Nghiên cứu nuôi trồng đtht cordyceps mililatis jq1 trên nhộng và ấu trùng tằm lá sắn attacus ricini

LỜI CÁM ƠN Em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS Bùi Văn Thắng ThS Nguyễn Thị Minh Hằng, Viện Công nghệ sinh học, Đại học Lâm nghiệp Hà Nội tận tình hƣớng dẫn giúp đỡ em suốt trình nghiên cứu để em hồn thành khóa luận Em xin chân thành cảm ơn thầy cô giáo Viện Công nghệ sinh học, Đại học Lâm nghiệp Hà Nội truyền đạt cho em kiến thức quí báu nhƣ giúp đỡ động viên em suốt thời gian học tập trƣờng Em xin chân thành cảm ơn bạn bè gia đình động viên giúp đỡ, tạo điều kiện thuận lợi suốt trình học tập, nghiên cứu để em hoàn thành nhiệm vụ học tập đƣợc giao Hà Nội ngày 15 tháng năm 2019 Sinh viên thực Trịnh Huy Minh i MỤC LỤC LỜI CÁM ƠN i MỤC LỤC ii DANH MỤC BẢNG iv DANH MỤC HÌNH v MỞ ĐẦU CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tình hình nghiên cứu nấm Đơng trùng Hạ thảo giới 1.1.1 Lược sử nghiên cứu 1.1.2 Phân loại, hình thái ĐTHT O.sinensis C.militaris 1.1.3 Vòng đời chế lây nhiễm Đông trùng hạ thảo vào thể côn trùng 1.1.4 Thành phần hóa học ứng dụng y học O.sinensis C.militaris 1.2 Tằm thầu dầu, sắn Attacus ricini 11 1.2.1 Phân loại 11 1.2.2 Chu trình sống 12 1.3 Nghiên cứu sản xuất nấm Đông trùng Hạ thảo Việt Nam 12 1.3.1 Sơ lƣợc lịch sử nghiên cứu 12 1.3.2 Công nghệ sản xuất nấm ĐTHT Việt Nam 13 1.3.3 Tình hình sản xuất nấm ĐTHT Việt Nam 13 CHƢƠNG 2: 14 MỤC TIÊU - NỘI DUNG- VẬT LIỆU – PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 14 2.1 Mục tiêu nghiên cứu 14 2.2 Nội dung, thời gian, địa điểm nghiên cứu 14 2.3.1 Đối tượng 14 2.3.2 Dụng cụ 15 2.3.3 Hóa chất nguyên liệu 15 2.3 Phƣơng pháp nghiên cứu 16 2.4.1 Quy trình ni cấy nấm ấu trùng nhộng tằm sắn 16 ii 2.4.2 Chuẩn bị môi trường nuôi cấy 17 2.4 Phƣơng pháp nghiên cứu 18 2.5.1 Phương pháp nhiễm nấm lên ấu trùng tằm 18 2.5.2 Phương pháp nhiễm nấm lên thân nhộng tằm 18 2.5.3 Các phương pháp thu thập xử lý số liệu: 19 CHƢƠNG 3: 20 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 20 3.1 Khả sinh trƣởng phát triển hệ sợi hình thành thể chủng nấm ĐTHT Cordycept militaris JQ1 ấu trùng tằm sắn 20 3.1.1 Kết nhiễm nấm cách phun trực tiếp qua da ấu trùng 20 3.1.2 Kết nhiễm nấm phun qua thức ăn sắn 21 3.1.3 Kết nhiễm nấm tiêm trực tiếp qua da ấu trùng 22 3.1.4 Kết phát triển hệ sợi nấm thể hình thức nhiễm nấm 24 3.2 Khả sinh trƣởng phát triển hệ sợi hình thành thể chủng nấm ĐTHT Cordycept militaris JQ1 nhộng tằm sắn 25 3.2.1 Kết nhiễm nấm phun trực tiếp qua da nhộng tằm 25 3.2.2 Kết nhiễm nấm tiêm qua da nhộng tằm 26 3.2.3 Kết phát triển hệ sợi nấm thể giai đoạn nhộng 27 CHƢƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 29 4.1 Kết luận 29 4.2 Kiến nghị 30 TÀI LIỆU THAM KHẢO iii DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1 Tác dụng số chất ĐTHT thể ngƣời Bảng 2.1 Công thức pha chế 1000ml môi trƣờng lỏng giống cấp II 17 Bảng 3.1 Khả nhiễm nấm ấu trùng tằm theo thể tích dịch 20 phun qua da 20 Bảng 3.2 Khả nhiễm nấm ấu trùng theo thể tích dịch phun qua thức ăn 21 Bảng 3.3 Khả nhiễm nấm ấu trùng tằm phƣơng pháp tiêm 23 Bảng 3.4 Khả nhiễm nấm ấu trùng tằm phƣơng pháp: Phun trực tiếp qua da, phun gián tiếp qua tiêm 24 Bảng 3.5 Sự phát triển hệ sợi nấm thể hình thức nhiễm nấm 24 Bảng 3.6 Khả nhộng nhiễm nấm phƣơng pháp phun trực tiếp 25 Bảng 3.7 Khả nhiễm nấm nhộng tằm phƣơng