Xây dựng hệ thống cảm ứng rễ tơ trên cây dưa chuột (cucumis sativus l ) phục vụ nghiên cứu biểu hiện gen (khóa luận tốt nghiệp)

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐỀ TÀI: “XÂY DỰNG HỆ THỐNG CẢM ỨNG RỄ TƠ TRÊN CÂY DƯA CHUỘT (CUCUMIS SATIVUS L.) PHỤC VỤ NGHIÊN CỨU BIỂU HIỆN GEN” Hà Nội - 2021 HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM KHOA CƠNG NGHỆ SINH HỌC KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐỀ TÀI: “XÂY DỰNG HỆ THỐNG CẢM ỨNG RỄ TƠ TRÊN CÂY DƯA CHUỘT (CUCUMIS SATIVUS L.) PHỤC VỤ NGHIÊN CỨU BIỂU HIỆN GEN” Người thực hiện: Phương Thị Lựu Ngành: Công nghệ sinh học Người hướng dẫn: TS Đỗ Tiến Phát TS Bùi Thị Thu Hương Hà Nội - 2021 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan số liệu kết nghiên cứu trung thực chưa cơng bố Nội dung lý thuyết có khóa luận tơi có tham khảo số tài liệu trích dẫn mục tài liệu tham khảo Mọi giúp đỡ cho việc thực khóa luận cám ơn Tơi xin hồn tồn chịu trách nhiệm với lời cam đoan trên! Hà nội, ngày 18 tháng năm 2021 Sinh viên thực Phương Thị Lựu i LỜI CẢM ƠN Để báo cáo khóa luận tốt nghiệp hồn thành, xin gửi lời cảm ơn chân thành sâu sắc đến TS Đỗ Tiến Phát TS Bùi Thị Thu Hương theo sát hướng dẫn giúp đỡ tơi tận tình suốt thời gian tơi thực khóa luận tốt nghiệp Tơi xin cảm ơn ban Lãnh đạo phịng Cơng nghệ tế bào Thực vật - Viện Công nghệ Sinh học PGS.TS Chu Hoàng Hà TS Đỗ Tiến Phát tạo điều kiện thuận lợi cho thực đề tài Xin gửi lời cảm ơn đến thầy cô khoa Công nghệ sinh học Học viện Nông nghiệp Việt Nam truyền đạt cho kiến thức định hướng thật quý báu ngành học Trong khoảng thời gian thực khóa luận tốt nghiệp, nhận hướng dẫn hỗ trợ tận tình ThS Hồng Thị Huyền Trang với tất cô, anh chị cán phịng Cơng nghệ tế bào Thực vật, Viện Công nghệ Sinh học, Viện Hàn Lâm Khoa Học Công nghệ Việt Nam Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành ấm áp đến tất anh chị cán phịng giúp đỡ tơi Đặc biệt lời cảm ơn cuối muốn giành cho gia đình, bạn bè, người thân u ln bên cạnh ủng hộ, giúp đỡ tất phương diện Tôi xin trân trọng cảm ơn! Hà nội, ngày 18 tháng năm 2021 Sinh viên thực Phương Thị Lựu ii MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN i LỜI CẢM ƠN ii MỤC LỤC iii DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT v DANH MỤC CÁC BẢNG vi DANH MỤC HÌNH vii Phần 1: MỞ ĐẦU 1.1 Tính cấp thiết đề tài 1.2 Mục đích yêu cầu đề tài 1.2.1 Mục đích 1.2.2 Yêu cầu Phần 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Giới thiệu dưa chuột 2.1.1 Giới thiệu chung 2.2 Giới thiệu chủng vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes 2.3 Hệ thống cảm ứng rễ tơ 10 2.4 Rễ tơ ứng dụng nuôi cấy rễ tơ 11 Phần 3: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 14 3.1 Vật liệu nghiên cứu 14 3.1.1 Nguyên liệu biến nạp 14 3.1.2 Hóa chất dụng cụ 14 3.2 Phương