LUẬN văn THẠC sĩ lựa chọn quy trình tách chiết DNA tổng số và bước đầu phân tích đa dạng di truyền nguồn gen dây thường xuân (hedera nepalensis k koch) ở việt nam dựa trên chỉ thị GBSSI

ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Đối tượng nghiên cứu

9 mẫu thực vật đã được phân loại dựa vào đặc điểm hình thái thuộc loài

Hedera nepalensis thu nhập tại một số tỉnh vùng núi phía Bắc Các mẫu được lấy bởi nhóm nghiên cứu tại Viện Dược liệu, chi tiết thể hiện trong Bảng 2.1

Một mẫu thuộc loài Hedera helix được sử dụng trong nghiên cứu để đối chiếu, lấy từ Vườn thực vật Hoa Nam, Trung Quốc

2.1.2 Tiêu chuẩn lựa chọn mẫu

Tiêu chuẩn lựa chọn mẫu: mẫu lá non, sạch đã được sấy khô và bảo quản trong túi silicagel chống ẩm

Bảng 2.1 Thông tin mẫu thực vật dùng trong nghiên cứu

Thời gian, địa điểm nghiên cứu

Thời gian thực hiện nghiên cứu: từ ngày 15/6/2018 – 25/04/2019 Địa điểm nghiên cứu: Phòng thí nghiệm của Bộ mônY Dược học cơ sở, Khoa Y Dược, Đại học Quốc gia Hà Nội

TT Ký hiệu mẫu Địa điểm lấy mẫu Tọa độ địa lý

1 H1 Bản Khoang, Sa Pa, Lào Cai 22°22'37.53"N-103°47'31.76"E

2 H2 Bản Khoang, Sa Pa, Lào Cai 22°22'37.53"N - 103°47'31.76"E

3 H3 Trạm cây thuốc Sa Pa, Lào Cai 22°21'10.29"N - 103°51'36.04"E

4 H4 Hồ Thầu, Hoàng Su Phì,

5 H5 TT Sa Pa, Lào Cai 22°20'17.84"N - 103°49'52.89"E

6 H6 TT Sa Pa, Lào Cai 22°20'17.84"N - 103°49'52.89"E

7 H15 Bản Khoang, Sa Pa, Lào Cai 22°23'0.01"N - 103°47'9.97"E

8 H16 Phó Bảng, Đồng Văn, Hà Giang 23°14'46.36"N - 105°11'30.49"E

9 H21 Sủng Là, Đồng Văn, Hà Giang 23°14'39.08"N - 105°12'48.68"E

10 HH Vườn Thực vật Hoa Nam,

Copyright @ School of Medicine and Pharmacy, VNU

Dụng cụ, trang thiết bị và hóa chất nghiên cứu

Hóa chất để tách chiết DNA tổng số: bộ kit Dneasy Plant Mini (Qiagen, Đức), bộ kit GeneJET Plant Genomic DNA Purification Mini (Thermo Scientific, Mỹ), hóa chất phân lập DNA theo quy trình CTAB, CTAB cải tiến mua từ Merck bao gồm: CTAB 3% (Tris 1M pH 8, EDTA, NaCl, nước khử ion); TE (Tris 1M pH

8, EDTA, nước khử ion); Isopropanol; Isoamylalcohol; Chloroform; β- mercaptoethanol

Hóa chất thực hiện kỹ thuật PCR: dNTP mix (Thermo Scientific), Phusion Polymerase (Thermo Scientific), cặp mồi đặt tổng hợp từ hãng Phusa Biochem (Việt Nam) đã được sử dụng trong một số nghiên cứu khác trên thế giới [23], có trình tự như sau: Mồi xuôi F: 5’CAC AAC TGT AAG ATC CTT TCA AA 3’; mồi ngược R: 5’CAT ACG CAT AGC ATG TAA CTG 3’

Hóa chất điện di: Agarose, Ethylene Diamine Tetra Acetic Acid (EDTA, Affymetrix), 5X DNA loading dye (Lonza), GeneRuler 100bp DNA Ladder (Thermo Scientific), Lambda DNA/HindIII Ladder (Thermo Scientific), Tris base (Bio basic), axit acetic (Merck)