pháp tiêm 26 Bảng 3.8 Khả nhiễm nấm nhộng tằm phun qua da tiêm 27 Bảng 3.9 Sự phát triển hệ sợi nấm thể hình thức nhiễm nấm 27 iv DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 Ophiocordyceps sinensis .5 Hình 1.2 Cordyceps militaris .6 Hình 1.3 Vịng đời nấm Đông trùng hạ thảo Hình 1.4 Ảnh ấu trùng nhộng tằm sắn Attacus ricini .11 Hình 2.1 Ấu trùng (A) nhộng (B) tằm sắn 15 Hình 2.2 Quy trình tổng qt ni trồng nấm Đơng trùng hạ thảo giá thể ấu trùng nhộng tằm sắn 16 Hình Ấu trùng tằm sau phun nhiễm nấm:10 ngày (A), 35 ngày (B) 70 ngày (C) 21 Hình 3.4 Ấu trùng tằm ăn sắn nhiễm nấm (A) sau 70 ngày (B) .22 Hình 3.2 Ấu trùng tằm đƣợc tiêm sau ngày (A) 10 ngày (B) 35 ngày (C) 23 Hình 3.3 Nhộng sau phun 60 ngày 26 v MỞ ĐẦU Nấm đông trùng hạ thảo (ĐTHT) danh từ để lồi nấm có đặc điểm “sâu mùa đông” trở thành “cỏ mùa hè” đƣợc sử dụng nhƣ loại thuốc thực phẩm chức nƣớc phƣơng Đơng hoạt động sinh học dƣợc tính Trong ĐTHT, ngồi 17 amino acid, vitamin (A,B1, B12, C, E, K) nguyên tố vi lƣợng quý (Se, Fe, Zn) có nhiều chất có hoạt tính dƣợc học nhƣ: acid cordycepic, superoxide dismutase (SOD), polysaccharide, manitol, adenosin, cordycepin có loại nấm [8], [11], [12] Các hoạt chất có tác dụng tốt tới hoạt động nhiều quan nhƣ tim mạch, phổi, thận, sinh sản đặc biệt làm tăng cƣờng hoạt động hệ miễn dịch, chống lại loại bệnh nhiễm trùng phòng chống ung thƣ, HIV/ AIDS [6], [7],[10], [17] Tuy số lƣợng loài ĐTHT xác định lớn, 700 lồi, nhƣng có số có đặc tính dƣợc học cao, chúng đƣợc gọi cordyceps dƣợc phẩm Nhìn chung loại ĐTHT đƣợc sử dụng rộng rãi có giá trị y học cổ truyền châu Á O.sinensis C.militaris Mặc dù O.sinensis loại tiếng đắt tiền nhƣng đặc thù vật chủ điều kiện sống khó khăn nên tƣơng đối không dễ dàng sản xuất thể Trong đó, C.militaris lại có mặt nhiều nơi giới, sống với nhiều điều kiện mơi trƣờng nên đƣợc sản xuất quy mô công nghiệp với chất hạt gạo chƣa chuyển đổi nên thị trƣờng, ĐTHT đƣợc sản xuất chủ yếu theo phƣơng thức [8], [9],[16], Ở Việt nam, khơng có sở thuộc Nhà nƣớc quản lý (Viện Hàn lâm Khoa học Việt Nam, Đại học Thái Nguyên, Đại học Đà Lạt, Đại học Lâm nghiệp…) mà cịn có nhiều cơng ty tƣ nhân (Thiên Phúc, Khải Anh, Nguyên Long…) trang trại khắp nƣớc sản xuất quy mô lớn, nên nguồn ĐTHT phong phú thị trƣờng với nhiều loại sản phẩm tƣơi, khô, nƣớc, bột [1], [2],[5] Tuy nhiên, phƣơng pháp mà đơn vị sử dụng chủ yếu dùng môi trƣờng chất gạo chƣa chuyển đổi với nhộng tằm dâu Nhƣng tại, xu hƣớng sử dụng ĐTHT từ ấu trùng (sâu non) nhộng tằm nguyên lại đƣợc ngƣời dân ƣa chuộng [9] Do đó, hồn thiện phƣơng pháp nuôi cấy C.militaris nhộng, tằm sống cần thiết Mặt khác, Việt Nam khuyến khích ni tằm sắn để tăng thu nhập cho nơng dân, đó, nguồn ấu trùng nhộng dồi dào.Vì vậy, sử dụng ấu trùng nhộng tằm ăn sắn ký chủ nuôi ĐTHT hƣớng sản xuất cần đƣợc ý Trên sở đó, chúng tơi thực đề tài “Nghiên cứu nuôi trồng ĐTHT Cordyceps mililatis JQ1 nhộng ấu trùng tằm sắn Attacus ricini” nhằm đáp ứng yêu cầu xã hội CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tình hình nghiên cứu nấm Đông trùng Hạ thảo giới 1.1.1 Lược sử nghiên cứu ĐTHT (ĐTHT) nghĩa “sâu mùa đông” [trở thành] cỏ mùa hè đƣợc thầy lang ngƣời Tạng ghi chép lại lần kỷ XV loài nấm ký sinh thể sâu tuyết vùng núi cao 4000-5000m cao nguyên vùng Tây Tạng Tứ Xuyên (Trung Quốc) Nếu mùa đông, cặp sâu - nấm giống sâu (côn