pháp nghiên cứu 15 3.2.1 Chuẩn bị nguyên liệu biến nạp 15 3.2.2 Chuẩn bị dung dịch huyền phù vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes 15 3.2.3 Lây nhiễm khuẩn 16 3.2.4 Kiểm tra biểu GUS thông qua dịch nhuộm 17 3.2.5 Kiểm tra gen chuyển phương pháp sinh học phân tử 17 iii 3.2.6 Các thí nghiệm nghiên cứu 19 3.2.7 Phương pháp xử lý số liệu 20 Phần 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 21 4.1 Ảnh hưởng nồng độ chất chọn lọc PPT đến mẫu biến nạp 21 4.2.1 Ảnh hưởng mật độ vi khuẩn đến hiệu chuyển gen 24 4.3 Ảnh hưởng thời gian đồng nuôi cấy đến hiệu chuyển gen 26 4.4 Kiểm tra hiệu quy trình với điều kiện tối ưu 28 Phần 5: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 31 5.1 Kết luận 31 5.2 Kiến nghị 31 TÀI LIỆU THAM KHẢO 32 PHỤ LỤC 36 iv DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT ADN Acid Deoxyribonucleic AS Acetosyringone CTAB Cetyl trimethyl ammonium bromide EDTA Ethylene Diamine Triacetic Acid gus β-glucuronidase MS Môi trường nuôi cấy theo Murashige Skoog (1962) NaCl Natri Clorua OD Optical density ORI Origin of replication PCR Polymerase Chain Reaction PPT Phosphinothricin pRi plasmid root induction pTi plasmid tumor induction ss T-DNA single-stranded DNA T-DNA Transfer DNA TL-DNA Transfer DNA Left border repeat sequences TR-DNA Transfer DNA Right border repeat sequences Tris HCL Tris hydrochloride Vir Virulence Region X – Gluc 5-bromo-4-chloro-3-indolyl glucoronide YEP Yeast Extract Peptone v DANH MỤC CÁC BẢNG STT Tên bảng Trang Bảng 4.1 Ảnh hưởng nồng độ chất chọn lọc PPT đến hiệu biến nạp 22 Bảng 4.2 Ảnh hưởng mật độ vi khuẩn đến hiệu biến nạp 25 Bảng 4.3 Ảnh hưởng thời gian đồng nuôi cấy đến hiệu chuyển gen 27 Bảng 4.4 Kiểm tra hiệu quy trình với điều kiện tối ưu 29 vi DANH MỤC HÌNH STT Tên hình Trang Hình 2.1 Giống dưa chuột Nhật Bản Hình 2.2 Hình thái giải phẫu dưa chuột Hình 2.3 Ri Plasmid vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes Hình 2.4 Cơ chế chuyển T-DNA Ri-plasmid sang genome thực vật 10 Hình 3.1 Sơ đồ khái quát quy trình biến nạp vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes mẫu mầm 16 Hình 3.2 Sơ đồ chu kỳ nhiệt phản ứng chạy PCR 19 Hình 4.1 Mẫu rễ tơ ngày tuổi cấy mơi trường có chứa nồng độ chất chọn lọc PPT 22 Hình 4.2 Mẫu rễ tơ sau chọn lọc bắt màu với dung dịch nhuộm màu X – Gluc 23 Hình 4.3 Mẫu rễ tơ 15 ngày tuổi sau lây nhiễm 26 Hình 4.4 Mẫu rễ tơ 20 ngày tuổi sau lây nhiễm 28 Hình 4.5 Kết điện di sản phẩm PCR mẫu rễ tơ 29 Hình 4.6 Sơ đồ quy trình chuyển gen tối ưu 30 vii Phần 1: MỞ ĐẦU 1.1 Tính cấp thiết đề tài Dưa chuột (Cucumis sativus L) rau ăn thuộc họ bầu bí, có nguồn gốc từ Nam Á Chúng biết đến Ấn Độ từ 3000 năm trước mang dọc theo phía Tây châu Á, châu Phi miền Nam châu Âu Thế kỉ 16, dưa chuột trồng lần Trung Quốc Cho đến dưa chuột