Máy soi, chụp ảnh gel (Gel Doc It, Mỹ), Hệ thống điện di (Cleaver Scientific Ltd, Anh), Máy PCR (Prime Thermal Cycler, Anh), Tủ an toàn sinh học (ESCO, Singapore), Máy li tâm EBA 21 (Hettich Zentrifugen, Đức), Máy lắc VELP (Scientifica, Đức), Máy quang phổ NP80 (Nanophotometer, Đức), Máy làm đá vảy (Fiocchetti, Ý), Tủ ấm (Panasonic, Nhật Bản), Tủ lạnh sâu -30 o C (Panasonic, Nhật Bản), Tủ mát 4 o C (FRIMED, Nhật Bản).

Phương pháp nghiên cứu

Nghiên cứu được tiến hành theo sơ đồ trong Hình 2.1

2.4.1 Tách chiết DNA tổng số

DNA được phân lập bằng 4 phương pháp là phương pháp sử dụng Mini-CTAB (Sanghai-Maroof và cộng sự, 1984), phương pháp CTAB cải tiến (Elias và cộng sự, 2004), DNeasy Plant Mini Kit (Qiagen, Đức) và GeneJET Plant Genomic DNA Purification Mini Kit (Thermo Scientific, Mỹ)

Hình 2.1 Sơ đồ thiết kế nghiên cứu

Quy trình DNeasy Plant Mini Kit (Qiagen, Đức) và GeneJET Plant Genomic DNA Purification Mini Kit (Thermo Scientific, Mỹ) thực hiện theo khuyến cáo của hãng

Quy trình CTAB cải tiến (Elias và cộng sự, 2004) gồm các bước như sau:

Bước 1: Cân 20 mg mẫu đã nghiền cho vào ống eppendorf 1,5 mL mới

Bước 2: Bổ sung thờm 388 àL đệm CTAB 3% đó ủ ấm ở 65 o C và bổ sung 12 àL β-mercaptoethanol

Bước 3: Ủ mẫu ở 65 o C trong 60 phút trong khối ổn nhiệt kết hợp lắc 400 vòng/ phút, cứ 20 phút đảo mẫu một lần

Bước 4: Để nguội ống mẫu về nhiệt độ phũng, bổ sung 200 àL Chloroform:

Isoamylalcohol (tỷ lệ 24:1 về thể tích) Trộn đều bằng việc đảo ngược ống trong 1 phút, dùng khối ổn nhiệt kết hợp lắc 400 vòng/ phút trong 20 phút

Bước 5: Ly tâm 12.000 vòng/phút trong 10 phút

Bước 6: Hút dịch pha trên chuyển sang ống eppendorf mới

Bước 7: Bổ sung thể tích tương đương Chloroform: Isoamylalcohol (tỷ lệ về thể tớch 24:1) và 80 àL CTAB 3%

Bước 8: Ly tâm ở 12.000 vòng/phút trong 10 phút

Bước 9: Hỳt dịch pha trờn chuyển sang ống eppendorf mới cú sẵn 140 àL isopropanol đã làm lạnh ở -20 o C

Bước 10: Trộn đều bằng việc đảo ngược ống Để ở -20 o C trong 60 phút

Bước 11: Ly tâm 12.000 vòng/phút trong 10 phút Đổ bỏ nhẹ nhàng dịch nổi

Bước 12: Bổ sung 0,5mL dung dịch ethanol 70%, búng đều

Bước 13: Ly tâm 12.000 vòng/phút trong 10 phút Đổ bỏ nhẹ nhàng dịch nổi và để tủa DNA khô tự nhiên trong tủ hút ít nhất 12 giờ

Bước 14: Hũa tan DNA tủa trong 100 àL đệm TE và 2 àL RNase

Quy trình Mini-CTAB (Sanghai-Maroof và cộng sự, 1984) gồm các bước như sau:

Bước 1: Cân 50 mg mẫu đã nghiền cho vào ống eppendorf 1,5 mL mới

Bước 2: Bổ sung thờm 800 àL đệm CTAB 3% đó ủ ấm ở 65 o C Ủ mẫu ở 65 o C trong 60 phút (cứ 15 phút đảo mẫu một lần)