trùng) đến mùa hè chúng lại nhƣ lồi thực vật (cỏ) [9], [15] Năm 1843, Miles Berkeley Đã miêu tả khoa học lần loài nấm”rễ mọc sâu” Tây tạng đó, đặt tên Sphaeriae sinensis [8], [9], [11] Ông cho vào cuối thu, đầu đông chất da của ấu trùng (sâu non) loài bƣớm đêm tƣơng tác với bào tử nấm tạo sợi nấm, sợi nấm đâm sâu vào ấu trùng lấy chất ding dƣỡng ấu trùng để phát triển Đầu hè năm sau, nấm phát triển mạnh, gây chết sâu, sau hình thành chồi, phát triển thành thể trông nhƣ chồi chui khỏi đầu sâu, nhƣng gốc (hệ sợi) dính vào thể sâu Nhƣ vậy, vào mùa đông nấm sống thể côn trùng, vào mùa hè nấm lại phát triển ngồi thể trùng trơng nhƣ nhỏ nên đƣợc gọi Đông trùng Hạ thảo Năm 1878, Pie Andrea Sacardo xác định loài nấm thực chất ký sinh loài nấm túi thuộc chi Cordyceps với ấu trùng (sâu non) lồi trùng thuộc chi Hepialus Do ơng chuyển lồi Sphaeriae sinensis sang chi Cordyceps trở thành Cordyceps sinensis Sau này, nhà khoa học xác định đƣợc khoảng 46 loài thuộc chi Hepialus bị nấm Cordyceps ký sịnh, nhƣng chủ yếu Thitarodes baimaensis Thitarodes armoricanus [8], [9], [11] Năm 2007, phân tích phát sinh chủng loại phân tử, Cordyceps sinensis lại đƣợc chuyển sang chi Ophiocordyceps tên lại đƣợc đổi thành OphioCordyceps sinensis lúc nhà khoa học xác định đƣợc nhiều loài Cordyceps ký sinh nhiều lồi trùng thuộc nhiều chi khác tên “Đông trùng hạ thảo’ đƣợc giới khoa học thừa nhận nên từ sau lồi nấm ký sinh trùng đƣợc gọi chung nấm đông trùng hạ thảo [8], [9], [11] Năm 2005 nhà khoa học thành công ni trồng hệ sợi ĐTHT lên men chìm với nguồn dinh dƣỡng tối ƣu cho sinh trƣởng 50g/l sucrose, 10g/l pepton, 3g/l dịch chiết nấm men thu đƣợc 22g/l sinh khối hệ sợi nấm sau 40 ngày lên men chìm Năm 2008, S.M Ruhul Amin, Nadia Alam, Mousumi Tania Md.Asaduzzaman Khan trung tâm phát triển mở rộng nấm quốc gia, Savar, Dhakha, Bangladesh nghiên cứu sinh trƣởng hệ sợi nấm Cordyceps militaris nhiều môi trƣờng nuôi cấy thang nhiệt độ pH khác Với bốn loại môi trƣờng: PDA (potatoes, dextrose, agar), PDYA (potatoes, dextrose, yeast, agar), MEA (malt, extract, agar), YEA (yeast, extract, agar) để ni cấy hệ sợi nấm Cordyceps militaris thu đƣợc kết PDA môi trƣờng tốt cho sinh trƣởng hệ sợi nấm Tiếp tục nuôi cấy hệ sợi nấm môi trƣờng PDA với thang pH 4-10 nhận thấy sợi nấm phát triển tốt khoảng pH từ 8,5-9,5 Để lọc đƣợc nhiệt dộ phù hợp với sinh trƣởng hệ sợi nấm, tác giả nuôi cấy hệ sợi khoảng nhiệt độ (≤ 10oC, 15oC, 20 oC, 25 oC,30 oC 35 oC) nhận thấy hệ sợi nấm sinh trƣởng đƣợc khoảng 10-25 oC, tốt 20-25 oC, sợi nấm không sinh trƣởng 30-35 oC [9], [15],[16] Hiện nay, nhà khoa học xác định đƣợc 700 loài ĐTHT, có khoảng 300 lồi đƣợc báo cáo tạo thể thuộc chi Cordyceps [8], [9], [11] Với nhiều đặc tính dƣợc học q ĐTHT khơng y học cổ truyền Tây Tạng nƣớc Viễn Đông (Hàn Quốc, Triều Tiên, Nhật Bản) mà y học đại sử dụng nhƣ loại thuốc tăng cƣờng miễn dịch lấy lại lƣợng nhiều tác dụng khác tới nhiều hệ quan thể Tuy có nhiều lồi đƣợc xác định, nhƣng có lồi sử dụng y học đặc tính dƣợc học chúng Các loại đƣợc gọi chung Cordyceps dƣợc phẩm Nhìn chung, hai loài nấm Cordyceps đƣợc sử dụng rộng rãi y học OphioCordyceps sinensis Cordyceps militaris Mặc dù O.sinensis đƣợc phát nhƣng thể tự nhiên vùng núi cao 4000 m dãy Himalaya chƣa có quốc gia sản xuất đƣợc thể nên chúng tƣơng đối đắt tiền Ngƣợc lại, C.militaris lại có mặt nhiều