biết đến rộng rãi loại trồng nhiều giới hầu hết tất quốc gia giới (Liu L & cs, 2011; Zhao & cs, 2019) Cây dưa chuột trồng quanh năm dưa chuột thuộc nhóm ưa nhiệt, thích nghi tốt với nhiều loại đất trồng khác Tuy nhiên, dưa chuột nhạy cảm với độ ẩm, độ mặn đất (Liu & cs, 2013; Ma & cs, 2018) Độ ẩm cao tạo điều kiện cho loại nấm gây bệnh phát triển mạnh điều dẫn đến suất, chất lượng dưa chuột bị giảm đáng kể (Li & cs, 2017; Liu & cs, 2017) Để cải thiện tình trạng ngồi, cải thiện điều kiện dinh dưỡng, giảm tác động yếu tố ngoại cảnh việc ứng dụng cơng nghệ sinh học nghiên cứu chọn tạo giống trồng nhà khoa học quan tâm thời gian gần Việc chỉnh sửa gen dưa chuột nhằm tạo giống ưu việt có khả tăng cường tính kháng chống chịu với sâu bệnh hại hay điều kiện bất thường môi trường Hiện nay, kỹ thuật chuyển gen thông qua vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes hướng nghiên cứu đầy tiềm với nhiều triển vọng lớn việc tạo vật liệu cho nghiên cứu chọn tạo giống trồng Tuy nhiên việc, để chuyển gen thành công, bên cạnh việc xây quy trình chuyển gen tối ưu cần phải thiết kế kiểm tra hoạt động cấu trúc chuyển gen trước tiến hành công tác biến nạp Nhiều nghiên cứu nước giới báo cáo kết chuyển gen thông qua vi khuẩn A rhizogenes nhiều đối tượng thực vật như: Để kiểm tra kết biểu gen mẫu rễ biến nạp, mẫu rễ sống sót mơi trường có chứa nồng độ chất chọn lọc nhuộm với dung dịch X – Gluc 0,1% Qua kết hình ảnh ta thấy đa phần mẫu rễ sống mơi trường có chất chọn lọc có biểu sau nhuộm mức độ biểu khác Ở nồng độ chất chọn lọc 3mg/L, tỷ lệ mẫu sống sót tỷ lệ rễ mang gen thị gus cận tiệm Kết thu tương tự nồng độ PPT tăng lên 5mg/L Như vậy, lựa chọn nồng độ 3mg/L cho việc chọn lọc dòng rễ tơ chuyển gen thí nghiệm 4.2 Tối ưu yếu tố ảnh hưởng đến hiệu chuyển gen thông qua vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes Hiệu chuyển gen phụ thuộc vào nhiều yếu tố kiểu gen, chủng vi khuẩn, bước trình chuyển gen Trong nghiên cứu này, tối ưu yếu tố mật độ vi khuẩn thời gian đồng ni cấy nhằm tìm điều kiện thích hợp cho q trình cảm ứng tạo rễ tơ dưa chuột thông qua vi khuẩn A rhizogenes 4.2.1 Ảnh hưởng mật độ vi khuẩn đến hiệu chuyển gen Mật độ vi khuẩn sử dụng cho trình biến nạp ảnh hưởng trực tiếp đến phát sinh rễ mẫu biến nạp hiệu chuyển gen dưa chuột Mẫu mảnh mầm tiến hành lây nhiễm dung dịch huyền phù khuẩn với dải nồng độ OD bước sóng 650nm 0,2; 0,4; 0,6; 0,8 30 phút Tiến hành theo dõi phát sinh rễ mẫu thời điểm 10 ngày, 15 ngày, 20 ngày sau lây nhiễm Kết (bảng 4.2), sau 10 ngày lây nhiễm nồng độ OD 650 = 0,2 cho tỷ lệ mẫu phát sinh rễ cao với 21,11%, nồng độ OD 650 = 0,6 OD 650 = 0,8 tỷ lệ mẫu phát sinh rễ cho giống 14,44%, OD 650 = 0,4 đạt 15,55% Theo dõi sau 15 ngày lây nhiễm, nồng độ OD 650 = 0,2, tỷ lệ mẫu phát sinh rễ đạt cao với 84,44%, OD 