Xây dựng hệ thống chuyển gen thông qua cảm ứng rễ tơ trên giống sắn km94

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC - - KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐỀ TÀI: “XÂY DỰNG HỆ THỐNG CHUYỂN GEN THÔNG QUA CẢM ỨNG RỄ TƠ TRÊN GIỐNG SẮN KM94” Ngƣời thực : Lê Thu Trang Khóa : K63 Khoa : Cơng nghệ Sinh học Ngƣời hƣớng dẫn : TS Đỗ Tiến Phát Ngƣời hƣớng dẫn : PGS TS Nguyễn Thanh Hải Hà Nội – 2022 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan kết số liệu nghiên cứu “Xây dựng hệ thống chuyển gen thông qua cảm ứng rễ tơ giống sắn KM94” tuyệt đối trung thực chƣa đƣợc cơng bố trƣớc đó, khơng có chép từ nguồn khác Ngoài ra, báo cáo có sử dụng số nguồn tài liệu tham khảo đƣợc trích dẫn nguồn thích rõ ràng Đề tài, nội dung báo cáo sản phẩm mà nỗ lực nghiên cứu q trình học thực tập phịng Cơng nghệ tế bào Thực vật – Viện Công nghệ Sinh học Tơi xin hồn tồn chịu trách nhiệm trƣớc môn, khoa nhà trƣờng cam đoan Hà Nội, ngày … tháng … năm 2022 Sinh viên thực Lê Thu Trang i LỜI CẢM ƠN Lời đầu tiên, xin gửi lời cảm ơn chân thành đến TS Đỗ Tiến Phát PGS TS Nguyễn Thanh Hải tạo điều kiện theo sát hƣớng dẫn tơi suốt thời gian thực khóa luận tốt nghiệp Tôi xin gửi lời cảm ơn đến ban Lãnh đạo phịng Cơng nghệ tế bào Thực vật – Viện Công nghệ Sinh học TS Đỗ Tiến Phát tạo điều kiện thuận lợi cho thực đề tài Tôi xin cảm ơn thầy, cô giáo khoa Công nghệ Sinh học – Học viện Nông nghiệp Việt Nam truyền đạt cho kiến thức, ln tận tình bảo đƣa lời khuyên quý báu suốt trình học tập trƣờng Trong thời gian thực khóa luận tốt nghiệp, nhận đƣợc hƣớng dẫn hỗ trợ tận tình từ chị Nguyễn Thị Linh nhƣ tất anh, chị cán phòng Công nghệ tế bào Thực vật – Viện Công nghệ Sinh học Tôi xin đƣợc gửi lời cảm ơn sâu sắc đến tồn thể anh, chị cán Phịng Cuối cùng, muốn gửi lời cảm ơn tới bố mẹ, tới gia đình bạn bè – ngƣời bên ủng hộ, giúp đỡ động viên tơi suốt q trình học tập vừa qua Mặc dù cố gắng hồn thành khóa luận tốt nghiệp phạm vi khả Tuy nhiên khơng tránh khỏi thiếu sót Rất mong nhận đƣợc cảm thông bảo tận tình từ q thầy tồn thể bạn Hà Nội ngày … tháng … năm 2022 Sinh viên thực Lê Thu Trang ii TÓM TẮT Mục đích đề tài: Xây dựng hệ thống cảm ứng rễ tơ giống sắn KM94 thử nghiệm chuyển gen thị vào rễ tơ sắn Phƣơng pháp nghiên cứu: Tối ƣu hệ thống cảm ứng rễ tơ thông qua vi khuẩn A rhizogenes với điều kiện: chủng vi khuẩn, loại vật liệu, mật độ khuẩn lây nhiễm thời gian đồng nuôi cấy tối ƣu Sau tiến hành chuyển cấu trúc biểu gen thị gus vào rễ tơ sắn Thu mẫu rễ tơ, kiểm tra biểu gen chuyển phƣơng pháp nhuộm XGluc xác định có mặt gen chuyển phƣơng pháp PCR Kết nghiên cứu: Tối ƣu quy trình cảm ứng tạo rễ tơ với chủng vi khuẩn ATCC 15834, sử dụng đoạn thân sắn làm vật liệu lây nhiễm với OD600=0,6 đồng nuôi cấy ngày Chuyển thành công cấu trúc biểu gen vào rễ tơ sắn Kết luận: Ứng dụng thành công hệ thống cảm ứng rễ tơ để chuyển cấu trúc biểu gen vào rễ tơ sắn iii MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN i LỜI CẢM ƠN ii TÓM TẮT iii DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT vi DANH MỤC BẢNG vii DANH MỤC HÌNH ẢNH ix PHẦN MỞ ĐẦU 1.1 Tính cấp thiết đề tài 1.2 Mục đích 1.3 Yêu cầu PHẦN 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Tổng quan sắn 2.1.1 Giới thiệu chung 2.1.2 Đặc điểm hình thái 2.1.3 Giống sắn KM94 2.2 Vi khuẩn A rhizogenes chế tạo rễ tơ thực vật 2.2.1 