Nghiên cứu phân tích đa hình di truyền gen beta lactoglobulin của lợn đen định hóa bằng phương pháp PCR RFLP

TRƯỜNG ĐẠI HỌC LÂM NGHIỆP VIỆT NAM VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC LÂM NGHIỆP o0o KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP NGHIÊN CỨU PHÂN TÍCH ĐA HÌNH DI TRUYỀN GEN (Beta-Lactoglobulin) CỦA LỢN ĐEN ĐỊNH HÓA BẰNG PHƯƠNG PHÁP PCR-RFLP NGÀNH : CÔNG NGHỆ SINH HỌC MÃ SỐ : 7420201 Giáo viên hướng dẫn : TS Hà Bích Hồng PGS TS Bùi Văn Thắng Sinh viên thực : Phạm Huyền Linh Lớp : K61 – CNSH Khóa học : 2016 - 2020 Hà Nội, 2020 LỜI CẢM ƠN Trong suốt trình học tập, nghiên cứu rèn luyện trƣờng Đại học Lâm Nghiệp để vƣợt qua khó khăn, thử thách đạt đƣợc thành công học tập, ngồi cố gắng thân, tơi cịn đƣợc giúp đỡ tận tình thầy cơ, gia đình bạn bè Để hồn thành đề tài khóa luận tốt nghiệp: “ Nghiên cứu phân tích đa hình di truyền gen β-LG (Beta-Lactoglobulin) lợn đen Định Hóa phương pháp PCR-RFLP”; với lịng biết ơn sâu sắc nhất, xin gửi đến quý thầy, cô Viện Công nghệ sinh học Lâm Nghiệp – Trƣờng Đại học Lâm Nghiệp giúp đỡ bảo tận tình cho tơi khơng q trình nghiên cứu khóa luận trƣờng mà cịn q trình học tập trƣờng Đặc biệt cảm ơn giúp đỡ thầy cô môn Công nghệ Gen & Di truyền phân tử Viện Công nghệ sinh học Lâm nghiệp Tôi xin trân thành cảm ơn TS Hà Bích Hồng PGS.TS Bùi Văn Thắng tận tình giúp đỡ, hƣớng dẫn tơi q thực đề tài khóa luận tốt nghiệp trƣờng Với kiến thức kỹ thầy cô truyền dạy khơng giúp tơi có đƣợc tảng kiến thức hồn thành khóa luận mà cịn hành trang q báu cho sau trƣờng Mặc dù có nhiều cố gắng để thực đề tài cách hồn chỉnh nhất, song cịn nhiều hạn chế kiến thức kinh nghiệm nên tránh khỏi thiếu sót Do vậy, tơi mong đƣợc góp ý từ thầy, bạn để khóa luận tốt nghiệp tơi đƣợc hoàn thiện Xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày 10 tháng năm 2020 Sinh viên Phạm Huyền Linh i MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN i DANH MỤC KÝ HIỆU TỪ VIẾT TẮT iv DANH MỤC HÌNH ẢNH v DANH MỤC BẢNG vi ĐẶT VẤN ĐỀ CHƢƠNG TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 1.1 Tổng quan Lợn đen Định Hóa 1.1.1 Nguồn gốc đặc điểm 1.1.2 Tập tính, chế độ ăn sinh sản Lợn đen 1.1.3 Giá trị sử dụng Lợn đen 1.2 Gen β-LG (Beta-Lactoglobulin) 1.2.1 Nguồn gốc cấu tạo chức gen β-LG 1.2.2 Các nghiên cứu gen β-LG giới 11 1.3 Cơ sở khoa học phƣơng pháp PCR-RFLP 13 1.3.1 Khái niệm đa hình gen 13 1.3.2 Kỹ thuật PCR 14 1.3.3 Kỹ thuật RFLP 17 1.3.4 Kỹ thuật PCR-RFLP 18 CHƢƠNG MỤC TIÊU, NỘI DUNG, VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 20 2.1 Mục tiêu cụ thể 20 2.1.1 Mục tiêu tổng quát 20 2.1.2 Mục tiêu cụ thể 20 2.2 Nội dung nghiên cứu 20 2.3 Vật liệu nghiên cứu 20 2.3.1 Dụng cụ nghiên cứu 20 ii 2.3.2 Thiết bị nghiên cứu 21 2.3.3 Hóa chất nghiên cứu 22 2.4 Phƣơng pháp nghiên cứu 23 2.4.1 Phƣơng pháp tách chiết DNA tổng số 23 2.4.2 Phƣơng pháp PCR 24 2.4.3 Phƣơng pháp cắt enzyme giới hạn 25 2.4.4 Phân tích đa hình gen 25 2.4.5 Phƣơng pháp điện di kiểm tra 26 2.4.6 Tinh sản phẩm PCR phƣơng pháp gel 27 2.4.7 Giải trình tự nucleotit 27 2.4.8 Phƣơng pháp phân tích số liệu 27 CHƢƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 28 3.1 Kết tách chiết DNA tổng số từ mẫu tai 28 3.2 Kết tối ƣu nhiệt độ gắn mồi cặp mồi β-LG_F/R 29 3.3 Kết nhân đoạn gen β-LG 31 3.4 Kết giải trình tự nucleotit đoạn gen β-LG