M., J A Galeota, A M Jar, K B Platt, F A Osorio and O J Lopez (2002) "Identification of neutralizing and nonneutralizing epitopes in z @ the porcine reproductive and respiratory syndrome virus GP5 ectodomain" J l 53 gm Virol 76(9) pp 4241-4250 Paton D J., I H Brown, S Edwards and G Wensvoort (1991) "'Blue ear' disease m co of pigs." Vet Rec 128(26).pp 617 Paton D., I Brown, S Edwards and G Wensvoort (1991) "'Blue ear' disease of an Lu 54 pigs." Vet Rec 128(24) pp 574 n va ac th 74 si 55 Pileri E and E Mateu (2016) "Review on the transmission porcine reproductive and respiratory syndrome virus between pigs and farms and impact on vaccination." Vet Res 47(1).pp 108 56 Plagemann P G and V Moennig (1992) "Lactate dehydrogenase-elevating virus, equine arteritis virus, and simian hemorrhagic fever virus: a new group of positive-strand RNA viruses." Adv Virus Res 41 pp 99-192 57 Rossow K D (1998) "Porcine reproductive and respiratory syndrome." Vet Pathol 35(1) pp 1-20 58 Shimizu M., S Yamada, Y Murakami, T Morozumi, H Kobayashi, K Mitani, N Ito, M Kubo, K Kimura, M Kobayashi and et al., (1994) "Isolation of lu porcine reproductive and respiratory syndrome (PRRS) virus from Heko-Heko an va disease of pigs." J Vet Med Sci 56(2) pp 389-391 n 59 Silva J., D Rocha, I Cunha, L R Sales, F Neto, M Fontes and J Simões (2015) to reproductive and respiratory syndrome" Asian Pacific Journal of Reproduction ie gh tn "Serological profile of offspring on an intensive pig farm affected by porcine p 4(4) pp 317-321 60 Terpstra C., G Wensvoort and J M Pol (1991) "Experimental reproduction of nl w oa porcine epidemic abortion and respiratory syndrome (mystery swine disease) by d infection with Lelystad virus: Koch's postulates fulfilled" Vet Q 13(3) pp 131-136 lu Terpstra C., G Wensvoort and J Pol (1991) "Experimental reproduction of porcine an 61 u nf va epidemic abortion and respiratory syndrome (mystery swine disease) by infection with Lelystad vims: Koch's postulates fulfilled" Veterinary Quarterly 13(3) pp 131-136 ll Tian K., X Yu, T Zhao, Y Feng, Z Cao, C Wang, Y Hu, X Chen, D Hu and oi m 62 z at nh X Tian (2007) "Emergence of fatal VIRUS PRRS variants: unparalleled outbreaks of atypical PRRS in China and molecular dissection of the unique @ 63 z hallmark" PloS one 2(6): e526 Tong G Z., Y J Zhou, X F Hao, Z J Tian, T Q An and H J Qiu (2007) gm 64 m co Emerg Infect Dis 13(9) pp 1434-1436 l "Highly pathogenic porcine reproductive and respiratory syndrome, China" Vet Rec (1992) "Porcine reproductive and respiratory syndrome (PRRS or blue- an Lu eared pig disease)" Vet Rec 130(5) pp 87-89 n va ac th 75 si 65 Wensvoort G., C Terpstra, J M Pol, E A ter Laak, M Bloemraad, E P de Kluyver, C Kragten, L van Buiten, A den Besten, F Wagenaar and et al., (1991) "Mystery swine disease in The Netherlands: the isolation of Lelystad virus" Vet Q 13(3) pp 121-130 66 White,M (1991) "'Blue ear'disease of pigs." Veterinary Record (United Kingdom) 67 WHO (1992) Good Maunfacturing practices for biological products, WHO (cited 2019 20/03/2019); Available from: https://www.who.int/biologicals/areas/vaccines/Annex_2_WHO_Good_manufacturing_ practices_for_biological_products.pdf 68 WHO (2011) WHO good manufacturing practices for sterile pharmaceutical lu products (cited 2019 20/03/2019); Available from: http://www.who.int an /medicines/services/expertcommittees/pharmprep/GMP-Sterile_QAS09295.pdf va 69 WHO (2014) WHO good maunfacturing practices for pharmaceutical products: n https://www.who.int/medicines/areas/quality_safety/quality_assurance/GMPPhar maceuticalProductsMainPrinciplesTRS961Annex3.pdf Yoo D., C Song, Y Sun, Y Du, O Kim and H C Liu (2010) "Modulation of 70 p ie gh tn to Main principles (cited 2019 20/03/2019); Available from: nl w host cell responses and evasion strategies for porcine reproductive and respiratory d oa syndrome virus" Virus Res 154(1-2).pp 48-60 ll u nf va an lu oi m z at nh z m co l gm @ an Lu n va ac th 76 si