Nghiên cứu phân lập và nuôi cấy hệ sợi nấm đông trùng hạ thảo kí sinh trên cơ thể bọ xít thu thập từ rừng tự nhiên

TRƢỜNG ĐẠI HỌC LÂM NGHIỆP VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC LÂM NGHIỆP - KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP NGHIÊN CỨU PHÂN LẬP VÀ NUÔI CẤY HỆ SỢI NẤM ĐÔNG TRÙNG HẠ THẢO KÝ SINH TRÊN CƠ THỂ BỌ XÍT THU THẬP TỪ TỰ NHIÊN NGÀNH : CÔNG NGHỆ SINH HỌC MÃ SỐ : 7420201 Giáo viên hướng dẫn : PGS.TS Bùi Văn Thắng : ThS Nguyễn Thị Minh Hằng Sinh viên thực : Vũ Thành Trung Mã sinh viên : 1453070116 Lớp : 59B - CNSH Khóa học : 2014 - 2018 Hà Nội, 2018 LỜI CẢM ƠN Để hồn thành khóa luận, đƣợc đồng ý nhà trƣờng, Viện Công nghệ sinh học Lâm nghiệp, thực khóa luận tốt nghiệp với đề tài: “ Nghiên cứu phân lập nuôi cấy hệ sợi nấm Đông trùng hạ thảo ký sinh thể Bọ xít thu thập từ tự nhiên” Trong q trình học tập nghiên cứu trƣờng Đại học Lâm nghiệp ngồi nỗ lực thân tơi nhận đƣợc quan tâm, giúp đỡ nhiều cá nhân tập thể Nhân dịp hồn thành xong khóa luận tốt nghiệp, xin chân thành cảm ơn Ban giám hiệu nhà trƣờng, Ban lãnh đạo thầy cô Viện Công nghệ sinh học Lâm nghiệp cho phép tạo điều kiện thuận lợi để đƣợc học tập nghiên cứu Viện Công nghệ sinh học Lâm nghiệp Tơi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS Bùi Văn Thắng ThS Nguyễn Thị Minh Hằng tận tình giúp đỡ hƣớng dẫn tơi suốt q trình học tập, nghiên cứu hồn thiện khóa luận tốt nghiệp Mặc dù tơi có cố gắng nỗ lực nhiều xong kiến thức hạn chế, thời gian thực đề tài ngắn nên chuyên đề nghiên cứu khơng tránh khỏi sai sót mong nhận đƣợc đóng góp q báu thầy để chun đề đƣợc hồn thiện Tơi xin chân thành cảm ơn! Sinh viên thực Vũ Thành Trung MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN MỤC LỤC DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT DANH MỤC HÌNH ĐẶT VẤN ĐỀ CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN VỀ VẤN ĐỀ CẦN NGHIÊN CỨU 1.1 Tổng quan nấm Đông trùng hạ thảo 1.1.1 Sự phân bố nấm Đông trùng hạ thảo 1.1.2 Sự lây nhiễm nấm Đông trùng hạ thảo Cordyceps vào thể côn trùng 1.1.3 Phân loại nấm đông trùng hạ thảo 1.1.4 Hoạt chất sinh học có loại nấm Đơng trùng hạ thảo 1.1.5 Giá trị dƣợc liệu nấm Đông trùng hạ thảo 10 1.1.6 Công dụng giá trị kinh tế nấm Đông trùng hạ thảo 16 1.2 Tình hình nghiên cứu ni trồng nấm Đông trùng hạ thảo 20 1.2.1 Trên giới 20 1.2.2 Tại Việt Nam 22 CHƢƠNG 2: ĐỐI TƢỢNG, MỤC TIÊU, NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 25 2.1 Mục tiêu nghiên cứu 25 2.2 Nội dung nghiên cứu 25 2.3 Đối tƣợng vật liệu nghiên cứu 25 2.4 Dụng cụ, hóa chất, nguyên liệu 25 2.5 Phƣơng pháp nghiên cứu 25 2.5.1 Phƣơng pháp phân lập nấm Cordyceps nutans 25 2.5.2 Phƣơng pháp khảo sát sinh trƣởng nấm Cordyceps nutans môi trƣờng lỏng( môi trƣờng dịch thể) 28 2.5.3 Khảo sát ăn lan hệ sợi nấm môi trƣờng rắn 30 2.6 Các phƣơng pháp thu thập xử lý số liệu: 31 CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 32 3.1 Đặc điểm phát triển hệ sợi chủng nấm Cordyceps nutans môi trƣờng nhân tạo sau trình phân lập 32 3.2 Đánh giá ảnh hƣởng môi trƣờng nuôi cấy tới sinh trƣởng, phát triển của sợi nấm C.nutans môi trƣờng lỏng (môi trƣờng dịch thể)38 3.3 Đánh giá ảnh hƣởng môi trƣờng nuôi cấy tới sinh trƣởng, phát triển của sợi nấm C.nutans môi trƣờng rắn 41 CHƢƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 46 Kết luận 46 Kiến nghị 46 TÀI LIỆU THAM KHẢO DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT Từ viết tắt Từ hồn chỉnh ĐTHT Đơng trùng hạ thảo CTTN Cơng thức thí nghiệm C.nutans Cordyceps nutans C.militaris Cordyceps militaris DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1 Ảnh hƣởng nhiệt độ đến ăn lan hệ sợi nấm sau thực phân lập 28 Bảng 2.2 Tên thành phần công thức môi trƣơng dịch thể nuôi cấy hệ sợi nấm 29 Bảng 2.3 Công thức nghiên cứu ảnh hƣởng môi trƣờng đến phát triển hệ sợi môi trƣờng lỏng 29 Bảng 2.4 Các công thức môi trƣờng rắn để nuôi cấy nấm 30 Bảng 2.5 Kết qủa theo dõi ăn lan hệ sợi nấm môi trƣờng rắn 31 Bảng 3.1 Sự phát triển hệ sợi chủng nấm C.nutans số môi trƣờng nhân giống 33 Bảng 3.2 Đƣờng kính hệ sợi nấm ăn lan qua cơng thức 35 Bảng 3.3 Biểu đồ đƣờng kính ăn lan hệ sợi nấm sau phân lập theo công thức 35 Bảng 3.4 Kết xác định sinh trƣởng phát triển nấm C.nutans môi trƣờng lỏng (môi trƣờng dịch thể) 39 Bảng 3.5 Thời gian ăn lan kín hộp, tỉ lệ hộp ăn lan kín đƣợc điểm hệ sợi mơi trƣờng nuôi rắn 42 DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 Cordyceps nutans đƣợc ngồi tìm thấy ngồi tự nhiên Đà Lạt Lâm Đồng Hình 1.2 Đơng trùng hạ thảo ngồi tự nhiên Hình 1.3 Hai giống nấm Đơng trùng hạ thảo: Đơng trùng hạ thảo ( hình A) O.sinensis (hình B) Hình 1.4 Các sản phẩm bào chế từ Đông trùng hạ thảo 19 Hình 3.1 Cordyceps nutans 32 Hình 3.2 Phân lập từ thể bọ xít (bên trái) Phân lập từ thể nấm (bên phải) 32 Hình 3.3 Biểu đồ đƣờng kính ăn lan hệ sợi nấm sau phân lập theo công thức 35 Hình 3.4 Hệ sợi nấm ăn lan bắt đầu chuyển màu nâu tím màu xám tím mơi trƣờng PGA 28oC 36 Hình 3.5 Hệ sợi nấm ăn lan bắt đầu chuyển màu vàng môi trƣờng PGA 28oC 36 Hình 3.6 Hệ sợi nấm ăn lan chuyển sang màu nâu tím màu xám tím mơi trƣờng TH 28oC 36 Hình 3.7 Hệ sợi nấm ăn lan chuyển sang màu vàng môi trƣờng TH 28oC 36 Hình 3.8 Hệ sợi nấm ăn lan chuyển từ nâu tím, sợi khí sinh có màu xám tím 36 Hình 3.9 Biểu đồ tỉ lệ phần trăm sợi nấm đƣợc nuôi cấy môi trƣờng 39 Hình 3.10 Hình ảnh sợi nấm sinh trƣởng phát triển môi trƣờng dịch thể sau 10 ngày nuôi cấy 40 Hình 3.11 Biểu đồ tỉ lên ăn lan kín loại cơng thức mơi trƣờng 43 Hình 3.12 Sợi nấm ăn lan môi trƣờng 43 ĐẶT VẤN ĐỀ Đông trùng Hạ thảo tên gọi dạng cộng sinh loài nấm túi thuộc chi Cordyceps với ấu trùng (sâu non) lồi trùng thuộc chi Hepialus Nấm Đơng trùng tự nhiên chủ yếu tìm thấy vào mùa hè vùng núi cao 4.000m cao nguyên Thanh Tạng (Thanh Hải - Tây Tạng) Tứ Xuyên (Trung Quốc) Cùng với phát triển Y học nói chung Y học cổ truyền nói riêng xu hƣớng quay sản phẩm thuốc có nguồn gốc từ tự nhiên, vừa mang lại hiệu cao, vừa tác dụng phụ Vì vậy, nấm dƣợc liệu ngày đƣợc nhiều ngƣời dân tin dùng nhƣ loại thảo dƣợc vừa có tác dụng chữa trị bệnh mà gây hại đến sức khỏe ngƣời sử dụng Trong nấm Đơng trùng hạ thảo đƣợc xem nguồn dƣợc liệu quý Theo tài liệu ghi chép đông dƣợc cổ, Đông trùng hạ thảo vị thuốc bồi bổ q giá, có tác dụng tích cực với bệnh nhƣ rối loạn tình dục, thận hƣ, liệt dƣơng, di tinh, đau lƣng, mỏi gối, ho hen, có tác dụng tốt trẻ em còi xƣơng chậm lớn Một số nghiên cứu đại gần nấm Đơng trùng hạ thảo có tác dụng làm tăng cƣờng công tuyến thƣợng thận, cải thiện đƣợc chức thận, nâng cao lực miễn dịch, kháng khuẩn, kháng virus, chống ung thƣ chất phóng xạ [10,11] Hiện nay, tự nhiên nấm Đơng trùng bị khai thác kiệt quệ, trữ lƣợng không đủ đáp ứng nhu cầu ngƣời sử dụng Vì có nhiều nƣớc