Nghiên cứu nhân nhanh in vitro và bước đầu khảo sát một số yếu tố ảnh hưởng tới khả năng tái sinh từ lớp mỏng tế bào cây khoai lang ruột tím (ipomoea batatas l)

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC   KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐỀ TÀI: “Nghiên cứu nhân nhanh in vitro bước đầu khảo sát số yếu tố ảnh hưởng tới khả tái sinh từ lớp mỏng tế bảo khoai lang ruột tím (Ipomoea batatas L.)” HÀ NỘI, 2021 HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC   KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐỀ TÀI: “NGHIÊN CỨU NHÂN NHANH IN VITRO VÀ BƯỚC ĐẦU KHẢO SÁT MỘT SỐ YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG TỚI KHẢ NĂNG TÁI SINH TỪ LỚP MỎNG TẾ BẢO CÂY KHOAI LANG RUỘT TÍM (IPOMOEA BATATAS L.)” Người thực : Đinh Ngọc Quý Mã sinh viên : 620622 Khóa : 62 Ngành : Công nghệ sinh học Giảng viên hướng dẫn : TS Nông Thị Huệ HÀ NỘI, 2021 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan tồn tất nghiệm đề tài tơi thực Tồn số liệu, kết nghiên cứu khóa luận trung thực chưa công bố cơng trình nghiên cứu trước Tơi xin cam đoan tồn thơng tin trích dẫn sử dụng luận văn trích dẫn rõ nguồn gốc, theo quy định giúp đỡ cho luận văn cảm ơn Hà Nội, ngày tháng năm 2021 Sinh viên Đinh Ngọc Quý i LỜI CẢM ƠN Khóa luận hồn thành cách thành cơng, để đạt điều này, ngồi cố gắng nỗ lực cịn có đồng hành, quan tâm, bảo tận tình thầy cô giáo, cán bộ, bạn bè, anh chị trước phịng thí nghiệp mơn Cơng nghệ sinh học Thực Vật – Khoa Công nghệ sinh học Trước hết, xin gửi lời cảm ơn chân thành tới ban quản lý Học viện Nông nghiệp Việt Nam tạo điều kiện hết mức cho thực khóa luận tốt nghiệp, cảm ơn tới ban chủ nhiệm khoa Công nghệ sinh học thầy cô môn Công nghệ sinh học Thực Vật – Khoa Công nghệ sinh học hỗ trợ, hướng dẫn chia sẻ kiến thức vô quý báu suốt q trình làm khóa luận phịng thí nghiệm mơn Đặc biệt, tơi xin bày tỏ lịng thành kính, biết ơn sâu sắc đến TS Nơng Thị Huệ trực tiếp hướng dẫn, dành thời gian kinh nghiệm quý báu chia sẻ cho từ ngày khóa luận hồn thiện Tơi xin gửi lời cảm ơn đến tồn thể phịng ban Khoa Cơng nghệ sinh học giúp đỡ nhiệt tình anh chị bạn phịng thí nghiệm, tạo điều kiện thuận lợi để hồn thành khóaa luận Và cuối cùng, với tất kính trọng, biết ơn sâu sắc, tơi xin gửi lời biết ơn vơ hạn tới gia đình người thân bạn bè sát cánh, động viên tơi để vượt qua giai đoạn khó khăn áp lực trình thực đề tài Tôi xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày… tháng… năm 2021 Sinh viên thực Đinh Ngọc Quý ii MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN i LỜI CẢM ƠN ii DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT v DANH MỤC BẢNG vi DANH MỤC HÌNH vii I MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề 1.2 