Bước 3: Để nguội ống mẫu về nhiệt độ phũng, bổ sung 500 àL Chloroform:

Isoamylalcohol (tỷ lệ 24:1 về thể tích) Trộn đều bằng việc đảo ngược ống trong 1 phút

Bước 4: Ly tâm lạnh ở 10.000 vòng/phút trong 10 phút

Bước 5: Hỳt 500 àL phần dịch bờn trờn và chuyển sang ống eppendorf mới

Bước 6: Bổ sung 500 àL Chloroform: Isoamylalcohol (tỷ lệ về thể tớch 24:1) và

Bước 8: Hỳt 500 àL từ từ phần dịch bờn trờn (pha trong) và chuyển sang ống eppendorf mới cú sẵn 350 àL isopropanol đó làm lạnh ở -20 o C

Bước 9: Trộn đều bằng việc đảo ngược ống Để ở -20 o C trong 30 phút

Bước 11: Đổ bỏ nhẹ nhàng dịch nổi và để tủa DNA khô tự nhiên trong tủ hút

Bước 12: Hũa tan DNA tủa trong 150 àL đệm

Với sự phát triển của khoa học, đã có thêm nhiều phương pháp mới được xây dựng giúp việc phân lập DNA đạt hiệu suất cao như sử dụng bộ dụng cụ thương mại đến từ các hãng Một số bộ Mini Kit thường được ứng dụng trong tách chiết DNA tổng số từ thực vật như: DNeasy Plant Mini Kit (Qiagen, Đức) và GeneJET Plant Genomic DNA Purification Mini Kit (Thermo Scientific, Mỹ) Nguyên lý phương pháp tách DNA tổng số theo bộ kit dựa trên sự thay đổi môi trường pH làm tăng ái lực của DNA và gắn DNA lên màng silica (Hình 1.6) Theo đó, các mẫu thực vật được ly giải, loại bỏ tạp, gắn DNA lên màng silica và rửa giải để thu được DNA tinh sạch như mô tả trong quy trình ở Hình 1.7

Ngoài ra, axit ascorbic, axit diethyldithiocarbamic và 2-mercaptoethanol có thể được đưa vào để bảo vệ DNA chống lại quá trình oxy hóa và biến tính RNA có thể được loại bỏ bằng cách sử dụng RNase

Hình 1.6 Nguyên lí hoạt động màng silica [58]

Hình 1.7 Sơ đồ mô tả quy trình tách chiết DNA sử dụng cột thu silica

Các bước tách chiết DNA sử dụng màng silica cơ bản gồm:

Bước 1: Ly giải DNA: thành tế bào thực vật được phá vỡ nhờ đệm ly giải và các muối chaotropic (muối hoạt động bề mặt) làm mất tính bền vững của liên kết hydro, lực Van der Waals và các tương tác kỵ nước

Bước 2: Loại bỏ tạp chất: thêm 1 số enzym có khả năng phân hủy protein,

RNASE để loại bỏ RNA

Bước 3: Gắn DNA lên bề mặt hạt silica: nhờ muối hoạt động hoặc cồn sẽ phá vỡ lớp vỏ hydrat hóa xung quanh, cho phép các ion tích điện dương tạo thành cầu nối muối giữa silica tích điện âm và DNA tích điện âm [37,

Bước 4: Rửa giải: Giúp loại bỏ tạp chất còn xót trên màng silica gel, ethanol để loại bỏ muối dư Sau bước này trên màng silica gel chỉ còn gắn DNA sẽ được làm khô cột bằng ly tâm để chắc chắn đã loại bỏ ethanol.

