Nghiên cứu phân tích đa dạng di truyền đoạn gen csnis1 (anpha s1 casein) của lợn đen định hóa bằng phương pháp pcr rflp

TRƯỜNG ĐẠI HỌC LÂM NGHIỆP VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC LÂM NGHIỆP VIỆT NAM  KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGHIÊN CỨU PHÂN TÍCH ĐA DẠNG DI TRUYỀN ĐOẠN GEN CSN1S1 (Alpha-S1 Casein) CỦA LỢN ĐEN ĐỊNH HĨA BẰNG PHƯƠNG PHÁP PCR-RFLP NGÀNH: CƠNG NGHỆ SINH HỌC MÃ NGÀNH: 7420201 Giáo viên hướng dẫn : PGS TS Bùi Văn Thắng TS Hà Bích Hồng Sinh viên : Nguyễn Thị Linh Mã sinh viên : 1653070121 Lớp : K61 - CNSH Niên khóa : 2016 - 2020 Hà Nội - 2020 LỜI CẢM ƠN Để thực hồn thành khóa luận tốt nghiệp này, em nhận hỗ trợ, giúp đỡ quan tâm, động viên từ nhiều quan, tổ chức cá nhân Khóa luận tốt nghiệp hoàn thành dựa tham khảo, học tập kinh nghiệm từ kết nghiên cứu liên quan, sách, báo chuyên ngành nhiều tác giả trường Đại học, tổ chức nghiên cứu, tổ chức trị… Đặc biệt hợp tác cán giáo viên trường Đại học Lâm Nghiệp giúp đỡ, tạo điều kiện vật chất tinh thần từ phía gia đình, bạn bè đồng nghiệp Trước hết, em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến giáo viên hướng dẫn PGS.TS Bùi Văn Thắng TS Hà Bích Hồng – người trực tiếp hướng dẫn khoa học dành nhiều thời gian, công sức hướng dẫn suốt trình thực nghiên cứu hồn thành khóa luận Em xin trân trọng cảm ơn Ban giám hiệu trường Đại học Lâm Nghiệp, tồn thể thầy giáo cơng tác trường tận tình truyền đạt kiến thức quý báu, giúp đỡ trình học tập nghiên cứu Kinh phí thực đề tài hỗ trợ đề tài cấp Tỉnh “Nghiên cứu bảo tồn nguồn gen Lợn đen huyện Định Hóa tỉnh Thái Nguyên” Tuy có nhiều cố gắng, luận tốt nghiệp không tránh khỏi thiếu sót Em kính mong Q thầy cơ, chun gia, người quan tâm đến đề tài, đồng nghiệp, gia đình bạn bè tiếp tục có ý kiến đóng góp, giúp đỡ để đề tài hồn thiện Hà Nội, ngày 15 tháng năm 2020 Sinh viên thực hiện Nguyễn Thị Linh i MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN i MỤC LỤC ii DANH MỤC KÝ HIỆU TỪ VIẾT TẮT v DANH MỤC BẢNG vi DANH MỤC HÌNH vii ĐẶT VẤN ĐỀ CHƯƠNG TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 1.1 Tình hình bảo tồn nguồn gen động, thực vật 1.2 Tổng quan Lợn đen Định Hóa 1.2.1 Nguồn gốc đặc điểm 1.2.2 Tập tính, chế độ ăn sinh sản Lợn đen 1.2.3 Giá trị sử dụng lợn đen 1.3 Gen CSN1S1 - Alpha S1 Casein 11 1.3.1 Nguồn gốc, cấu tạo chức gen CSN1S1 11 1.3.2 Các dạng alen gen CSN1S1 16 1.4 Cơ sở khoa học phương pháp PCR-RFLP 19 1.4.1 Khái niệm đa hình gen 19 1.4.2 Kỹ thuật PCR 20 1.4.3 Kỹ thuật RFLP 23 1.4.4 Kỹ thuật PCR-RFLP 23 CHƯƠNG MỤC TIÊU, NỘI DUNG, VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 25 2.1 Mục tiêu đề tài 25 2.1.1 Mục tiêu tổng quát 25 2.1.2 Mục tiêu cụ thể 25 2.2 Nội dung nghiên cứu 25 ii 2.2.1 Địa điểm thời gian nghiên cứu 25 2.2.2 Nội dung nghiên cứu: 25 2.3 Vật liệu nghiên cứu 26 2.3.1 Dụng cụ nghiên cứu 26 2.3.2 Thiết bị nghiên cứu 26 2.3.3 Hóa chất nghiên cứu 27 2.4 Phương pháp nghiên cứu 28 2.4.1 Phương pháp lấy mẫu 28 2.4.2 Phương pháp tách chiết DNA tổng số 28 2.4.3 Phương pháp PCR 29 2.4.4 Phương pháp cắt enzyme giới hạn 31 2.4.5 Phân tích đa hình gen 31 2.4.6 Phương pháp điện di kiểm tra 32 2.4.7 Tinh sản phẩm PCR 33 2.4.8 Giải trình tự nucleotit 33 2.4.9 Phương pháp phân tích số liệu 33 CHƯƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 34 3.1 Kết tách chiết DNA tổng số từ mẫu máu 34 3.2 Kết tối ưu hóa nhiệt độ gắn mồi 35 3.2.1 Kết thiết kế mồi 35 3.2.2 Kết tối ưu nhiệt độ gắn mồi cặp mồi CSN1S1_F/R 36 3.3 Kết PCR nhân đoạn gen CSN1S1 38 3.4.Kết giải trình tự nucleotide đoạn gen CSN1S1 Lợn đen Định Hóa 40 3.5 Kết so sánh trình tự đoạn gen CSN1S1 xây dựng quan hệ di truyền 41 3.5.1 So sánh trình tự CSN1S1 với trình tự gen công bố ngân hàng gen quốc tế NCBI 42 3.5.2 Kết xây dựng quan