Nghiên cứu phân lập và tuyển chọn chủng vi khuẩn lactic có một số đặc tính dùng để định hướng ứng dụng sản xuất sản phẩm probiotic

LỜI CẢM ƠN Trên thực tế khơng có thành công mà không gắn liền với hỗ trợ, giúp đỡ dù hay nhiều, dù trực tiếp hay gián tiếp ngƣời khác Trong suốt thời gian từ bắt đầu học tập trƣờng đến nay, em nhận đƣợc nhiều quan tâm, giúp đỡ q Thầy Cơ, gia đình bạn bè Với lòng biết ơn sâu sắc nhất, em xin gửi đến Cơ Bộ mơn Vi sinh - Hóa sinh thuộc Viện Công nghệ Sinh học - Trƣờng Đại học Lâm Nghiệp với tri thức tâm huyết để truyền đạt vốn kiến thức quý báu cho chúng em suốt thời gian học tập Trƣờng Và đặc biệt em xin chân thành cảm ơn TS Nguyễn Nhƣ Ngọc nhiệt tình hƣớng dẫn em hồn thành tốt báo cáo khóa luận tốt nghiệp Nếu khơng có lời hƣớng dẫn, dạy bảo Thầy Cơ em nghĩ báo cáo khóa luận tốt nghiệp em khó hồn thiện đƣợc Một lần nữa, em xin chân thành cảm ơn thầy cô Bƣớc đầu vào thực tế em hạn chế nhiều bỡ ngỡ, trình độ lý luận nhƣ kinh nghiệm thực tiễn cịn hạn chế Do vậy, khơng tránh khỏi thiếu sót, em mong nhận đƣợc ý kiến đóng góp q báu q Thầy Cơ để kiến thức em lĩnh vực đƣợc hoàn thiện hơn, giúp em học hỏi thêm đƣợc nhiều kinh nghiệm làm hành trang tốt cho công việc sau Em xin chân thành cảm ơn! Hà nội, ngày tháng năm 2018 Sinh viên thực Nguyễn Thị Lý MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG DANH MỤC CÁC HÌNH ĐẶT VẤN ĐỀ Chƣơng 1: TỔNG QUAN 1.1 Vi khuẩn Lactic (LAB) 1.1.1 Khái quát nhóm vi khuẩn sinh Lactic 1.1.2 Phân loại vi khuẩn lactic 1.1.3 Các yếu tố ảnh hƣởng đến sinh trƣởng vi khuẩn lactic 1.1.4 Ứng dụng vi khuẩn lactic 1.2 Probiotic 10 1.2.1 Khái niệm Probiotic 10 1.2.2 Vai trò Probiotic 11 Chƣơng 2: MỤC TIÊU – NÔI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 16 2.1 Mục tiêu nghiên cứu 16 2.2 Nội dung nghiên cứu 16 2.3 Phƣơng pháp nghiên cứu 16 2.3.1 Nguyên liệu 16 2.3.2 Hóa chất Thiết bị 16 2.3.3 Các phƣơng pháp nghiên cứu 18 Chƣơng 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 25 3.1 Kết phân lập khiết giống 25 3.2 Kết khả sinh axit lactic 27 3.3 Kết đặc điểm sinh hoá chủng đƣợc chọn lọc 28 3.4 Kết kiểm tra khả chịu nhiệt 30 3.5 Kết kiểm tra khả chịu pH thấp 31 3.6 Kết khả sinh chất kháng khuẩn 32 3.7 Kết thử hoạt tính enzyme ngoại bào 36 3.8 Kết thử hoạt tính kháng kháng sinh 38 Chƣơng 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 41 4.1 Kết luận 41 4.2 Kiến nghị 41 TÀI LIỆU THAM KHẢO DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT LAB (Lactic Acid Bacteria) Vi khuẩn lactic MRS de Man, Rogosa, Sharp BC (Bacterial Cellulose) Cellulose vi khuẩn kDa kiloDalton sp (species) Loài GRAS Generally Recognized As Safe (Đƣợc cơng nhận chung an tồn) aa Acid amino VSV Vi sinh vật VK Vi khuẩn NCCLS National Committee for Clinical Laboratory Standards LB Lysogeny Broth (môi trƣờng để nuôi cấy vi khuẩn) WHO FAO World Health Organization (Tổ chức Y tế giới) Food and Agriculture Organization of the United Nations (Tổ chức Lƣơng thực Nông nghiệp Liên Hiệp Quốc) DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 