nơi giới, chủng giống hoang dã kén chọn vật chủ, sinh trƣởng chậm, giới hạn tăng trƣởng thấp, kích thƣớc nhỏ nên chúng giá thành đắt đỏ Tuy nhiên, khác với O.sinensis, C.militaris đƣợc sản xuất thể quy mô công nghiệp chất bán rắn loại hạt chƣa chuyển đổi nên đáp ứng đƣợc phần yêu cầu ĐTHT xã hội [8],[9], [11],[12] 1.1.2 Phân loại, hình thái ĐTHT O.sinensis C.militaris - OphioCordyceps sinensis Giới (regnum) Fungi Phân giới (subregnum) Dikarya Ngành (phylum) Ascomycota Phân ngành (subphylum) Pezizomycotina Lớp (class) Sordariomycetes Phân lớp (subclass) Hypocreomycetidae Bộ (ordo) Hypocreales Họ (familia) Ophiocordycipitaceae Chi (genus) Ophiocordyceps Loài (species) O sinensis Hình 1.1 Ophiocordyceps sinensis Về hình thái, thể nấm mọc đỉnh đầu sâu màu nâu sẫm hình chồi, đầu nấm nhƣ lƣỡi mác Nấm Đơng trùng Hạ thảo cịn sống, ngƣời ta trơng rõ hình sâu, với cành nhỏ, mọc Khi sấy khô - Giai đoạn phát triển thể: nhiệt độ 220C, độ ẩm 90-95%, ánh sáng 1000 lux Thí nghiệm đƣợc lặp lại lần 2.5.3 Các phương pháp thu thập xử lý số liệu: - Sử dụng phần mềm Excel số phần mềm thống kê sinh học - Sử dụng phƣơng pháp đo kích thƣớc thủ cơng phƣơng pháp đếm số lƣợng thể để thu thập số liệu 19 CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Khả sinh trƣởng phát triển hệ sợi hình thành thể chủng nấm ĐTHT Cordycept militaris JQ1 ấu trùng tằm sắn 3.1.1 Kết nhiễm nấm cách phun trực tiếp qua da ấu trùng Giống nấm cấp II đƣợc phun trực tiếp lên thể ấu trùng tằm với liều lƣợng 10ml, 15ml, 20ml Mỗi ngày phun lần ngày liên tiếp Sau ngày ấu trùng bị chết cứng lại Sau 5- ngày thân ấu trùng sẫm lại xuất lấm trắng dọc theo thân sợi nấm phát triển ăn lan dần khắp bề mặt vỏ ngồi ấu trùng tằm Tiếp xuất thể màu vàng cam lớn dần lên Kết thí nghiệm đƣợc thể theo bảng 3.1 sau Bảng 3.1 Khả nhiễm nấm ấu trùng tằm theo thể tích dịch phun qua da Thể tích phun Số lƣợng thí Số lƣợng ấu trùng Tỉ lệ nhiễm (ml) nghiệm (con) tằm nhiễm nấm (con) nấm (%) 10 120 33 27,5 15 120 45 37,5 20 120 63 52,5 360 141 39 Tổng tỉ lệ nhiễm trung bình Dựa vào số liệu bảng 3.1 ta thấy tỉ lệ nhiễm nấm lơ thí nghiệm khác Tỷ lệ nhiễm nấm giảm dần theo thể tích phun giống, nhóm sử dụng 20ml có tỷ lệ nhiễm nấm nhiều với tỷ lệ 52,5% tiếp đến 37,5% tƣơng ứng với nhóm sử dụng 15ml nhóm thấp nhóm sử dụng 10ml lần với tỉ lệ nhiễm nấm cịn 27,5% Các thí nghiệm cho thấy, việc sử dụng thể tích phun lớn tỷ lệ nhiễm nấm cao Nguyên nhân thể tích lớn có nhiều sợi nấm nên xâm chiếm thể ấu trùng diễn nhanh hơn, tránh nhiễm khuẩn khác 20 A B C Hình Ấu trùng tằm sau phun nhiễm nấm:10 ngày (A), 35 ngày (B) 70 ngày (C) Sau thời gian nhiễm nấm, loại bỏ hết bị chết thối, chăm sóc hệ sợi nấm, kết trình phát triển hệ sợi thể thu đƣợc nhƣ là: - Thời gian hệ sợi ăn kín bề mặt ấu trùng trung bình: 10,2 ngày - Thời gian bắt đầu xuất thể: 18,3 ngày - Số lƣợng thể trung bình thân ấu trùng: 5,5 - Kích thƣớc trung bình thể/ấu trùng: Chiều dài: 35,2mm, đƣờng kính: 2,5mm 3.1.2 Kết nhiễm nấm phun qua thức ăn sắn Giống nấm cấp II đƣợc phun trực tiếp lên sắn thức ăn ấu trùng tằm với liều lƣợng 10ml, 15ml, 20ml Mỗi ngày phun lần ngày liên tiếp Sau ngày ấu trùng bị chết cứng lại, sau 5- ngày thân ấu trùng sẫm lại xuất lấm trấng dọc theo thân, tiếp xuất thể màu vàng cam lớn dần lên Kết thí nghiệm đƣợc trình bày theo bảng 3.2 sau: Bảng 3.2 Khả nhiễm nấm ấu trùng theo