tiến hành nghiên cứu để tìm kỹ thuật ni trồng lồi nấm cách hiệu Ví dụ, Cơng ty Aloha Medicinals Mỹ, nuôi trồng thành công Đông trùng Hạ thảo nhân tạo mơi trƣờng hồn tồn tự nhiên (với điều kiện nhiệt độ lƣợng oxy thấp) Công ty Biofact life (Malaysia) kết hợp công nghệ tiên tiến Nhật nƣớc khác nuôi cấy thành công nấm Cordyceps môi trƣờng nhân tạo để tạo hai hoạt chất Cordycepin Adenosine đƣợc tạo từ hệ sợi nấm Các nƣớc nhƣ Trung Quốc, Hàn Quốc, Mỹ, Nhật Bản, … sản xuất đƣợc nấm Đông trùng quy mô công nghiệp từ năm 1995 Năm 2009, Viện Khoa Học Lâm Nghiệp Việt Nam trƣờng Đại học Lâm Nghiệp tiến hành điều tra thu mẫu nấm ĐTHT (Cordyceps nutans) khu bảo tồn Tây Yên Tử - Sơn Động - Bắc Giang Tác giả Phạm Quang Thu thông báo phát đƣợc lồi nấm Đơng trùng hạ thảo đƣợc giám định loài Cordyceps nutans Đây loài nấm đƣợc mơ tả ghi nhận có phân bố Việt Nam Xuất phát từ nhu cầu sử dụng sản phẩm, nâng cao chất lƣợng sản phẩm, tìm cơng thức ni cấy nhân tạo nhân giống cho lồi Đơng trùng hạ thảo Cordyceps nutans, tiến hành thực đề tài : “Nghiên cứu phân lập nuôi cấy hệ sợi nấm Đông trùng hạ thảo ký sinh thể Bọ xít thu thập từ tự nhiên” , nhằm xây dựng đƣợc kỹ thuật phân lập nuôi trồng giá thể nhân tạo phù hợp với điều kiện nuôi cấy Việt Nam CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN VỀ VẤN ĐỀ CẦN NGHIÊN CỨU 1.1 Tổng quan nấm Đông trùng hạ thảo Nấm Đông trùng hạ thảo tên chung nhóm lồi nấm ký sinh sâu non sâu trƣởng thành số loại côn trùng Nấm đƣợc đặt tên Đông trùng hạ thảo dựa vào trình phát sinh, phát triển vòng đời chúng Sâu non, nhộng, sâu trƣởng thành số lồi trùng nằm dƣới đất mặt đất bị nấm ký sinh Các loài nấm sử dụng chất hữu thể côn trùng làm thức ăn, làm cho côn trùng bị chết Mùa đông, nhiệt độ ẩm độ khơng khí thấp, nấm ký sinh dạng hệ sợi Đến mùa hè, nhiệt độ ẩm độ không khí cao, nấm chuyển sang giai đoạn sinh sản hữu tính, hình thành thể Nhƣ vậy, mùa đơng nấm ký sinh sâu, tồn giai đoạn hệ sợi, mùa hạ mọc thành nấm nên có tên Đông trùng hạ thảo Theo tài liệu tham khảo hệ thống phân loại Gi-Ho Sung et al (2007), việc phân loại lồi nấm Đơng trùng hạ thảo Nấm Cordyceps nutans thuộc:  Giới (King dom): Fungi  Ngành phụ (Division) : Ascomycota  Lớp (Class): Sordariomycetes  Họ (Family): Cordycipitaceae  Chi (Genus): Cordyceps Loài Cordyceps nutans: Nấm mọc phần đầu ngực phần cuối bụng bọ xít nhƣng chủ yếu phần đầu ngực Nấm cịn non hình thn nhọn hình lƣỡi liềm, già chia làm phần rõ rệt: phần cuống nấm có màu nâu đen phần đầu nấm hình chùy có màu đỏ da cam đặc trƣng Số lƣợng nấm ký chủ từ 1-5 nấm, nấm trƣởng thành thu đƣợc có chiều dài từ -180 mm, chiều ngang phần thân nấm 2-2,5mm Phần đầu nấm hay gọi quan sinh sản nấm chiếm từ 1/6 đến 1/4 chiều dài nấm, chiều ngang từ 2,5 – mm Bảng 3.2 Đƣờng kính hệ sợi nấm ăn lan qua cơng thức Đƣờng kính ăn lan hệ sợi nấm (cm) Môi Nhiệt trƣờng độ (oC) PL1 PGA PL2 CTTN Sau Sau Sau 10 Sau 15 ngày ngày 22 0,0 ± 0,0 0,2 ± 0,0 0,5 ± 0,1 0,7 ± 0,1 PGA 25 0,3 ± 0,1 1,2 ± 0,1 1,9 ± 0,1 3,3 ± 0,2 PL3 PGA 28 0,9 ± 0,1 2,3 ± 0,1 3,9 ± 0,2 4,8 ± 0,3 PL4 TH 22 0,0 ± 0,0 0,4 ± 0,0 0,7 ± 0,1 1,0 ± 0,1 PL5 TH 25 0,4 ± 0,0 1,5 ± 0,1 2,2 ± 0,1 3,9 ± 0,2 PL6 TH 28 1,2 ± 0,2 2,7 ± 0,2 4,5 ± 0,3 5,2 ± 0,3 5.2 4.8 4.5 3.9 3.9 3.3 2.7 2.3 2.2 1.9 1.2 0.7 0.5 0.2 1.5 0.9 0.7 0.4 0.3 1.2 0.4 0 PL1 PL2 Sau ngày PL3 PL4 Sau ngày Sau 10 ngày PL5 PL6 Sau 15 ngày Hình 3.3 Biểu đồ đƣờng