2.1 Danh sách máy móc thiết bị sử dụng 18 Bảng 3.1: Kết phân lập vi khuẩn LAB 26 Bảng 3.2: Kết khả sinh axit chủng vi khuẩn 27 Bảng 3.3: Kết thử nghiệm phản ứng Calatase nhuộm Gram 29 Bảng 3.4: Kết mật độ vi khuẩn cfu /ml với ảnh hƣởng nhiệt dộ 31 Bảng 3.5: Kết mật độ vi khuẩn cfu/ml với ảnh hƣởng pH 32 Bảng 3.6: Kết thử nghiệm hoạt tính kháng khuẩn chủng vi khuẩn 33 Bảng 3.7: Hoạt tính enzyme ngoại bào 36 Bảng 3.8: Hoạt tính kháng kháng sinh Tetracylin 38 Bảng 3.9: Hoạt tính kháng kháng sinh Streptomycin 39 Bảng 3.10: Hoạt tính kháng kháng sinh Gentamycin 39 DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1 Một số hình ảnh vi khuẩn lactic [1] Hình 3.1 Hình ảnh khuẩn lạc vi khuẩn phân lập từ thực phẩm lên men 27 Hình 3.2 Ống nghiệm bảo quản giống vi khuẩn 28 Hình 3.3 Khả ức chế vi khuẩn Ecoli gây bệnh dịch chất kháng khuẩn thô các chủng vi khuẩn đƣợc tuyển chọn 33 Hình 3.4 Khả ức chế vi khuẩn Samonella gây bệnh dịch chất kháng khuẩn thô các chủng vi khuẩn đƣợc tuyển chọn 33 Hình 3.5 Khả ức chế vi khuẩn Shigella gây bệnh dịch chất kháng khuẩn thô các chủng vi khuẩn đƣợc tuyển chọn 34 Hình 3.6 Khả ức chế vi khuẩn H12 dịch chất kháng khuẩn thô các chủng vi khuẩn đƣợc tuyển chọn 34 Hình 3.7 Khả ức chế vi khuẩn BA dịch chất kháng khuẩn thô các chủng vi khuẩn đƣợc tuyển chọn 34 Hình 3.8 Khả ức chế vi khuẩn NT1 dịch chất kháng khuẩn thô các chủng vi khuẩn đƣợc tuyển chọn 35 Hình 3.9 Hoạt tính phân giải Tinh bột chủng vi khuẩn 37 đƣợc tuyển chọn 37 Hình 3.10 Hoạt tính phân giải Cellulose chủng vi khuẩn đƣợc tuyển chọn 37 Hình 3.11 Hoạt tính phân giải Protease chủng vi khuẩn đƣợc tuyển chọn 37 Hình 3.12 Hoạt tính kháng kháng sinh nồng độ 10mg/l chủng vi khuẩn tuyển chọn 39 Hình 3.13 Hoạt tính kháng kháng sinh nồng độ 50mg/l chủng vi khuẩn tuyển chọn 40 ĐẶT VẤN ĐỀ Từ thời cổ đại ngƣời biết sử dụng Vi sinh vật (VSV) để chế biến bảo quản thực phẩm, nhƣng ý tƣởng tạo sản phẩm VSV sống hữu ích để bổ sung vào thức ăn nƣớc uống nhằm cải thiện sức khoẻ nâng cao suất vật nuôi đƣợc quan tâm nhiều vài thập kỷ trở lại Khi chƣa tìm thuốc kháng sinh, ngƣời biết tiêu thụ thực phẩm chứa vi sinh vật sống có lợi nhƣ sản phẩm lên men có nguồn gốc từ sữa Theo Ayurveda, ngành y học lâu đời khoảng 2500 năm trƣớc công nguyên, tiêu thụ sữa chua (1 sản phẩm sữa lên men) đƣợc ủng hộ để trì sức khỏe tốt (Chopra v Doiphode, 2002) Các vi khuẩn có lợi ruột tạo ảnh hƣởng tốt cho thể cách ngăn cản khối ung thƣ, làm bất hoạt virus, tạo cc enzyme kháng thể tự nhiên, làm giảm cholesterol Bên cạnh chúng ức chế tăng trƣởng vi khuẩn có hại qua việc tiết mơi trƣờng acid hữu cơ, chất kháng khuẩn, đặc biệt tạo thành chất kháng khuẩn Trong vi khuẩn có hại lại tạo sản phẩm có hại cho vật chủ nhƣ độc tố chất gây ung thƣ Khi vi khuẩn có hại chiếm ƣu thế, cạnh tranh chất dinh dƣỡng với tế bào vật chủ đồng thời nồng độ chất có hại tăng lên Các chất không tác động mà tích lũy thể vật chủ theo thời gian, chúng đƣợc xem nhƣ yếu tố gây lo hại, ung thƣ, xơ vữa động mạch, giảm khả miễn dịch