Bước 5: Giải phóng thu hồi DNA: DNA được giải phóng khỏi màng silica bằng cách giải hấp với dung dịch ion thấp, chẳng hạn như TE hoặc nước

Kiểm tra và định lượng DNA

Kiểm tra sự có mặt của DNA thực hiện bằng cách điện di sản phẩm tách trên gel agarose 1.2% trong vũng 30 phỳt với hiệu điện thế 100 V Điện di mẫu 4 àL sản phẩm tỏch trộn với 1 àL đệm chứa ethidium bromide trong đệm TAE 1X Cỏc băng DNA được hiện hình khi soi dưới ánh sáng tử ngoại Định lượng nồng độ và độ tinh sạch của DNA tách chiết bằng cách đo chỉ số

OD260/280 (tỷ lệ hấp thụ quang của DNA ở bước sóng 260 nm so với độ hấp thụ quang tại bước sóng 280 nm) Thông thường giá trị OD260/280 khoảng 1.8-2.0 có thể xem DNA tách chiết được là tinh sạch

2.4.2 Khuếch đại đoạn gen đích bằng kỹ thuật PCR Để có quy trình nhân dòng đặc hiệu và ổn định, tiến hành các thí nghiệm tối ưu nhiệt độ gắn mồi, nồng độ mồi và nồng độ DNA Tất cả các phản ứng đều có đối chứng âm và đối chứng dương Phusion DNA polymerase được sử dụng cho phản ứng PCR với khả năng tạo những mẫu dài với độ chính xác và tốc độ cao chỉ với một enzyme duy nhất ngay cả ở những đoạn gen khó nhân dòng nhất Phusion DNA polymerase đem lại hiệu suất cao nhờ hoạt tính nhân dòng chiều 5’- 3’ và đọc sửa

3' - 5' (đây là hoạt tính enzyme cắt mạch DNA từ tận cùng đầu mút theo chiều 3' - 5') Khi bắt gặp một cặp base bổ sung không chính xác, DNA polymerase sẽ đảo ngược chiều đi của nó và cắt bỏ base không ăn khớp Sau khi cắt đi base, polymerase có thể lắp lại chính xác base cần thiết và tiếp tục tái bản DNA

Kiểm tra sản phẩm PCR: Sản phẩm PCR được đánh giá chất lượng trên gel agarose 1,5% trong đệm TAE, sử dụng thang chuẩn GeneRuler 100 bp DNA Ladder để xác định kích thước sản phẩm

2.4.3 Tinh sạch và giải trình tự Để thu được kết quả giải trỡnh tự chỳng tụi tiến hành thu 20 àL sản phẩm PCR gửi đi hãng First Base (Malaysia) để tinh sạch và giải trình tự Kết quả giải trình tự được hiển thị bằng phần mềm BioEdit version 7.2.6.1, qua đó xác định được kiểu gen của từng mẫu nghiên cứu

Cách đọc kết quả giải trình tự như sau: mỗi nucleotit được thể hiện bằng một đỉnh với màu đặc trưng (A: màu xanh lá cây, C: màu xanh da trời, G: màu đen, T: màu đỏ) Tại vị trí cho mỗi nucleotit, nếu chỉ hiện 1 đỉnh màu thì mẫu thực vật có kiểu gen đồng hợp tử, nếu xuất hiện hai đỉnh màu thì là kiểu gen dị hợp tử

Hình 2.2 Kết quả giải trình tự một đoạn gen trên phần mềm Bioedit

2.4.4 Xây dựng cây phát sinh chủng loại phân tích sự đa dạng di truyền của nguồn gen

Dùng phần mềm Sequencher 5.4.6 để chỉnh sửa chuỗi nucleotit, đối với những pic ở đầu và cuối chuỗi thường nhiễu, không rõ ràng sẽ được loại bỏ khỏi chuỗi Phân tích phát sinh loài được tiến hành với trình tự DNA bằng phương pháp Maximum Likelihood trong phần mềm Mega X với giá trị bootstrap 1000 lần lặp lại Phân tích sự đa dạng di truyền của nguồn gen Dây Thường Xuân có thể tham khảo trình tự các vùng gen được công bố trên Genbank Vùng trình tự tham khảo phân tích gồm các loài thuộc chi Hedera và 2 loài thuộc chi Merrilliopanax

KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU

Tách chiết DNA tổng số

Kết quả điện di DNA tổng số từ 10 mẫu nghiên cứu (Hình 3.1) cho thấy tất cả các mẫu đều thu hồi được DNA tổng số thành công với 4 quy trình tách chiết