hệ di truyền dựa trình tự đoạn gen CSN1S1 44 iii 3.6.Kết phân tích đa hình di truyền gen CSN1S1 giống Lợn đen Định Hóa 45 CHƯƠNG KẾT LUẬN - TỒN TẠI - KIẾN NGHỊ 47 4.1 Kết luận 47 4.2 Tồn 47 4.3 Kiến nghị 47 TÀI LIỆU THAM KHẢO iv DANH MỤC KÝ HIỆU TỪ VIẾT TẮT Các chữ viết Nghĩa tiếng Anh tắt ATP bp Adenosin triphosphat Adenosin triphosphat Base pair Cặp base Cộng cs Da DNA (DNA) dNTP EDTA Nghĩa tiếng Việt Dalton Deoxyribonucleic acid Axit deoxyribonucleic Deoxyribonucleotide Deoxyribonucleotid triphosphate triphosphate Ethylenediaminetetraacetic acid axit ethylenediamine tetraacetic Foward-Primer Mồi xi kb Kilobase (1000 base) 1000 cặp base µl Microlit F-Primer mRNA Messenger RNA RNA thông tin Nicotinamide adenine Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate dinucleotide phosphate National Center for Trung tâm Quốc gia Thông Biotechnology Information tin Công nghệ sinh học Polymerase Chain Reaction Phản ứng chuỗi polymerase Restriction fragment length Phân tích đa hình trình tự polymorphism DNA RNA Ribonucleic acid Axit ribonucleic rRNA Ribosomal RNA ARN ribosome Room temperature Nhiệt độ phòng Reverse primer Mồi ngược TAE Tris-Acetate-EDTA Tris-Acetate-EDTA tRNA Transfer RNA ARN vận chuyển UV Untraviolet Tia cực tím V/p v/p Vịng / phút NAD(P)H NCBI PCR RFLP RT R-Primer v DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1: Danh mục thiết bị sử dụng đề tài 26 Bảng 2.2: Danh mục hóa chất sử dụng đề tài 27 Bảng 2.3: Trình tự cặp mồi sử dụng phản ứng PCR 29 Bảng 2.4: Thành phần phản ứng PCR 30 Bảng 2.5: Chu kỳ nhiệt độ phản ứng PCR 31 vi DANH MỤC HÌNH Hình 1.1: Hình dạng đặc điểm Lợn đen Hình 1.2: Hình ảnh NST Lợn đen 12 Hình 3.1: Kết điện di DNA tổng số mẫu máu Lợn đen 34 Hình 3.2: Kết tối ưu nhiệt độ gắn mồi cặp mồi CSN1S1_F/R 37 Hình 3.3: Kết nhân đoạn gen CSN1S1 cá thể Lợn đen Định Hóa 39 Hình 3.4: Trình tự đoạn gen CSN1S1 Lợn đen Định Hóa 41 Hình 3.5: So sánh trình tự sai khác nucleotit gen CSN1S1 Lợn đen Định Hóa với trình tự ngân hàng gen 43 Hình 3.6: Cây quan hệ di truyền Lợn đen Định Hóa số loài ngân hàng gen quốc tế 44 Hình 3.7: Kết điện di sản phẩm cắt enzyme giới hạn MaeI 04 trình tự đoạn gen CSN1S1 04 cá thể Lợn đen Định Hóa 45 vii ĐẶT VẤN ĐỀ Hiệu ngành chăn nuôi lợn phụ thuộc nhiều vào tốc độ tăng trọng sản lượng thị khả sinh sản Hơn nữa, theo xu hướng người tiêu dùng thường thích sử dụng loại thịt chất lượng ngon, hàm lượng chất béo Trước nhu cầu thị trường, nhà khoa học ý chọn lọc giống vật nuôi để nâng cao chất lượng thịt tỷ lệ nạc, độ mềm, màu sắc độ thịt khả tăng trọng Chính giống Lợn đen Định Hóa lồi quan tâm nay, giống lợn đen địa huyện Định Hóa tỉnh Thái Nguyên Vấn đề đặt đa số người dân địa phương nuôi giống lợn lai Các dịng lợn lai có đặc điểm không rõ ràng, không lý lịch nguồn gốc cụ thể, việc chăn nuôi tự phát giống lợn lai làm tăng nguy đe dọa tới bảo tồn nguồn gen, dần giống lợn địa gồm quần thể lợn có nguồn gốc Thái Nguyên đặc biệt Lợn đen Định Hóa Lâu dần, theo tự nhiên thứ đểu trở nên quý Do đó, nghiên cứu việc thu nhận, nhân rộng quần thể Lợn đen có nguồn gốc từ Định Hóa có vai trị quan trọng việc bảo tồn loài Lợn Việt Nam nói chung khu vực Định Hóa nói riêng Cơng tác chọn giống đóng vai trị quan trọng việc nâng cao hiệu ngành chăn nuôi Việc chọn giống không chỉ dựa vào kiểu hình mà cịn dựa vào kỹ thuật đại chỉ thị phân tử tăng khả xác, rút ngắn thời gian nâng cao hiệu chọn lọc Trong đó, nghiên cứu mối liên quan đa hình gen quan trọng cơng tác chọn giống, xác định đa hình di truyền đoạn gen CSN1S1 làm sở cho nghiên cứu mối tương quan gen với chất lượng sữa Lợn đen Định Hóa Mặc dù lợn khơng phải loài cho sữa cung cấp cho người, chất lượng sữa phản ánh khả sinh sản nuôi giống Nhận thấy vấn đề tiến hành thực đề tài: “Nghiên cứu phân tích