Nghiên cứu đa dạng di truyền nguồn gen lim xanh tại khu vực núi luốt, trường đại học lâm nghiệp bằng kỹ thuật rapd

LỜI CẢM ƠN Để hồn thành chƣơng trình tốt nghiệp đại học chuẩn bị cho công việc tƣơng lai, qua trình học tập trƣờng Đại học Lâm Nghiệp nhận đƣợc nhiều động viên, giúp đỡ học tập nhƣ trongcuộc sống Bài khóa luận tốt nghiệp đánh giá kết thúc trình học tập nghiên cứu giảng đƣờng Đại học Để hồn thành khóa luận không cần cố gắng, nỗ lực than mà em nhận đƣợc giúp đỡ quý báu từ thầy cô, bạn bè gia đình Nhân đây, tơi xin đặc biệt gửi lời cảm ơn chân thành tới PGS TS Nguyễn Văn Thắng Ths Nguyễn Thị Huyền quan tâm giúp đỡ, hƣớng dẫn tận tình cho tơi thời gian thực khóa luận Xin đƣợc gửi tới thầy giảng viên Viện Công nghệ sinh họcTrƣờng Đại học Lâm Nghiệp lời chúc sức khỏe lời cảm ơn sâu sắc Vì quan tâm, dạy dỗ, bảo tận tình, chu đáo thầy suốt năm qua Cuối xin gửi lời cảm ơn tới gia đình, bạn bè ln bên cạnh động viên, quan tâm tạo điều kiện giúp đỡ tơi hồn thành chƣơng trình học tập Hà Nội, ngày 14 tháng năm 2018 Sinh viên Nguyễn Ngọc Đức MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN MỤC LỤC DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG DANH MỤC CÁC HÌNH ĐẶT VẤN ĐỀ Chƣơng I TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 1.1 Cây Lim Xanh 1.1.1 Vị trí phân bố 1.1.2 Đặc điểm hình thái 1.1.3 Đặc điểm sinh học Lim Xanh 1.1.4 Công dụng Lim Xanh 1.2 Đa dạng di truyền số kỹ thuật phân tử ứng dụng nghiên cứu đa dạng di truyền thực vật 1.2.1 Đa dạng sinh học 1.2.2 Đa dạng di truyền 1.3 Một số thị phân tử thƣờng dùng nghiên cứu đa dạng sinh học 1.3.1 Kỹ thuật thị ADN không sử dụng PCR: 1.3.2 Kỹ thuật Chỉ thị ADN sử dụng PCR: 10 1.4 Một số nghiên cứu đa dạng di truyền giới 13 1.5 Một số nghiên cứu đa dạng di truyền Việt Nam 16 Chƣơng II MỤC TIÊU - NỘI DUNG - VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 19 2.1 Mục tiêu nghiên cứu 19 2.1.1 Mục tiêu chung: 19 2.1.2 Mục tiêu cụ thể: 19 2.2 Nội dung nghiên cứu 19 2.3.Vật liệu địa điểm nghiên cứu 19 2.3.1 Vật liệu nghiên cứu 19 2.3.2 Địa điểm nghiên cứu 20 2.4 Hóa chất thiết bị sử dụng cho nghiên cứu 20 2.4.1 Hóa chất 20 2.4.2 Máy móc thiết bị 22 2.5 Các cặp mồi sử dụng nghiên cứu 22 2.6 Phƣơng pháp nghiên cứu 22 2.6.1 Phƣơng pháp tách chiết ADN từ mẫu câyLim Xanh 22 2.6.2 Phƣơng pháp PCR (Polymerase Chain Reaction) 24 2.6.3.Phƣơng pháp điện di gel agarose 24 2.6.4 Phƣơng pháp phân tích số liệu RAPD 25 Chƣơng II KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 26 3.1 Kết tách chiết ADN tổng số 26 3.2 Kết phân tích hiệu cặp mồi nghiên cứu 26 3.3 Kết phân tích mối quan hệ di truyền mẫu nghiên cứu 32 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 36 Kết Luận 36 Kiến Nghị 36 TÀI LIỆU THAM KHẢO DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT Từ viết tắt Viết đầy đủ AFLP Amplified Fragment Length ADN CTAB Cetyl Trimethyl Amonium Bromide ADN Deoxyribose Nucleic Acid cs Cộng dNTP Deoxynucleotide triphosphate OD Optical Density EDTA Ethylene Diamino Tetra Acetic acide PCR Polymerase