Giới thiệu chung vi khuẩn A rhizogenes 2.2.2 Cơ chế tạo rễ tơ thực vật 14 2.3 Giới thiệu gen gus 16 2.4 Các yếu tố ảnh hƣởng đến hiệu chuyển gen 17 2.5 Ứng dụng hệ thống rễ tơ thực vật 17 2.6 Một số nghiên cứu rễ tơ Việt Nam 18 2.7 Nghiên cứu tạo rễ tơ sắn 19 PHẦN 3: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 21 3.1 Vật liệu nghiên cứu 21 iv 3.1.1 Vật liệu 21 3.1.2 Hóa chất dụng cụ 21 3.2 Phƣơng pháp nghiên cứu 22 3.2.1 Chuẩn bị vật liệu biến nạp 22 3.2.2 Chuẩn bị dung dịch huyền phù vi khuẩn A rhizogenes 22 3.2.3 Lây nhiễm vi khuẩn 22 3.2.4 Kiểm tra biểu GUS phƣơng pháp nhuộm mô 23 3.2.5 Xác định có mặt gen chuyển phƣơng pháp PCR 23 3.2.6 Phƣơng pháp xử lý số liệu 24 PHẦN 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 25 4.1 Xây dựng hệ thống cảm ứng tạo rễ tơ sắn 25 4.1.1 Ảnh hƣởng chủng vi khuẩn đến khả tạo rễ 25 4.1.2 Ảnh hƣởng loại vật liệu biến nạp đến khả tạo rễ 26 4.1.3 Ảnh hƣởng mật độ tế bào vi khuẩn đến khả tạo rễ 29 4.1.4 Ảnh hƣởng thời gian đồng nuôi cấy đến khả tạo rễ 30 4.2 Chuyển cấu trúc biểu gen vào rễ tơ sắn 31 4.2.1 Đánh giá hiệu quy trình chuyển gen 31 4.2.2 Đánh giá biểu gen chuyển dòng rễ tơ chuyển gen 32 PHẦN 5: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 34 5.1 Kết luận 35 5.2 Kiến nghị 35 PHẦN TÀI LIỆU THAM KHẢO 36 PHỤ LỤC 41 v DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT ADN Acid Deoxyribonucleic A rhizogenes Agrobacterium rhizogenes AS Acetosyringone CTAB Cetyl Trimethyl Ammonium Bromide EDTA Ethylene Diamine Triacetic Acid Gus ꞵ - glucuronidase MS Môi trƣờng nuôi cấy theo Murashige Skoog (1962) OD Optical density ORF Open reading frame PCR Polymerase Chain Reaction pRi Plasmid root induction pTi Plasmid tumor induction T-DNA Transfer DNA TL-DNA Transfer DNA Left border repeat sequences TR-DNA Transfer DNA Right border repeat sequences Tris HCl TRIS hydrochloride Vir Virulence Region X-Glux – bromo – – chloro – – indolyl glucoronide YEP Yeast Extract Peptone YMB Yeast Mannitol Broth vi vii DANH MỤC BẢNG Bảng Ảnh hƣởng chủng vi khuẩn A rhizogenes đến khả tạo rễ 26 Bảng Ảnh hƣởng loại vật liệu sử dụng đến khả tạo rễ 27 Bảng Ảnh hƣởng mật độ tế bào vi khuẩn đến khả tạo rễ 30 Bảng Ảnh hƣởng thời gian đồng nuôi cấy đến khả tạo rễ 30 Bảng Hiệu quy trình chuyển gen 32 Bảng Kết nhuộm X-Gluc dòng rễ tơ thu đƣợc 33 viii DANH MỤC HÌNH ẢNH Hình Cây sắn giống KM94 .4 Hình Mặt cắt ngang củ sắn Hình Cấu trúc Ri-plasmid 10 Hình Sự lây nhiễm hình thành rễ tơ thơng qua vi khuẩn A rhizogenes 15 Hình Mẫu rễ sau tuần nuôi cấy môi trƣờng cảm ứng tạo rễ 25 Hình Mẫu vật liệu theo dõi sau tuần nuôi cấy 28 Hình Một số mẫu rễ tơ chuyển gen gus nuôi cấy sau tuần lây nhiễm 32 Hình Biểu gen gus rễ tơ sắn 33 Hình Kết điện di sản phẩm PCR kiểm tra có mặt gen gus dịng rễ chuyển gen Giếng M: Thang chuẩn; Giếng (-): đối chứng âm (WT); Giếng (+): đối chứng dƣơng (plasmid); Giếng 1-11: dòng rễ chuyển gen 34 ix đoạn thân cao liên quan đến độ nhạy cảm mô đoạn thân với vi khuẩn so với vùng mơ khác mà cịn phụ thuộc vào tình trạng sinh lí vùng mơ (các phận non thích hợp cho xâm nhiễm) Từ kết này, lựa chọn đoạn thân làm nguồn vật liệu cho thí nghiệm 4.1.3 Ảnh hƣởng mật độ tế bào vi khuẩn đến khả tạo rễ Mật độ tế bào vi khuẩn dùng để lây nhiễm yếu tố tác động trực tiếp đến hiệu cảm ứng tạo rễ tơ A rhizogenes Mật độ vi khuẩn số tế bào vi khuẩn đơn vị thể