thể tích dịch phun qua thức ăn Thể tích phun (ml) 10 15 20 Tổng tỉ lệ nhiễm trung bình Số lƣợng tằm thí nghiệm (con) 120 120 120 Số lƣợng tằm nhiễm nấm (con) 6 Tỉ lệ tằm nhiễm nấm (%) 2,5 5,0 5,0 360 15 4,2 21 Dựa vào số liệu ta thấy tỉ lệ nhiễm nấm lơ thí nghiệm tƣơng tự thấp (2- 5%) Nguyên nhân xâm nhập vào hệ tiêu hóa, enzyme vi sinh vật khác tiêu diệt sợi nấm trƣớc chúng phát triển Tuy nhiên, có lƣợng nhỏ sợi nấm vƣợt qua đƣợc hàng rào miễn dịch nên phát triển thể tỷ lệ không cao A B Hình 3.1 Ấu trùng tằm ăn sắn nhiễm nấm (A) sau 70 ngày (B) Sau thời gian nhiễm nấm, loại bỏ hết bị chết thối, chăm sóc hệ sợi nấm, kết trình phát triển hệ sợi thể thu đƣợc nhƣ là: - Thời gian hệ sợi ăn kín bề mặt ấu trùng trung bình: 12,1 ngày - Thời gian bắt đầu xuất thể (ngày): 20,6 (ngày) - Số lƣợng thể trung bình/ ấu trùng: 4,0 - Kích thƣớc trung bình thể /ấu trùng:Chiều dài: 34,3mm,đƣờng kính: 2,4 mm 3.1.3 Kết nhiễm nấm tiêm trực tiếp qua da ấu trùng Tiêm với liều lƣợng 100 µL giống nấm qua da vào đầu ngực bụng ấu trùng tằm Kết trình phát triển hệ sợi nấm hình thức nhiễm nấm tiêm trực tiếp qua da ấu trùng đƣợc thể bảng sau 22 Bảng 3.3 Khả nhiễm nấm ấu trùng tằm phƣơng pháp tiêm Số lƣợng tằm thí Số lƣợng tằm Tỉ lệ tằm nhiễm nghiệm (con) nhiễm nấm (con) nấm (%) Đầu 120 0,0 Ngực 120 2,5 Bụng 120 2,5 Tổng tỉ lệ 360 1,7 Khu vực tiêm nhiễm trung bình Dựa vào số liệu ta thấy tỉ lệ nhiễm nấm tiêm vào phần bụng phần ngực tƣơng tự nhƣng thấp (2,5%) Khi tiêm vào phần đầu khơng bị nhiễm nấm (0%), chúng chết bị phân rữa hết Nguyên nhân tiêm vào ấu trùng tằm, đặc biệt vào phần đầu- nơi tập trung tế bào thần kinh, giết chết tằm nhanh tằm bị vi khuẩn phân hủy trƣớc hệ sợi nấm phát triển đến mức phù hợp Cũng liều lƣợng cao so với sức chịu đựng chúng, làm chúng chết nhanh A B C Hình 3.2 Ấu trùng tằm đƣợc tiêm sau ngày (A) 10 ngày (B) 35 ngày (C) Sau thời gian nhiễm nấm, loại bỏ hết bị chết thối, chăm sóc hệ sợi nấm, kết trình phát triển hệ sợi thể thu đƣợc - Thời gian hệ sợi ăn kín bề mặt ấu trùng trung bình: 9,4 ngày - Thời gian bắt đầu xuất thể: 17,9 ngày - Số lƣợng thể trung bình thân ấu trùng: 5,7 - Kích thƣớc trung bình thể (mm): Chiều dài: 37,1, đƣờng kính: 2,6 23 3.1.4 Kết phát triển hệ sợi nấm thể hình thức nhiễm nấm - Về khả nhiễm nấm Từ kết bảng 3.1, 3.2 3.3 thu đƣợc kết tổng hợp sau: Bảng 3.4 Khả nhiễm nấm ấu trùng tằm phƣơng pháp: Phun trực tiếp qua da, phun gián tiếp qua tiêm Số lƣợng tằm Phƣơng pháp Số lƣợng tằm thí nhiễm nấm nghiệm (con) Phun trực tiếp qua da 360 141 39,2 Phun gián tiếp qua 360 15 4,2 Tiêm 360 1,7 nhiễm nấm (con) Tỉ lệ tằm nhiễm nấm (%) Nhƣ vậy, khả nhiếm nấm phƣơng pháp phun nhiễm nấm qua da với liều lƣợng 20ml/ấu trùng có kết tốt (39%) Phƣơng pháp phun nhiễm nấm qua tiêm có tỷ lệ thành cơng thấp (4,2% 1,7%) - Về phát triển hệ sợi nấm thể nấm Từ kết 3.1, 3.2 3.3 trình phát triển hệ sợi thể nấm đƣợc thể bảng sau: Bảng 3.5 Sự phát triển hệ sợi nấm thể hình thức nhiễm nấm Kích thƣớc Thời gian hệ Thời gian bắt Số lƣợng quả thể trung sợi ăn kín bề bình Phƣơng pháp đầu xuất thể trung mặt ấu nhiễm nấm thể bình Chiều Đƣờng trùng trung (ngày) thân ấu trùng dài kính bình (ngày) (mm) (mm) Phun trực tiếp qua da 10,2 18,3 5,5 35,2 2.5 Phun gián tiếp qua 12,1 20,6 4,0 34,3 2.4 Tiêm 9,4 17,9 5,7 37,1 2.6 24 Dựa vào số liệu ta thấy thời gian để phát triển hệ sợi bắt đầu thể giảm dần