kính ăn lan hệ sợi nấm sau phân lập theo công thức Từ bảng 3.1 bảng 3.2 cho ta thấy nuôi cấy hệ sợi nấm môi trƣờng dinh dƣỡng nhiệt độ khác sinh trƣởng phát triển hệ sợi nấm khác rõ ràng Sự khác thể rõ tiêu nhƣ thời gian để nấm ăn lan môi trƣờng dinh dƣỡng, đặc diểm hệ sợi nấm mọc môi trƣờng dinh dƣỡng qua khoảng thời gian xác định Hệ sợi nấm lúc đầu có màu trắng, sau chuyển dần sang màu nâu tím màu xám tím Sợi khí sinh có màu xám tím, hệ sợi chất có màu vàng 35 Hình 3.4 Hệ sợi nấm ăn lan bắt đầu Hình 3.5 Hệ sợi nấm ăn lan bắt đầu chuyển màu nâu tím màu xám tím chuyển màu vàng môi trƣờng PGA môi trƣờng PGA 28oC 28oC Hình 3.6 Hệ sợi nấm ăn lan chuyển Hình 3.7 Hệ sợi nấm ăn lan chuyển sang màu nâu tím màu xám tím sang màu vàng môi trƣờng TH o môi trƣờng TH 28 C 28oC Hình 3.8 Hệ sợi nấm ăn lan chuyển từ nâu tím, sợi khí sinh có màu xám tím 36  Xét mơi trƣờng phân lâp: Nấm môi trƣờng phát triển tốt (đặc biệt nhiệt độ 28oC) nhƣng có khác biệt thời gian ăn lan nhƣ hình thái hệ sợi môi trƣờng Trên môi trƣờng PGA: thời gian hệ sợi ăn lan kín bề mặt mơi trƣờng chậm (thời gian để nấm ăn kín 10 ngày) cịn mơi trƣờng TH thời gian ăn lan kín ngày Khi điều kiện nhiệt độ sợi nấm mơi trƣờng TH có đƣờng kính lớn hệ sợi nấm môi trƣờng PGA Ở môi trƣờng TH: Thời gian hệ sợi ăn lan kín bề mặt mơi trƣờng ngắn (7 ngày hệ sợi ăn lan kín nhiệt độ 28oC) Sau phát triển kín bề mặt mội trƣờng, sau khoảng 10 ngày hệ sợi có xu hƣớng tổng hợp hoạt chất sinh học khiến cho màu hệ sợi thay đổi từ trắng sang màu nâu tím, sau đến ngày thứ 15 hệ sợi lại bắt đầu chuyển sợi, sợi nấm bắt đầu già thối hóa Yếu tố dẫn đến khác biệt hệ sợi nấm mơi trƣờng thành phần dinh dƣỡng Ở mơi trƣờng PGA, dinh dƣỡng nên hệ sợi chậm phát triển, nhiên mặt lợi hệ sợi nấm phát triển chậm khoảng thời gian nuôi cấy phát triển đến cực đại khơng bị thối hố Do đó, ta sử dụng môi trƣờng PGA để nuôi cấy hệ sợi nấm phục vụ cho mục đích giữ giống Ở mơi trƣờng TH, thành phần chứa nhiều dinh dƣỡng (pepton, cao nấm men) nên hệ sợi phát triển nhanh (chỉ ngày hệ sợi ăn kín bề mặt mơi trƣờng) nhƣng có nhƣợc điểm hệ sợi nấm nhanh chóng chuyển sang giai đoạn tổng hợp hoạt chất bắt đầu ngả sang màu vàng (hệ sợi sinh tổng hợp hoạt chất sinh học, màu sắc chuyển từ trắng sang nâu tím chuyển sang màu vàng già đi) Do đó, sử dụng môi trƣờng tổng hợp để nuôi cấy hệ sợi nấm phục vụ cho mục đích nhân nhanh giống để cung cấp giống phục vụ sản xuất  Xét theo nhiệt độ để hệ sợi nấm ăn lan: 37 Ở nhiệt độ 28oC hệ sợi nấm ăn lan tốt nhất, sợi nấm ăn lan nhanh nhanh già Ở nhiệt độ 22oC hệ sợi nấm ăn lan chậm nhất, giai đoạn ngày sau phân lập sợi nấm cịn chƣa ăn lan đƣợc Yếu tố nhiệt độ có ảnh hƣởng tới q trình ăn lan hệ sợi nấm, sợi nấm ăn lan nhiệt độ cao Cịn với nhiệt độ 28oC phù hợp với thân nhiệt bên bọ xít, nên nuôi trồng điều kiện nhiệt độ đƣờng kính ăn lan sợi nấm cao nhất, sau ngày nấm phân lập ăn lan kín bề mặt đĩa thạch, nhiệt độ phù hợp làm cho hệ sợi nấm ăn lan nhanh nấm nhanh chóng chuyển từ trắng sang màu nâu tím, từ màu nâu tím, sợi khí sinh có màu xám tím, sau chuyển thành vàng, hệ sợi tổng hợp chất sinh học lấy hết dinh dƣỡng môi trƣờng dẫn đến hệ sợi nhanh già điều kiện Ở nhiệt độ 25oC mức nhiệt độ trung bình nên phát triển hệ sợi nấm trung bình Nhiệt độ 22oC nhiệt độ đủ lạnh để kìm hãm phát triển, ăn lan hệ sợi nấm đông trùng bên đĩa thạch, nên phát triển hệ sợi