đa dạng di truyền đoạn gen CSN1S1 (Alpha-S1 Casein) Lợn đen Định hóa phương pháp PCR-RFLP” CHƯƠNG TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 1.1 Tình hình bảo tồn nguồn gen động, thực vật Ngoài nước Trên giới đa dạng sinh học thể rõ vùng nhiệt đới, vùng chỉ chiếm 15% diện tích bề mặt trái đất chiếm tới 78% tổng số loài sinh vật hành tinh Cho đến có 90.000 lồi sinh vật xác định vùng nhiệt đới, tồn vùng ơn đới Bắc Mỹ Châu Âu - Á chỉ có 50.000 lồi Mỗi năm, trái đất khoảng 2.000 loài động vật, thực vật, nghĩa 10% số loài mơ tả Nếu kỷ trước bình qn vài chục năm có lồi bị tuyệt chủng, năm thập niên chín mươi, người ta tính bình qn phút có lồi bị tuyệt chủng, đặc biệt lồi có ích chim, ếch ăn sâu bọ…Theo tính tốn gần tốc độ phá rừng, người ta dự đoán khoảng từ 2-8% số trái đất bị tuyệt chủng 25 năm tới Theo đánh giá nhà khoa học, điểm nóng giới có tới 34.000 loài đặc hữu Tuy nhiên, theo đà thu hẹp diện tích phân bố lồi đặc hữu nay, số loài giảm xuống 10% 20 năm tới Nhiều lồi động vật có ích, có nguồn gen quý bị thu hẹp vùng phân bố, số lượng cá thể dần nguồn gen Chẳng hạn lợn vòi, hươu sao, tê giác, bò rừng… Nguồn gen động vật biến nhanh chóng tồn giới, vòng 15 năm qua 300 số 6.000 giống xác định (nguồn www.fao.org/DADIS) bị tuyệt chủng trung bình khoảng 1-2 giống biến tuần Các nước đã, xây dựng thực chiến lược toàn cầu cho việc quản lý nguồn tài nguyên di truyền động vật Trong nỗ lực quốc tế bảo tồn phát triển nguồn gen động vật, nâng cao nhận thức vai trò giá trị nguồn gen động vật, cung cấp sở khoa học cho việc thiết lập sách quốc gia, khu vực toàn cầu, chiến lược hành động quan trọng Giống vật ni có vai trị quan trọng lồi người việc cung cấp thực phẩm (thịt, trứng, sữa, chất đốt, len, dạ, dược phẩm, sức kéo…) Ramuno cộng (2000) thiết kế cặp mồi nhân đoạn trình tự bao gồm phần intron 8, exon 9, phần intron9 Dê với nhiệt độ gắn mồi tối ưu 60oC Nguyễn Thanh Sơn cs (2018) sử dụng cặp mồi nhân đoạn gen CSN1S1 với nhiệt độ gắn mồi 55oC nhân thành công đoạn gen Dê Nản, Thái Nguyên Đối với cặp mồi CSN1S1_F/R thiết kế cho lợn đen Định Hóa, nhiệt độ 60oC nhân đặc hiệu đoạn gen mong muốn, việc lựa chọn nhiệt độ gắn mồi tối ưu cặp mồi CSN1S1_F/R dao động từ 54oC đến 60oC 3.3 Kết PCR nhân đoạn gen CSN1S1 DNA tổng số tách chiết bước sử dụng làm khuôn để nhân gen CSN1S1 kỹ thuật PCR-RPLF với cặp mồi tương ứng đặc hiệu thiết kế Dựa vào kết thu từ thí nghiệm tối ưu nhiệt độ gắn mồi cặp mồi CSN1S1_F/R (Hình 3.2), chúng tơi chọn nhiệt độ 56oC để tiến hành phản ứng PCR nhân đoạn gen CSN1S1 Lợn đen Định Hóa với 06 mẫu máu (M1, M2, M3, M4, M5, M6) tách chiết từ 06 cá thể Lợn đen Định Hóa Kết PCR thể hình 3.3 38 Hình 3.3: Kết nhân đoạn gen CSN1S1 cá thể Lợn đen Định Hóa (A): Nhân đoạn gen CSN1S1 với các giếng từ đến tương ứng với mẫu DNA từ M1 đến M6, đ/c: mẫu đối chứng âm đó DNA thay bằng H2O, M: DNA marker 100bp; (B): Tinh sản phẩm PCR từ mẫu máu M5, M: marker 1kb Kết thu sau: nhân thành công 4/6 mẫu thu thập gen CNS1N1 Tất mẫu nhân gen có kích thước gần 221bp, phù hợp với kích thước lý thuyết đoạn gen CSN1S1 Từ hình 3.3 A thấy kết điện di giếng số 3, 4, 5, cho băng DNA rõ nét, khơng xuất băng phụ, băng có kích thước tương đồng giếng số 4, cho băng sáng, rõ nét cho thấy nồng độ DNA mẫu cao Điều cho thấy, mồi sử dụng đặc hiệu nhiệt độ bắt mồi tối ưu nồng độ DNA M4, M5 thu cao Sản phẩm PCR từ mẫu máu M3, M4, M5, M6 xuất với băng DNA đặc hiệu rõ nét (Hình 3.3 A) Kích thước đoạn DNA khuếch đại sử dụng cặp mồi CSN1S1_F/R nhiệt độ gắn mồi 56oC thu từ mẫu máu tương đồng với kích thước dự kiến 39 Ở giếng số 2, tương ứng với mẫu M1, M2, ta thấy băng DNA khơng xuất hiện, ngun nhân chất lượng DNA trình tách chiết DNA mẫu chưa tốt, nồng độ DNA chưa cao Vì sản phẩm PCR khơng thu kết Ở giếng số mẫu đối