650 = 0,8, cho thấy tỷ lệ mẫu phát sinh rễ thấp (75,56%) Tại thời điểm 20 ngày sau lây nhiễm, tỷ lệ mẫu phát sinh rễ nồng độ OD có thay đổi Tại nồng 24 độ OD 650 = 0,4 cho thấy tỷ lệ mẫu phát sinh rễ tăng nhanh đạt 98,89%, OD 650 = 0,8 92,22%, nồng độ OD 650 = 0,2 dừng lại 91,11% giống với nồng độ OD 650 = 0,6 Từ kết trên, thấy mật độ vi khuẩn sử dụng cho biến nạp tác động đến tỷ lệ mẫu cảm ứng tạo rễ, khả cảm ứng tạo rễ không tỷ lệ thuận theo mật độ vi khuẩn Điều lý giải khả tương tác vi khuẩn với tế bào thực vật phụ thuộc vào mật độ vi khuẩn, mật độ cao dẫn tới việc ức chế trình lây nhiễm giảm hiệu chuyển gen khả cảm ứng tạo rễ tơ Các mẫu rễ phát sinh sau 20 ngày lây nhiễm kiểm tra biểu gen gus thông qua dịch nhuộm X - Gluc 0,1% Kết (bảng 4.2.) cho thấy nồng độ OD 650 = 0,4 tỷ lệ biểu gus đạt 63,32% cao nhất, nồng độ OD 650 = 0,2 đạt 58,95% OD 650 = 0,6 đạt 50,70%; OD 650 = 0,8 đạt 50,71% Do mật độ vi khuẩn sử dụng cho biến nạp phù hợp cho trình cảm ứng tạo rễ tơ đối tượng dưa chuột OD 650 = 0,4 Bảng 4.2 Ảnh hưởng mật độ vi khuẩn đến hiệu biến nạp Tỷ lệ mẫu phát sinh rễ (%) Tỷ lệ biểu OD 10 ngày 15 ngày 20 ngày gus (%) 0,2 21,11 ± 4,15 84,44 ± 4,15 91,11 ± 3,14 58,95 ± 1,05 0,4 15,55 ± 1,57 82,22 ± 4,15 98,89 ±1,57 63,32 ± 0,97 0,6 14,44 ± 4,15 80,00 ± 4,71 91,11 ± 1,57 50,70 ± 1,81 0,8 14,44 ± 4,15 75,56 ± 5,67 92,22 ± 3,14 50,71 ± 3,31 25 a b c d Hình 4.3 Mẫu rễ tơ 15 ngày tuổi sau lây nhiễm a - mẫu rễ tơ đối chứng; b - mẫu rễ tơ sau 15 ngày lây nhiễm nồng độ OD 650 = 0,2; c - mẫu rễ tơ sau 15 ngày lây nhiễm nồng độ OD 650 = 0,4; d - mẫu rễ tơ sau 15 ngày lây nhiễm nồng độ OD 650 = 0,8 4.3 Ảnh hưởng thời gian đồng nuôi cấy đến hiệu chuyển gen Một yếu tố khác tác động trực tiếp đến phát sinh rễ mẫu mức độ biểu gen thời gian đồng ni cấy Sau xác định mật độ vi khuẩn thích hợp OD 650 = 0,4, tiến hành thí nghiệm tối ưu thời gian đồng ni cấy với chủng khuẩn K599 mang vector pZY102, sử dụng nồng độ biến nạp OD 650 = 0.4 Tiến hành thí nghiệm lây nhiễm khuẩn trực tiếp 30 phút dung dịch huyền phù vi khuẩn Nuôi mẫu điều kiện tối 24 250C từ - ngày tiến hành đồng nuôi cấy vi khuẩn khoảng thời gian ngày, ngày ngày 26 Bảng 4.3 Ảnh hưởng thời gian đồng nuôi cấy đến hiệu chuyển gen Tỷ lệ mẫu phát sinh rễ (%) Thời gian đồng nuôi cấy 10 ngày 15 ngày 20 ngày Tỷ lệ biểu gus (%) ngày 6,67 ± 2,72 70,00 ± 2,72 94,44 ± 4,15 55,60 ± 3,35 ngày 17,78 ± 4,15 81,11 ± 1,57 98,89 ± 1,57 65,18 ± 2,56 ngày 2,22 ± 1,57 56,67 ± 5,44 86,67 ± 2,72 64,17 ± 2,27 Bảng 4.3 cho thấy, với thời gian đồng nuôi cấy ngày sau 10 ngày đồng nuôi cấy, tỷ lệ mẫu phát sinh rễ đạt 17,78% cao nhất, thời gian đồng nuôi cấy ngày đạt 6,67% ngày 2,22% Sau ngày tiếp theo, phát sinh mẫu rễ khoảng thời gian đồng ni cấy có chênh lệch lớn Cụ thể, ngày đồng nuôi cấy, tỷ lệ mẫu phát sinh rễ cao