Năm 1974, Paker đƣa khái niệm probiotic để VSV chất làm cân hệ VSV đƣờng ruột ngƣời vật ni, kể từ có nhiều phát vai trò, tác dụng VSV sống nhƣ: tăng cƣờng sức khoẻ hệ tiêu hố thơng qua cải thiện cân hệ vi sinh vật ruột (Fuller, 1989), tăng đáp ứng miễn dịch, phòng chống ung thƣ đƣờng tiêu hoá (FAO/WHO, 2001), giảm colesterol máu (Pereira Gibson, 2002) Các (VSV) probiotic thiết phải VSV sống hữu ích, chúng vi khuẩn (VK) (thƣờng VK khuẩn lactic, số chủng Bacillus) nấm men Đề tài: “Nghiên cứu phân lập tuyển chọn chủng vi khuẩn lactic có số đặc tính dùng để sản xuất sản phẩm probiotic” đƣợc tiến hành nhằm phân lập, đánh giá, tuyển chọn chủng vi khuẩn lactic có đặc tính probiotic phục vụ cho việc sản xuất sản phẩm Probiotic Chƣơng 1: TỔNG QUAN 1.1 Vi khuẩn Lactic (LAB) 1.1.1 Khái quát nhóm vi khuẩn sinh Lactic Vi khuẩn lactic (LAB) đƣợc định nghĩa nhóm vi khuẩn Gram (+), gồm trực khuẩn cầu khuẩn khơng sinh bào tử, khơng ƣa khí (non-aerobic) nhƣng chịu oxy (aerotolerant), sinh acid lactic sản phẩm lên men carbohydrat LAB gồm nhiều chi, tiêu biểu chi Lactobacillus, Leuconostoc, Pediococcus Streptococcus [3,14] Các LAB không di động, catalase âm tính, tỉ lệ GC thấp dƣới 50% LAB ƣa ấm chịu nhiệt, nhiệt độ sinh trƣởng tối ƣu tùy loài, dao động từ 28 đến 45oC LAB có nhu cầu dinh dƣỡng phức tạp, lên men cần vitamin, acid amin peptid ngắn Nguồn carbohydrat glucose, fructose, lactose, maltose, sucrose; số chủng vi khuẩn sử dụng tinh bột nhƣ Lactobacillus amylophilus L amylovorus [15] LAB phân bố rộng rãi nhiều hệ sinh thái, thƣờng đƣợc tìm thấy số loại thực phẩm (các sản phẩm từ sữa, thịt rau lên men, bột nhào chua…), thực vật, đƣờng tiêu hóa, hơ hấp sinh dục ngƣời động vật [2,3] LAB có lịch sử ứng dụng lâu đời thực phẩm lên men tác động có lợi mặt dinh dƣỡng, cảm quan tuổi thọ sản phẩm, với sản phẩm dễ hỏng nhƣ sữa, thịt, cá, số loại rau Trong y dƣợc, nhiều loài LAB đƣợc sử dụng làm probiotic để cải thiện nâng cao sức khỏe với nhiều tác dụng trị liệu đáng ý nhƣ ngăn ngừa nhiễm khuẩn đƣờng ruột, điều trị tiêu chảy, tăng cƣờng đáp ứng miễn dịch, giảm cholesterol máu, giảm nguy mắc ung thƣ [15] LAB sinh nhiều loại chất có tác dụng kháng khuẩn: acid lactic, acid acetic, ethanol, acid béo, H2O2, diacetyl… đặc biệt chất kháng khuẩn Mặc dù chất kháng khuẩn đƣợc tìm thấy nhiều loại vi khuẩn khác, chất kháng khuẩn sinh LAB thu hút đƣợc ý đặc biệt nhà khoa học tính an tồn tác dụng ức chế nhiều vi khuẩn gây bệnh nguy hiểm nhƣ Staphylococcus aureus, Listeria monocytogenes… Trong số khoảng 200 chất kháng khuẩn đƣợc mô tả nay, chất kháng khuẩn từ LAB chiếm tới 90% [16] Một số vi khuẩn thƣờng dùng thực phẩm, số giống vi khuẩn lactic nòng cốt liên quan đến trình lên men thực phẩm nhƣ: Lactobacillus, Lactococcus, Leuconostoc, Pediococcus Streptococcus [3] 1.1.2 Phân loại vi khuẩn lactic 1.1.2.1 Phân loại vi khuẩn lactic theo Orla-Jensen Orla-Jensen phân loại vi khuẩn lactic dựa vào đặc điểm hình thái học (cầu khuẩn trực khuẩn), kiểu lên men, khả phát triển nhiệt độ khác nhau, mức