DNA tổng số từ các mẫu hiện hình với một băng rõ nét tương ứng với băng 23,1 kb của thang chuẩn DNA, cho thấy DNA ít bị đứt gãy trong quá trình thao tác

Hình 3.1 Kết quả DNA tổng số điện di trên gel agarose 1,2%

Từ mẫu lá khô H.nepalensis được phân lập DNA bằng phương pháp Mini- CTAB, phương pháp CTAB cải tiến (Elias và cộng sự, 2004), DNeasy Plant Mini Kit (Qiagen, Đức) và GeneJET Plant Genomic DNA Purification Mini Kit thể hiện ở Bảng 3.1 cho ta thấy rằng nồng độ DNA tổng số có nồng độ dao động từ 10,5 đến 437,4 ng/μL Cụ thể, phương pháp Mini-CTAB thu hồi được lượng DNA nhiều nhất, trung bình là 437,4 ng/μL Theo quy trình CTAB cải tiến thu được nồng độ DNA trung bình là 237,7 ng/μL Tách chiết DNA tổng số từ DNeasy Plant Mini Kit và GeneJET Plant Genomic DNA Purification Mini Kit thu hồi nồng độ DNA trung bình với số lượng lần lượt là 13,7 và 10,6 ng/μL, giá trị này thấp hơn so với quy trình tách sử dụng CTAB và CTAB cải tiến hơn 20 lần

Bảng 3.1 Nồng độ DNA tổng số của các mẫu nghiên cứu

Quy trình CTAB cải tiến

Về mặt lý thuyết, khi kết quả đo OD260/280 trong giới khoảng từ 1,8-2,0 chứng tỏ DNA thu được tinh sạch cao, dưới 1,8 nghĩa là DNA còn lẫn nhiều protein (hay nói cách khác là độ tinh sạch thấp) Độ tinh sạch nồng độ DNA thu được trong nghiên cứu đánh giá thông qua chỉ số hấp thụ quang OD260/280 dao động từ 1,8 đến 2,0 Kết quả này cho thấy DNA đảm bảo độ tinh sạch ở cả 4 phương pháp tách chiết Kết quả nồng độ và chỉ số OD260/280 được trình bày trong Bảng 3.2

Bảng 3.2 Chỉ số OD 260/280 của các mẫu nghiên cứu

Quy trình CTAB cải tiến

Kết quả tối ưu hóa quy trình nhân dòng đoạn gen GBSSI bằng kỹ thuật PCR27 1 Tối ưu quy trình PCR

3.2.1 Tối ưu quy trình PCR

Kết quả tối ưu nhiệt độ gắn mồi

Trong phản ứng PCR nhiệt độ gắn mồi là yếu tố quan trọng để đảm bảo phản ứng PCR có hiệu suất cao Vì vậy, dựa vào khuyến cáo của hãng chúng tôi tiến hành tối ưu nhiệt độ trong dải nhiệt bao gồm 8 nhiệt độ khác nhau: 48,2; 50,3; 52,0;

53,8; 55,7; 57,5; 59,2 và 61,6 o C; hai mẫu đối chứng luôn được thực hiện bao gồm: một mẫu đối chứng âm, một mẫu chứng dương Theo như kết quả điện di sản phẩm tối ưu nhiệt độ gắn mồi cho gen GBSSI thể hiện trong Hình 3.2 , cho thấy: ở nhiệt độ từ 48,2 o C đến 59,2 o C đều lên băng sáng có kích thước khoảng 700 bp, trong đó tại khoảng nhiệt 48,2 o C đến 50,3 o C có thêm một băng không đặc hiệu bên dưới (kết quả rất mờ, in trên giấy không thấy) Gắn mồi ở 52 o C đến 57,5 o C cho băng sản phẩm điện di sáng, đặc hiệu, kích thước phù hợp với lý thuyết (~700 bp) Vì vậy khoảng nhiệt độ gắn mồi thích hợp cho phản ứng khuếch đại gen GBSSI là từ 52 o C đến 57,5 o C

Hình 3.2 Tối ưu nhiệt độ gắn mồi gen GBSSI Làn M: Thang chuẩn GeneRuler

100 bp; Kí hiệu trên các làn: nhiệt độ gắn mồi ( 0 C); (-): Đối chứng âm; (+): Đối chứng dương