Chain Reaction RAPD Random Amplified Polymorphism ADN SSR Simple Sequence Repeat PIC Polymorphism information content TE Tris-EDTA UV Ultra Violet DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 2.1: Bảng ký hiệu mẫu Lim Xanhsử dụng nghiên cứu 20 Bảng 2.2 Trình tự cặp mồi RAPD sử dụng nghiên cứu 22 Bảng 2.3 Thành phần dung dịch đệm rửa 23 Bảng 2.4 Thành phần dung dịch đệm tách 23 Bảng 2.5.Thành phần phản ứng PCR 24 Bảng 2.6 Chu kỳ phản ứng PCR 24 Bảng 3.1 Các phân đoạn DNA đƣợc nhân ngẫu nhiên với mồi OPAC-14 28 Bảng 3.2 Các phân đọan ADN đƣợc nhân ngẫu nhiênvới mồi OPAH-01 đƣợc mã hóa thành kí hiệu 29 Bảng 3.3 Tổng hợp số loại phân đoạn, băng ADN đƣợc nhân bản,số phân đoạn, băng ADN đa hình 31 Bảng 3.4 Hệ số tƣơng đồng mẫu Lim Xanh nghiên cứu 33 DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 3.1 Kết điện di ADN tổng sốcủa mẫu Lim Xanh 26 Hình 3.2.Sản phẩm PCR-RAPD mẫu Lim Xanhvới mồi OPAC-14 27 Hình 3.3.Sản phẩm PCR-RAPD mẫu Lim Xanh với mồi OPAH-01 29 Hình 3.4.Sản phẩm PCR-RAPD mẫu Lim Xanh với mồi Rm1 30 Hình 3.5 Sơ đồ hình biểu diễn mối quan hệ di truyền mẫu Lim Xanh 34 ĐẶT VẤN ĐỀ Cây Lim Xanh tên khoa học là: Erythrophleum fordii, thuộc họ Vang (Caesalpiniaceae) , Cây gỗ lớn, thƣờng xanh cao 30m, thân thẳng Lúc non vỏ ngồi có mầu xám với vết nứt dọc nhẹ màu nâu, già vỏ có màu nâu sẫm, nứt vng hay bong vảy lớn có nhiều lỗ vỏ rõ; thịt vỏ dày, màu hồng Là lồi gơc q nên có giá trị kinh tế cao Vì việc khai thác bừa bãi dẫn đến loài Lim Xanh có nguy báo động Từ nhƣng lí em xây dựng đề tài nhằm cung cấp nguyên liệu phân tử ban đầu cho quy trình giám định mã vạch ADN từ thực vật Cho đến chƣa có nghiên cứu phân tích đa dạng di truyền loài Lim Xanh đƣợc báo cáo, nghiên cứu trƣớc tập trung vào phân tích hình thái lồi Lim Xanh, gần với phát triển sinh học đại, đời kỹ thuật sinh học phân tử AFLP, RAPD, SSR, SNP…đã cho phép đánh giá mối quan hệ di truyền cá thể, quần thể, xuất xứ cách nhanh chóng, thị RAPD loại thị đƣợc sử dụng phổ biến, RAPD kỹ thuật cho phép phát nhanh tính đa dạng di truyền quần thể, phƣơng pháp đơn giản, khơng địi hỏi kỹ thuật cao, khơng phải sử dụng đồng vị phóng xạ, phát nhiều locus lúc, nên đƣợc sử dụng rộng rãi việc đánh giá đa dạng di truyền Đểgóp phần bảo tồn sử dụng nguồn gen hiệu giá trị kinh tế mà lồi mang lại chúng tơi lựa chọn đề tài “Nghiên cứu đa dạng di truyền nguồn gen Lim Xanh Khu vực núi Luốt – Trƣờng Đại Học Lâm Nghiệp kỹ thuật RAPD” Chƣơng I TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 1.1 Cây Lim Xanh 1.1.1 Vị trí phân bố Lim Xanh có tên khoa học Erythruphleum fordii,thuộc họ Đậu (Fabaceae), chi Lim Xanh (Erythruphleum) Cây Lim Xanh thƣờng đƣợc phân bố chủ yếu kiểu rừng nhiệt đới thƣờng xanh độ cao từ 300500m Chi Lim Xanh có nguồn gốc miền Nhiệt đới cận nhiệt đới Nam Á Đông Nam Á bao gồm miền Đông đảo Đài Loan, Quảng Đông, Triết Giang…, lồi đa tác dụng có giá trị kinh tế cao bảo tồn cao Tại Việt Nam Lim Xanh lồi cận đặc hữu Việt Nam khu phân bố tập trung Việt Nam, phát Lim Xanh mọc rải rác miền Nam