Lợn đen Định Hóa 33 3.4.1 So sánh trình tự β-LG với trình tự gen công bố ngân hàng gen quốc tế NCBI 34 3.4.2 Kết xây dựng quan hệ di truyền dựa trình tự đoạn gen β-LG 37 3.5 Kết phân tích đa hình di truyền gen β-LG giống Lợn đen Định Hóa 37 CHƢƠNG KẾT LUẬN – TỒN TẠI – KIẾN NGHỊ 40 4.1 Kết luận 40 4.2 Tồn kiến nghị 40 TÀI LIỆU THAM KHẢO 41 iii DANH MỤC KÝ HIỆU TỪ VIẾT TẮT Các chữ viết tắt ATP bp cs Da DNA (DNA) dNTP EDTA FA F-Primer kb µl mRNA NAD(P)H Nghĩa tiếng Anh Adenosin triphosphat Base pair Dalton Deoxyribonucleic acid Deoxyribonucleotide triphosphate Ethylenediaminetetraacetic acid fatty acids Foward-Primer Kilobase (1000 base) Microlit Messenger RNA Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate NCBI National Center for Biotechnology Information PCR Polymerase Chain Reaction RFLP RNA rRNA RT R-Primer TAE tRNA UV V/p Restriction fragment length polymorphism Ribonucleic acid Ribosomal RNA Room temperature Reverse primer Tris-Acetate-EDTA Transfer RNA Untraviolet v/p iv Nghĩa tiếng Việt Adenosin triphosphat Cặp base Cộng Axit deoxyribonucleic Deoxyribonucleotid triphosphate axit ethylenediamine tetraacetic Axit béo Mồi xuôi 1000 cặp base RNA thông tin Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate Trung tâm Quốc gia Thông tin Công nghệ sinh học Phản ứng chuỗi polymerase Phân tích đa hình trình tự DNA Axit ribonucleic ARN ribosome Nhiệt độ phòng Mồi ngƣợc Tris-Acetate-EDTA ARN vận chuyển Tia cực tím Vịng / phút DANH MỤC HÌNH ẢNH Hình 1.1: Hình ảnh Lợn đen Định Hóa Hình 3.1: Kết điện di DNA tổng số 03 mẫu tai Lợn đen 28 Hình 3.2: Kết tối ƣu nhiệt độ gắn mồi cặp mồi β-LG_F/R 30 Hình 3.3: Kết nhân đoạn gen cá thể Lợn đen Định Hóa 32 Hình 3.4: Trình tự đoạn gen β-LG Lợn đen Định Hóa 34 Hình 3.5: So sánh trình tự sai khác nucleotit gen β-LG Lợn đen Định Hóa với trình tự tƣơng đống ngân hàng gen quốc tế 36 Hình 3.6: Cây quan hệ di truyền Lợn đen Định Hóa số loài ngân hàng gen quốc tế 37 Hình 3.7: Vị trí trình tự nhận biết enzyme giới hạn đoạn gen βLG………………………………………………………………………………37 v DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1: Danh mục thiết bị sử dụng đề tài 21 Bảng 2.2: Danh mục hóa chất sử dụng đề tài 22 Bảng 2.3: Trình tự cặp mồi sử dụng phản ứng PCR 24 Bảng 2.4: Thành phần phản ứng PCR 24 Bảng 2.5: Chu kỳ nhiệt độ phản ứng 25 Bảng 3.1: Kết so sánh trình tự đoạn gen β-LG Lợn đen Định Hóa với trình tự tƣơng đồng ngân hàng gen quốc tế NCBI 35 vi ĐẶT VẤN ĐỀ Lợn lồi vật ni có vai trị quan trọng ngành công nghiệp chăn nuôi Lợn cung cấp nhiều loại sản phẩm phục vụ đời sống ngƣời cung cấp nguồn phụ phẩm để làm phân bón phục vụ cho sản xuất nơng nghiệp Ở Việt Nam có nhiều giống Lợn địa có đặc điểm tốt nhƣ Lợn đen vùng Định Hóa, Thái Nguyên Về giá trị thƣơng phẩm, chất lƣợng thịt Lợn đen tốt, da dày, thịt đỏ, chế biến có mùi thơm dai Vấn đề số lƣợng lợn đen chủng giảm mạnh xuống mức đáng lo ngại, cần có biện pháp để cải thiện khả sinh trƣởng, sinh sản phát triển lồi lợn nhằm mục đích bảo tồn nhƣ phát triển quy mô chăn nuôi để đáp ứng nhu cầu tiêu thụ thị trƣờng Trên giới có nhiều nghiên cứu việc chọn lọc giống vật nuôi thị phân tử Trong có nghiên cứu gene β-LG tính tƣơng quan mật thiết gene với mức độ sinh trƣởng phát triển loài Lợn đen nhƣ loài động vật có vú khác Cụ thể mã hóa loại protein có nhiều sữa động vật