theo phƣơng thức nhiễm nấm là: tiêm (9,4 17,9 ngày) -> Phun trực tiếp qua da (10,2 18,3 ngày) -> Phun gián tiếp qua (12,1 20,6 ngày) Phƣơng pháp tiêm cho số lƣợng thể trung bình/ấu trùng kích thƣớc (chiều dài, đƣờng kính) trung bình thể tốt (5.7 thể/ ấu trùng 37.1 2.6 mm/ thể) sau phun trực tiếp qua da (5.5 thể/ ấu trùng 35.2 2.5 mm/ thể) Phun gián tiếp qua có kết thấp (4.0 thể/ ấu trùng 34.3 2.4 mm/ thể) - Nhƣ vậy, với phát triển hệ sợi nấm thể nấm ấu trùng phƣơng pháp tiêm tốt Tiếp theo phƣơng pháp phun qua da Cuối phƣơng pháp phun qua 3.2 Khả sinh trƣởng phát triển hệ sợi hình thành thể chủng nấm ĐTHT Cordycept militaris JQ1 nhộng tằm sắn 3.2.1 Kết nhiễm nấm phun trực tiếp qua da nhộng tằm Giống nấm đƣợc phun trực tiếp lên thể nhộng với liều lƣợng 10ml, 15ml, 20ml Mỗi ngày phun lần ngày liên tiếp Kết trình phát triển hệ sợi nấm hình thức nhiễm nấm phƣơng pháp phun nhộng đƣợc thể bảng sau Bảng 3.6 Khả nhộng nhiễm nấm phƣơng pháp phun trực tiếp Thể tích phun (ml) Số lƣợng tằm thí nghiệm (con) Số lƣợng tằm nhiễm nấm (con) Tỉ lệ tằm nhiễm nấm (%) 10 15 20 120 120 57 72 47.5 60 120 93 360 222 Tổng tỉ lệ nhiễm trung bình 77.5 61,6 Dựa vào số liệu thu đƣợc ta thấy tỉ lệ nhiễm nấm lô thí nghiệm khác Tỷ lệ nhiễm nấm giảm dần theo thể tích phun giống, nhóm sử dụng 20ml có tỷ lệ nhiễm nấm nhiều với tỷ lệ 77.5% tiếp đến 60% 25 tƣơng ứng với nhóm sử dụng 15ml nhóm thấp nhóm sử dụng 10ml lần với tỉ lệ nhiễm nấm cịn 47.5% Các thí nghiệm cho thấy, việc sử dụng thể tích phun lớn tỷ lệ nhiễm nấm cao Nguyên nhân thể tích lớn có nhiều sợi nấm nên xâm chiếm thể nhộng diễn nhanh hơn, tránh đƣợc nhiễm loại vi khuẩn khác làm thối rữa nhộng tằm Hình 3.3 Nhộng sau phun 60 ngày 3.2.2 Kết nhiễm nấm tiêm qua da nhộng tằm Tiêm với liều lƣợng 100 µL vào đầu ngực bụng nhộng Kết theo dõi trình phát triển hệ sợi nấm hình thức nhiễm nấm phƣơng pháp tiêm nhộng đƣợc thể bảng sau: Bảng 3.7 Khả nhiễm nấm nhộng tằm phƣơng pháp tiêm Số lƣợng tằm thí Số lƣợng tằm Tỉ lệ tằm nhiễm nghiệm (con) nhiễm nấm (con) nấm (%) Đầu 120 90 75 Ngực 120 93 77,5 Bụng 120 94 78,3 360 277 76,9 Khu vực tiêm Tổng tỉ lệ nhiễm trung bình Dựa vào số liệu ta thấy tỉ lệ nhiễm nấm lơ thí nghiệm tƣơng tự cao từ 75 – 78,3% Các thí nghiệm cho thấy, việc tiêm nhiễm nấm vào phận nhộng quan trọng trình nhiễm nấm so với tiêm nhiễm nấm vào ấu trùng Có thể giai đoạn này, 26 nhộng q trình phân hóa tạo quan nên tốc độ gây chết tƣơng tự phần bị nhiễm nấm 3.2.3 Kết phát triển hệ sợi nấm thể giai đoạn nhộng - Về khả nhiễm nấm Từ kết bảng 3.6 3.7 thu đƣợc kết tổng hợp sau: Bảng 3.8 Khả nhiễm nấm nhộng tằm phun qua da tiêm Hình thức nhiễm nấm Số lƣợng tằm thí nghiệm (con) Số lƣợng tằm nhiễm nấm (con Tỉ lệ tằm nhiễm nấm (%) Phun qua da 360 222 61,6 Tiêm 360 277 76,9 Kết thu đƣợc cho thấy tỷ lệ nhiễm nấm hình thức tiêm (76,9%) cao so với hình thức phun qua da (61,6%) Kết lại ngƣợc với khả nhiễm nấm ấu trùng (1,7% 39,2%) Điều cho thấy khả tiếp nhận nấm giai đoạn côn trùng khác - Về phát triển hệ sợi thể nấm giai đoạn nhộng Sau thời gian nhiễm nấm, loại bỏ hết bị chết thối, chăm sóc hệ sợi nấm phƣơng pháp khác trên, kết trình phát triển hệ sợi thể nhộng đƣợc thể bảng sau: Bảng 3.9 Sự phát triển hệ sợi nấm thể hình thức nhiễm nấm Thời gian hệ sợi Thời gian bắt Số lƣợng Phƣơng ăn kín bề mặt ấu đầu xuất thể trung bình pháp trùng trung bình thể thân nhiễm