Trung Quốc Ở Việt Nam, theo tài liệu trƣớc đây, Lim Xanh mọc tập trung tỉnh vùng Đông Bắc, Bắc Trung Bộ biên giới cực nam lồi gỗ q tỉnh Quảng Nam Nhƣng gần phát Lim Xanh có Quảng Ngãi, Bình Định, Bình Thuận (huyện Hàm Tân, độ vĩ 10,47 Bắc) Nhƣ khu phân bố Lim Xanh từ 10-230o vĩ Bắc 102108o kinh Đơng Các tỉnh có nhiều Lim Xanh là: Lạng Sơn, Phú Thọ, Vĩnh Phúc,Thái nguyên, Bắc Kạn, Bắc Giang, Quảng Ninh, Thanh Hoá, Nghệ An, Hà Tĩnh, Quảng Bình, Quảng Trị, Quảng Nam Vùng sơng Thanh, huyện Nam Giang, tỉnh Quảng Nam khu rừng với nhiều Lim Xanh có đƣờng kính 1,5m Gỗ Lim Xanh có giá trị kinh tế cao 1.1.2 Đặc điểm hình thái Hình 1.1: Cây lim xanh (chụp núi Luốt) Cây gôc lớn cao 37 - 45m,đƣờng kính có tới - 2,5m, thƣờng xanh, gốc có bạnh vè, than trịn, phân cành nhánh lớn, tán hình ơ, dày, rộng Võ màu nâu, bong vẩy lớn Khi cịn non có nhiều bí khổng Lá kép lơng chim lần, hoa tự kép hình bong Quả thuôn dài 20 cm, rộng - cm, hạt dẹt màu nâu đen, xếp lợp lên nhau, có lớp vỏ chất sừng, bảo vệ nên tồn lâu đất, dễ bảo quản Tán cây: Tán thƣờng trịn có độ dày từ 1/5 ÷ 1/4 chiều cao vút ngọn.Hình thái lá, hoa 1.1.3 Đặc điểm sinh học Lim Xanh Lim xanh loài gỗ lớn, phân bố vành đai nhiệt đới thấp, từ 200 - 800m, nhƣng tập trung độ cao 300 - 500m Vùng phân bố Lim Xanh có nhiệt độ bình qn năm 22,2-23,80C, nhiệt độ tối thấp tuyệt dối 1,40C, lƣợng mƣa biến động từ 1.500mm/năm (Qùi Châu, Nghệ An) đến 3.000 mm/năm (Móng Cái, Quảng Ninh), độ ẩm trung bình năm 80-86% Yêu cầu ánh sang thay đổi theo giai đoạn sinh trƣởng, phát triển: Giai đoạn - tháng tuổi, Lim Xanh chịu bóng, sinh trƣởng bình thƣờng độ tàn che 25 - 75%, đặc biệt thích hợp độ tàn che 50% Trong điều kiện đƣợc chiếu sáng tự nhiên 100%, sánh sang hoàn tồn ( khơng che) che tối 100%, Lim Xanh non sinh trƣởng Giai đoạn lớn ( từ tuổi trở lên) sinh trƣởng bình thƣờng điều kiện ánh sang tự nhiên Khi trƣởng thành, Lim Xanh vƣơn lên tầng cao rừng Cây phân bố nhiều loại đất có nhiều nguồn gốc khác nhƣ: sa thạch, phiến thạch sét, gnai, mica sit, pooc phia… có thành phần giới từ cát pha, sét nhẹ, sét trung bình đến sét nặng Cây thích hợp với đất sâu, dày, ẩm, nhƣng mọc đƣợc loại đất thối hóa với tầng đất mỏng, độ ẩm không cao, sinh trƣởng Đất có lim xanh mọc thƣờng chua đến chua trung bình Lim Xanh thƣờng mọc thành quần thụ hỗn loại, chúng mọc xen với loài thuộc chi Dẻ đá Dẻ gai (họ Dẻ), loài gội nếp, tram, săng lẻ, sau sau, tram trắng… Cây tái sinh tốt dƣới tán rừng có độ tàn che 0,3 - 0,7 Đặc biệt tái sinh tốt dƣới tán rừng có lồi sau sau, săng lẻ để tạo thành khu rừng hỗn giao Lim Sau sau vùng Lạng Sơn; Lim Săng lẻ vùng Tây Nghệ An Tăng trƣởng hàng năm khơng q chậm so với nhiều lồi gỗ khác: tăng trƣởng đƣờng kính 0,7 - 0,8 cm/năm tăng trƣởng chiều cao 0,8 Chƣơng III KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 3.1 Kết tách chiết ADN tổng số Tách chiết ADN tổng số bƣớc quan nghiên cứu hệ gen sinh vật, đô tinh hàm lƣợng ADN tách chiết ảnh hƣởng đến kết thí nghiệm tiếp theo, ADN thu đƣợc phải có chất lƣợng cao, đảm bảo tính ngun