β-lactoglobulin có liên quan tới sản lƣợng chất lƣợng sữa Việc UBND tỉnh Thái Nguyên Quyết định 2150/QĐ-UBND ngày 08/10/2013 chủ trƣơng sáng suốt, kịp thời để bảo tồn nguồn gen giống địa bàn tỉnh có nhiệm vụ bảo tồn nguồn gen Lợn đen Định Hóa mà trƣớc hết tiến hành nghiên cứu bảo tồn, xác minh nguồn gốc giống để đăng ký nguồn gen, tạo điều kiện đăng ký thƣơng hiệu Lợn đen Định Hóa sau Ngồi hội để lƣu giữ nguồn nguyên liệu cho nhu cầu sản xuất tiêu dùng tƣơng lai, vật liệu quý cho công tác đào tạo nghiên cứu khoa học lĩnh vực chọn giống, di truyền, miễn dịch… Để góp phần bảo tồn phát triển Lợn đen Định Hoá, thực nghiên cứu mối tƣơng quan đa hình di truyền với tính trạng sinh trƣởng, sinh sản, thực đề tài: “ Nghiên cứu phân tích đa hình di truyền gene β-LG (Beta-Lactoglobulin) lợn đen Định Hóa phương pháp PCR-RFLP” CHƢƠNG TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 1.1 Tổng quan Lợn đen Định Hóa ình 1.1: Hình ảnh Lợn đen Định Hóa 1.1.1 Nguồn gốc đặc điểm Định hóa huyện miền núi thuộc tỉnh Thái Nguyên Việt Nam, sở hữu nguồn gen vật ni địa q giống Lợn đen Định Hóa Do điều kiện địa lý, đồi núi cao hiểm trở, việc thơng thƣơng có nhiều hạn chế, ngƣời dân nuôi Lợn vùng núi huyện Định Hóa, tỉnh Thái Nguyên giao dịch mua bán Lợn quanh huyện Chính vậy, giống Lợn nội Việt Nam đƣợc nhân dân đặt tên giống Lợn đen Định Hóa Lý giống Lợn đen Định Hóa đến giữ đƣợc độ chủng định chúng đƣợc ni vùng núi cao, nơi mà kinh tế phát triển, điều kiện địa lý xa xôi, núi non hiểm trở đặc biệt hệ thống giao thông nên việc pha tạp với giống Lợn nhập ngoại Lợn nội khác vùng đồng hầu nhƣ khơng thể thực đƣợc Vì vậy, giống Lợn đen Định Hóa giữ đƣợc mức độ cao chủng, chƣa bị lai tạp nhiều với giống Lợn nội ngoại khác, song bị cận huyết cao Phân loại khoa học: Giới (regnum) : Animalia Ngành (phylum) : Chordata Lớp (class) : Mammalia Bộ (ordo) : Artiodactyla Họ (familia) : Suidae Chi (genus) : Sus Loài (species) :Sus domesticus + Đặc điểm nhận dạng: Lợn đen Định Hóa đa phần có màu lơng đen tuyền, lƣng võng, bụng sệ, mõm dài, bốn chân trắng Đặc điểm lơng da lợn đen Định Hóa đồng nhất, xƣơng nhỏ, thể trạng rắn chắc, thích nghi với điều kiện địa hình ni thả rơng rừng núi + Sinh học - Sinh thái: Lợn đen Định Hóa có khả sinh sản mức trung bình Lợn có tính chịu đựng kham khổ cao, có khả chịu đựng bệnh tật tốt Thức ăn chủ yếu tận dụng phế phụ phẩm nông nghiệp, phù hợp với phƣơng thức chăn nuôi vùng kinh tế khó khăn Năng suất sản xuất thịt mức trung bình + Giá trị: Lợn có ngoại hình nhỏ, hƣớng sản xuất mỡ nạc, thịt nạc có màu đỏ, thịt mỡ có màu trắng, da dầy giịn, thịt có mùi thơm ngon ình 3.3: Kết nhân đoạn gen cá thể Lợn đen Định Hóa A Nhân đoạn gen β-LG v i giếng t mẫu DNA t M DNA mar er p đến tương ứng v i inh sản phẩm PCR t mẫu tai T5, M: DNA marker 1kb Kết thu đƣợc nhƣ sau: nhân thành công 3/3 mẫu thu thập gen β-LG Tất mẫu nhân đƣợc gen có kích thƣớc gần 872bp, phù hợp với kích thƣớc lý thuyết đoạn gen β-LG Từ hình 3.3 A thấy kết điện di giếng số 1, 3, cho băng DNA rõ nét, nhiên có xuất băng phụ mờ Mồi đƣợc sử dụng đặc hiệu nhiệt độ bắt mồi tối ƣu nồng độ DNA T1, T3 thu đƣợc cao Kích thƣớc đoạn DNA đƣợc khuếch đại từ mẫu tai sử dụng cặp mồi βLG_F/R nhiệt độ gắn mồi 58oC tƣơng đồng với kích thƣớc dự kiến Nhƣ vậy, thành công việc nhân đoạn gen β-LG Lợn đen Định Hóa mẫu tai T1, T3, T5 