tích, mật độ thấp làm giảm khả tiếp xúc vi khuẩn với tế bào, dẫn đến làm giảm hiệu biến nạp; nhƣng mật độ cao dẫn tới việc khuẩn phát triển lại sau trình diệt khuẩn làm ảnh hƣởng tới phát triển mẫu sau Để xác định đƣợc mật độ khuẩn tối ƣu cho biến nạp, đoạn thân sắn đƣợc cắt tạo tổn thƣơng ngâm dịch khuẩn với mật độ OD600nm khác 0,4; 0,6; 0,8 1,0 Tỉ lệ mẫu tạo rễ tơ số rễ trung bình mẫu đƣợc ghi nhận bảng Chúng nhận thấy lây nhiễm đoạn thân sắn với A rhizogenes mật độ OD600nm khác nhau, tỉ lệ mẫu tạo rễ thu đƣợc khác Khi mật độ vi khuẩn giá trị OD600nm = 0,6, tỉ lệ mẫu tạo rễ đạt đƣợc cao (41,67%), đồng thời số rễ trung bình mẫu thu đƣợc cao nhất, đạt 1,44 0,80 rễ/mẫu Trong đó, mật độ vi khuẩn thấp (OD600nm = 0,4) cao (OD600nm = 0,8) cho tỉ lệ mẫu cảm ứng tạo rễ thấp Mặc dù khơng có khác biệt lớn tỷ lệ tạo rễ tơ nồng độ OD600nm từ 0,6-0,8 nhƣng có ghi nhận tƣợng mọc lại khuẩn ngƣỡng mật độ vi khuẩn cao từ OD600nm 0,8-1,0 Từ kết thấy, mật độ vi khuẩn thích hợp sử dụng cho cảm ứng tạo rễ tơ sắn OD600nm = 0,6 29 Bảng Ảnh hƣởng mật độ tế bào vi khuẩn đến khả tạo rễ OD Tổng mẫu Tỉ lệ tạo rễ (%) Số rễ T mẫu 0,4 180 31,11 ± 2,55a 1,16 ± 0,42a 0,6 180 41,67 ± 3,34b 1,44 ± 0,80b 0,8 180 36,11 ± 2,55b 1,29 ± 0,65a 1,0 180 40,00 ± 2,89b 1,29 ± 0,59a 4.1.4 Ảnh hƣởng thời gian đồng nuôi cấy đến khả tạo rễ Đồng nuôi cấy giai đoạn cần thiết, ảnh hƣởng quan trọng đến hiệu cảm ứng tạo rễ Đây khoảng thời gian vi khuẩn tiếp tục phát triển sau biến nạp, đồng thời chuyển đoạn T-DNA xâm nhập vào hệ gen thực vật Ở thí nghiệm này, đoạn thân sắn đƣợc cắt tạo vết thƣơng ngâm dịch khuẩn OD600nm = 0,6 sau đồng ni cấy mơi trƣờng MS có bổ sung 200 mg/l AS thời gian 3, ngày Bảng Ảnh hƣởng thời gian đồng nuôi cấy đến khả tạo rễ Thời gian ĐNC (ngày) Tổng mẫu Tỉ lệ tạo rễ (%) Số rễ T mẫu 180 26,67 ± 5,00a 1,19 ± 0,45a 180 41,11 ± 3,47b 1,38 ± 0,70b 180 40,56 ± 8,56b 1,40 ± 0,57b 30 Kết đánh giá hiệu cảm ứng tạo rễ tơ công thức thời gian đồng nuôi cấy đƣợc thể bảng Dựa vào số liệu thấy, q trình đồng ni cấy có ảnh hƣởng đến tỉ lệ mẫu tạo rễ Ở công thức đồng nuôi cấy ngày, tỉ lệ mẫu tạo rễ số rễ trung bình mẫu thu đƣợc cao nhất, lần lƣợt đạt 41,11 1,38 ngày lần lƣợt 40,56 0,70 rễ/mẫu Số liệu công thức đồng nuôi cấy 1,40 0,57 rễ/mẫu Trong đó, đồng ni cấy ngày sau biến nạp, tỉ lệ mẫu tạo rễ thu đƣợc thấp với 26,67 số rễ tạo trung bình mẫu 1,19 ± 0,45 Tuy nhiên, khơng có khác biệt thống kê tỷ lệ tạo rễ tơ thời gian đồng nuôi cấy ngày ngày Do để tiết kiệm thời gian, lựa chọn thời gian đồng nuôi cấy ngày cho thí nghiệm Quy trình chuyển gen vào rễ tơ sắn: Dựa vào kết tối ƣu điều kiện chuyển gen, đƣa đƣợc quy trình chuyển gen cảm ứng tạo rễ tơ sắn sử dụng vi khuẩn A rhizogenes Theo đó, chủng vi khuẩn A rhizogenes ATCC 15834 đƣợc sử dụng cho thí nghiệm biến nạp giống sắn KM94 Các mẫu đoạn thân sắn từ sắn in vitro tuần tuổi đƣợc cắt thành đoạn có kích thƣớc 0,5 – cm, lây nhiễm mẫu dịch huyền phù khuẩn có OD600nm = 0,6 đồng nuôi cấy ngày Sau thời gian đồng nuôi cấy, mẫu biến nạp đƣợc chuyển lên môi trƣờng cảm ứng tạo rễ tơ theo dõi khả hình thành rễ Hiệu tạo rễ cao thu đƣợc trình tối ƣu sử dụng chủng khuẩn ATCC 15834 khoảng 41 4.2 Chuyển cấu trúc biểu gen vào rễ tơ sắn 4.2.1 Đánh giá hiệu quy trình chuyển gen Sau xây dựng thành công phƣơng pháp chuyển gen tạo rễ tơ giống sắn KM94 thơng qua chủng dại ATCC 15834, nhóm