đạt 81,11% ngày đồng nuôi cấy đạt 56,67% Sau 20 ngày lây nhiễm thu kết tương tự Tỷ lệ mẫu phát sinh rễ thời gian đồng nuôi cấy ngày đạt cao (98.89%) tỷ lệ mẫu phát sinh rễ thấp công thức ngày đồng ni cấy (86.67%) Tiếp đó, mẫu rễ phát sinh tiến hành kiểm tra biểu gen gus thông qua dịch nhuộm X - Gluc 0,1% Kết cho thấy, tỷ lệ biểu gus thời gian đồng nuôi cấy ngày đạt cao với 65,18% Trong thời gian đồng ni cấy cịn lại, ngày đồng ni cấy tỷ lệ biểu gus đạt 55,60% ngày đồng nuôi cấy đạt 64,17% (kết tỷ lệ thuận với tỷ lệ mẫu phát sinh rễ) Theo (Phan Thủy nguyễn cs, 2020) khảo sát số nhân tố ảnh hưởng hiệu chuyển gen thơng qua vi khuẩn A tumefaciens giống dưa leo nếp ta, nhân tố thời gian đồng ni cấy vi khuẩn thời điểm ngày tỷ lệ biểu gus đạt mức cao chiếm 60,00% Trong nghiên cứu cho thấy đối tượng giống dưa chuột Choka f1, việc chuyển gen nhờ vi khuẩn A rhizogenes thời gian đồng nuôi cấy ngày 27 cho tỷ lệ biểu gus cao đạt 65,18% tỷ lệ mẫu phát sinh rễ đạt 98.89% sau 20 ngày lây nhiễm Một nghiên cứu khác khẳng định với thời gian đồng ni cấy ngày tỷ lệ mẫu phát sinh rễ tơ đạt tới 90% nhờ chủng khuẩn A rhizogenes ATCC15834 (Shi HP & cs, 2006) Từ kết ta khẳng định thời gian đồng nuôi cấy ngày đảm bảo khuẩn xâm nhiễm đủ mẫu rễ sinh trưởng tốt cho hiệu chuyển gen cao a b c d Hình 4.4 Mẫu rễ tơ 20 ngày tuổi sau lây nhiễm a - mẫu rễ tơ đối chứng; b - mẫu rễ tơ sau 20 ngày tuổi với thời gian đồng nuôi cấy ngày; c - mẫu rễ tơ sau 20 ngày tuổi với thời gian đồng nuôi cấy ngày; d - mẫu rễ tơ sau 20 ngày tuổi với thời gian đồng nuôi cấy ngày 4.4 Kiểm tra hiệu quy trình với điều kiện tối ưu Sau tối ưu quy trình chuyển gen chúng tơi tiến hành thí nghiệm kiểm tra biểu gen gus với cấu trúc K599 - pZY102 điều kiện OD 650 = 0,4, thời gian đồng nuôi cấy ngày Mẫu rễ tơ sau 20 ngày biến nạp thu nhuộm với dung dịch X - Gluc 0,1% Kết ta có (bảng 4.4) đây: 28 Bảng 4.4 Kiểm tra hiệu quy trình với điều kiện tối ưu Lơ thí Tỷ lệ mẫu phát sinh rễ (%) Tỷ lệ mẫu biểu nghiệm 10 ngày 15 ngày 20 ngày gus (%) 16,67 83,33 100 62,50 16,67 86,67 100 63,45 13,33 76,67 96,67 65,39 Kết cho thấy tỷ lệ biểu gus sau lần lặp lại với điều kiện tối ưu tỷ lệ mẫu phát sinh rễ cao đạt 96,67 – 100% Cùng với tỷ lệ biểu gen gus chiếm 62,5 – 65,39% Các dòng rễ tái sinh thu mẫu tiến hành tách DNA kiểm tra có mặt gen gus Kết điện di sản phẩm PCR với cặp mồi đặc hiệu cho thấy xuất băng vạch đặc trưng gen gus intron vị trí khoảng 700bp dòng rễ chuyển gen mẫu đối chứng dương, rễ đối chứng âm khơng có xuất băng vạch (Hình 4) Như nói cấu trúc pZY102/gus intron chuyển thành cơng vào rễ tơ dưa chuột Hình 4.5 Kết điện di sản phẩm PCR mẫu rễ tơ M - thang chuẩn 1.000bp, giếng - đối chứng âm, giếng - đối chứng dương, giếng - dòng rễ tơ 1, giếng - 17 dòng rễ tơ chuyển gen 29  Quy trình chuyển gen tối ưu Hình 4.6 