độ sử dụng đƣờng Một số giống vi khuẩn lactic nịng cốt liên quan đến q trình lên men thực phẩm nhƣ Lactobacillus, Lactococcus, Leuconostoc, Pediococcus Streptococcus [2,3] Hình 1.1 Một số hình ảnh vi khuẩn lactic [1]  Streptococcus Nhóm vi khuẩn có dạng hình cầu hình trứng, kết đơi hay dạng chuỗi, lên men đồng hình Hiện có 50 lồi Streptococus đƣợc nhận biết, vi khuẩn phân bố chủ yếu xoang miệng đƣờng hô hấp Một số Streptococcus nhƣ Sp Mutans tác nhân gây bệnh sâu viêm màng tim [4] DL1 + DL2 + DC3 + N2 + N3 + Que dài - - - - - - - - - - Dƣa chua Dƣa củ chua Que dài Que dài Que ngắn Nem chua Que ngắn 3.4 Kết kiểm tra khả chịu nhiệt Kết NC Phạm Thị Ngọc Lan Lê Thanh Bình, (2003) cho thấy, phân lập từ phân gà tƣơi 789 chủng vi khuẩn lactic, có hai chủng lựa chọn (CH123 CH156) có đặc tính probiotic hai chủng có khả sinh trƣởng khung nhiệt độ từ 15-45oC Đối với VSV probiotic, khả sống phạm vi nhiệt độ rộng có ý nghĩa khơng nhiều chúng diện đƣờng tiêu hóa vật nuôi, nhƣng lại quan trọng chúng tồn 30 điều kiện bảo quản trƣờng hợp chế biến thức ăn [11] Sự ảnh hƣởng nhiệt độ tới sinh trƣởng vi khuẩn lactic đƣợc mô tả bảng 3.4 Bảng 3.4: Kết mật độ vi khuẩn cfu /ml với ảnh hƣởng nhiệt dộ STT Kí hiệu vi khuẩn Mật độ vi khuẩn cfu /ml 30oC 35oC 37oC 40oC 45oC M1 4.107 8.107 6.108 4.108 2,8.106 M3 2,4.107 7.107 5.108 3.108 5.106 C2 4,2.107 8,2.107 6,2.108 3,8.108 6.106 DC3 5.107 1.108 8,2.108 4,5.108 2.107 N2 5,2.107 1,2.108 8.108 4.108 2,3.107 N3 5.107 1,5.108 8,1.108 4,1.108 2,1.107 - Tất vi khuẩn có khả chịu nhiệt từ 30 – 45oC Tất vi khuẩn sinh trƣởng tốt nhiệt dộ 37oC cho mật độ vi sinh vật > 5.108 Tại điểm nhiệt dƣới 37oC vi khuẩn sinh trƣởng hơn, nồng độ vi sinh vật giảm - Các chủng vi khuẩn: DC3; N2; N3 có tốc độ sinh trƣởng tốt ổn định chủng vi khuẩn lại Định hƣớng ứng dụng chủng bảo quản thực phẩm chế biến thức ăn 3.5 Kết kiểm tra khả chịu pH thấp Một đặc tính quan trọng khác vi sinh vật probiotic khả sống mơi trƣờng có độ pH khác Các kết nghiên cứu ảnh hƣởng pH môi trƣờng nuôi cấy đến mật độ khả sản sinh axit lactic VSV probiotic đƣợc trình bày bảng 3.5 31 Bảng 3.5: Kết mật độ vi khuẩn cfu/ml với ảnh hƣởng pH STT Mật độ vi khuẩn cfu/ml Kí hiệu vi khuẩn pH=2 pH=3 pH=4 pH=5 M1 2.105 2,3.105 2,4.106 3,4.107 M3 1,3.105 1,5.105 1,6.106 2.107 C2 2,2.105 2,3.105 2,4.106 4.107 DC3 6.105 8.105 8.106 2.108 N2 7.105 8,2.105 8.106 2,3.108 N3 8,1.105 1.106 1,2.107 4.108 - Tất chủng vi khuẩn có khả sinh trƣởng điều kiện pH thấp (từ 2-5) Tại pH mật độ vi khuẩn >106 CFU/ml - Các chủng vi khuẩn: DC3; N2; N3 có khả sinh trƣởng mạnh tạo thành sinh khối lớn hơn, cho thấy chúng có khả chịu đƣợc pH thấp tốt Lợi dụng đặc điểm để sử dụng chủng vi khuẩn bảo quản thực phẩm lên men loại thực phẩm 3.6 Kết khả sinh chất kháng khuẩn Bổ sung 500 µl dịch thơ thu đƣợc từ dịch lên men chủng vi khuẩn có khả sinh axit mạnh (gồm: M1; M3; C2; N2; N3; DC3) vào lỗ đĩa thạch chứa môi trƣờng LB cấy sẵn vi sinh vật gây bệnh Hoạt tính ức chế số vi khuẩn gây bệnh (E.coli, Samonella sp., Shigella sp., Bacillus