Kết quả tối ưu nồng độ DNA

Nồng độ DNA tối ưu với dải theo cấp số nhân: 6,25; 12,5; 25; 50; 100; 200 ng/àL Hỡnh 3.3 thể hiện kết quả điện di sản phẩm tối ưu nồng độ DNA Cỏc băng đều sỏng, đặc hiệu từ nồng độ 6,25 đến 200 (ng/àL), trong đú cú hai băng ở nồng độ

25 (ng/àL) và 50 (ng/àL) cho băng đặc hiệu và sỏng nhất Từ kết quả chỳng tụi lựa chọn nồng độ DNA khuụn tối ưu nhất cho phản ứng PCR là 25 (ng/àL)

Hình 3.3 Tối ưu nồng độ DNA gen GBSSI Làn M: Thang chuẩn GeneRuler

100 bp; Kớ hiệu trờn cỏc làn: nồng độ DNA (ng/àL); (-): Đối chứng õm; (+): Đối chứng dương

Kết quả tối ưu nồng độ mồi:

Hình 3.4 Tối ưu nồng độ mồi gen GBSSI Làn M: Thang chuẩn 100 bp; Kí hiệu trờn cỏc làn: nồng độ mồi (àM) tương ứng với 3 mẫu; (-): Đối chứng õm

Nồng độ tối ưu mồi gen GBSSI bao gồm: 0,1; 0,3 và 0,9 àM, Hỡnh 3.4 là kết quả điện di sản phẩm của tối ưu nồng độ của mồi cho gen GBSSI, cho thấy ở nồng độ 0,3 àM thu cỏc băng sỏng, đặc hiệu và ổn định nhất nờn chọn nồng độ hoạt động tối ưu của mồi là 0,3 àM

3.2.2 So sánh khả năng nhân dòng đoạn gen GBSSI của 4 quy trình

Sử dụng điều kiện sau khi tối ưu quy trình chúng tôi tiến hành chạy phản ứng PCR với các thành phần và điều kiện chi tiết trong Bảng 3.3

Bảng 3.3 Thành phần và điều kiện phản ứng PCR

Thành phần Nồng độ hoạt động

(25 àL) Điều kiện (chu trình nhiệt)

Nước khử ion 14,75 *Biến tính đầu: 98 o C – 30 giây

*Giữ sản phẩm ở 4 o C Đệm 5x 1x 5,0 dNTPs 2 mM 0,2 mM 2,5

Hình 3.5 Kết quả PCR nhân dòng gen GBSSI trên gel agarose 1,5% sử dụng DNA tổng số từ quy trình khác nhau Làn M: O Gene Ruler Ladder DNA

Copyright @ School of Medicine and Pharmacy, VNU marker, Làn (-): đối chứng âm Làn H: sản phẩm PCR từ các mẫu có kí hiệu tương ứng

DNA được chúng tôi tiến hành PCR gen GBSSI với 10 mẫu sử dụng DNA khuôn thu được từ 4 qui trình tách chiết DNA khác nhau Trong đó, quy trình Mini-CTAB cho 3/10 mẫu lên băng là những mẫu H3, H4, H21 (Hình 3.5 A) Quy trình CTAB cải tiến cho hiệu quả nhân dòng gen cao hơn 5/10 mẫu bao gồm mẫu: H2, H3, H4, H6, HH (Hình 3.5 B) Trong khi đó, PCR từ DNA thu được từ cả 2 bộ kit GeneJET Mini Kit và DNeasy Plant Mini Kit có 9/10 mẫu lên với băng sáng rõ thể hiện trong Hình 3.5 C và D Như vậy, hiệu quả nhân dòng gen thông qua PCR từ các mẫu DNA thu được từ kit cao hơn so với mẫu DNA thu được từ quy trình Mini-CTAB và CTAB cải tiến.