vẹn phân tử, khơng lẫn RNA, protein hay tạp chất khác ADN tổng số 18 mẫu Lim Xanh đƣợc tách chiết thành công với chất lƣợng ADN cao Kết điện di kiểm tra ADN gel agarose 1% cho thấy băng ADN tổng số thu đƣợc sắc nét, ADN khơng bị gãy (Hình 3.1) 10 11 12 13 14 15 16 17 18 Hình 3.1 Kết điện di ADN tổng sốcủa mẫu Lim Xanh Ghi chú: giếng 1-18: DNA tổng số mẫu từ LX1 đến LX18 Trên ảnh điện di, băng ADN tổng số mẫu Lim Xanh thu đƣợc gọn, rỏ nét, không xuất băng phụ Chứng tỏ ADN tổng số thu đƣợc có độ nguyên vẹn cao hoàn toàn đáp ứng để thực phản ứng PCR-RAPD 3.2 Kết phân tích hiệu cặp mồi nghiên cứu Để nghiên cứu quan hệ di truyền cá thể quần thể Lim Xanh, chúng tơi sử dụng mồi RAPD có tên trình tự nhƣ mơ tả bảng 2.2 26 Sau hoàn thành phản ứng PCR sản phẩm đƣợc điện di gel agarose 1,5% để phân tích đa hình DNA mẫu nghiên cứu Các băng ADN thu đƣợc phân tích dựa có mặt hay vắng mặt chúng mẫu nghiên cứu Nếu có kí hiệu 1, cịn khơng có kí hiệu Những băng có mẫu mà khơng có mẫu khác gọi băng đa hình Những phân đoạn DNA xuất 18 mẫu kích thƣớc gọi băng đơn hình Dựa vào mức độ đa hình băng đánh giá mức độ khác giống mẫu nghiên cứu Kết điện di sản phẩm RAPD cho thấy tất đoạn mồi ngẫu nhiên sử dụng có xuất phân đoạn DNA đa hình soi gel dƣới đèn UV Sau kết phân tích cụ thể sản phẩm RAPD cho số mồi đặc trƣng M 10 11 12 13 14 15 16 17 18 Hình 3.2.Sản phẩm PCR-RAPD mẫu Lim Xanhvới mồi OPAC-14 Ghi chú: giếng 1-18: DNA tổng số mẫu từ LX1 đến LX18; M: marker 100bp Kết điện di sản phẩm RAPD với mồi OPAC-14 xuất 12 phân đoạn DNA đƣợc nhân ngẫu nhiên cho mẫu Lim Xanh băng vạch thể rõ nét, kích thƣớc loại phân đoạn có chiều dài dao động từ 290 – 1050 bp so với thang DNA chuẩn 100 bp Sau nhận đƣợc hình ảnh điện di sản phẩm RAPD với mồi OPAC-14 (hình 3.2) tiến hành mã hóa số 27 liệu kết thu đƣợc trình bày nhƣ bảng 3.1 Mồi OPAC-14 có tổng cộng 13 loại phân đoạn DNA xuất với kích thƣớc khác nhau, tổng số băng DNA xuất 18 mẫu Lim Xanh với mồi OPAC-14 87 băng, số băng đa hình 87 chiếm tỷ lệ 100% Bảng 3.1 Các phân đoạn DNA đƣợc nhân ngẫu nhiên với mồi OPAC-14 Mồi OPAC-14 290 300 390 400 450 500 600 700 800 900 1000 1050 Mẫu bp bp bp bp bp bp bp bp bp bp bp bp LX1 0 0 0 0 0 0 LX2 0 1 1 1 1 1 LX3 0 0 0 0 0 0 LX4 0 0 0 0 0 0 LX5 0 0 0 0 0 0 LX6 0 1 1 1 1 1 LX7 0 1 1 1 1 1 LX8 1 0 0 0 0 0 LX9 0 1 1 1 1 1 LX10 1 1 1 1 0 LX11 0 0 0 0 0 0 LX12 0 1 1 1 0 LX13 0 1 1 1 0 LX14 0 0 0 0 0 0 LX15 0 0 0 0 0 0 LX16 0 0 0 0 0 0 LX17 0 1 1 1 1 LX18 0 1 1 1 1 28 Hình 3.3.Sản phẩm PCR-RAPD mẫu Lim Xanh với mồi OPAH-01 Ghi chú: giếng 1-18: DNA tổng số mẫu từ LX1 đến LX18; M: marker 100bp Sau nhận đƣợc kết hình ảnh điện di sản phẩm RAPD với mồi OPAH-01, tiến hành mã hóa số liệu kết thu đƣợc trình bày nhƣ bảng 3.2 Mồi OPAH-01 có tổng cộng 10 loại phân đoạn ADN xuất với kích thƣớc khác nhau,trong 10 phân đoạn đa hình Tổng số băng ADN xuất 18 mẫu Lim Xanh phân tích với mồi OPAH-01 39 băng, có 39 băng đa hình chiếm tỷ lệ 100% Bảng 3.2 Các phân đọan ADN đƣợc nhân ngẫu nhiênvới mồi OPAH-01 đƣợc mã hóa thành kí hiệu 290 300 400 