Mục đích 1.3 Yêu cầu II TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Giới thiệu chung khoai lang tím 2.1.1 Nguồn gốc 2.1.2 Phân loại 2.1.3 Đặc điểm hình thái 2.1.4 Đôi nét giống khoai lang tím 2.1.5 Tình hình phát triển Việt Nam 2.1.6 Giá trị khoai lang tím 2.2 Tình hình nghiên cứu nuôi cấy mô In vitro khoai lang tím 2.2.1 Tình hình nghiên cứu khoai lang giới 2.2.2 Tình hình nghiên cứu khoai lang tím Việt Nam III VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 11 3.1 Đối tượng, vật liệu, địa điểm thời gian nghiên cứu 11 3.1.1 Đối tượng nghiên cứu 11 3.1.2 Vật liệu nghiên cứu 11 3.1.3 Địa điểm thời gian nghiên cứu 11 3.2 Nội dung phương pháp nghiên cứu 12 3.2.1 Nội dung nghiên cứu 12 3.4 Phương pháp nghiên cứu 15 iii 3.4.1 Phương pháp nuôi cấy lớp mỏng tế bào (Thin cell layer – TCL) 15 3.4.2 Phương pháp chuẩn bị lớp mỏng tế bào 15 3.5 Điều Kiện nuôi cấy: 16 3.6 Xử lý số liệu 16 IV KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 17 4.1 Nghiên cứu giai đoạn nhân nhanh khoai lang ruột tím 17 4.1.1 Ảnh hưởng BA đến khả nhân nhanh chồi in vitro khoai lang tím 17 4.1.2 Ảnh hưởng Kinetin đến khả nhân nhanh chồi in vitro khoai lang tím 19 4.2 Bước đầu nghiên cứu số yếu tố ảnh hướng đến khả tái sinh chồi từ lớp mỏng khoai lang ruột tím 21 4.2.1 Ảnh hưởng BA tới tái sinh chồi từ lớp mỏng tế bào đoạn thân khoai lang tím 21 4.2.2 Ảnh hưởng Kinetin tới tái sinh chồi từ lớp mỏng tế bào đoạn thân khoai lang tím 23 4.2.3 Ảnh hưởng BA IAA tới tái sinh chồi từ lớp mỏng tế bào đoạn thân khoai lang tím 25 4.2.4 Ảnh hưởng Kinetin IAA tới tái sinh chồi từ lớp mỏng tế bào đoạn thân khoai lang tím 27 4.3 Ảnh hưởng môi trường nuôi cấy tới tái sinh chồi từ lớp mỏng tế bào đoạn thân khoai lang tím 28 V KẾT LỤÂN VÀ KIẾN NGHỊ 31 5.1 Kết luận 31 5.2 Kiến nghị 31 TÀI LIỆU THAM KHẢO 32 PHỤ LỤC 34 iv DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT STT Viết tắt Viết đầy đủ MS Murashige - Skoog BA 6-Benzylaminopurine IAA β-indol-acetic acid TCL Thin cell layer lTCL Long thin cell layer tTCL Transverse thinn cell layer CT Công thức NXB Nhà xuất v DANH MỤC BẢNG Bảng 4.1 Ảnh hưởng BA đến khả nhân nhanh chồi khoai lang tím sau tuần 17 Bảng 4.2 Ảnh hưởng Kinetin đến khả nhân nhanh chồi khoai lang tím sau tuần 19 Bảng 4.3 Ảnh hưởng BA tới tái sinh chồi từ lớp mỏng đoạn thân khoai lang tím sau tuần 21 Bảng 4.4 Ảnh hưởng Kinetin đến tái sinh chồi từ lớp mỏng đoạn thân khoai lang tím sau tuần 23 Bảng 4.5 Ảnh hưởng BA IAA tới tái sinh chồi từ lớp mỏng đoạn thân khoai lang tím sau tuần 26 Bảng 4.6 Ảnh hưởng Kinetin IAA tới tái sinh chồi từ lớp mỏng đoạn thân khoai lang tím sau tuần 27 Bảng 4.7 Ảnh hưởng môi trường tới tái sinh chồi từ lớp mỏng đoạn thân sau tuần 29 vi DANH MỤC HÌNH Hình 2.1 