nghiên cứu tiến hành chuyển cấu trúc biểu gen vào sắn sử dụng quy trình tối ƣu Theo đó, vector pZY102 mang gen thị gus đƣợc biến nạp vào A rhizogenes ATCC 31 15834 đƣợc sử dụng cho nghiên cứu Các mẫu rễ đƣợc nhuộm với dung dịch X-Gluc để kiểm tra có mặt gen chuyển Tồn quy trình đƣợc tiến hành lặp lại ba lần nhằm đánh giá hiệu chuyển gen Bảng Hiệu quy trình chuyển gen Lơ TN Tổng mẫu Số mẫu tạo rễ Tỉ lệ tạo rễ (%) Số rễ TB mẫu 75 48 64,00 2,38 ± 1,38 75 51 68,00 1,94 ± 1,05 75 56 74,67 2,23 ± 1,39 Trung bình 75 51,67 68,89 2,18 ± 1,29 Kết thể bảng cho thấy chuyển cấu trúc pZY102 mang gen gus intron vào giống sắn KM94, tỉ lệ mẫu biến nạp tạo rễ tơ môi trƣờng cảm ứng 68,89 ; đồng thời số rễ trung bình tạo đoạn thân 2,18 ± 1,29 Hình Một số mẫu rễ tơ chuyển gen gus nuôi cấy sau tuần lây nhiễm 4.2.2 Đánh giá biểu gen chuyển dòng rễ tơ chuyển gen Các dòng rễ thu đƣợc đƣợc tiến hành nhuộm X-Gluc để đánh giá biểu gen thị gus Màu xanh chàm đặc trƣng xuất số mẫu rễ (Hình 8), chứng tỏ thu đƣợc dòng rễ tơ chuyển gen gus ổn định Sau 48 nhuộm, tiến hành quan sát thống kê mẫu rễ mang biểu gen gus Kết thể bảng cho thấy tỉ lệ mẫu xanh tổng số mẫu đem nhuộm 32 87,41 , số rễ mang biểu gen gus tổng số rễ đem nhuộm 70,71% Bảng Kết nhuộm X-Gluc dòng rễ tơ thu đƣợc Lô TN Số mẫu nhuộm gus Số mẫu xanh Số rễ Tỉ lệ rễ biểu Tỉ lệ mẫu Tổng số biểu hiện gen xanh (%) rễ nhuộm gen gus gus (%) 18 15 83,33 49 28 57,14 20 18 90,00 33 23 69,70 18 16 88,89 34 29 85,29 Trung bình 18,67 16,33 87,41 38,67 26,67 70,71 Hình Biểu gen gus rễ tơ sắn (mũi tên đỏ: rễ mang gen chuyển, mũi tên trắng: rễ không mang gen chuyển) Các mẫu rễ tơ biểu màu xanh thông qua phƣơng pháp nhuộm X-Gluc đồng thời đƣợc thu tách DNA kiểm tra có mặt gen gus Kết điện di sản phẩm PCR với cặp mồi đặc hiệu cho thấy xuất băng vạch đặc trƣng gen gus intron vị trí 649 bp dòng rễ chuyển gen mẫu đối 33 chứng dƣơng, đối chứng âm xuất băng vạch (Hình 9) Nhƣ kết luận cấu trúc pZY102/gus intron đƣợc chuyển thành cơng vào giống KM94 Hình Kết điện di sản phẩm PCR kiểm tra có mặt gen gus dịng rễ chuyển gen Giếng M: Thang chuẩn; Giếng (-): đối chứng âm (WT); Giếng (+): đối chứng dương (plasmid); Giếng 1-11: dòng rễ chuyển gen Tổng hợp kết thấy chúng tơi xây dựng thành công phƣơng pháp chuyển gen tạo rễ tơ cho giống sắn KM94 thông qua vi khuẩn A rhizogenes Quy trình sử dụng phƣơng pháp chuẩn bị huyền phù khuẩn từ đĩa ni đặc thay ni lỏng, giúp đơn giản hóa thao tác thời gian chuẩn bị Nguồn vật liệu ban đầu sắn in vitro nhân nhanh, bảo quản quanh năm, giúp chủ động nguồn mẫu Tỉ lệ cảm ứng tạo rễ tơ (68,89 ) chƣa cao so với nghiên cứu công bố đối tƣợng trồng khác nhƣng công bố việc xây dựng thành công hệ thống cảm ứng rễ tơ sắn Việt Nam Kết tiền đề cho nghiên cứu chuyển gen chỉnh sửa hệ gen giống sắn Việt Nam tƣơng lai 34 PHẦN 5: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 5.1 Kết luận Nghiên cứu hồn thiện đƣợc quy trình tạo rễ tơ giống sắn KM94 thông qua vi khuẩn A rhizogenes với điều kiện tối ƣu bao gồm: Chủng A rhizogenes thích hợp có khả cảm ứng tạo rễ tơ ATCC 15834; vật liệu phù hợp để biến nạp đoạn thân sắn in vitro tuần tuổi; mật độ vi khuẩn tối ƣu OD600nm = 0,6; thời gian đồng ni cấy thích hợp ngày Tỉ lệ cảm ứng tạo rễ thu đƣợc sử dụng quy trình tối ƣu đạt 40% Đã ứng dụng thành công hệ thống để chuyển cấu trúc biểu gen vào rễ tơ sắn thu đƣợc