450 600 680 900 bp bp bp Mẫu bp bp bp bp 1000 1020 1050 bp bp bp LX1 0 0 0 0 0 LX2 0 1 1 LX3 0 0 0 0 0 LX4 0 0 0 0 0 LX5 0 0 0 0 0 LX6 1 0 1 LX7 1 0 1 LX8 0 0 0 0 LX9 1 0 1 0 29 LX10 1 0 0 0 LX11 0 0 0 0 0 LX12 1 0 0 0 LX13 1 0 1 LX14 0 0 0 0 0 LX15 0 0 0 0 0 LX16 0 0 0 0 0 LX17 1 1 0 LX18 1 0 0 Hình 3.4.Sản phẩm PCR-RAPD mẫu Lim Xanh với mồi Rm1 Ghi chú: giếng 1-18: DNA tổng số mẫu từ LX1 đến LX18; M: marker 100bp Với mồi Rm1 xuất loại phân đoạn ADN chiếm 100% tổng số phân đoạn ADN Tổng số băng ADN đƣợc nhân 92, tổng số băng đa hình 92, số băng đơn hình Số liệu kết đƣợc mã hóa 18 mẫu Lim Xanh với mồi Rm1 Phân tích tƣơng tự với mồi lại ta thu đƣợc kết bảng 3.4 30 Bảng 3.3 Tổng hợp số loại phân đoạn, băng ADN đƣợc nhân bản,số phân đoạn, băng ADN đa hình STT Tên mồi Số phân Phân đoạn ADN đoạn đa hình Số băng Băng ADN đa ADN hình đƣợc ADN đƣợc Số Tỷ lệ nhân Số Tỷ lệ nhân lƣợng (%) lƣợng (%) OPAC-14 13 13 100 87 87 100 OPAH-01 10 10 100 37 37 100 Rm1 4 100 26 26 100 Rm2 7 100 69 69 100 Rm4 9 100 91 91 100 Rm5 8 100 71 71 100 OPA20 2 100 12 12 100 OPB18 2 100 12 12 100 TỔNG 45 45 100 415 415 100 Qua bảng cho thấy tất mồi đƣợc nghiên cứu xuất phân đoạn ADN đƣợc nhân bản, thu đƣợc tổng cộng 415 băng, băng đa hình 415 chiếm 100%.Số phân đoạn ADN đƣợc nhân 45, có 45 phân đoạn đa hình chiếm 100% Mồi OPAC-14 OPAH-01xuất phân đoạn ADN nhiều lần lƣợt 13 10phân đoạn Mặc dù mồi OPAC-14 OPAH-01 cho số phân đoạn DNA đƣợc khuếch đại lớn nhƣng qua bảng 3.2 cho thấy mồi Rm4 tạo phân đoạn DNA nhƣng số băng DNA đƣợc khuếch đại 18 mẫu lớn đạt 91 băng Mồi OPA20 OPB18 sử dụng cho kết khuếch đại thấp cho phân đoạn kích thƣớc DNA 12 băng DNA đƣợc nhân 18 mẫu Mặc dù nhƣng tất mồi sử dụng nghiên cứu cho băng DNA 31 đƣợc nhân đa hình Tỉ lệ đa hình cao chứng tỏ có khác biệt di truyền 18 mẫu Lim xanh nghiên cứu 3.3 Kết phân tích mối quan hệ di truyền mẫu nghiên cứu Từ kết phân tích hình ảnh điện di sản phẩm RAPD, thống kê băng điện di (xuất = 1, không xuất = 0) xử lí số liệu phân tích RAPD phần mềm NTSYSpc version 2.1 nhằm xác định khoảng cách di truyền mẫu nghiên cứu thông qua hệ số tƣơng đồng di truyền biểu đồ hình Để xác phân tích mối quan hệ di truyền mấu nghiên cứu Lim Xanh sử dụng hệ số tƣơng đồng di truyền Jaccard phƣơng pháp tính UPGMA Hệ số tƣơng đồng di truyền Jaccard cho biết mối quan hệ mặt di truyền mẫu cần phân tích Trị số Jaccard tiến mức độ tƣơng đồng di truyền mẫu thấp ngƣợc lại, tiến mức độ tƣơng đồng di truyền cao Hệ số tƣơng đồng cặp mẫu nghiên cứu đƣợc thể bảng 3.5 cho thấy, 18 mẫu Lim Xanh nghiên cứu có hệ số tƣơng đồng di truyền dao động từ 0,345 - 0,891 Trong hệ số tƣơng đồng di truyền thấp 0,400 (cặp mẫu LX1 - LX12) cho thấy mẫu LX1 - LX12 có quan hệ di truyền cách xa nhau, hệ số tƣơng đồng cao 0,891 (cặp mẫu LX5 – LX16) chứng tỏ mẫu có quan hệ di truyền gần nhau, điều cho thấy mức độ tƣơng đồng mẫu khu vực Núi Luốt – Trƣờng đại học Lâm Nghiệp cao Hay nói cách khác độ đa dạng di truyền mẫu Lim Xanh nghiên cứu tƣơng đối thấp.