kỹ thuật PCR sử dụng cặp mồi đặc hiệu β-LG_F/R Do sản phẩm PCR nhân đoạn gen β-LG xuất 32 số băng phụ nên phải tiến hành tinh sản phẩm PCR phƣơng pháp gel trƣớc gửi sản phẩm giải trình tự nucleotide Kết tinh sản phẩm PCR phƣơng pháp gel Sau nhân thành công đoạn gen β-LG mẫu Lợn đen Định Hóa (Hình 3.3 A), dựa vào kết thu đƣợc định lựa chọn mẫu T5 để tinh Sản phẩm PCR nhân đoạn gen β-LG từ mẫu tai T5 đƣợc tinh kít PCR Purification Kit InTRON theo phƣơng pháp trình bày mục 2.4.7 Sau tinh sạch, tiến hành điện di kiểm tra kết sản phẩm sau đƣợc tinh sạch, kết cho thấy băng DNA nhất, sáng rõ nét, khơng bị dứt gãy, khơng cịn xuất băng DNA phụ (Hình 3.3 B) Với kết tinh này, sản phẩm PCR đủ điều kiện chất lƣợng để gửi giải trình tự nucleotide 3.4 Kết giải trình tự nucleotit đoạn gen β-LG Lợn đen Định Hóa Dựa kết nhân đoạn gen β-LG hình 3.4 chúng tơi định sử dụng mẫu T5 đem giải trình tự Bởi giếng số mẫu T5 cho vạch DNA to, sáng rõ nét so với mẫu T1, T3, điều cho thấy chất lƣợng DNA mẫu T5 tốt nhất, đạt tiêu chuẩn để đem giải trình tự Sản phẩm PCR mẫu T5 đƣợc tinh gửi giải trình tự nucleotide Kết giải trình tự đoạn gen β-LG mẫu Lợn đen Định Hóa đƣợc thể hình 3.4 Mục đích việc giải trình tự nucleotide đoạn gen β-LG để xác định đƣợc mối quan hệ di truyền giống Lợn đen Định Hóa với giống Lợn khác đƣợc cơng bố ngân hàng gen tìm đƣợc enzyme giới hạn thích hợp cho nghiên cứu đa hình đoạn gen phƣơng pháp PCR-RFLP 33 ình 3.4: Trình tự đoạn gen β-LG Lợn đen Định Hóa So với kích thƣớc tính tốn lý thuyết đoạn gen β-LG nhân đƣợc có kích thƣớc 872bp phân tích trình tự gen thực tế cơng cụ BioEdit chúng tơi thu đƣợc đoạn gen β-LG với kích thƣớc 872bp Đoạn gen β-LG thực tế có kích thƣớc với tính tốn lý thuyết 872bp Việc giải trình tự gen β-LG Lợn đen Định Hóa đóng góp quan trọng để đánh giá vai trị tầm quan trọng yếu tố liên quan đến biểu gen protein sữa 3.4.1 So sánh trình tự β-LG với trình tự gen cơng bố ngân hàng gen quốc tế NCBI Trình tự đoạn gen β-LG giống Lợn đen Định Hóa đƣợc BLAST ngân hàng gen quốc tế NCBI để xác định trình tự tƣơng đồng Kết cho thấy có 05 trình tự tƣơng đồng với trình tự đoạn gen β-LG mẫu T5 Trong 34 đó, có 03 trình tự có tƣơng đồng thấp Do đó, chúng tơi lựa chọn 02 trình tự tƣơng đồng cao với trình tự đoạn gen β-LG để nghiên cứu so sánh xây dựng quan hệ di truyền Hai trình tự có độ tƣơng đồng cao với đoạn gen β-LG nghiên cứu Lợn tỷ lệ tƣơng đồng đƣợc thể bảng 3.1 ảng 3.1: Kết so sánh trình tự đoạn gen β-LG Lợn đen Định Hóa với trình tự tương đồng ngân hàng gen quốc tế NCBI STT Tên lồi Kí hiệu Tỉ lệ tƣơng đồng Pig DNA sequence FP102268.14 97,24% AY962046.1 97.65% from clone CH242-95K10 on chromosome Sus scrofa beta- lactoglobulin (BLG) gen Dựa vào bảng 3.1 ta nhận thấy trình tự đoạn gen β-LG giống Lợn đen Định Hóa có tỷ lệ tƣơng đồng cao với trình tự đoạn gen β-LG Pig DNA sequence from clone CH242-95K10 on chromosome 1, complete sequence có mã số FP102268.14 NCBI (97,24%), thứ hai trình tự đoạn gen Sus scrofa beta-lactoglobulin (BLG) gen, exons 1, and partial cds với mã số AY962046.1 NCBI (97.65%) Kết khẳng định trình tự nhân đƣợc mẫu DNA T5 gen β-LG Lợn Sự sai khác trình tự nucleotide gen β-LG Lợn đen Định Hóa so với 02 trình tự ngân hàng gen đƣợc thể cụ thể hình 3.5 Nguyên nhân sai khác trình tự nucleotide ảnh hƣởng mơi trƣờng, chúng