cereus) dịch chất kháng khuẩn thơ đƣợc thể đƣờng kính vịng vơ khuẩn xung quanh lỗ thạch đƣợc thể bảng 3.4 hình 3.3; 3.4; 3.5; 3.6; 3.7; 3.8 32 Bảng 3.6: Kết thử nghiệm hoạt tính kháng khuẩn chủng vi khuẩn STT Hoạt tính kháng khuẩn (D – d,mm) Kí hiệu H12 chủng Ecoli Samonella Shigella Ba1 M1 M3 C2 DC3 N2 N3 19ab 19ab 17b 21a 18ab 19ab 22a 21a 21a 32a 33aa 32aa 18ab 22a 15bc 24a 23a 23a 13c 16b 17b 23a 24a 23a 14c 16b 12c 19a 20a 22a NT1 17b 19ab 15b 33aa 32aa 35aa Trong đó: a: khả kháng khuẩn tốt; b : khả kháng khuẩn trung bình ; c : khả kháng khuẩn kém) (d= 7mm) Hình 3.3 Khả ức chế vi khuẩn Ecoli gây bệnh dịch chất kháng khuẩn thô các chủng vi khuẩn tuyển chọn Hình 3.4 Khả ức chế vi khuẩn Samonella gây bệnh dịch chất kháng khuẩn thô các chủng vi khuẩn tuyển chọn 33 Hình 3.5 Khả ức chế vi khuẩn Shigella gây bệnh dịch chất kháng khuẩn thô các chủng vi khuẩn tuyển chọn Hình 3.6 Khả ức chế vi khuẩn H12 dịch chất kháng khuẩn thô các chủng vi khuẩn tuyển chọn Hình 3.7 Khả ức chế vi khuẩn BA dịch chất kháng khuẩn thô các chủng vi khuẩn tuyển chọn 34 Hình 3.8 Khả ức chế vi khuẩn NT1 dịch chất kháng khuẩn thô các chủng vi khuẩn tuyển chọn - Tất chủng vi khuẩn tuyển chọn có khả sinh chất kháng khuẩn Trong chủng DC3; N2; N3 cho hoạt tính mạnh mẽ với tất chủng vi khuẩn kiểm nghiệm - Đối với chủng vi khuẩn gây bệnh đƣờng ruột E.coli: tất chủng vi khuẩn cho hoạt tính kháng tốt Có thể chủng vi khuẩn sinh chất kháng lại ecoli nhƣ cociln Có thể lợi dụng đặc điểm để sản xuất probiotic kháng E.coli - Đối với chủng gây bệnh Samonella: tất chủng vi khuẩn chọn lọc cho kết kháng tốt Lợi dụng đặc điểm để ức chế vi khuẩn gây bệnh thƣơng hàn tốt - Đối với chủng gây bệnh Shigella: chủng M3; DC3; N2; N3 cho hoạt tính kháng khuẩn tốt Chủng M1 C2 cho hoạt tính kháng yếu - Đối với chủng Bacillus: vi khuẩn Gram dƣơng nên hoạt tính kháng lại chủng tốt Ccá chủng DC3; N2; N3 cho hoạt tính kháng mạnh mẽ so với chủng M1; M3 C2 - Các chủng vi khuẩn DC3; N2; N3 thu đƣợc phân lập vi khuẩn từ nƣớc dƣa chua nem chua có khả sinh chất kháng khuẩn tốt Các chủng M1; M3; C2 thu đƣợc phân lập từ măng chua cà muối chua cho hoạt tính yếu 35 3.7 Kết thử hoạt tính enzyme ngoại bào Sau ni lỏng nhân sinh khối chủng vi khuẩn 24 giờ, thu dịch lỏng ly tâm loại xác vi sinh vật Thu nhận enzym thơ thử số hoạt tính enzyme ngoài, kết thu đƣợc đƣợc đánh giá theo bảng 3.7 Bảng 3.7: Hoạt tính enzyme ngoại bào STT Kí hiệu vi khuẩn Hoạt tính enzyme (D-d; mm) Amylase Cellulase Protease M1 14b 28aa 11bc M3 13bc 29aa 12bc C2 11bc 29aa 14b DC3 20a 27aa 21a N2 18b 25aa 18a N3 19ab 24a 19ab Trong đó: a: khả phân giải mạnh; b: khả năngphân giải rung bình ; c: khả phân giải (d=7mm) Hoạt tính phân giải tinh bột thể dựa bắt màu với Lugol Lugol có khả bắt màu với tinh bột tạo màu xanh đen Khi tinh bột bị thủy phân thành chất có trọng lƣợng phân tử thấp bắt màu khơng cịn Vùng suốt nên đỏ nơi enzyme tác dụng phân hủy chất Hoạt tính phân giải Cellulose thể dựa bắt màu Congo đỏ với CMC, thuốc thử Congo đỏ có khả bắt màu với liên