nấm ngắn, sợi nấm ngày đầu không quan sát đƣợc phát triển hệ sợi nấm, ngày sau thấy đƣợc phát triển chậm chạp hệ sợi nấm dù môi trƣờng Việc phát triển chậm tốt cho việc bảo quản giữ giống nấm giống nấm đƣợc thời gian dài để cung cấp giống phục vụ cho công tác sản xuất giống nấm 3.2 Đánh giá ảnh hƣởng củ môi trƣờng nuôi cấy tới sinh trƣởng, phát triển của sợi nấm C.nutans môi trƣờng lỏng (môi trƣờng dịch thể) Để xác định khả phát triển hệ sợi nấm C.nutans môi trƣờng lỏng, tiến hành nghiên cứu công thức môi trƣờng dinh dƣỡng khác nhau, nuôi cấy điều kiện (điều kiện nhiệt độ 28oC điều 38 kiện bên tốt cho sinh trƣởng hệ sợi nấm, ni lắc 150 vịng/ phút Theo dõi thời gian hệ sợi phát triển kín mơi trƣờng bình nồng độ sợi nấm bình Kết đƣợc thể bảng 3.4 Bảng 3.4 Kết xác định sinh trƣởng phát triển nấm C.nutans môi trƣờng lỏng (môi trƣờng dịch thể) STT Công Mật độ hệ Mật độ hệ Mật độ hệ sợi sợi sợi Thời gi n hệ môi trƣờng môi trƣờng môi trƣờng thức ngày thứ ngày thứ ngày thứ (%) (%) (%) sợi ăn kín (ngày) MTL1 10 30 47 15 MTL2 10 38 55 13 MTL3 17 31 20 MTL4 15 52 81 10 100% 87% 80% 60% 10% 52% 38% 30% 40% 20% 55% 47% 31% 17% 10% 7% 15% 0% MTL1 MTL2 MTL3 MTL4 Mật độ hệ sợi môi trường ngày thứ Mật độ hệ sợi môi trường ngày thứ Mật độ hệ sợi môi trường ngày thứ Hình 3.9 Biểu đồ tỉ lệ phần trăm sợi nấm đƣợc nuôi cấy môi trƣờng 39 MTL1 MTL2 MTL3 MTL4 Hình 3.10 Hình ảnh sợi nấm sinh trƣởng phát triển môi trƣờng dịch thể sau 10 ngày ni cấy Nhìn vào bảng 3.3 biểu đồ 3.2 ta thấy: Ở công thức môi trƣờng dinh dƣỡng dịch thể nấm sinh trƣởng đƣợc, nhiên loại mơi trƣờng có thành phần dinh dƣỡng khác nên thời gian sợi nấm sinh trƣởng trông môi trƣờng dịch thể nhanh hay chậm khác Từ kết nuôi cấy nhận thấy: tốc độ sinh trƣởng hệ sợi nấm qua công thức môi trƣờng lần lƣợt là: MTL4 > MTL2 > MTL1 > MTL3 Hệ sợi nấm sinh trƣởng phát triển nhanh MTL4 mơi trƣờng chứa nhiều dinh dƣỡng (có pepton cao nấm men) mơi trƣờng có chất già dinh dƣỡng giúp kích thích sinh trƣởng sợi nấm cách mạnh mẽ Ở MTL1 MTL2 tốc độ sinh trƣởng hệ sợi nấm gần nhƣ tƣơng đồng lƣợng dinh dƣỡng mơi trƣờng công thức gần nhƣ 40 tƣơng tự nhau, nhiên dinh dƣỡng cao nấm men giúp nấm dễ phân giải hấp thụ pepton nên tốc độ sinh trƣởng hệ sợi nấm MTL2 nhanh MTL1 Cuối MTL3, mơi trƣờng chứa dinh dƣỡng (chỉ có dịch chiết khoai tây) nên hệ sợi sinh trƣởng với tốc độ chậm khoảng thời gian nồng độ sợi nấm thấp Khi sinh khối hệ sợi kín mơi trƣờng lỏng nấm bắt đầu kết lại tạo lớp màng (hay gọi váng nấm) phía bên bề mặt mơi trƣờng, cơng thƣc MTL4 váng nấm dày có màu nâu thẫm màu đặc trƣng sợi nấm mà đến lúc trƣởng thành 3.3 Đánh giá ảnh hƣởng củ môi trƣờng nuôi cấy tới sinh trƣởng, phát triển của sợi nấm C.nutans môi trƣờng rắn Để đánh giá mức độ ảnh hƣởng chất nuôi trồng đến sinh trƣởng, phát triển C.nutans, tiến hành thí nghiệm ni cấy nấm công thức môi trƣờng khác điều kiện ni trồng chăm sóc Định kỳ kiểm ra, so sánh ăn lan hệ sợi công thức môi trƣờng khác từ cấy giống khi ăn lan kín hết bề mặt môi trƣờng Kết thu đƣợc thể bảng 3.5 41 Bảng 3.5 Thời gian ăn lan kín hộp, tỉ lệ hộp ăn lan kín đƣợc điểm hệ sợi môi trƣờng nuôi rắn Tỉ lệ Thời gian để hệ hộp hệ sợi sợi ăn lan hết ăn lan kín mơi trƣờng (%) (ngày) MTR1 54 12 MTR2 68 CTTN Đặc điểm hệ sợi môi trƣờng nuôi cấy Sợi nấm mỏng có màu trắng Sợi nấm dày có màu trắng sau chuyển sang nâu tím, sợi khí sinh có màu xám tím Sợi