Sơ đồ quy trình chuyển gen tối ưu 30 Phần 5: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 5.1 Kết luận Hệ thống cảm ứng tạo rễ tơ in vitro thông qua vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes giống dưa chuột Choka F1 xây dựng với hiệu suất tạo rễ tơ đạt hiệu cao Đã xác định ngưỡng nồng độ chất chọn lọc PPT thích hợp đối tượng dưa chuột 3mg/L Mật độ vi khuẩn thích hợp sử dụng để biến nạp đôi tượng dưa chuột OD 650 = 0,4, tỷ lệ mẫu phát sinh rễ cao sau 20 ngày 98,89% Thời gian đồng ni cấy thích hợp ngày với tỷ lệ mẫu phát sinh rễ cao sau 20 ngày 98,89% Sự tồn biểu gen chuyển gus khẳng định thông qua phản ứng PCR với mồi đặc hiệu nhuộm GUS Tỷ lệ biểu gus chiếm 62,5 -65,39% 5.2 Kiến nghị Tiếp tục thực quy trình cảm ứng tạo rễ tơ dưa chuột ứng dụng nghiên cứu kiểm tra hoạt động cấu trúc chuyển gen, biểu gen nghiên cứu chỉnh sửa hệ gen dưa chuột đồng thời mở hướng ứng dụng với loài trồng khác 31 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt Dương Tấn Nhựt , Hoàng Thanh Tùng, Trịnh Thị Hương, Nguyễn Hồng Hoàng , Vũ Thị Hiền, Nguyễn Bá Nam, Nguyễn Phúc Huy, Vũ Quốc Luận, Phạm Bích Ngọc, Chu Hồng Hà, Trần Thị Thùy An, Trần Đình Phương, Nguyễn Thị Thu Hương & Trần Công Luận (2015) Đánh giá tác dụng tăng lực saponin rễ tơ chuyển gen sâm ngọc linh (panax vietnamensis et grushv.) Tạp chí cơng nghệ sinh học: 13(1): 75-82 Hoàng Thị Huyền Trang, Hoàng Khánh Linh, Nguyễn Thị Linh, Trịnh Đình Duy, Lê Thị Như Thảo, Phạm Bích Ngọc, Phạm Bích Ngọc & Đỗ Tiến Phát (2021) Nghiên cứu khả tái sinh chuyển gen thị vào giống dưa chuột Choka F1 Tạp chí Khoa học Cơng nghệ - Đại học Thái Nguyên: 226(1): 83-91 Nguyễn Hồng Nhung, Lê Quang Huy, Lê Như Thảo, Phạm Bích Ngọc, Chu Hồng Hà & Đỗ Tiến Phát Thiết lập hệ thống cảm ứng rễ tơ giống đậu tương Việt Nam sử dụng đánh giá hoạt động cấu trúc chuyển gen Hội nghị Cơng nghệ Sinh học tồn quốc 2019 Phan Thủy Quyên, Nguyễn Thị Thanh Thảo, Phan Lê Trâm Anh, Huỳnh Nguyễn Minh Nghĩa, Dương Hoa Xô & Nguyễn Xuân Dũng (2020) Tối ưu yếu tố ảnh hưởng đến chuyển gen vào dưa leo (cucumis sativus L.) qua trung gian Agrobacterium tumefaciens Hội nghị Công nghệ Sinh học toàn quốc: 29-34 Tài liệu tiếng Anh Bernard R Glick, Jack J Pasternak & Cheryl L Panten (2010) Molecular biotechnology: Principles and applications of recombinant DNA New York: ASM press Noemi Gutierrez-Valdes, Suvi T Häkkinen, Camille Lemasson, Marina Guillet, Kirsi-Marja Oksman-Caldentey, Anneli Ritala & Florian Cardon (2020) 32 Hairy Root Cultures A Versatile Tool With Multiple Applications Plant sciences doi: 10.3389/fpls.2020.00033 Archana Giri & M.Lakshmi Narasu (2000) Transgenic hairy roots: recent trends and applications Biotechnology Advances: 1-22 Chaoqiong Liang, Huawei Liu, Jianjun Hao, Jianqiang Li & Laixin Luo (2019) Expression