chứng (thay DNA khuôn H2O) không xuất băng DNA Như vậy, thành công việc nhân đoạn gen CSN1S1 Lợn đen Định Hóa mẫu máu M3, M4, M5, M6 kỹ thuật PCR sử dụng cặp mồi đặc hiệu CSN1S1_F/R để gửi giải trình tự Kết tinh sản phẩm PCR phương pháp gel Sau nhân thành công đoạn gen CSN1S1 mẫu Lợn đen Định Hóa (Hình 3.3 A), chúng tơi dựa vào kết thu định lựa chọn mẫu M5 để tinh Mẫu máu tinh kít PCR Purification Kit InTRON theo phương pháp trình bày mục 2.4.7 Sau tinh sạch, đem điện di kiểm tra kết sản phẩm sau tinh nhận thấy băng DNA sáng rõ nét, không bị dứt gãy, không xuất sản phẩm phụ, thể (Hình 3.3 B), đủ điều kiện chất lượng để đem giải trình tự 3.4 Kết giải trình tự nucleotide đoạn gen CSN1S1 Lợn đen Định Hóa Dựa kết nhân đoạn gen CSN1S1 hình 3.3 A chúng tơi định sử dụng mẫu M5 đem giải trình tự Bởi giếng số mẫu M5 cho vạch DNA to, sáng rõ nét so với mẫu M3, M4, M6 điều cho thấy chất lượng DNA mẫu M5 tốt nhất, đạt tiêu chuẩn để đem giải trình tự Sản phẩm PCR mẫu M5 tinh gửi giải trình tự nucleotide Kết giải trình tự đoạn gen CSN1S1 mẫu Lợn đen Định Hóa thể hình 3.4 Mục đích việc giải trình tự nucleotide đoạn gen CSN1S1 để xác định mối quan hệ di truyền giống Lợn đen Định Hóa với giống Lợn khác công bố ngân hàng gen tìm enzyme giới hạn thích hợp cho nghiên cứu đa hình đoạn gen phương pháp PCRRFLP 40 Hình 3.4: Trình tự đoạn gen CSN1S1 Lợn đen Định Hóa So với kích thước tính tốn lý thuyết đoạn gen CSN1S1 nhân có kích thước 221bp phân tích trình tự gen thực tế công cụ BioEdit thu đoạn gen CSN1S1 với kích thước 203bp Đoạn gen CSN1S1 thực tế có kích thước nhỏ so với tính tốn lý thuyết q trình giải trình tự số nucleotide hai đầu đoạn gen bị nhiễu trình tự khơng ghi nhận Việc giải trình tự đoạn gen CSN1S1 Lợn đen Định Hóa cung cấp đóng góp quan trọng để đánh giá vai trò tầm quan trọng yếu tố liên quan đến biểu gen protein sữa Tham khảo số báo kích thước đoạn gen CSN1S1 Dê 200bp, tương đồng Dê động vật nhai lại khác (khoảng 96% với giá súc, cừu) động vật không nhai lại (điểm tương đồng khoảng 88% với thỏ; 80,5% với người 77% với chuột) (L Ramunno cs, 2004) Nhìn chung, đoạn gen CSN1S1 Dê có chung loại tổ chức giống với Bò (Koczan cs, 1991), với số khác biệt tương đối lớn kích thước Trên thực tế phân tích gen CSN1S1 Dê chứng minh tỷ lệ kích thước exon/intron cao (1:13,74) so với quan sát thấy gia súc (1:14,38) Tỷ lệ khác quan sát hai loài chủ yếu ba retroposon artiodactyla bổ sung nằm intron gen CSN1S1 gia súc (L Ramunno cs, 2004) Một xem xét chung mở rộng gen (sự gia tăng kích thước intron khu vực chuyển gen hậu việc chèn retroposons) hiểu chiến lược tiến hóa áp dụng để làm giảm tính khả dụng mục tiêu dễ bị tổn thương (exon, Promators yếu tố điều tiết khác) tác 41 động đột biến chèn vào retronuon (Brosius, 1999) Sự khác biệt quan sát lồi bị Dê tập hợp phần trung tâm gen (giữa intron 12) Điều ủng hộ giả thuyết định nghĩa ba phần gen CSN1S1 CSN2, tập hợp trước đa dạng hóa tiến hóa hai gen (Koczan cs, 1991) Kết so sánh trình tự đoạn gen CSN1S1 xây dựng quan hệ di truyền 3.4.1 So sánh trình tự CSN1S1 với trình tự gen cơng bố ngân hàng gen quốc tế NCBI Trình tự đoạn gen CSN1S1 BLAST ngân hàng gen quốc tế NCBI để xác định trình tự tương đồng Kết cho thấy có 06 trình tự tương đồng với đoạn gen CSN1S1 mẫu M5 Trong đó, có 02 trình tự mRNA chỉ tương đồng với đoạn gen CSN1S1 33 nucleotide tương ứng với kích thước exon9 01 trình tự chỉ tương đồng mức 83,62% đoạn gồm 97 nucleotide Do đó, chúng tơi lựa chọn 03 trình tự tương đồng cao với trình tự CSN1S1 để nghiên cứu so sánh xây dựng quan hệ di truyền Ba trình tự tương đồng với tên sinh vật tỷ lệ tương đồng thể bảng 3.1 Bảng 3.1: Kết so sánh trình tự đoạn gen CSN1S1 Lợn đen Định Hóa với trình tự tương đồng ngân hàng gen quốc tế NCBI STT Tên lồi Kí hiệu