nấm dày có màu trắng chuyển MTR3 73 dần sang nâu tím, sợi khí sinh có màu xám tím Sợi nấm dầy bơng có màu trắng sau MTR4 80 chuyển sang màu nâu tím, sợi khí sinh có màu xám tím, sợi bắt đầu có dấu hiệu già MTR5 60 10 MTR6 61 10 MTR7 65 Sợi nấm mỏng có màu trắng chuyển chuyển dần sang nâu tím Sợi nấm mỏng có màu trắng chuyển chuyển dần sang nâu tím Sợi nấm dày có màu trắng chuyển chuyển dần sang nâu tím 42 80% 80% 73% 68% 70% 60% 60% 61% MTR5 MTR6 65% 54% 50% 40% 30% 20% 10% 0% MTR1 MTR2 MTR3 MTR4 MTR7 Hình 3.11 Biểu đồ tỉ lệ ăn lan kín loại cơng thức mơi trƣờng MTR4 MTR7 Hình 3.12 Sợi nấm ăn lan mơi trƣờng Việc nuôi cấy nấm Đông trùng hạ thảo môi trƣờng rắn đƣợc nghiên cứu nhiều năm qua Từ cuối kỷ 19, nhà khoa học công bố nghiên cứu tạo thể côn trùng sau nghiên cứu ni trồng thành công nấm hợp chất hữu quy mơ phịng thí nghiệm So với loại mơi trƣờng khác mơi trƣờng rắn đạt hiệu mặt nhƣ diện tích ni trồng nhỏ, giảm lƣợng nƣớc tiêu thụ so với nuôi cấy lỏng, đồng thời giảm chi phí xử lý nƣớc thải tiêu thụ lƣợng q trình ni nấm Ngồi mơi trƣờng rắn xốp thống khí giúp cho việc phát triển sợi nấm thể tổng hợp đƣợc nhiều hợp chất có hoạt tính sinh học 43 Để sản xuất quy mô lớn số lƣợng thể nấm ngƣời ta sử dụng môi trƣờng rắn chứa chất nhân tạo mơi trƣờng rắn chứa trùng (ví dụ, ấu trùng tằm B mori) Nhộng tằm giàu chất đạm, vitamin A, B1, B2, PP, C chất khống nhƣ canxi, phốt Trong 100g nhộng tằm có 79,7g nƣớc, 13g protid; 6,5g lipid cung cấp tới 206 calo Hàm lƣợng protein nhộng tằm cao, chiếm tới 73,5%, gồm nhiều axit amin quan trọng nhƣ leucin, isoleucin, lysin, threonin, cystein, phenylalanin, tyrosin, valin, arginin, alanin, glycin, serin… Sử dụng nhộng tằm làm nguồn chất ni trồng nấm ta chủ động nguồn cung cấp nhộng tằm loại thức ăn cho ngƣời nên không gây hại Từ bảng 3.5 cho thấy nuôi cấy nấm công thức môi trƣờng dinh dƣỡng khác sinh trƣởng phát triển hệ sợi nấm khác Sự khác thể rõ tiêu nhƣ thời gian để hệ sợi nấm mọc kín mơi trƣờng, tỉ lệ ăn lan hệ sợi hết hộp công thức Cụ thể, tốc độ ăn lan hệ sợi kín bề mặt mơi trƣờng nhanh MTR4 thứ tự là: MTR4 > MTR3 > MTR2 = MTR7 > MTR6 > MTR5 > MTR1 Nguyên nhân lƣợng dinh dƣỡng mơi trƣờng ni cấy cơng thức có khác biệt Ở công thức MTR2, MTR3, MTR4 sử dụng thêm nguồn dinh dƣỡng dịch xay nhộng tƣơi chứa hàm lƣợng dinh dƣỡng cao dễ sử dụng nên hệ sợi nấm sử dụng trực tiếp ln, dẫn đến tốc độ sinh trƣởng nhanh công thức khác, tùy vào hàm lƣợng dịch nhộng xay đƣợc bổ sung vào mà tốc độ sinh trƣởng hệ sợi khác MTR4 đƣợc bổ sung 20% dịch nhộng xay có tốc độ sinh trƣởng hệ sợi nhanh nhất, tiếp đến MTR3 với 15% dịch nhộng xay MTR2 với 10% dịch nhộng xay Sợi nấm cơng thức có độ dày thay đổi màu sác nhƣ màu sắc phát triển hệ sợi nấm môi trƣờng thạch Ở công thức MTR5, MTR6 MTR7 bổ sung bột nhộng khô, có hàm lƣợng dinh dƣỡng cao nhƣng dinh dƣỡng bột nhộng khơ khó hấp 44 thụ dịch xay nhộng tƣơi, tốc độ sinh trƣởng hệ sợi nấm có chậm hơn, MTR7 đƣợc bổ sung 5% bột nhộng khơ có tốc độ sinh trƣởng hệ sợi nhanh MTR6 với 4% bột nhộng khô, MTR5 với 3% bột nhộng khô Trên mơi trƣờng hệ sợi nấm mỏng khơng có chuyển màu sắ sợi nấm cách rõ rệt Cuối MTR1, khơng đƣợc bổ sung thêm dinh dƣỡng mà thành phần chất bao gồm cơm gạo lức dịch khoáng nên hệ sợi sinh trƣởng phát triển chậm (mất 10 ngày để hệ sợi ăn lan kín bề mặt mơi trƣờng) Ở mơi trƣờng sợi nấm mỏng có màu trắng, khơng có chuyển