profiling and regulatory network of cucumber microRNAs and their putative target genes in response to cucumber green mottle mosaic virus infection Arch Virol 164(4):1121-1134 Chee & Paula P (1990) High frequency of somatic embryogenesis and recover of fertile cucumber plants HortScience 25: 792-793 Florian Cardon, Roser Pallisse, Muriel Bardor, Aurore Caron, Jessica Vanier, Jean Pierre Ele Ekouna, Patrice Lerouge, Michèle BoitelConti & Marina Guillet (2019) Brassica rapa hairy root based expression system leads to the production of highly homogenous and reproducible profiles of recombinant human alpha-L-iduronidase Plant Biotechnol J 17(2):505-516 Huang S, Li R, Zhang Z, Li L, Gu X, Fan W, Lucas WJ, Wang X, Xie B & Ni P (2009) The genome of the cucumber, Cucumis sativus L Nat Genet 41: 1275-1281 Jianyu Zhao, Li Jiang, Gen Che, Yupeng Pan, Yanqiang Li, Yu Hou, Wensheng Zhao, Yanting Zhong, Lian Ding, Shuangshuang Yan, Chengzhen Sun, Renyi Liu, Liying Yan, Tao Wu, Xuexian Li, Yiqun Weng & Xiaolan Zhang (2019) A functional allele of CsFUL1 regulates fruit length through inhibiting CsSUP and auxin transport in cucumber Plant Biologists Li X & Chen S (2017) Screening and identification of cucumber germplasm and rootstock resistance (Meloidogyne incognita) Genet Mol Res 33 against the root-knot nematode 10 Liu L, Duan L, Zhang J, Mi G, Zhang X, Zhang Z & Ren H (2013) Arabidopsis LOS5 gene enhances chilling and salt stress tolerance in Cucumber J Integr Agric 12:825–834 11 Liu SQ, Liu XH & Jiang LW (2011) Genome-wide identification, phylogeny and expression analysis of the lipoxygenase gene family in cucumber Genet Mol Res 10:2613–2636 12 Liu Y, Chen L, Wu G, Feng H & Zhang G (2017) Identification of root-secreted compounds involved in the communication between cucumber, the beneficial Bacillus amyloliquefaciens, and the soil-borne pathogen Fusarium oxysporum Mol Plant Microb Interact 13 Ma J Jun Ma, Chao Sun, Longqiang Bai, Rongrong Dong, Yan Yan, Xianchang Yu, Chaoxing He, Zhirong Zou & Yansu Li (2018) Transcriptome analysis of cucumber roots reveals key cold-resistance genes induced by AM fungi Plant Plant Molecular Biology Reporter 36:135–148 14 Mari Narusaka,Yasuyuki Kubo, Katsunori Hatakeyama, Jun Imamura, Hiroshi Ezura,Yoshihiko Nanasato, Yutaka Tabei, Yoshitaka Takano, Ken Shirasu & Yoshihiro Narusaka (2013) Interfamily transfer of dual NB-LRR genes confers resistance to multiple pathogens PLoS One 15 Medina-Bolivar, Luis Fabricio, Yang & Tianhong (2018) Method to increase the yield of products in plant material 16 Monica T Britton, Matthew AEscobar & Abhaya M Dandekar (2008) The oncogenes of Agrobacterium tumefaciens and Agrobacterium rhizogenes Agrobacterium: From biology to biotechnology New York: Springer publish: 524-565 17 Nanasato