dòng rễ tơ mang gen chuyển với tỉ lệ tạo rễ tơ đạt trung bình 68,89%, hiệu chuyển gen đạt 87,41% tỷ lệ rễ biểu gen gus thu đƣợc 70,71% 5.2 Kiến nghị Tiếp tục nghiên cứu, phát triển ứng dụng hệ thống tạo rễ tơ nghiên cứu chức gen hay kiểm tra hoạt động cấu trúc chuyển gen giống sắn Việt Nam Đồng thời, tiếp tục mở rộng hƣớng nghiên cứu đối tƣợng trồng quan trọng khác 35 PHẦN TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tham khảo tiếng Việt Bùi Huy Đáp, 1987 Cây sắn Trong sách hoa màu Việt Nam tập NXB Nông nghiệp, 114 trang Hoàng Kim, Phạm Văn Biên, 1995 Cây sắn NXB Nơng nghiệp thành phố Hồ Chí Minh, 68 trang Lê Thị Nhƣ Thảo, Nguyễn Hồng Nhung, Lê Quang Huy, Bùi Phƣơng Thảo, Lê Thu Ngọc, Phạm Bích Ngọc, Chu Hồng Hà, Đỗ Tiến Phát (2021) Phát triển hệ thống cảm ứng tạo rễ tơ in vitro số giống đậu tƣơng phục vụ nghiên cứu biểu gen chỉnh sửa gen Tạp chí Cơng nghệ sinh học 19(3): 459470 Nguyễn Hồng Nhung, Lê Quang Huy, Lê Thị Nhƣ Thảo, Phạm Bích Ngọc, Chu Hồng Hà, Đỗ Tiến Phát (2019) Thiết lập hệ thống cảm ứng rễ tơ giống đậu tƣơng Việt Nam sử dụng đánh giá hoạt động cấu trúc chuyển gen Hội nghị Cơng nghệ Sinh học tồn quốc năm 2019: 205–206 Tiếng liệu tham khảo tiếng Anh Akramian, M., Tabatabaei, S.M.F., Mirmasoumi, M., 2008 Virulence of Different Strains of Agrobacterium rhizogenes on Genetic Transformation of Four Hyoscyamus Species Env Sci Bensaddek, L., Villarreal, M.L., Fliniaux, M.-A., 2008 Induction and growth of hairy roots for the production of medicinal compounds Electron J Integr Biosci 3, 2–9 Binns, A.N., Costantino, P., 1998 The Agrobacterium Oncogenes, in: Spaink, H.P., Kondorosi, A., Hooykaas, P.J.J (Eds.), The Rhizobiaceae: Molecular Biology of Model Plant-Associated Bacteria Springer Netherlands, Dordrecht, pp 251– 266 Brasileiro, A.C.M., Aragao, F.J.L., 2001 Marker Genes for in Vitro Selection of Transgenic Plants J Plant Biotechnol 3, 113–121 Cardarelli, M., Spanò, L., De Paolis, A., Mauro, M.L., Vitali, G., Costantino, P., 1985 Identification of the genetic locus responsible for non-polar root induction by Agrobacterium rhizogenes 1855 Plant Mol Biol 5, 385–391 Cardarelli, M., Spanò, L., Mariotti, D., Mauro, M.L., Van Sluys, M.A., Costantino, P., 1987 The role of auxin in hairy root induction Mol Gen Genet MGG 208, 457–463 Casanova, E., Valdés, A., Zuker, A., Fernández, B., Vainstein, A., Maria, I., Trillas, M.I., Moysset, L., 2004 rolC-transgenic carnation plants: Adventitious organogenesis and levels of endogenous auxin and cytokinins Plant Sci 167, 551–560 Chandra, S., 2012 Natural plant genetic engineer Agrobacterium rhizogenes: role of T-DNA in plant secondary metabolism Biotechnol Lett 34, 407–415 36 Chandran, R.P., Potty, V.P., 2011 Different Inducer Molecules and Strains of Agrobacterium rhizogenes on Enhancing Transformation Frequency in Host Plants CIAT, 1993 Cassava Breeding, Agronomy Research and Technology Transfer in Asia: Proceedings of the Fourth Regional Workshop Held in Trivandrum, Kerala, India, Nov 2-6, 1993 CIAT Conn, H.J., 1942 Validity of the Genus Alcaligenes J Bacteriol 44, 353–360 Dehio, C., Grossmann, K., Schell, J., Schmülling, T., 1993 Phenotype and hormonal status of transgenic tobacco plants overexpressing the rolA gene of Agrobacterium rhizogenes T-DNA Plant Mol Biol 23, 1199–1210 Filetici, P., Spanò, L., Costantino, P., 