sống điều kiện khí hậu khác nhau, trình tồn phát triển, trải qua q trình tiến hóa, trình tự thơng tin di truyền sinh vật xuất sai khác hay vài vị trí nucleotide chế độ dinh 35 dƣỡng gây đột biến dẫn đến sai khác nhƣ cịn cá thể loài khác nên dẫn đến chênh lệch tỉ lệ tƣơng đồng nhƣ bảng 3.1 ình 3.5: So sánh trình tự sai khác nucleotit gen β-LG Lợn đen Định Hóa với trình tự tương đống ngân hàng gen quốc tế 36 3.4.2 Kết xây dựng quan hệ di truyền dựa trình tự đoạn gen βLG Dựa kết so sánh trình tự đoạn gen β-LG Lợn đen Định Hóa với 03 trình tự tƣơng đồng ngân hàng gen quốc tế NCBI (bảng 3.1), chúng ình 3.6: Cây quan hệ di truyền Lợn đen Định Hóa số lồi ngân hàng gen quốc tế tiến hành xây dựng quan hệ di truyền 03 trình tự dựa kiểu phân nhóm Neibourjoining NCBI Các mẫu có hệ số tƣơng đồng di truyền cao đƣợc xếp thành nhóm, nhóm có liên hệ với Kết xây dựng quan hệ di truyền đƣợc thể hình 3.6 Từ phân loại dựa số liệu trình tự đoạn gen β-LG_T5 thấy mối quan hệ di truyền giống Lợn đen Định Hóa với hai giống Lợn ngân hàng gen nhƣ sau: Sus scrofa beta-lactoglobulin (BLG) gen, exons 1, and partial cds với mã số AY962046.1 ; Pig DNA sequence from clone CH24295K10 on chromosome 1, complete sequence với mã số ngân hàng gen FP102268.14 Ta thấy đƣợc loài AY962046.1 có độ tƣơng đồng cao loài lợn nhƣng sống vùng điều kiện địa lí khác nên có tác động điều kiện bên ngồi nên gây đột biến số gen Cịn lồi FP102268.14 lợn đƣợc so sánh nhiễm sắc thể số có tƣơng đồng thấp 3.5 Kết phân tích đa hình di truyền gen β-LG giống Lợn đen Định Hóa Sản phẩm PCR nhân đoạn gen β-LG cá thể Lợn đen Định Hóa đƣợc cắt enzyme giới hạn để nghiên cứu đa hình di truyền gen 37 quần thể Dựa vào kết giải trình tự nucleotide trình tự đoạn gen β-LG ngân hàng gen, sử dụng phần mềm Webcutter 2.0, lựa chọn đƣợc số enzyme giới hạn để phục vụ nghiên cứu đa hình đoạn gen βLG vị trí cắt trình tự nhận biết số enzyme giới hạn đƣợc lựa chọn đƣợc thể hình 3.7 ình Vị trí trình tự nhận iết en yme giới hạn đoạn gen β-LG Đối với đoạn gen β-LG nhân đƣợc giống Lợn đen Định Hóa, chúng tơi sử dụng phần mềm Webcuter 2.0 để tìm enzyme giới hạn cắt lần đoạn trình tự, Sau lựa chọn đƣợc 03 enzyme giới hạn SmaI, DraI SacI để nghiên cứu đa hình di truyền gen Enzyme SmaI có vị trí nhận biết nucleotide số 445 với trình tự nhận biết CCCGGG Enzyme DraI cắt đoạn gen vị trí nucleotide số 407 có trình tự nhận biết TTTAAA Enzyme SacI có trình tự nhận biết GAGCTC vị trí nucleotide số 560 cắt đoạn gen β-LG thành hai đoạn trình tự có kích thƣớc 560 bp 312 bp Cả 03 enzyme giới hạn enzyme thƣơng mại phổ biến, 38 nhƣng dựa vào vị trí cắt 03 enzyme nhận thấy SacI enzyme phù hợp để nghiên cứu đa hình chiều dài đoạn cắt giới hạn Hai enzyme SmaI DraI có vị trí cắt đoạn gen, sản phẩm cắt khó phân biệt đƣợc rõ ràng gel agarose Tuy nhiên, lý khách quan nên không đặt đƣợc enzyme giới hạn kịp thời gian hoàn thành nghiên cứu Do đó, kết cắt enzyme giới hạn đoạn gen β-LG đƣợc tiếp tục thực thời gian tới 39 CHƢƠNG KẾT LUẬN – TỒN TẠI – KIẾN NGHỊ 4.1 Kết luận Tách chiết tinh đƣợc 03 mẫu DNA tổng số từ tai giống Lợn đen Định Hóa Nhân thành công đoạn gen β-LG kỹ thuật PCR từ 03 mẫu DNA cá thể Lợn đen Định Hóa Xác định đƣợc trình tự đoạn gen β-LG Lợn đen Định Hóa phục vụ cho đăng ký quyền ngân hàng gen quốc tế để hƣớng tới đăng ký nhãn hiệu đặc sản địa