Tỉ lệ tương đồng Sus crofa alpha S1 casein (CSN1S1) EU025875 97.975% Sus crofa beta-casein (cs2) EU213063 98.95% Capra hircus csn1S1 AJ504711 82.91% 42 Dựa vào bảng 3.1 ta nhận thấy trình tự gen CSN1S1 giống Lợn đen Định Hóa có tỷ lệ tương đồng cao với trình tự đoạn gen CSN1S1 (Sus crofa alpha S1 casein) có mã số EU025875.1 NCBI (97.975%), thứ hai trình tự đoạn gen CS2 (Sus crofa beta-casein ) với mã số EU213063.1 NCBI (98,95%), cuối trình tự csn1S1 (Capra hircus partial csn1s1) với mã số AJ504711.2 NCBI (82,91%) Kết khẳng định trình tự nhân mẫu DNA M5 đoạn gen CSN1S1 Lợn Trình tự đoạn gen giống Lợn đen Định Hóa có tương đồng với trình tự đoạn gen CSN1S1 giống Lợn Hàn Quốc (EU025875.1) Mặt khác, trình tự đoạn gen CSN1S1 giống Lợn đen Định Hóa có độ tương đồng tương đối cao với trình tự gen CS2 giống Lợn Hàn Quốc (EU213063.1) Đối với gen CSN1S1 Dê (AJ504711.2) độ tương đồng thấp chúng gen Sự sai khác trình tự nucleotide gen CSN1S1 Lợn đen Định Hóa so với 03 trình tự ngân hàng gen thể cụ thể hình 3.5 Nguyên nhân sai khác trình tự nucleotide ảnh hưởng môi trường, chúng sống điều kiện khí hậu khác nhau, q trình tồn phát triển, trải qua q trình tiến hóa, trình tự thông tin di truyền sinh vật xuất sai khác hay vài vị trí nucleotide chế độ dinh dưỡng gây đột biến dẫn đến sai khác cá thể lồi khác nên dẫn đến chênh lêch tỉ lệ tương đồng bảng 3.1 Hình 3.5: So sánh trình tự sai khác nucleotit gen CSN1S1 Lợn đen Định Hóa với trình tự ngân hàng gen 43 4 3.5.2 Kết xây dựng quan hệ di truyền dựa trình tự đoạn gen CSN1S1 Dựa kết so sánh trình tự đoạn gen CSN1S1 Lợn đen Định Hóa với 03 trình tự tương đồng ngân hàng gen quốc tế NCBI (bảng 3.1), tiến hành xây dựng quan hệ di truyền 04 trình tự dựa kiểu phân nhóm Neibourjoining NCBI Các mẫu có hệ số tương đồng di truyền cao xếp thành nhóm, nhóm có liên hệ với Kết xây dựng quan hệ di truyền thể hình 3.6 Hình 3.6: Cây quan hệ di truyền Lợn đen Định Hóa số lồi ngân hàng gen quốc tế Qua hình 3.6 cho thấy mẫu chia thành nhóm, nhóm gồm 03 trình tự Lợn, nhóm cịn lại 01 trình tự Dê Từ phân loại dựa số liệu trình tự gen CSN1S1_M5 có quan hệ gần gũi với loài theo thứ tự sau: Sus scrofa alpha S1 casein (CSN1S1); Sus scrofa beta-casein (csn2); Capra hircus CSN1S1 Ta thấy loài Sus scrofa alpha S1 casein (CSN1S1) Lợn đen Hàn Quốc có độ tương đồng cao lồi Lợn lại sống điều kiện địa lí khác nên có tác động điều kiện bên ngồi gây nên đột biến số gen Cịn lồi Sus scrofa beta-casein (csn2) Lợn đen Hàn quốc so sánh gen khác CSN2 nên dẫn đến có tương đồng thấp điều tất yếu Cuối loài Capra hircus CSN1S1 gen CSN1S1 lại lồi Dê lồi khác biệt khơng phải lồi Lợn nên có tỉ lệ tương đồng thấp nhất, sử dụng loài để so 44 sánh khác biệt kiểu gen loài khác kiểu gen khác kết dự tính trước 3.5 Kết phân tích đa hình di truyền gen CSN1S1 giống Lợn đen Định Hóa Sản phẩm PCR nhân đoạn gen CSN1S1 04 cá thể Lợn đen Định Hóa cắt enzyme giới hạn để nghiên cứu đa hình di truyền gen quần thể Dựa vào kết giải trình tự nucleotide trình tự đoạn gen CSN1S1 ngân hàng gen, sử dụng phần mềm Webcutter 2.0, lựa chọn enzyme giới MaeI để nghiên cứu đa hình di truyền gen Enzyme MaeI có trình tự nhận biết CTAG cắt đoạn gen CSN1S1 vị trí nucleotide số 83 (vị trí thể hình 3.4) Với cá thể khác nhau, vị trí cắt enzyme giữ khơng đổi tính bảo thủ cao bị đột biến dẫn đến vị trí nhận biết enzyme Dựa vào kết cắt enzyme MaeI đoạn gen CSN1S1 cá thể, thấy đa hình di truyền gen quần thể Lợn đen Định Hóa Kết điện di sản phẩm cắt enzyme giới hạn thể hình 3.7 Hình 3.7: Kết điện di sản phẩm cắt enzyme giới hạn MaeI 04 trình tự đoạn gen CSN1S1 04 cá thể Lợn đen Định Hóa Giếng đến 4: tương ứng với mẫu M3, M4, M5, M6; M: DNA marker 1kb 45 Kết cắt enzyme MaeI đoạn gen CSN1S1cho thấy tất cá thể Lợn đen Định Hóa (M3, M4, M5, M6) cho