Điều cá thể có mối quan hệ di truyền gần 32 Bảng 3.4 Hệ số tƣơng đồng mẫu Lim Xanh nghiên cứu LX1 LX1 LX2 1,000 LX3 LX4 LX5 LX6 LX7 LX8 LX9 LX2 0,582 1,000 LX3 0,909 0,527 1,000 LX4 0,836 0,563 0,781 1,000 LX5 0,890 0,472 0,836 0,763 1,000 LX6 0,418 0,690 0,363 0,436 0,418 1,000 LX7 0,400 0,563 0,418 0,272 0,436 0,763 1,000 LX8 0,800 0,381 0,709 0,745 0,800 0,363 0,309 1,000 LX9 0,509 0,745 0,454 0,636 0,400 0,618 0,454 0,490 1,000 LX10 LX11 LX12 LX13 LX14 LX15 LX16 LX17 LX18 LX10 0,600 0,472 0,545 0,545 0,600 0,527 0,581 0,727 0,545 1,000 LX11 0,690 0,490 0,709 0,818 0,618 0,363 0,272 0,636 0,600 0,436 1,000 LX12 0,509 0,490 0,490 0,454 0,581 0,618 0,709 0,563 0,563 0,800 0,345 1,000 LX13 0,490 0,690 0,509 0,545 0,454 0,672 0,545 0,472 0,727 0,600 0,618 0,608 1,000 LX14 0,781 0,363 0,800 0,727 0,781 0,454 0,472 0,727 0,363 0,563 0,654 0,581 0,454 1,000 LX15 0,818 0,436 0,763 0,727 0,854 0,418 0,509 0,727 0,363 0,600 0,581 0,618 0,418 0,818 1,000 LX16 0,854 0,472 0,836 0,727 0,890 0,381 0,400 0,763 0,436 0,563 0,727 0,509 0,563 0,745 0,851 1,000 LX17 0,436 0,527 0,454 0,309 0,509 0,690 0,709 0,381 0,490 0,581 0,381 0,709 0,690 0,509 0,545 0,581 1,000 LX18 0,509 0,600 0,454 0,345 0,472 0,690 0,709 0,454 0,600 0,618 0,418 0,709 0,690 0,472 0,509 0,472 0,854 33 1,000 A2 A A1 B C2 C C1 Hệ số tƣơng đồng di truyền Hình 3.5 Sơ đồ hình biểu diễn mối quan hệ di truyền mẫu Lim Xanh 34 Hình 3.5 biểu diễn mối quan hệ di truyền 18 mẫu Lim xanh Núi Luốt, Trƣờng Đại học Lâm nghiệp thơng qua hệ số tƣơng đồng di truyền Qua hình 3.5 thấy 18 mẫu Lim xanh nghiên cứu đƣợc chia thành nhóm chính: nhóm A, nhóm B nhóm C Nhóm A gồm mẫu (LX1, LX3, LX5, LX16, LX15, LX14, LX8 VÀ LX4) Trong nhóm A lại đƣợc chia thành nhóm nhỏ A1 A2 Nhóm A1 gồm mẫu LX4 LX11 có mức tƣơng đồng di truyền cao (81,81%) Nhóm A2 gồm mẫu cịn lại, có mẫu LX1 LX3 có mức độ tƣơng đồng di truyền cao tất mẫu nghiên cứu (90,91%) Đây mẫu đƣợc thu hái vị trí Nhóm B gồm mẫu (LX2, LX9 LX13) có tƣơng đồng di truyền so với mẫu cịn 0,71 Nhóm C cịn lại mẫu (LX12, LX10, LX18, LX17, LX7 LX6) Nhóm C tiếp tục chia thành nhóm nhỏ C1 C2 Nhóm nhỏ C1 gịm mẫu LX10 LX12 có tƣơng đồng di truyền 80% hay có khoảng cách di truyền 0,2 Nhóm nhỏ C2 gồm mẫu cịn lại: cặp mẫu LX17 LX18 có quan hệ di truyền gần (85,5%); cặp mẫu LX6 LX7 có mức tƣơng đồng di truyền 76,4% 35 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết Luận Đã tách chiết ADN tổng số từ 18 mẫu Lim Xanh nghiên cứu Qua kiểm tra cho thấy, mẫu ADN tổng số tách chiết đƣợc có chất lƣợng tốt, sử dụng cho nghiên cứu Nghiên cứu 18 mẫu Lim Xanh với mồi ngẫu nhiên việc sử dụng kỹ thuật RAPD thu đƣợc 415phân đoạn ADN đƣợc nhân ngẫu nhiên, có 415 băng đa hình chiếm tỷ lệ 100% Trong mồi ngẫu nhiên sử dụng tất mồi biểu tính đa hình Phân tích mối quan hệ di truyền 18 mẫu Lim xanh cho thấy mẫu có tƣơng đồng di truyền mức từ 0,345-0,891 đƣợc chia thành nhóm chính: nhóm A gồm mẫu; nhóm B gồm mẫu nhóm C gồm mẫu Kiến Nghị Cần tiếp tục sử dụng kỹ thuật RAPD với nhiều mồi ngẫu nhiên kết hợp nhiều kỹ thuật khác nhƣ SSR, AFLP, RFLP để xác định