1987 Conserved regions in the T-DNA of different Agrobacterium rhizogenes root-inducing plasmids Plant Mol Biol 9, 19–26 Filippini, F., Schiavo, F.L., Terzi, M., Costantino, P., Trovato, M., 1994 The Plant Oncogene rolB Alters Binding of Auxin to Plant Cell Membranes Plant Cell Physiol 35, 767–771 Gelvin, S.B., 2003 Improving plant genetic engineering by manipulating the host Trends Biotechnol 21, 95–98 Giri, C.C., Giri, A., 2007 Plant Biotechnology Practical Manual I International Publishing House Hansen, G., Das, A., Chilton, M.D., 1994 Constitutive expression of the virulence genes improves the efficiency of plant transformation by Agrobacterium Proc Natl Acad Sci U S A 91, 7603–7607 Herrera-Estrella, A., Chen, Z.M., Van Montagu, M., Wang, K., 1988 VirD proteins of Agrobacterium tumefaciens are required for the formation of a covalent DNA-protein complex at the 5’ terminus of T-strand molecules EMBO J 7, 4055– 4062 Hodges, L.D., Cuperus, J., Ream, W., 2004 Agrobacterium rhizogenes GALLS protein substitutes for Agrobacterium tumefaciens single-stranded DNA-binding protein VirE2 J Bacteriol 186, 3065–3077 Hodges, L.D., Lee, L.-Y., McNett, H., Gelvin, S.B., Ream, W., 2009 The Agrobacterium rhizogenes GALLS Gene Encodes Two Secreted Proteins Required for Genetic Transformation of Plants J Bacteriol 191, 355–364 Hodges, L.D., Vergunst, A.C., Neal-McKinney, J., Dulk-Ras, A den, Moyer, D.M., Hooykaas, P.J.J., Ream, W., 2006 Agrobacterium rhizogenes GALLS Protein Contains Domains for ATP Binding, Nuclear Localization, and Type IV Secretion J Bacteriol Hong, S.-B., Peebles, C.A.M., Shanks, J.V., San, K.-Y., Gibson, S.I., 2006 Terpenoid indole alkaloid production by Catharanthus roseus hairy roots induced by Agrobacterium tumefaciens harboring rol A, B, C genes Biotechnol Bioeng 93, 386–390 Howard, E.A., Zupan, J.R., Citovsky, V., Zambryski, P.C., 1992 The VirD2 protein of A tumefaciens contains a C-terminal bipartite nuclear localization signal: implications for nuclear uptake of DNA in plant cells Cell 68, 109–118 37 Jefferson, R.A., Burgess, S.M., Hirsh, D., 1986 beta-Glucuronidase from Escherichia coli as a gene-fusion marker Proc Natl Acad Sci U S A 83, 8447–8451 Kereszt, A., Li, D., Indrasumunar, A., Nguyen, C.D.T., Nontachaiyapoom, S., Kinkema, M., Gresshoff, P.M., 2007 Agrobacterium rhizogenes-mediated transformation of soybean to study root biology Nat Protoc 2, 948–952 Kiyokawa, S., Kobayashi, K., Kikuchi, Y., Kamada, H., Harada, H., 1994 Rootinducing region of mikimopine type Ri plasmid pRi1724 Plant Physiol 104, 801–2 Kumar, V., Sharma, A., Narasimha Prasad, B.C., Bhaskar Gururaj, H., Aswathanarayana Ravishankar, G., 2006 Agrobacterium rhizogenes mediated genetic transformation resulting in hairy root formation is enhanced by ultrasonication and acetosyringone treatment Electron J Biotechnol 9, 0–0 Le H, Nguyen NH, Ta DT, Le TNT, Bui TP, Le NT, Nguyen CX, Rolletschek H, Stacey G, Stacey MG, Pham NB, Do PT, Chu HH (2020) CRISPR/Cas9Mediated Knockout of Galactinol Synthase-Encoding Genes Reduces Raffinose Family Oligosaccharide Levels in Soybean Seeds Frontiers in Plant Science 11 Lessard, P., Kulaveerasingam, H., York, G., Strong, A., Sinskey, A., 2002 Manipulating gene expression for the metabolic engineering of plants Metab Eng Lobell, D., Burke, M., Tebaldi, C., Mastrandrea, M., Falcon, W., Naylor, R., 