đổi màu sắc sợi trình ăn lan hệ sợi nấm Ở cơng thức khác tỉ lệ nấm ăn lan tồn bình khác MTR4 > MTR3 > MTR2 > MTR7 > MTR6 > MTR5 > MTR1, tỉ lệ ăn lan hết hộp nấm môi trƣờng môi trƣờng dinh dƣỡng nên sợi nấm ăn lan khác nhau, mơi trƣờng thích hợp làm cho nấm có tỉ lệ hộp ăn lan cao so với mơi trƣờng khac, q trình cấy giống thao tác chƣa cẩn thận dẫn đến số lƣợng hộp bị nhiễm nấm bệnh Ta thấy, tốc độ ăn lan sợi nấm hộp tỉ lệ thuận với chiều tăng hàm lƣợng chất dinh dƣỡng, nhƣng dinh dƣỡng hộp nhiều làm giảm độ bám hệ sợi gạo lứt sau gạo đƣợc nấu lên, tỉ lệ 20% hợp lý để nuôi cấy hệ sợi mơi trƣờng rắn Trong cơng thức MTR4 hệ sợi ăn lan mơi trƣờng gạo có đặc điểm nhƣ hệ sợi ăn lan môi trƣờng thạch mà ăn lan kín hộp có thay đổi dần đần màu sắc từ màu trắng trở chuyển sang màu nâu tím, sợi khí sinh có màu xám tím, chuyển sang màu vàng, cơng thức hệ sợi phát triển nhanh tỉ lệ hộp ăn lan hết cao 45 CHƢƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận Qua trình thực nghiên cứu thu đƣợc kết bƣớc đầu nhƣ sau: Phân lập thành cồn giống nấm Đông trùng hạ thảo C.nutans từ thể tƣơi lấy từ tỉnh Lâm Đồng môi trƣờng thạch, với công thức môi trƣờng 20 g/l glucose; 2,5 g/l pepton; 2,5 g/l cao nấm men; 0,5 g/l MgSO4.7H2O; 0,25 g/l KH2PO4; 14 g/l agar Nhân giống thành công nấm C.nutans môi trƣờng dịch thể với công thức môi trƣờng tốt 20g/l Glucose + 5g/l pepton + 5g/l cao nấm men + khống chất Ni cấy thành cơng hệ sợi nấm C.nutans môi trƣờng rắn với công thức môi trƣờng tốt 80% Gạo lứt/hộp + 20% dịch xay nhộng tƣơi + 50 ml dịch khoáng ( dịch khoáng bao gồm thành phần: 100 ml/l nƣớc dừa + 200 g/l Khoai tây (lấy dịch chiết) + g/l vitamin B1 + 0,5 g/l MgSO4.7H2O; 0,25 g/l KH2PO4.), công thức sợi ăn sợi khỏe mọc nhanh có chuyển biến sợi ăn lan diễn Kiến nghị Từ kết đạt đƣợc q trình nghiên cứu tơi đƣa kiến nghị nhƣ sau: Do thời gian thực khóa luận, làm thực nghiệm tƣơng đối ngắn nên cơng thức thí nghiệm khơng thể lặp lại nhiều lần để có đƣợc kết tốt nhất, độ tin cậy chƣa cao, chƣa phát huy đƣợc hết ƣu điểm thí nghiệm Thời gian làm khóa luận ngắn nên chƣa thể xác định đƣợc điều kiện bên ngồi nhƣ nhiệt độ, ánh sáng, độ ẩm để kích cho nấm tạo thể, cần tiếp tục nghiên cứu yếu tố bên ảnh hƣởng đến việc thể Việc thể cần điều kiện khác hoàn toàn so với điều kiện cho ăn lan hệ sợi công thức ăn lan nhanh chƣa cho thể nấm tốt, cần có thời gian nghiên cứu để hồn thiện quy trình ni cấy lồi Cordyceps nutans 46 TÀI LIỆU THAM KHẢO  Tài liệu tiếng Việt 1) Đái Duy Ban (2009), Nghiên cứu phát lồi Đơng trùng Hạ thảo Isaria cerambycidae NSP Việt Nam xác định số hoạt chất sinh học Đông trùng Hạ thảo - Thông tin y học Bộ y tế, tháng 8/2009 2) Nguyễn Thị Minh Hằng, Bùi Văn Thắng, Trƣờng Đại học Lâm nghiệp Việt Nam, nghiên cứu nuôi trồng nấm đông trùng hạ thảo (cordycepsmilitaris) giá thể tổng hợp nhộng tằm 3) Phạm Quang Thu (2009) Điều tra phát nấm Nhộng trùng hạ thảo Cordyceps nutans pat phân b khu bảo tồn thiên nhiên Tây n Tử Sơn Động - Bắc Giang Tạp trí nơng nghiệp phát triển nông thôn số tháng 4/2009 4) Phạm Quang Thu (2009) Phát nấm Nhộng trùng hạ thảo Cordyceps gunni (Berk.)Berk vườn qu c gi T m Đảo tỉnh Vĩnh Ph c Tạp chí nơng nghiệp phát triển nông thôn số - tháng 6/2009 5) Phạm Quang Thu, Nguyễn Mạnh Hà Phát nấm Nhộng trùng hạ thảo Cordyceps militaris (L.:FR.)LINK vườn qu c gia Hồng Liên tỉnh Lào Cai Tạp chí nông nghiệp