Độ tương đồng của trình tự gen GBSSI được khuếch đại

Đã xác nhận được trình tự vùng gen GBSSI của 9/10 mẫu nghiên cứu, có chiều dài khoảng 618 bp Để nghiên cứu đa hình di truyền gen GBSSI, chúng tôi tiến hành so sánh 9 mẫu nghiên cứu với 15 trình tự của các loài khác trong chi

Hedera cùng với 2 loài khác thuộc chi Merrilliopanax đã công bố trên Genbank với chiều dài khoảng 560 bp Bảng 3.4

Bảng 3.4 Các trình tự tham chiếu được sử dụng trong nghiên cứu

TT Tên loài/thứ Mã số

Phân loại H.nepalensis và H.sinensis hiện vẫn còn nhiều vấn đề tranh cãi

H.helix và H.nepalensis khác biệt di truyền như thế nào cũng là một câu hỏi cần lời giải Chính vì vậy, chúng tôi tiên hành so sánh 9 trình tự của các mẫu trong nghiên cứu này với các trình tự đã được công bố trên genbank của H.nepalensis, H.sinensis, H.helix Kết quả đối chiếu trình tự nucleotit vùng gen nghiên cứu thể

Copyright @ School of Medicine and Pharmacy, VNU hiện ở Hình 3.6 Khoảng cách di truyền và số lượng nucleotit sai khác giữa trình tự

GBSSI của 9 mẫu nghiên cứu với H.nepalensis, H.sinensis và H.helix được thể hiện trong Bảng 3.5 Kết quả phân tích cho thấy 9 mẫu nghiên cứu tương đồng 99.7%, sai khác ở 8/618 nucleotit.Phân làm 3 nhóm, nhóm I gồm H1, H2, H4, H5, H6 100% giống nhau; nhóm II gồm H3 và HH với 3 nucletit khác biệt với nhóm I ở vị trí 13, 421 và 603 và nhóm III gồm H16, H21 với 1 vị trí nucleotit khác với nhóm I lần lượt tại vị trí 243 và 263

Hình 3.6 So sánh trình tự vùng GBSSI của H.nepalensis với các loài có quan hệ gần gũi thuộc chi Hedera

Bảng 3.5 Khoảng cách di truyền (phía dưới bên trái) và số lượng nucleotit sai khác (phía trên bên phải) giữa trình tự GBSSI của 9 mẫu nghiên cứu với

9 mẫu thu thập ở Việt Nam có trình tự tương đồng với so với H.nepalensis

(AY204084.1) sai khác thấp nhất 2/565 nucleotit với các mẫu H1, H2, H4, H5, H6 đến 5/565 nucleotit với các mẫu H3, HH Trình tự của H.helix và H.sinensis trên có sự khác biệt lớn với 9 mẫu nghiên cứu (khác 268/618 với mẫu H1) và H.nepalensis (268/565 nucleotit)

Kết hợp với kết quả về khoảng cách di truyền và ở Bảng 3.5 nhận thấy: khoảng cách di truyền giữa các mẫu H.nepalensis ở Việt Nam cho gen GBSSI là không cao Sự khác biệt di truyền lớn nhất nằm ở mẫu H.helix và H.sinensis với giá trị khoảng cách di truyền đều là 1,91 Hầu như không có sự khác biệt di truyền giữa các mẫu H1, H2, H4, H5, H6, H16, H21, H.nepalensis

Chín mẫu bao gồm H1, H2, H3, H4, H5, H6, H16, H21, HH được nhân dòng và giải trình tự gen GBSSI thành công Phân tích gen cho thấy có 8 nucleotit sai khác giữa các mẫu trong đoạn gen dài 618 bp.

Xây dựng cây phát sinh chủng loại dựa trên chỉ thị GBSSI

Trước khi tiến hành xây dựng cây phát sinh chủng loại, mô hình tiến hóa đặc trưng cho GBSSI được tính toán bằng phần mềm Mega X Mô hình tối ưu được xác định là mô hình 3 tham số Tamura (T92) với phân phối Gamma là thích hợp nhất (BIC = 7042,115; AICc = 6657,293; -lnL = 3277,457; R = 1.45), phân tích boostrap với 1000 lần lấy lại mẫu Mức độ tin cậy được đánh giá theo giá trị bootstrap như sau: mức độ tin cậy cao: >85%; mức độ tin cậy trung bình: 65-85%; mức độ tin cậy thấp: C), vị trí 369 (A=>T) và vị trí 368 (A=>C); loài H21 khác tại 3 vị trí là vị trí nucleotit số 263 (T=>C), vị trí 368 (A=>T) và vị trí 269 (A=>C) Đặc biệt loài H3 có 5 vị trí khác biệt tại nucleotit thứ 13, 368, 369, 420, 603 Như vậy, các vị trí này có thể là các vị trí đặc trưng riêng cho loài H.nepalensis Việt Nam hoặc đây có thể là các vị trí có liên quan đến việc hình thành thứ loài mới tại Việt Nam Nghiên cứu của chúng tôi đã góp phần bổ sung số liệu của phân loại một số loài thuộc chi