kết hydrogen Polysacarit, CMC bị phân hủy thành chất có trọng lƣợng phân tử thấp bắt màu khơng cịn Vùng suốt nên đỏ nơi enzyme tác dụng phân hủy chất Hoạt tính phân giải protein thể dựa bắt màu với Coomassie brilliant Blue R – 250 Coomassie brilliant Blue R – 250 có khả bắt màu với protein màu xanh Khi protein bị thủy phân thành chất có trọng lƣợng phân 36 tử thấp bắt màu khơng cịn Vùng suốt nên đỏ nơi enzyme tác dụng phân hủy chất M1 M3 N2 DC3 C2 N3 ĐC Hình 3.9 Hoạt tính phân giải Tinh bột chủng vi khuẩn tuyển chọn Hình 3.10 Hoạt tính phân giải Cellulose chủng vi khuẩn tuyển chọn M1 C2 M3 DC3 N2 ĐC N3 Hình 3.11 Hoạt tính phân giải Protease chủng vi khuẩn tuyển chọn 37 - Tất chủng vi khuẩn thể khả sinh số enzyme ngoại bào Ba chủng vi khuẩn DC3; N2; N3 thể hoạt tính enzyme tốt ổn định với loại chất -Hoạt tính cellulose chủng tốt Các chủng M1; M3; C2 cho hoạt tính phân giải cellulose cao Cho thấy khả sinh enzyme celllulase tốt Ba chủng vi khuẩn cịn lại cho họat tính tốt Lợi dụng đặc tính phân giải cellulose để sản xuất probiotic bổ sung vào thức ăn cho động, phân vi sinh,… - Hoạt tính amylase protease chủng DC3; N2; N3 thể tốt Các chủng lại thể hoạt tính trung bình cho thấy khả sinh enzyme amylase enzyme protease Vi sinh vật chuyển hoá tinh bột vi sinh vật phân giải tinh bột có vai trị quan trọng việc tạo nguồn thức ăn cacbon cho vi sinh vật khác Ngồi cịn đƣợc sử dụng để sản xuất amylaza cần công nghiệp sản xuất rƣợu, bia, cồn, đƣờng,… Lợi dụng vi sinh vật có khả chuyển hoá protease để sản xuất chế phẩm vi sinh vật bổ sung đƣờng ruột chế phẩm xử lí nƣớc thải rác thải giết mổ,…  Chọn lựa chủng vi khuẩn DC3; N2; N3 cho thí nghiệm 3.8 Kết thử hoạt tính kháng kháng sinh Sau chọn lọc chủng vi khuẩn có khả sinh chất kháng khuẩn mạnh khả sinh tổng hợp số enzyme ngoại bào tốt, tiến hành nghiên cứu đặc tính kháng kháng sinh chủng vi khuẩn Kết nghiên cứu đƣợc thể bảng 3.8; bảng 3.9; bảng 3.10 Bảng 3.8: Hoạt tính kháng kháng sinh Tetracylin Hoạt tính kháng lại Tetracylin Kí hiệu STT vi khuẩn 10mg/l 20mg/l 30mg/l 40mg/l 50mg/l N2 + + + + + N3 + + + + + DC3 + + + + + (Ghi chú: + : kháng tốt; - : Khơng kháng được) 38 Bảng 3.9: Hoạt tính kháng kháng sinh Streptomycin Hoạt tính kháng lại Streptomycin Kí hiệu vi STT khuẩn 10mg/l 20mg/l 30mg/l 40mg/l 50mg/l N2 + + + + + N3 + + + + + DC3 + + + + + (Ghi chú: + : kháng tốt; - : Không kháng được) Bảng 3.10: Hoạt tính kháng kháng sinh Gentamycin Kí hiệu STT Hoạt tính kháng lại Gentamycin vi khuẩn 10mg/l 20mg/l 30mg/l 40mg/l 50mg/l N2 + + + _ _ N3 + + + _ _ DC3 + + _ _ _ (Ghi chú: + : kháng tốt; - : Khơng kháng được) Hình 3.12 Hoạt tính kháng kháng sinh nồng độ 10mg/l chủng vi khuẩn tuyển chọn 39 Hình 3.13 Hoạt tính kháng kháng sinh nồng độ 50mg/l chủng vi khuẩn tuyển chọn - Với loại kháng sinh trên, chủng vi khuẩn : DC3; N2; N3 thể hoạt tính kháng kháng sinh tốt với loại kháng sinh : Tetracylin Streptomycin Cho hoạt tính kháng kháng sinh kháng sinh Gentamycin Ở nồng độ 30mg/l ba chủng vi khuẩn đƣợc hoạt tính kháng kháng sinh