Y, Konagaya K, Okuzaki A, Tsuda M & Tabei Y (2013) Improvement of Agrobacterium-mediated transformation of cucumber (Cucumis sativus L.) by combination of vacuum infiltration and co-cultivation on filter paper wicks Plant Biotechnol Rep 7: 267-276 34 18 Schmulling T, Schell J & Spena A (1988) Single genes from Agrobacterium rhizogenes insluence plant development The EMBOJ (9): 2621-2629 19 Shi HP, Qi Y, Zhang Y & Liang S (2006) Induction of cucumber hairy roots and effect of cytokinin 6-BA on its growth and morphology Europe PMC 20 Tabei Y, Kitade S, Nishizawa Y, Kikuchi N, Kayano T, Hibi T & Akutsu K (1998) Transgenic cucumber plants harboring a rice chitinase gene exhibit enhanced resistance to gray mold (Botrytis cinerea) Plant Cell Rep 17: 159-164 21 Takafumi Yoshikawa & Tsutomu Furuya (1987) Saponin production by cultures of Panax ginseng transformed with Agrobacterium rhizogenes Plant Cell Reports volume 6: 449–453 22 Tomy Michael & Angelo Spen (1995) The Plant Oncogenes rol A, B, and C from Agrobacterium rhizogenes Agrobacterium Protocol: 207-222 23 Trulson AJ, Simpson RB & Shahin EA (1986) Transformation of cucumber (Cucumis sativus L.) plants with Agrobacterium rhizogenes Theor Appl Genet 73: 11-15 24 Zhang Y, Zhang X, Liu B, Wang W, Liu X, Chen C, Liu X, Yang S & Ren H (2014) A GAMYB homologue CsGAMYB1 regulates sex expression of cucumber via an ethylene-independent pathway J Exp Bot 65: 3201-3213 25 Jianyu Zhao, Li Jiang, Gen Che, Yupeng Pan, Yanqiang Li, Yu Hou, Wensheng Zhao, Yanting Zhong, Lian Ding, Shuangshuang Yan, Chengzhen Sun, Renyi Liu, Liying Yan, Tao Wu, Xuexian Li, Yiqun Weng & Xiaolan Zhang (2019) A functional allele of CsFUL1 regulates fruit length through inhibiting CsSUP and auxin transport in cucumber Plant Cell https://doi.org/10.1105/tpc.18.00905 35 PHỤ LỤC Phụ lục 1: Các thành phần môi trường nuôi cấy Bảng 1: Thành phần mơi trường MS Thành phần Đa lượng Hóa chất KNO 1650 NH NO 1900 MgSO 180,54 KH PO 170 CaCl 332,02 FeSO 7H2O Na EDTA CoCl Na MoO KI 22,3 0,83 0,025 0,025 ZnSO 37,3 MnSO 27,8 H BO Vitamin 6,2 8,6 CuSO Vi lượng mg/L Glycine Nicotinic 0,5 Myo-Inositol 100 Pyridoxine HCl 0,5 Thiamine HCl 0,1 36 Bảng 2: Thành phần môi trường YEP Hàm lượng (g/L) Thành phần Yeast extract 10 Peptone 10 NaCl Phụ lục 2: Thành phần dung dịch nhuộm X – Gluc Thành phần 50 ml X – Gluc 0,1% Triton X 100 0,5 Tris NaCl 44,5 DMSO Phụ lục 3: Thành phần dung dịch đệm tách chiết DNA sử dụng CTAB Thành phần Nồng độ gốc Nồng độ sử dụng Thể tích cần lấy cho 15 ml CTAB Bột 2% 1,5g Tris HCL (pH=8) 1M 0,1M 1,5ml 0,5M 0,02M 0,16ml 5M 1,4M 4,2ml EDTA (pH=8) NaCl H O deion 7,64ml 37 Phụ lục 4: Thành phần phản ứng PCR Thành phần Thể tích (µl) H O deion 4,3 PCR master mix 2x 7,5 Mồi xuôi 0,6 Mồi ngược 0,6 DNA template Tổng thể tích 15 38