phƣơng Bƣớc đầu xác định đƣợc số enzyme giới hạn phù hợp để nghiên cứu đa hình gen β-LG Lợn đen Định Hoá phƣơng pháp PCR-RFLP khẳng định giống Lợn đen Định Hóa giống Lợn đặc hữu địa phƣơng 4.2 Tồn kiến nghị Tồn Do thời gian kinh phí thực đề tài hạn chế nên đề tài chƣa hoàn thiện đƣợc nội dung phân tích đa hình gen β-LG chƣa phân tích đƣợc số lƣợng lớn cá thể Lợn đen Định Hóa phục vụ xác định tần số alen tần số kiểu gen gen β-LG quần thể Lợn đen Định Hóa Kiến nghị Tiến hành cơng bố trình tự đoạn gen β-LG lên Ngân hàng Gen Quốc tế để phục vụ đăng ký quyền Tiếp tục phân tích đa hình di truyền đoạn gen β-LG sử dụng enzyme cắt giới hạn phù hợp Phân tích đa hình gen β-LG số lƣợng lớn cá thể để phục vụ xác định tần số kiểu gen tần số alen gen β-LG (từ 30 cá thể trở lên) Đánh giá mối tƣơng quan đa hình kiểu gen gen β-LG với tính trạng liên quan phục vụ đánh giá giá trị nguồn gen Lợn đen Định Hoá 40 TÀI LIỆU THAM KHẢO TIẾNG VIỆT Bùi Chí Bửu, Nguyễn Thị Lang (2014), ―Di truyền phân tử‖, NXB Thành phố Hồ Chí Minh Dƣơng Văn Cƣờng, Nguyễn Huy Thuần (2017), ―Giáo trình Nguyên lý kỹ thuật di truyền‖, NXB Khoa Học Kỹ Thuật, Hà Nội Tr 19 Khuất Hữu Thanh (2012), ―Cơ sở di truyền Sinh học phân tử Kỹ thuật Gen‖, NXB Khoa học kỹ thuật, Hà Nội Lê Thị Thuý, Nguyễn Văn Hậu, Eiji Kobayshi, Mitsuzu Minezawwa (1999), ―Phân tích sai khác di truyền giống lợn nuôi Việt nam kỹ thuật di truyền phân tử PCR - RFLP‖, Thông tin khoa học kỹ thuật chăn nuôi Thông tin Viện chăn nuôi, 1999 Lê Viết Ly (2004), ―Cơng tác bảo tồn nguồn gen vật ni Bình diện toàn cầu‖, Hội nghị bảo tồn quĩ gen vật nuôi 1990 – 2004, Hà nội,10/2004, trang 65 Nguyễn Thanh Sơn (2018), ― Phân tích đa hình di truyền gen CSN1S1, βLG Dê Nản Định Hóa kỹ thuật PCR-RFLP‖ TÀI LIỆU TIẾNG ANH A A El-Hanafy, M A El-Saadani, M Eissa, G M Maharem, Z A Khalifa (2010), ―Polymorphism of β-Lactoglobulin gene in barki and damascus and their cross bred goats in relation to milk yield‖, Biotechnology in Animal Husbandry, 26 (1-2)pp.1- 12 A.A.M El Hanafy, M.I Qureshi, J Sabir1, M Mutawakil, M.M.M Ahmed, H El Ashmaoui, H.A.M.I Ramadan, M Abou-Alsoud, M.A Sadek (2015), ―Nucleotide sequencing and DNA polymorphism studies of beta- lactoglobulin gene in native Saudi goat breeds in relation to milk yield‖, Czech Journal of Animal Science 60 (3)pp 132 – 138 Ajay Kumar, Pramod Kumar Rout, Ramadhar Roy (2006), ―Polymorphism of -lacto globulin gene in Indian goats and its effect on milk yield‖ 10 Amr A El Hanafy, Muhammad Qureshi, Jamal Sabir, Mohamed Mutawakil, Mohamed M Ahmed, Hassan El Ashmaoui, Hassan Ramadan, Mohamed Abou-Alsoud, Mahmoud Abdel Sadek (2014), ―DNA Polymorphism Studies of β-Lactoglobulin Gene in Saudi Goats‖, International Journal of Agricultural and Biosystems Engineering (12)pp 1390 – 1393 11 Aschaffenburg R, Drewry J, 1955 Occurrence of different -lactoglobulin in cow’s milk Nature 176:218–210 12 Aymard P, Durand D, Nicolaï T The effect of temperature and ionic strength on the dimerisation of β-lactoglobulin Int J Biol Macromol 1996;19:213–221 13 Brownlow S, Cabral JHM, Cooper R, Flower DR, Yewdall SJ, Polikarpov I, North ACT, Sawyer L Bovine beta-lactoglobulin at 1.8 angstrom resolution—still an enigmatic lipocalin Structure 1997;5(4):481–495 14 Bu G, Luo Y, Lu J and Zhang Y (2010) Reduced antigenicity of blactoglobulin