2008 Prioritizing Climate Change Adaptation Needs for Food Security in 2030 Science 319, 607–610 Martin-Tanguy, J., Sun, L.Y., Burtin, D., Vernoy, R., Rossin, N., Tepfer, D., 1996 Attenuation of the Phenotype Caused by the Root-Inducing, Left-Hand, Transferred DNA and Its rolA Gene (Correlations with Changes in Polyamine Metabolism and DNA Methylation) Plant Physiol 111, 259–267 Maurel, C., Leblanc, N., Barbier-Brygoo, H., Perrot-Rechenmann, C., BouvierDurand, M., Guern, J., 1994 Alterations of auxin perception in rolBtransformed tobacco protoplasts Time course of rolB mRNA expression and increase in auxin sensitivity reveal multiple control by auxin Plant Physiol 105, 1209–1215 Mauro, M.L., Trovato, M., Paolis, A.D., Gallelli, A., Costantino, P., Altamura, M.M., 1996 The Plant OncogenerolDStimulates Flowering in Transgenic Tobacco Plants Dev Biol 180, 693–700 Meyer, A., Tempe, J., Costantino, P., 2000 Hairy root: A molecular overview Functional analysis of Agrobacterium rhizogenes T-DNA genes Plant-Microbe Interact 93–139 Monica T, B., Escobar, M.A., Dandekar, A.M., 2008 The Oncogenes of Agrobacterium Tumefaciens and Agrobacterium Rhizogenes, in: Tzfira, T., Citovsky, V (Eds.), Agrobacterium: From Biology to Biotechnology Springer, New York, NY, pp 523–563 Moriguchi, K., Maeda, Y., Satou, M., Hardayani, N.S., Kataoka, M., Tanaka, N., Yoshida, K., 2001 The complete nucleotide sequence of a plant root-inducing (Ri) plasmid indicates its chimeric structure and evolutionary relationship 38 between tumor-inducing (Ti) and symbiotic (Sym) plasmids in Rhizobiaceae J Mol Biol 307, 771–784 Murugesan, S., Manoharan, C., Vijayakumar, R., Panneerselvam, A., 2010 Isolation and Characterization of Agrobacterium rhizogenes from the Root Nodules of some Leguminous Plants Int J Microbiol Res 1, 92–96 Nilsson, O., Olsson, O., 2006 Getting to the root: The role of the Agrobacterium rhizogenes rol genes in the formation of hairy roots Physiol Plant 100, 463– 473 Ozyigit, I.I., Dogan, I., Artam Tarhan, E., 2013 Agrobacterium rhizogenes-Mediated Transformation and Its Biotechnological Applications in Crops, in: Hakeem, K.R., Ahmad, P., Ozturk, M (Eds.), Crop Improvement Springer US, Boston, MA, pp 1–48 Palazon, J., Cusidó, R.M., Roig, C., Piđol, M.T., 1998 Expression of the rolC gene and nicotine production in transgenic roots and their regenerated plants Plant Cell Rep 17, 384–390 Petersen, S.G., Stummann, B.M., Henningsen, K.W., Olesen, P., 1989 Structure and function of root-inducing (Ri) plasmids and their relation to tumor-inducing (Ti) plasmids [Agrobacterium rhizogenes, Agrobacterium tumefaciens, review] Physiol Plant Den Pirian, K., Piri, K., Ghiyasvand, T., 2012 Hairy roots induction from Portulaca oleracea using Agrobacterium rhizogenes to noradrenaline’s production Schmulling, T., Schell, J., Spena, A., 1988 Single genes from Agrobacterium rhizogenes influence plant development EMBO J 7, 2621–2629 Sevon, N., Oksman-Caldentey, K., 2002 Agrobacterium rhizogenes-Mediated Transformation: Root Cultures as a Source of Alkaloids Planta Med 68, 859– 868 Shoja H.M., 2010 Contribution to the study of the Agrobacterium rhizogenes plast genes, rolB and rolC, and their homologs in Nicotiana tabacum Sinkar, V.P., Pythoud, F., White, F., Nester, E., Gordon, M., 