mối quan hệ di truyền mẫu Lim Xanh có độ tin cậy nhằm tạo sở cho việc lai tạo giống hiệu Đề tài dừng lại việc phân tích 18 cá thể Lim Xanh khu vực Núi Luốt -Trƣờng đại học Lâm Nghiệp, cần phân tích tồn diện đa dạng di truyền xuất xứ khác loài Lim Xanh 36 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu Tiếng Việt [3] Nguyễn Văn Giang, Vũ Ngọc Lan, Tống Văn Hải (2013), “Nghiên cứu đa dạng di truyền Khoai Môn – Sọ thị phân tử ADN”, Tạp chí Khoa học Phát triển, tập 11, số 1: 1-6 [4] Trần Ngọc Hải, Phùng Thị Tuyến (2013), ”Đánh giá mức độ đa dạng di truyền loài Du Sam đá vôi (Keteleeria davidiana BertrADN Beissn.) kỹ thuật RAPD”, tạp chí Khoa học cơng nghệ Lâm Nghiệp số 1-2013 [5] Nguyễn Hữu Hiệp, Trần Nhân Dũng, Đặng Thanh Sơn Nguyễn Văn Đƣợc, ”Nghiên cứu đa dạng sinh học giống có múi huyện Gị Quao, tỉnh Kiên Giang”, Tạp chí Khoa học 2004:1, trang 105-114 [6] Hoàng Đăng Hiếu, Chu Thị Thu Hà, Phạm Bích Ngọc , Lâm Đại Nhân, Nguyễn Thị Thúy Hƣờng , Chu Hoàng Hà (2016), “Sử dụng thị ISSR việc đánh giá đa dạng di truyền quần thể Ba Kích Quảng Ninh”, Tạp chí Sinh học (2016), 38(1): 89-95 [7] Hà Văn Huân, “Phân tích quan hệ di truyền quần thể Long Não (Cinnamomum camphora L.Presl) kỹ thuật PCR-RAPD”, Tạp chí khoa học cơng nghệ Lâm Nghiệp số năm 2015 [11] Hồng Kim Ngũ, Phùng Ngọc Lan, Sinh thái rừng: Giáo trình ĐH Lâm nghiệp, Nhà xuất Nông nghiệp, Hà Nội, 2005 [12] Phạm Nhật (2001), giảng đa dạng sinh học, trƣờng đại học Lâm Nghiệp, : 2-83 [13] Nhiều tác giả (2004), thuốc động vật làm thuốc Việt Nam, tập I, nhà xuất khoa học kỹ thuật - Hà Nội, 872-873 [14] Nguyễn Thị Pha, Trần Thị Xuân Mai, Nguyễn Thị Liên, Nguyễn Thị Hồng Nhung, Trần Đình Giỏi, “Đa dạng sinh học số loài Lan Rừng thuộc chi Dendrobium kỹ thuật RAPD”, tạp chí khoa học Trường đại học Cần Thơ Số, 22a(2012) Trang: 186-192 [15] Lê Đình Phƣơng (2013), “Nghiên cứu số đặc điểm sinh vật học kỹ thuật gieo ƣơm loài Giổi ăn (Michelia tonkinensis A.Chev) vƣờng quốc gia Bến Én, tỉnh Thanh Hóa”, Luận văn thạc sỹ khoa học Lâm Nghiệp, trƣờng đại học Lâm Nghiệp [16] Nguyễn Minh Quế (2009), Đánh giá mối quan hệ di truyền số mẫu dẻ nghiên cứu bảo tồn nguồn gen dẻ Trùng Khánh - Cao Bằng kỹ thuật nuôi cấy mô - tế bào thực vật, Luận văn thạc sĩ Sinh học, Trƣờng Đại học Sƣ phạm - Đại học Thái Nguyên [17] Phạm Bình Quyền, Nguyễn Nghĩa Thìn (2002), Đa dạng sinh học, NXB Nông nghiệp Hà Nội, : 9-85 [18] Nguyễn Thị Thơ, Nguyễn Thị Hải Hà, Phùng Văn Phê, Vũ Quang Nam, Đỗ Quang Trung, Hồ Hải Ninh, “Tính đa dạng di truyền lồi Kim tuyến đá vơi (Anoectochilus calcareus Aver.) Quản Bạ-Hà Giang”, Tạp chí Khoa học công nghệ Lâm Nghiệp số 2-2014 [19] Trần Đức Vƣợng, Bùi Ngọc Quang, Lƣơng Văn Tiến, Hoàng Văn Thắng, Trần Hồ Quang (2014), “Đánh giá đa dạng di truyền xuất xứ Lai (Aleurites moluccana (L.) Willd) thị RAPD”, Tạp chí KHLN 3/2014 (3382 - 3389) Tài liệu nƣớc [20] Doyle JJ ADN Doyle JL, 1990 Isolation of plant DNA from fresh tissue Focus 12: No1, p 13 – 15 [21] Elizângela Almeida Rocha, Luciano Vilela Paiva, Humberto Henrique de