by conjugation with glucose through con-trolled Maillard reaction conditions Food Agr Immuno l21:143-156 15 Creamer LK, Parry DAD, Malcolm GN Secondary structure of bovine beta-lactoglobulin B Arch Biochem Biophys 1983;227(1):98–105 16 Ehn BM, Allmere T, Telemo E, Bengtsson U and Ekstrand B (2005) Modification of IgE binding to b-lactoglobulin by fermentation and proteolysis of cow’s milk J Agr Food Chem 53:3743-3748 17 Erhardt G, 1989 Evidence for a third allele at the beta lactoglobulin locus of sheep milk and its occurrence in different breeds Anim Genet 20: 197–204 18 Gouda, E.M., Galal, M.K., Wasfy, M.A and Abdelaziz, S.A (2011) Phenotypes, genotypes and allele frequencies of Beta-Lactoglobulin in Egyptian cattle and buffalo J Agril Sci., (4) : 203-210 19 Godovac -Zimmermann J, Krause I, Baranyi M, Fischer-Frühholz S, Juszczak J, Erhardt G, Buchberger J, Klostermeyer H Isolation and rapid sequence characterization of two novel bovine beta-lactoglobulins I and J J Protein Chem 1996;15(8):743–750 20 Grosclaude, F (1988) Le polymorphisme génétique des principales lactoprotéines bovines.Relations avec la quantité, lacomposition et les aptitudes fromagères du lait INRA Prod Anim., (1) : 5-17 21 Henrik Berg Rasmussen (2012), ―Restriction Fragment Length Polymorphism Analysis of PCR-Amplified Fragments (PCR-RFLP) and Gel Electrophoresis – Valuable Tool for Genotyping and Genetic Fingerprinting‖, Institute of Biological Psychiatry, Mental Health Centre Sct Hans, Copenhagen University Hospitals, Roskilde, Denmark 22 Hattori M, Miyakawa S, Ohama Y, Kawamura H, Yoshida T, To-o K, Kuriki T and Takahashi K (2004) Reduced im-munogenicity of blactoglobulin by conjugation with acidic oligosaccharides J Agr Food Chem 52:4546-4553 23 Karimi, K., Nasiri, M.T.B., Fayyazi, J., Mirzadeh, K.H., Roushanfekr, H (2009) Allele and genotype frequencies of b-Lactoglobulin gene in Iranian Najdi cattle and buffalo populations using PCR-RFLP African J Biotechnol., (15) : 3654-3657 24 Kh Kahilo, S EL-Shazly, A El-Khadrawy and I Fattouh (2014), ―Genetic Polymorphism in β-lactoglobulin Gene of Some Goat Breeds in Egypt and its Influence on Milk Yield‖, Life Science Journal 11 (10)pp 232 – 238 25 Lum, L.S., Dovc, P and Medrano, J.F (1997) Polymorphisms of Bovine -Lactoglobulin promoter and differences in the binding affinity of Activator Protein-2 Transcription Factor J Dairy Sci., 80 : 1389-1397 26 M H Yahyaoui, R N Pena, A Sa´nchez, and J M Folch (2000), ―Rapid communication: lactoglobulin Polymorphism in the goat β- proximal promoter region‖, Journal of Animal Science 78 1100 – 1101 27 M Ballester, A Sa nchez and J M Folch (2005), ―Assignment of the blactoglobulin (BLG ) gene to porcine chromosome 1‖, International Society for Animal Genetics, Animal Genetics, 36, 352–365 28 Mohamed Habib Yahyaoui (2003), ―Genetic polymorphism in goat Study of the kappa casein, beta lactoglobulin, and stearoyl coenzyme A desaturase genes‖, Universidad Autónoma de Barcelona, Facultad de Veterinaria 29 Moili B, Pilla F, Tripaldi C, 1998 Detection of milk protein genetic polymorphism in order to improve dairy traits in sheep and goats: A review Small Rum Res 27: 185–195 30 Namita Garg, S.K Singh, P.K Rout and Ajoy Mandal (2009), ―Genetic polymorphism of milk proteins in barbari goats‖, Tropical