Hedera Cụ thể, phân loại được loài H.nepalensis tại một số tỉnh vùng núi phía Bắc,

Việt Nam với những loài H.algeriensis, H.maroccana, H.caucasigena, H.cypria, H.maderansis, H.pastuchovii, H.azorica, H.canariensis, H.Hibernica Từ đó, có thể bước đầu kết luận rằng, GBSSI là một chỉ thị hữu ích giúp phân loại loài

Loài Dây thường xuân với tên khoa học là Hedera nepalensis K Koch được mô tả và đặt tên theo hệ thống phân loại lần đầu tiên bởi tác giả K Koch vào năm

1853 Năm 1929, tác giả Wien gộp một loài khác là Hedera sinensis vào cùng loài

H.nepalensis, và cho rằng loài Hedera nepalensis K Koch là một tên đồng danh của Hedera sinensis Tuy nhiên đến năm 2002, Jun Wen khi nghiên cứu về đặc điểm hình thái và di truyền của chi Hedera trên thế giới đã cho rằng loài Hedera nepalensis có 2 thứ H.nepalensis var.sinensis và H.nepalensis var.nepalensis Theo hình thái, thứ H.nepalensis var.nepalensis và thứ var.sinensis được phân biệt dựa trên hai đặc điểm bao gồm số lượng thùy (5 trong var.nepalensis và 3 trong var.sinensis) và số lượng thùy bên (nhiều trong var.nepalensis và hầu như không có trong var.sinensis) Tuy nhiên, một số mẫu của H nepalensis var.sinensis cho thấy sự thay đổi về số lượng thùy lá (từ 3 đến 5) Sự trùng lặp xảy ra giữa H.nepalensis var.nepalensis và var.sinensis vì các đặc điểm được sử dụng để phân biệt giữa chúng không nhất quán [14] Để giải quyết khó khăn trong phân loại hình thái, phân tích dựa trên các chỉ thị di truyền là công cụ hữu ích và có độ chính xác cao Trong phân tích đa dạng di truyền, hai thứ loài này được phân biệt bởi sự khác biệt ở mức độ đa dạng Và theo cây phát sinh chủng loại xây dựng bởi chỉ thị GBSSI, có thể nhận thấy H.nepalensis và H.sinensis tách làm 2 nhánh với mức độ tin cậy cao ở nhánh H.nepalensis (99%) Qua đó, có thể kết luận sơ bộ rằng chỉ thị phân tử

GBSSI có khả năng giải quyết khó khăn trong phân loại hình thái 2 loài này Để cung cấp thêm thông tin về đa dạng di truyền nguồn gen Dây Thường Xuân, các chỉ thị phân tử khác như chỉ thị ITS (gen nhân) hay matK (gen lục lạp),…cũng cần được khảo sát

Tiêu đề	Lựa chọn quy trình tách chiết DNA tổng số và bước đầu phân tích đa dạng di truyền nguồn gen dây thường xuân (Hedera nepalensis K.Koch) ở Việt Nam dựa trên chỉ thị GBSSI
Tác giả	Nguyễn Thị Thu Thảo
Người hướng dẫn	PGS.TS. Đinh Đoàn Long, ThS. Phạm Thị Hồng Nhung
Trường học	Đại học Quốc gia Hà Nội
Chuyên ngành	Dược học
Thể loại	Khóa luận tốt nghiệp đại học
Năm xuất bản	2019
Thành phố	Hà Nội

Định dạng
Số trang	54
Dung lượng	1,44 MB