Nhờ đặc tính mà bổ sung vi khuẩn có ích thực phẩm để giảm lƣợng sử dụng kháng sinh, đồng thời giảm tình trạng vi khuẩn kháng lại kháng sinh Khi tiến triển dòng kháng kháng sinh tiếp tục, sử dụng probiotics để thay cho kháng sinh trở nên phổ biến hơn, hai lĩnh vực ngƣời vật nuôi Sử dụng probiotic đƣợc xác định áp dụng dòng vi khuẩn sống có lợi để đạt đƣợc kết tốt ngăn ngừa tình trạng bị bệnh hay cải thiện sức khỏe chung vật chủ Nền tảng tính hiệu dựa vào cộng sinh mơi trƣờng sinh thái vi khuẩn đƣợc củng cố để kháng lại xâm nhập hay tăng mức mầm bệnh, dẫn đến bị bệnh vật chủ Giới hạn sử dụng kháng sinh thay sử dụng probiotic giúp giảm tỷ lệ tiến triển dòng vi khuẩn kháng kháng sinh tình trạng sử dụng kháng sinh tràn lan khơng đƣợc kiểm sốt 40 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận Sau thời gian thực đề tài, kết thu đƣợc nhƣ sau: Đã phân lập đƣợc 10 chủng vi khuẩn Lactic từ mẫu thực phẩm lên men khu vực Xuân Mai – Hà Nội.Chọn lọc chủng vi khuẩn : M1; M3; C2; DC3; N2; N3 có khả sinh axit mạnh cho thử nghiệm sau (chịu pH thấp; chịu nhiệt; kháng khuẩn, hoạt tính enzyme; khả kháng kháng sinh) Thử nghiệm khả chịu nhiệt ph thấp cho thấy chủng vi khuẩn có khả chịu nhiệt (30-45oC) pH (2-5) tốt Đã kiểm tra khả kháng khuẩn (vi khuẩn kiểm định: B subtilis; Ecoli, Salmonella, Shigella) cho thấy chủng vi khuẩn: DC3; N2; N3 cho hoạt tính tốt tƣơng đối ổn định (đƣờng kính kháng khuẩn >20mm) Sau kiểm tra khả sinh số enzyme ngoại bào cho thấy chủng vi khuẩn: DC3; N2; N3 cho hoạt tính tốt ổn định (>20mm).Kết thử nghiệm khả kháng kháng sinh với loại kháng sinh Streptomycin, Gentamycin Tetracyclin cho thấy: chủng vi khuẩn tuyển chọn có kả kháng kháng lại Streptomycin Tetracyclin Riêng với Gentamycin chủng không cho kết kháng lại nồng độ 40 mg/l Kiến nghị Do thời gian ngắn nên chƣa thể hoàn thành thí nghiệm để xác định đặc tính sinh hóa khác chủng đãt tuyển chọn Cần có nghiên cứu thêm để kiểm tra hoạt tính khác chủng vi khuẩn Lactic phân lập đƣợc Nghiên cứu sâu đặc điểm sinh lí - sinh hóa chủng khuẩn Tiến hành định danh chủng vi khuẩn Nghiên cứu điều kiện nuôi cấy (PH, nhiệt độ, dinh dƣỡng, thời gian, ) để tạo môi trƣờng tối ƣu cho chủng vi khuẩn sinh trƣởng tốt cho hoạt tính mạnh Nghiên cứu thêm đặc tính probiotic ( khả chịu muối mật; khả bám dính bề mặt;…) để tuyển chọn chủng vi khuẩn tốt phục vụ sản xuất probiotic 41 TÀI LIỆU THAM KHẢO 1) Nguyễn Lân Dũng, Phạm Thị Trân Châu, Nguyễn Thanh Hiền, Lê Đình Lƣơng, Đồn Xn Mƣợu, Phạm Văn Ty (1978), Một số phương pháp nghiên cứu vi sinh vật học tập Nxb KH&KT, Hà Nội 2) Tại chí khoa học: “Phân lập tuyển chọn dịng vi khuẩn Lactic có khả kháng khuẩn từ dưa lê non (Cucumis melo L.) muối chua”, Huỳnh Ngọc Tâm, Trần Thanh Trú, Nguyễn Văn Mƣời Hà Thanh Tồn, Khoa Nơng nghiệp Sinh học Ứng dụng, Trƣờng Đai học Cần Thơ 3) Khóa luận tốt nghiệp, Nghiên cứu phân lập vi khuẩn lactic sinh enzyme ngoại bào từ sản phẩm lên men truyền thống Hà Nội, Nguyễn Huyễn Trang (2011), Trƣờng Đại Học Lâm Nghiệp Việt Nam 4) Phan Thị Khánh Hoa, Nguyễn