and Subtropical Agroecosystems 11 181 – 183 31 Papiz MZ, Sawyer L, Eliopoulos EE, North ACT, Findlay JBC, Sivaprasadarao R, Jones TA, Newcomer ME, Kraulis PJ The structure of beta-lactoglobulin and its similarity to plasma retinol-binding protein Nature 1986;324(6095):383–385 32 Puyol P, Perez MD, Mata L, Ena JM, Calvo M Effect of retinol and fatty acid binding by bovine beta-lactoglobulin on its resistance to trypsin digestion Int Dairy J 1993;3(7):589–597 33 Puyol P, Dolores Perez M, Sanchez L, Ena JM, Calvo M Uptake and passage of beta-lactoglobulin, palmitic acid and retinol across the Caco-2 monolayer BBA Biomembranes 1995;1236(1):149–154 34 Qin BY, Bewley MC, Creamer LK, Baker HM, Baker EN, Jameson GB Structural basis of the Tanford transition of bovine beta- lactoglobulin Biochemistry 1998;37(40):14014–14023 35 Raziye Işik, Güldehen Bilgen, Nedim Koşum, Çağrı Kandemir, Turgay Taşkin (5-2017), ―Polymorphism in Exon of β- Lactoglobulin (β-LG) Gene and Its Association with Milk Yield in Saanen Goats‖, Journal of Tekirdag Agricultural Faculty 36 Remus-Alexandru, V.-B, Georgescu, S.E., Manea, M.A., Dinischiotu, A and Costache, M (2010) Analysis of Beta-Lactoglobulin and KappaCasein genotypes in cattle 37 Ren, D.-X., Miao, S.-Y., Chen, Y.-L., Zou, C.-X., Liang, X.-W and Liu, J.X (2011) Genotyping of the ê-Casein and â-Lactoglobulin genes in Chinese Holstein, Jersey and water buffalo by PCR-RFLP J Genet., 90 (1) : 1-5 38 Saleha Y M Alakilli1, Karima F Mahrous, Lamiaa M Salem1 and Ekram S Ahmed (2012), ―Genetic polymorphism of five genes associated with growth traits in goat‖, African Journal of Biotechnology 11 (82)pp 14738 – 14748 39 Sawyer L, Kontopidis G The core lipocalin, bovine beta- lactoglobulin BBA-Protein Struct M 2000;1482(1–2):136–148 40 Sitkowska, B., Neja, W., Wisniewska, E., Mroczkowski, S and Sawa, A (2009) Effect of the polymorphic composite forms of BetaLactoglobulin on the milk yield and chemical composition in maximum lactation J Cent Eur Agric., 10 (3) : 251-254 41 Vitomir Vidovic, Dragomir Lukac1, Zolt Nemes2, Snezana Trivunovic1 βlactoglobulin genetic variants in Serbian Holstein-Friesian dairy cattle and their association with yield and quality of milk Animal Science Papers and Reports vol 32 (2014) no 2, 179-182 Tài liệu Internet: 42 https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4121524/?fbclid=IwAR37w QQwAFep5cdyUcPPYjRqHr8Kh_rzs8aQtfXNiC1JefCWbOSozxdTLE 43 https://www.researchgate.net/figure/Primary-structure-of-b-LG-bLactoglobulin-comprises-162-AA-including-5-Cys residues_fig1_6567933?fbclid=IwAR1F5QYVEPXSkVqpnPV0JdQz4j WihmO5RITfBfthim5AVNdtAx3ZYzn3ddE ... (Beta- Lactoglobulin) lợn đen Định Hóa phương pháp PCR- RFLP? ?? CHƢƠNG TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 1.1 Tổng quan Lợn đen Định Hóa ình 1.1: Hình ảnh Lợn đen Định Hóa 1.1.1 Nguồn gốc đặc điểm Định hóa huyện miền... triển Lợn đen Định Hoá, thực nghiên cứu mối tƣơng quan đa hình di truyền với tính trạng sinh trƣởng, sinh sản, chúng tơi thực đề tài: “ Nghiên cứu phân tích đa hình di truyền gene β-LG (Beta- Lactoglobulin) ... đình bạn bè Để hồn thành đề tài khóa luận tốt nghiệp: “ Nghiên cứu phân tích đa hình di truyền gen β-LG (Beta- Lactoglobulin) lợn đen Định Hóa phương pháp PCR- RFLP? ??; với lịng biết ơn sâu sắc nhất,