nấm (ngày) (ngày) ấu trùng Phun trực tiếp qua da Tiêm Kích thƣớc thể trung bình Chiều Đƣờng dài kính (mm) (mm) 9.7 18,3 7,2 40,7 2,6 9,1 17,8 7,.7 41,1 2,5 Dựa vào số liệu ta thấy thời gian để phát triển hệ sợi bắt đầu thể giảm dần theo phƣơng thức nhiễm nấm là: tiêm (9,1 17,8 ngày) -> Phun trực tiếp qua da (9,7 18,3 ngày) Phƣơng pháp tiêm cho số lƣợng thể trung bình/ấu trùng kích thƣớc (chiều dài, đƣờng kính) trung bình thể tốt (7,7 thể/ ấu trùng 41,1 2,6 mm/ thể) sau phun 27 trực tiếp qua da (7,2 thể/ ấu trùng 40,7 2,6 mm/ thể Kết cao với khả nhiễm nấm ấu trùng Điều cho thấy khả sinh trƣởng phát triển nấm giai đoạn trùng khác nhau, có lẽ nguồn dinh dƣỡng thể côn trùng khác giai đoạn Tuy nhiên với số lƣợng tằm nghiên cứu cịn ít, trang thiết bị phịng thí nghiệm chƣa đại kỹ thuật nghiên cứu chƣa thành thục nên kết thấp kết In-Pyo Hong cộng [9] nghiên cứu tằm dâu Do cần tiếp tục nghiên cứu số lƣợng đối tƣợng lớn hơn, phịng thí nghiệm đại để có kết khả quan 28 CHƢƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 4.1 Kết luận Trong thời gia từ tháng 8/2018 đến tháng 5/2019 Viện Công nghệ sinh học- Đại học Lâm nghiệp Hà Nội, với kết nghiên cứu thu đƣợc đối tƣợng nấm Đông trùng hạ thảo Cordyceps militaris JQ1 giá thể ấu trùng nhộng tằm sắn Attacus ricini, rút số kết luận sau đây: - Đã nuôi cấy thành công chủng nấm Đông trùng hạ thảo Cordyceps militaris JQ1 giá thể ấu trùng nhộng tằm sắn Attacus ricini - Sự sinh trƣởng phát triển chủng JQ1 giai đoạn hệ sợi hình thành thể nấm ấu trùng +Hệ sợi nấm: Nhiễm nấm qua da với liều lƣợng 20ml/ấu trùng có kết tốt (39%) Phƣơng pháp phun nhiễm nấm qua (vào đƣơng tiêu hóa) tiêm cho tỷ lệ thành cơng thấp (4.2% 1.7%) +Hình thành thể nấm: Số lƣợng kích thƣớc (chiều dài, đƣờng kính) trung bình thể nấm phun nhiễm nấm qua có kết thấp (4.0 thể/ ấu trùng 34.3 2.4 mm/ thể) Nhiễm nấm qua da tiêm có kết cao nhƣng khơng có khác biệt lớn phƣơng pháp (lần lƣợt là: 5.5 thể; 35.2 2.5 mm/ thể 5.7 thể; 37.1 2.6 mm/ thể) - Sự sinh trƣởng phát triển hệ sợi thể nấm nhộng: + Giai đoạn phát triển hệ sợi nấm: tỷ lệ nhiễm nấm hình thức tiêm (76,9%) cao so với hình thức phun qua da (61,6%) + Giai đoạn hình thành thể nấm: Số lƣợng kích thƣớc (chiều dài, đƣờng kính) trung bình thể nấm phƣơng pháp tiêm có kết cao so với phun nhiễm nấm qua da nhƣng khơng có khác biệt lớn phƣơng pháp (Tiêm:7.7 thể/ ấu trùng 41.1 2.6 mm/ thể; phun trực tiếp qua da: 7.2 thể/ ấu trùng 40,7 2.6 mm/ thể) 29 - Khả nhiễm nấm phát triển hệ sợi, thể nhộng cao so với ấu trùng 4.2 Kiến nghị - Cần tiếp tục nghiên cứu số lƣợng đối tƣợng lớn - Cần nghiên cứu ảnh hƣởng điều kiện sống nhƣ: nhiệt độ, pH, độ ẩm, ánh sáng, loại giá thể môi trƣờng dinh dƣỡng tới sinh trƣởng, phát triển nấm - Cần phân tích số tiêu hóa sinh thành phần dƣợc liệu thể nấm ấu trùng nhộng tằm - Kết đƣợc sử dụng tham khảo nghiên cứu ứng dụng phục vụ sản xuất nấm Đông trùng hạ thảo Cordyceps militaris JQ1 giá thể ấu trùng nhộng tằm sắn Attacus ricini 30 TÀI LIỆU THAM KHẢO A.Tài liệu tiếng Việt Đái Duy Ban (2009), Nghiên cứu phát lồi Đơng trùng Hạ thảo Isaria cerambycidae NSP Việt Nam xác định số hoạt chất sinh học Đông trùng Hạ thảo - Thông tin y học Bộ y tế, tháng 8/2009 Phạm Quang Thu (2009) Điều tra phát nấm Nhộng trùng hạ thảo Cordyceps nutans pat phân bố khu bảo tồn thiên nhiên Tây Yên Tử - Sơn Động - Bắc Giang Tạp trí