băng DNA với kích thước tương ứng khoảng 120bp 83bp So sánh với trình tự nucleotide mẫu M5 kích thước băng DNA vị trí cắt giới hạn enzyme MaeI Điều cho thấy cá thể Lợn đen Định Hóa có kiểu gen gen CSN1S1 vị trí nhận biết enzyme MaeI bảo thủ Kết chưa thể khẳng định quần thể Lợn đen Định Hóa khơng có đa hình kiểu gen gen CSN1S1 số lượng cá thể phân tích nhỏ, chưa đại diện cho quần thể Theo tìm hiểu chúng tơi, chưa có nghiên cứu đa hình di truyền gen CSN1S1 Lợn kết bước đầu phục vụ cho nghiên cứu Trên thực tế, alen CSN1S1 Dê biết đến liên kết với mức biểu khác (Chianese cs, 1997; Martin cs, 1999; Bevilacqua cs, 2002; Ramunno cs, 2005) Một giả thuyết đưa khác biệt quan sát biểu gen CSN1S1của Dê kết trực tiếp nhiều yếu tố chỉ gen quy định (Ramunno cs, 2005) Kumar cs (2007) tiến hành nghiên cứu đa hình gen CSN1S1 giống Dê Ấn Độ Jamnapari, Jakhrana, Beetal, Barbari, Marwari, Osmanabadi, Chegu, Sirohi, Black Bengal, Gaddi, Surti Dê địa phương Uttar Pradesh Madhya Pradesh kỹ thuật PCR-RFLP quan sát alen A với tần số 0,68 - 1,00, alen B với tần số 0,10 - 0,23 alen F với tần số 0,005 Trong nghiên cứu này, alen A chiếm ưu có kiểu gen AA, BB, AD AF, khơng tìm thấy kiểu gen AB Tuy nhiên, alen D F không quan sát nghiên cứu Kiểu gen AB cịn cần xác minh ưu có vượt qua cha mẹ với kiểu gen AA BB hay không 46 CHƯƠNG KẾT LUẬN - TỒN TẠI - KIẾN NGHỊ 4.1 Kết luận Tách chiết tinh 06 mẫu DNA tổng số từ máu giống Lợn đen Định Hóa Thiết kế thành công cặp mồi CSN1S1_F/R để nhân đoạn gen CSN1S1 bao gồm phần intron 8, exon 9, phần intron Lợn đen Định Hóa Nhân thành công đoạn gen CSN1S1 kỹ thuật PCR từ 04 mẫu tổng số 06 mẫu DNA 06 cá thể Lợn đen Định Hóa Xác định trình tự đoạn gen CSN1S1 Lợn đen Định Hóa phục vụ cho đăng ký quyền ngân hàng gen quốc tế để hướng tới đăng ký nhãn hiệu đặc sản địa phương Phân tích thành cơng đa hình đoạn gen CSN1S1 Lợn đen Định Hoá phương pháp PCR-RFLP khẳng định giống Lợn đen Định Hóa giống lợn đặc hữu địa phương 4.2 Tồn Do thời gian kinh phí thực đề tài hạn chế nên đề tài chưa phân tích số lượng lớn cá thể Lợn đen Định Hóa 4.3 Kiến nghị Tiến hành cơng bố trình tự đoạn gen CSN1S1 lên Ngân hàng Gen Quốc tế để phục vụ đăng ký quyền Tiếp tục phân tích đa hình di truyền đoạn gen CSN1S1 số lượng lớn cá thể để phục vụ xác định tần số kiểu gen tần số alen gen CSN1S1 (từ 30 cá thể trở lên) Lựa chọn thêm vài enzyme giới hạn phù hợp để nghiên cứu đa hình gen CSN1S1 quần thể Lợn đen Định Hóa Đánh giá mối tương quan đa hình kiểu gen đoạn gen CSN1S1 với tính trạng liên quan phục vụ đánh giá giá trị nguồn gen Lợn đen Định Hoá 47 TÀI LIỆU THAM KHẢO TIẾNG VIỆT Bùi Chí Bửu, Nguyễn Thị Lang (2014), “Di truyền phân tử”, NXB Thành phố Hồ Chí Minh Dương Văn Cường, Nguyễn Huy Thuần (2017), “Giáo trình Nguyên lý kỹ thuật di truyền”, NXB Khoa Học Kỹ Thuật, Hà Nội Tr 19 Hoàng Nghĩa Duyệt (2006), “Nghiên cứu mức protein tỉ lệ lysine/năng lượng phần Lợn nái Móng Cái ni ở mợt số tỉnh miền Trung”, Luận án Tiến sĩ Nông nghiệp, Đại học Huế, tr 34-76 Khuất Hữu Thanh (2012), “ Cơ sở di truyền Sinh học phân tử Kỹ thuật Gen”, NXB Khoa học kỹ thuật, Hà Nội Nguyễn Thị Phương Lam (2017), “Nghiên cứu một số đặc điểm sinh học di truyền Lợn rừng Tây Nguyên”, tr.3-10 Phạm Khánh Từ, Nguyễn Ngọc Huy, Lê Thị Lan Phương, Nguyễn Thị Vinh, Hoàng Nghĩa Duyệt, Nguyễn Quang Linh, Đàm Văn Tiện, Hồng Văn Kì (2007), “Nghiên cứu đa dạng bảo tồn vốn gen động vật nuôi địa khu vực Thừa Thiên - Huế”, Tạp chí Nơng nghiệp phát triển nông thôn, tháng 4, tr 19-22 Trần Huê Viên (2005), “Nghiên cứu một số đặc điểm sinh trưởng sinh sản Lợn đen nuôi ở Ba Bể, Pác Nậm, tỉnh Bắc Kạn”, Tạp chí Nơng nghiệp Phát triển nơng thơn, kì 1, tháng 12, tr.48-52 Trần Trang Nhung, Nguyễn Văn Bình, Hồng Tồn Thắng, Đinh Văn Bình (2005), “Giáo trình ni