Việt Cƣờng, Lê Thanh Bình (2001), “Ảnh hưởng số nguồn khoáng nitơ lên sinh trưởng sinh tổng hợp Nisin Lactococcus lactis subsp lactis”Tạp chí Khoa học Công nghệ, 39(5), 37-43 5) Luận văn tiến sĩ: “Phân lập, tuyển chọn đánh giá đặc tính probiotic số chủng vi sinh vật hữu ích để sản xuất chế phẩm probiotic dùng chăn nuôi” Trần Quốc Việt, Bùi Thị Thu Huyền, Dƣơng Văn Hợp Vũ Thành Lâm, Viện Vi sinh vật Công nghệ sinh học - Đại học Quốc gia - Hà Nội 6) Khóa luận tốt nghiệp: “ Tổng quan Probiotic”, Cao Thị Kim Yến, Đại học Kỹ thuật Công nghệ TP.HCM, 2010 7) Đề tài:“Khảo sát khả chịu đựng acid, muối mật kháng sinh số vi sinh vật nguyên liệu sản xuất probiotic dùng đường uống”, Nguyễn Vũ Tƣờng Vy, Nguyễn Văn Thanh, Trần Thu Hoa, Bộ môn Vi sinh Ký sinh – Khoa Dƣợc, ĐH Y Dƣợc TP.HCM 8) Lƣơng Đức Phẩm (2005), Vi sinh vật học an toàn vệ sinh thực phẩm, Nxb Nông nghiệp 9) Lƣơng Đức Phẩm (2009), Công nghệ sinh học bảo quản chế biến thực phẩm, Nxb KH&KT,Hà Nội 10) Phƣơng pháp phân tích số tiêu vi sinh vật cảu thực phẩm 11) Phạm Thị Ngọc Lan Lê Thanh Bình, (2003) “Đặc điểm phân loại chủng Lactobacillus probiotic CH123 CH 126 phân lập từ đường ruột gà” Tuyển tập báo cáo Hội nghị Công nghệ Sinh học Toàn quốc năm 2003 tr.101-105 Tài liệu tiếng anh 12) Fuller R, (1989) Probiotics in man and animals J Appl Bacteriol 66: p 365-378 13) FAO/WHO, (2001) “Health and Nutritional Properties of Probiotics in Food Including Powder Milk with Live Lactic Acid Bacteria” Report of a Joint FAO/WHO Expert Consultation on Evaluation of Health and Nutritional Properties of Probiotics in Food Including Powder Milk with Live Lactic Acid Bacteria Argentina October.2001 14) Holt, J.G (Ed) (2000): Bergeys manual of systemic bacteriology Williams and Wilkins Baltimore, 2000 Kozaki M, Uchi mura.T and Okada.S, (1992) “Erperimental Manual for Lactic Acid Bacteria”.Tokyo, Japan Asakurasyoten Lane,D.J (1991) 16S/23SrRNA sequencing In Nucleic acid techniques in bacterial systematics Ed: Stackebrandt, E I Goodfellow, M p.115-147 15) Parker, R.B, (1974) “Applications of lactobacillus feeding in swine and other livestock” Amer Feed Manufacturers Assoc Nutr Council, November p 38 Pereira, D I., and G R Gibson, (2002) Effects of consumption of probiotics and prebiotics on serum lipid levels in humans Crit Rev Biochem Mol Biol 37: p.259 - 281 16) Saito, H; Miura, K (1963) “Preparation of transforrming deoxyribonucleic acid by phenol treatment” Biochim Biophys Acta 1963; 72: p.612-629 17) Sanders, M.E, and Klaenhammers.T.R, (2001).“The scientific basis of Lactobacillus acidophilus NCFM functionality as a probiotic” J Dairy Sci 84 p.319-321 18) Siuta Cruce and Goulet J, (2001) “Improving probiotic survival rates” Food Technol., 55, p.36 - 42 19) Therner, W; Chem.Z (1894) xviii, 1845 Timmerman H.M, C.J.M Koning L Mulder F.M Romboutsd and A.C Beynen, (2004).”Monostrain, multistrain and multispecies probiotics -A comparison of functionality and efficacy” International Journal of Food Microbiology 96 p.219-233