1988 rolA locus of the Ri plasmid directs developmental abnormalities in transgenic tobacco plants Slightom, J., Durand-Tardif, M., Jouanin, L., Tepfer, D., 1986 Nucleotide sequence analysis of TL-DNA of Agrobacterium rhizogenes agropine type plasmid Identification of open reading frames J Biol Chem 261, 108–21 Smulders, M.J.M., Croes, A., Kemp, A., Hese, K., Harren, F., Wullems, G., 1991 Inhibition by Ethylene of Auxin-Promotion of Flower Bud Formation in Tobacco Explants Is Absent in Plants Transformed by Agrobacterium rhizogenes Plant Physiol 96, 1131–5 Spano, L., Mariotti, D., Cardarelli, M., Branca, C., Costantino, P., 1988 Morphogenesis and Auxin Sensitivity of Transgenic Tobacco with Different Complements of Ri T-DNA Plant Physiol 87, 479–483 Taylor, B., Amasino, R., White, F., Nester, E., Gordon, M., 1985 T-DNA analysis of plants regenerated from hairy root tumors Mol Gen Genet MGG 39 Tepfer, D., 1984 Transformation of several species of higher plants by Agrobacterium rhizogenes: sexual transmission of the transformed genotype and phenotype Cell 37, 959–967 Tzfira, T., Citovsky, V., 2000 From host recognition to T-DNA integration: the function of bacterial and plant genes in the Agrobacterium–plant cell interaction Mol Plant Pathol 1, 201–212 Vansuyt, G., Vilaine, F., Tepfer, M., Rossignol, M., 1992 rol A modulates the sensitivity to auxin of the proton translocation catalyzed by the plasma membrane H(+)-ATPase in transformed tobacco FEBS Lett 298, 89–92 Veena, V., Taylor, C., 2007 Agrobacterium rhizogenes: Recent developments and promising applications Vitro Cell Dev Biol - Plant 43, 383–403 Weller S.A., Stead D.E., 2002 Detection of root mat associated Agrobacterium strains from plant material and other sample types by post‐enrichment TaqMan PCR Weller, S.A., Stead, D.E., Young, J.P.W., 2005 Induction of root‐mat symptoms on cucumber plants by Rhizobium, but not by Ochrobactrum or Sinorhizobium, harbouring a cucumopine Ri plasmid White, F., Taylor, B., Huffman, G., Gordon, M., Nester, E., 1985 Molecular and genetic analysis of the transferred DNA regions of the root-inducing plasmid of Agrobacterium rhizogenes J Bacteriol 164, 33–44 40 PHỤ LỤC Phụ lục Các thành phần môi trƣờng nuôi cấy Bảng 1: Môi trƣờng MS Thành phần MS I MS II MS III MS IV Hóa chất Hàm lƣợng (mg/L) NH4NO3 1650 KNO3 1900 CaCl2.H2O 440 MgSO4.7H2O 370 KH2PO4 170 H2BO3 6,2 MnSO4.H2O 16,9 ZnSO4.7H2O 8,6 KI 0,83 Na2MoO4.2H2O 0,25 CuSO4.5H2O 0,25 CoCl2.6H2O 0,25 FeSO4.7H2O 28 Na2EDTA 37,5 Myo – inositol 100 Thiamine – HCl (B1) Pyridoxine – HCl (B6) Acide Nicotinique 41 0,5 Bảng Thành phần môi trƣờng YEP Hàm lƣợng (g/L) Thành phần Yeast extract 10 Bacto peptone 10 NaCl Bảng Thành phần môi trƣờng YMB Hàm lƣợng (g/L) Thành phần Yeast extract 0,4 Manitol 10 NaCl 0,1 Mg2SO4.7H2O 0,2 K2HPO4.3H2O 0,65 Phụ lục 2: Thành phần dung dịch nhuộm X – Gluc Thành phần ml X – Gluc 0,1% Triton X-100 0,5 Tris NaCl 44,5 DMSO Tổng 50 42 Phụ lục 3: Thành phần dung dịch đệm tách chiết DNA Thành phần Nồng độ gốc Nồng độ sử dụng Thể tích cần lấy cho 15 ml CTAB Bột 2% 1,5 g Tris HCl (pH=8) 1M 0,1M 1,5 ml 0,5M 0,02M 0,16 ml 5M 1,4M 4,2 ml EDTA (pH=8) NaCl H2O deion 7,64 ml Phụ lục 4: Thành phần phản ứng PCR Thành phần Thể tích (µl) H2O deion 4,3 PCR master mix 2X 7,5 Mồi xuôi 0,6 Mồi ngƣợc 0,6 DNA template Tổng thể tích 15 43