Carvalho, Claudia Teixeira Guimarães (2010), ”Molecular characterization ADN genetic diversity of potato cultivars using SSR ADN RAPD markers”, Crop Breed Appl Biotechnol (Online) vol.10 no.3 Viỗosa Sept [22] Kamran Ashraf, Altaf Ahmad, Anis Chaudhary, Mohd Mujeeb, Sayeed Ahmad, Mohd Amir, ADN N Mallicka (2014), “Genetic diversity analysis of Zingiber Officinale Roscoe by RAPD collected from subcontinent of India”, Saudi J Biol Sci 21(2): 159–165 [23] Kumar R S., Parthiban K.T., Rao M G (2009), “Molecular characterization of Jatropha genetic resources through inter-simple sequence repeat (ISSR) markers”, Mol Biol Rep,36, 1951-1956 [24] Muhammad Faisal Anwar Malik, Kaleem Tariq, Afsari S Qureshi, Muhammad Rashid Khan, Muhammad Ashraf, Gul Naz & Asad Ali (2017), “Analysis of genetic diversity of soybean germplasm from five different origins using RAPD markers”, Journal: Acta Agriculturae ScADNinavica, Section B — Soil & Plant Science Volume 67, Issue [25] Muthusamy S., Kanagarajan S., Ponnusamy S (2008), “Efficiency of RAPD ADN ISSR markers system in accessing genetic variation of rice bean (Vigna umbellata) LADNraces”, Electronic Journal of Biotechnology, 11(3) [26] Prashanth N., YugADNer A., Lakshmi Bhavani N., 2016, “Genetic Diversity of Popular Cultivated Turmeric Genotypes from Telangana Region Using RAPD Markers”, International Journal of Science ADN Research (IJSR), Volume Issue 10, October 2016 [27] Nguyen Duc Thanh, Henry Nguyen 2000 Use of AFLP for the study of genetic diversity in uplADN rice Adv in Natural Sciences, 1: 107-114 [28] P G Kawar, R M Devarumath ADN Y Nerkar, “Use of RAPD markers for assessment of genetic diversity in sugarcane cultivars”, Indian Journal of Biotechnology Vol January 2009, pp 67-71 [29] Basheer-Salimia R., Shtaya M., M.Awad, J.Abdallah ADN Y.Hamdan (2013), ”Genetic diversity of Palestine lADNraces of faba bean (Vicia faba) based on RAPD markers”, Genetics ADN Molecular Research 12 (3): 3314-3323 [30] Sylwia Okoń, Edyta Paczos-Grzęda, Magdalena Łoboda, Danuta Sugier (2014), “Indentifiacion of genetic diversity among Arnica montana L genoypes RAPD markers”, Acta Sci Pol., Hortorum Cultus, 13(4), 6371 [31] Weir, B.S, 1996 Genetic Data Analysis II: Methods for Discrete Population Genetic Data Sinauer Associates, Inc SunderlADN, MA 376p [32] Xingfeng Zhao, Yongpeng Ma, Weibang Sun, Xiangying Wen, ADN Richard Milne (2012), “High Genetic Diversity ADN Low Differentiation of Michelia coriacea (Magnoliaceae), a Critically Endangered Endemic in Southeast Yunnan, China”, Int J Mol Sci 13, 4396-4411; doi:10.3390/ijms13044396 [33] Yadav J P, SADNeep Kumar, Manila Yadav, Sangeeta, Sanjay Yadav(2014), “Assessment of genetic diversity using RAPD marker among different accessions of Salvadora oleoides of North-West India” May 1, Volume 4; Issue [35] Z Mahmood, Raheel F., Dasti A., Shahzadi S., Athar M., Qayyum M (2009), “Genetic diversity analysis of the species of Gossypium by using RAPD markers”, African Journal of Biotechnology, Vol 8, No 16