Dê”, NXB Nông Nghiệp, Hà Nội Tr - TIẾNG ANH Aggeler J, Park CS, Bissel l MJ “Regulation of milk protein and basement membrane gen expression: the influence of the extracellular matrix” J Dairy Sci 1988; 71(10): 2830-42 10 Balia, F., Pazzola, M., Dettori, M.L., Mura, M.C., Luridiana, S., Carcangiu, V., Piras, G & Vacca, G.M., 2013 “Effect of CSN1S1 gen polymorphism and stage of lactation on milk yield and composition of extensively reared goats” J Dairy Res 80, 129-137 11 Bevilacqua, C., Ferranti, P., Garro, G., Veltri, C., Lagonigro, R., Leroux, C., Pietrola, E., Addeo, F., Pilla, F., Chianese, L & Martin, P., 2002 “Interallelic recombination is probably responsible for the occurrence of a new as1-casein variant found in the goat species” Eur J Biochem 269, 1293-1303 12 Brignon G, Mahe MF, Ribadeau-Dumas B, Mercier JC, Grosclaude F “Two of the three gentic variants of goat alpha s1-casein which are synthesized at a reduced level have an internal deletion possibly due to altered RNA splicing” Eur J Biochem 1990; 193(1):237-41 13 Brinkmann J, Jagannathan V, Drögemüller C, Rieder S, Leeb T, Thaller G, Tetens J (2016) “Gentic variability of the equine casein gens” J Dairy Sci 99(7), 5486-5497 14 Brooks, P.H and D.J.A Cole (1970), “The effect of the presence of a boar on the attainment of purberty in gilt”, Journal of Reproduction Fertility, pp 23- 435 15 Caroli A, Chiatti F, Chessa S, Rignanese D, Ibeagha-Awtemu EM, Erhardt G “Characterization of the casein gen complex in West African goats and description of a new alpha(s1)-casein polymorphism” J Dairy Sci 2007; 90(6):2989-96 16 Caroli AM, Chessa S, Erhardt GJ (2009) “Invited review: milk protein polymorphisms in cattle: effect on animal breeding and human nutrition” J Dairy Sci 92(11): 5335-5352 17 Céline Carillier Jacquin, Hélène Larroque and Christèle Robert‑ Granié (2016), “Including αs1 casein gen information in genomic evaluations of French dairy goats”, Gentics Selection Evolution Journal 18 Cieslak, J., Wodas, L., Borowska, A cs (2019), “5’-flanking variants of equine casein gens (CSN1S1, CSN1S2, CSN2, CSN3) and their relationship with gen expression and milk composition” J Appl Gentics 60, 71-78 19 Cosenza, G., Pauciullo, A., Gallo, D., Colimoro, L., D’avino, A., Mancusi, A & Ramunno, L., 2008 “Genotyping at the CSN1S1 locus by PCR-RFLP and AS-PCR in a Neapolitan goat population” Small Rumin Res 74, 8490 20 Dagnachew BS, Thaller G, Lien S, DNAoy T “Casein SNP in Norwegian goats: additive and dominance effects on milk composition and quality” Gent Sel Evol 2011; 43:31 21 Grosclaude, F & Martin, P., 1997 “Casein polymorphisms in the goat Proceedings of an International Seminar: International Dairy Federation milk protein polymorphism seminar II Bruxelles-Belgium” pp 241-253 22 Grosclaude, F., Mahé, M.F., Brignon, G., Distasio, L & Jeunet, R., 1987 “A Mendelian polymorphism underlying variations of goat αs-1-casein” Gent Sel Evol.19 (4), 399-412 23 Hayes B, Hagesaether N, DNAoy T, Pellerud G, Berg PR, Lien S “Effects on production traits of haplotypes among casein gens in Norwegian goats and evidence for a site of preferential recombination” Gentics 2006; 174(1):455-64 24 Ibeagha-Awemu, E.M., Kgwatalala, P & Zhao, X., 2008 “A critical analysis of production-associated DNA polymorphisms in the gens of cattle, goat, sheep, and pig” Mamm Genome 19, 591-617 25 Jansà-Perez, M.J., Leroux, C., Bonastre, A.S & Martin, P., 1994 “Occurrence of a LINE sequence in the 3’ UTR of the goat alpha s1-casein E-encoding alen associated with reduced protein synthesis level” Gen 147, 179-187 26 Koczan, D., Hobom, G., Seyfert, H.M., 1991 “Genomic organization of the bovine as1-casein gen” 27 Kumar, A., Rout, P.K., Mandal, A & Roy, R., 2007 “Identification of the CSN1S1 alen in Indian goats by the PCR-RFLP method” Animal 1, 10991104 28 Küpper, J., Chessa, S., Rignanese, D., Caroli, A & Erhardt, G., 2010 “Divergence at the casein haplotypes in dairy and meat goat breeds” J Dairy Res 77, 56-62 29 Leroux C, Mazure N, Martin P “Mutations away from splice site recognition sequences might cis-modulate alternative splicing of goat alpha s1-casein transcripts Structural organization of the relevant gen” J Biol Chem 1992; 267(9):6147-57 30 Martin P, Szymanowska M, Zwierzchowski L, Leroux C “The impact of gentic polymorphisms on the protein composition of ruminant milks” Reprod Nutr Dev 2002; 42(5): 433-59 31 Martin, P., Szymanowska, M., Zwierzchowski, L & Leroux, C., 2002 “The impact of gentic polymorphisms on the protein composition of ruminant milks” Reprod Nutr Dev 42, 433-459 32 Mastrangelo, S., Sardina, M.T., Tolone, M & Portolano, B., 2013 “Gentic polymorphism at the CSN1S1 gen in Girgentana dairy goat breed” 33 Pauciullo A, Giambra IJ, Iannuzzi L, Erhardt G (2014) “The β-casein in camels: molecular characterization of the CSN2 gen, promoter analysis and gentic variability” Gen 547(1):159-168 34 Pieszka M, Łuszczyński J, Zamachowska M, Augustyn R, Długosz B, Hędrzak M (2016) “Is mare milk an appropriate food for people?” – a review Ann Anim Sci 16(1):33-51 35 Ptack E, Schaeffer LR “Use of test day yields for gentic evaluation of dairy sires and cows” Livestock Prod Sci 1993; 34:23-34 36 Ramunno, L., Cosenza, G., Pappalardo, M., Pastore, N., Gallo, D., Di Gregorio, P & Masina, P., 2000 “Identification of goat CSN1S1F alen by means of PCR-RFLP method” Anim Gent 31, 333-346 37 Ramunno, L., Cosenza, G., Rando, A., Illario, R., Gallo, D., Berardino, D D & Masina, P., 2004 “The αs1-casein gen: gen structure and promoter analysis” Gen 334, 105-109 38 Ramunno, L., Cosenza, G., Rando, A., Illario, R., Gallo, D., Berardino, D D & Masina, P., 2004 “The αs1-casein gen: gen structure and promoter analysis” Gen 334, 105-111 39 Rout PK, Kumar A, Mandal A, Laloe D, Singh SK, Roy R “Characterization of casein gen complex and gentic diversity analysis in Indian goats” Anim Biotechnol 2010; 21(2):122-34 40 Salimei E, Fantuz F (2012) “Equid milk for human consumption” Int Dairy J 24 (2):130-142 41 Sanchez A, Ilahi H, Manfredi E, Serradilla JM “Potential benefit from using the alpha (s1)-casein genotype information in a selection scheme for dairy goats” J Anim Breed Gent 2005; 122(1):21-9 42 Sanders K, Bennewitz J, Reinsch N, Thaller G, Prinzenberg EM, Kuhn C et al “Characterization of the DGAT1 mutations and the CSN1S1 promoter in the German Ange ln dairy cattle population” J Dairy Sci 2006; 89(8):3164-74 43 Smith BD (2007) “The ultimate ecosystem engineers” Science 315: 1797-8 44 Swalve HH “Theoretical basis and computational methods for different testday gentic evaluation methods” J Dairy Sci 2000; 83(5):1115-24 45 Umesha Kavali (11-2014), “Studies on gentic polymorphism of alpha s1 casein gen in nandidurga goats”, Karnataka Veterinary, Animal and Fisheries Sciences University, Bidar 46 Yang F, Li L, Liu H, Cai Y, Wang G “Polymorphism in the exon of betalactoglobulin variant B precursor gen and its association with milk traits and protein structure in Chinese Holstein” Mol Biol Rep 2012; 39(4):3957-64 47 Yue XP, Zhang XM, Wang W, Ma RN, Deng CJ, Lan XY et al “The CSN1S1 N and F alens identified by PCR-SSCP and their associations with milk yield and composition in Chinese dairy goats” Mol Biol Rep 2011; 38(4):2821 INTERNET 48 https://en.wikipedia.org/wiki/CSN1S1 49 https://link.springer.com/article/10.1007/s13353-018-0473-2#article-info 50 https://www.gencards.org/cgi-bin/carddisp.pl?gen=CSN1S1 51 https://www.uniprot.org/uniprot/P39035