nơng nghiệp phát triển nông thôn số - tháng 4/2009 Phạm Quang Thu (2009) Phát nấm Nhộng trùng hạ thảo Cordyceps gunni (Berk.)Berk vƣờn quốc gia Tam Đảo tỉnh Vĩnh Phúc Tạp chí nơng nghiệp phát triển nông thôn số - tháng 6/2009 Phạm Quang Thu, Nguyễn Mạnh Hà Phát nấm Nhộng trùng hạ thảo Cordyceps militaris (L.:FR.)LINK vƣờn quốc gia Hoàng Liên tỉnh Lào Cai Tạp chí nơng nghiệp phát triển nông thôn, số - tháng 9/2009 Phạm Thị Thuỳ (2004) Công nghệ sinh học bảo vệ thực vật NXB ĐH Quốc Gia Hà Nội B Tài liệu tiếng Anh A Lovegrove, C H Edwards, I De Noni, H Patel, S N El, T Grassby, C Zielke, M Ulmius, fL Nilsson, P J Butterworth, P R Ellis and P R Shewry, Role of polysaccharides in food, digestion, and healthAcid cordycepic, Crit Rev Food Sci Nutr 2017 Jan 22; 57(2): 237–253 Hardeep S Tuli, Sardul S Sandhu, and A K Sharma, Pharmacological and therapeutic potential of Cordyceps with special reference to Cordycepin, Biotech 2014 Feb; 4(1): 1–12 Hui Mei Yu, Bor-Sen Wang, Shiow Chyn Huang, and Pin-Der Duh, Comparison of Protective Effects between Cultured Cordyceps militaris and Natural Cordyceps sinensis against Oxidative Damage, J Agric Food Chem., 2006, 54 (8), pp 3132–3138 In-Pyo Hong, Pil-Don Kang, Ki-Young Kim, Sung-Hee Nam, Man-Young Lee, Yong-Soo, Choi,Nam-Suk Kim, Hye-Kyung Kim, Kwang-Gill Lee, and Richard A Humber, Fruit Body Formation on Silkworm by Cordyceps militaris, Mycobiology 2010 Jun; 38(2): 128–132 10 Kenneth A Jacobson and Zhan-Guo Gao, Adenosine receptors as therapeutic targets, Nat Rev Drug Discov 2006 Mar; 5(3): 247–264 11 Kim GY, Ko WS, Lee JY, Lee JO, Ryu CH, Choi BT, Park YM, Jeong YK, Lee KJ, Choi KS, Heo MS, Choi YH Water extract of Cordyceps militaris enhances maturation of murine bone marrow-derived dendritic cells in vitro, Biol Pharm Bull 2006 Feb;29(2):354-60 12 Li SP1, Yang FQ, Tsim KW Quality control of Cordyceps sinensis, a valued traditional Chinese medicine, J Pharm Biomed Anal 2006 Aug 28;41(5):157184 Epub 2006 Feb 28 13 Michael N Diringer, Michael T Scalfani,1 Allyson R Zazulia, Tom O Videen, Rajat Dhar, William J Powers, Effect of Mannitol on Cerebral Blood Volume in Patients with Head Injury, Neurosurgery 2012 May; 70(5): 1215– 1219 14 Nan JX., Park EJ., Yang BK., Song CH., Ko G., Sohn DH Antifibrotic effect of extracellular biopolymer from submerged mycelial cultures of Cordyceps militaris on liver fibrosis induced by bile duct ligation and scission in rats, Arch Pharm Res 2001 Aug;24(4):327-32 15 Pornanong Aramwit, Nipaporn Bang, Juthamas Ratanavaraporn, Titpawan Nakpheng Teerapol Srichana, Cordyceps militaris Growing on the Dead Larva of Bombyx mori Silkworm as a New Source of Cordycepin with an Antiproliferative Activity on Cancer Cells and Its Reaction on Cells, The Journal of Agricultural Science 6(6):41-53, 2014 16 Ruiying Chen Masatoshi Ichida, Infection of the Silkworm, Bombyx mori , with Cordyceps militaris, Journal of Insect Biotechnology and Sericology · February 2002 17 Tohru Fukai and Masuko Ushio-Fuka, Superoxide Dismutases: Role in Redox Signaling, Vascular Function, and Diseases, Antioxid Redox Signal 2011 Sep 15; 15(6): 1583–1606 18 Yi Liu, Jihui Wang, Wei Wang, Hanyue Zhang, Xuelan Zhang, and Chunchao Han, The Chemical Constituents and Pharmacological Actions of Cordyceps sinensis, Evid Based Complement Alternat Med 2015