phát triển nông thôn số - tháng 9/2009 6) Phạm Thị Thuỳ (2010) Nghiên cứu phát triển nguồn nấm Be uveri Met rhizium để ứng dụng phòng trừ âu hại câ trồng, câ rừng phát nguồn nấm ord cep p làm thực phẩm chức cho người Báo cáo Hội thảo Quốc gia bệnh hại thực vật Việt Nam 24/4 – 25/4/2010 Nhà xuất Nông nghiệp Trang 224 – 231  Tài liệu nƣớc 7) Ahn YJ., Park SJ., Lee SG., Shin SC., Choi DH (2000) Cordycepin: selective growth inhibitor derived from liquid culture of Cordyceps militaris against Clostridium spp J Agric Food Chem., 48, 2744-2748 8) Li N., Song JG., Liu JY., Zhang H (1995) Compared chemical composition between Cordyceps militaris and Cordycpes sinensis Journal of Jilin Agriculture University 17, 80–83 9) Kobayashi Y The genus Cordycepsand its allies Sci Rep Tokyo Bunrika Daigaku Sect B 1941;5:53-260 10) Kobayasi Y., 1982 Keys to the taxa of the genera Cordyceps and Torrubiella Transactions of the Mycological Society of Japan 23:329–364 Herbal, New York 11) Jae-Sung K., Kumar S., Se -Eun P., Bong-Suk C.i, Seung K., Nguyen T H., Chun-Sung K., Han-Seok C., Myung-Kon K., Hong-Sung C., Yeal P., Sung-Jun K., 2006 A Fibrinolytic Enzyme from the Medicinal Mushroom Cordyceps militaris Journal of Microbiology 44(6):622-31 12) Sung J.M., Park Y.J., Han S.K., 2006 Selection of superior strains of Cordyceps militaris with enhanced fruiting body productivity Mycobiology 34: 131–137 13) Patcharaporn Wongsa , Kanoksri Tasanatai , Patricia Watts and Nigel Hywel-Jones (2005), Isolation and in vitro cultivation of the insect pathogenic fungus Cordyceps unilateralis 14) Wol-Soon J., Yoo-Jin C., Hyoun-Ji K., Jae-Yun L., Byung-Hyouk N., Jae-Dong L., Sang-Wha L., Su-Yeong S and Min-Ho J., 2010.The Antiinflammatory Effects of Water Extract from Cordyceps militaris in Murine Macrophage Mycobiology 38(1): 46-51 15) Xie C.Y., Gu Z.X., Fan G.J., 2009a Production of cordycepin and mycelia by submerged fermentation of Cordyceps militaris in mixture natural culture Applied Biochemistry and Biotechnology 158:483–492 16) Xie C.Y., Liu G.X., Gu Z.X., 2009b Effects of culture conditions on mycelium biomass and intracellular cordycepin production of Cordyceps militaris in natural medium Annua Microbiology 59:293–299 17) Xiong C.H., Xia Y.L., Zheng P., 2010 Developmental stage-specific gene expression profiling for a medicinal fungus Cordyceps militaris Mycology 1:25–66 18) Young-Joon A., Suck- Joon P., Sang-Gil L., Sang-Cheol S and DonHa C., 2000 Cordycepin: Selective Growth Inhibitor Derived from Liquid Culture of Cordyceps militaris against Clostridium spp Journal of Agricultural and Food Chemistry 48: 2744−2748 19) Yu H.M., Wang B.S., Huang S.C., 2006 Comparison of protective effects between cultured Cordyceps militaris and natural Cordyceps sinensis against oxidative damage Journal of Agriculture and Food Chemistry 54:3132–3138 20) Wang J.F., Yang C.Q., 2006 Research survey on artificial cultivation and product development of Cordyceps militaris Lishizhen Medicine And Material Medical Research 17:268–269 21) Wang GD (1995) Ecology, cultivation and application of Cordyceps and Cordyceps sinensis Scientific and Technical Documents, Beijing 22) Wang JF., Yang CQ (2006) Research survey on artificial cultivation and product development of Cordyceps militaris Lishizhen Medicine And Material Medical Research 17:268–269