Cây khoai lang ngồi tự nhiên Hình 2.2 Củ khoai lang tím Hình 3.1 Mẫu khoai lang tím in vitro tuần tuổi 11 Hình 3.2 Kiểu cắt lớp mỏng đoạn thân khoai lang tím 15 Hình 4.1 Chồi khoai lang tím mơi trường bổ sung nuôi cấy bổ sung BA sau tuần 18 Hình 4.2 Chồi khoai lang tím mơi trường bổ sung nuôi cấy bổ sung Kinetin sau tuần 20 Hình 4.3 Lớp mỏng lTCL đoạn thân khoai lang tím ni cấy mơi trưởng bổ sung BA với nồng độ khác sau tuần 22 Hình 4.4 Lớp mỏng lTCL đoạn thân khoai lang tím ni cấy mơi trưởng bổ sung Kinetin với nồng độ khác sau tuần 24 Hình 4.5 Lớp mỏng lTCL đoạn thân khoai lang tím ni cấy mơi trưởng bổ sung BA IAA với nồng độ khác sau tuần 26 Hình 4.6 Lớp mỏng lTCL đoạn thân khoai lang tím ni cấy môi trưởng bổ sung Kinetin IAA với nồng độ khác sau tuần 28 Hình 4.7 Lớp mỏng lTCL đoạn thân khoai lang tím ni cấy mơi trường khống với nồng độ khác sau tuần 29 vii I MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề Khoai lang loại lương thực chủ đạo hầu hết quốc gia nông nghiệp, Theo số liệu thống kê Tổ chức Lương thực – Nông nghiệp giới (FAO), độ hữu ích khoai lang thống kê với 77% làm lương thực, 13% làm thức ăn gia súc, 3% làm nguyên liệu chế biến, 6% bị thải bỏ đi, việc sử dụng khoai lang tuỳ vào mục đích sử dụng định hướng phát triển quốc gia Khoai lang tím Nhật Bản (Ipomoea batatas) có giá trị dinh dưỡng giá trị kinh tế cao Đây nguyên liệu dùng nhiều công nghệ chế biến thực phẩm, tạo mặt hàng chủ lực Okinawa, Nhật Bản Giống khoai lang Nhật phù hợp dùng để ăn tươi, chế biến, xuất Tuy khoai lang tím có tiềm việc sản xuất quy mơ lớn lại gặp nhiều khó khăn việc quy hoạch bền vững cải thiện tiêu chuẩn giống Mặt khác Trung Quốc thị trường tiêu thụ cho mặt hàng khoai lang ruột tím nhu cầu chất lượng, kiểm định nghiêm ngặt Chất lượng khoai lang chưa tốt điểm trừ khiến giá khoai lang không ổn định làm cho đời sống bà nơng dân gặp nhiều khó khăn Để khắc phục tình trạng thối hố giống việc tiến hành phục tráng chọn tạo giống mục tiêu cấp bách mà nhà quản lý hướng tới Tuy nhiên để cải tiến giống khoai lang theo phương pháp truyền thống nhiều thời gian để có đặc tính ban đầu Việc áp dụng kỹ thuật nhân giống vơ tính in vitro sử dụng đoạn thân mang mắt ngủ, đỉnh sinh trưởng áp dụng nhiều số giống khoai lang khác khoai lang Nhật, HNV1…và đạt thành công định, nhiên hệ số nhân giống chưa thực cao Do vậy, việc tìm phương pháp nuôi cấy in vitro phù để cải thiện quy trình vi nhân giống khoai lang cần thiết Kĩ thuật nuôi cấy lớp mỏng tế bào (thin cell layer - TCL) kỹ thuật mà mẫu cấy từ phận khác lá, cuống lá, thân, thân rễ Như vậy, qua thí nghiệm nhân thấy Kinetin khơng thích hợp với mơi trường nhân nhanh khoai lang tím 4.2 Bước đầu nghiên cứu số yếu tố ảnh hướng đến khả tái sinh chồi từ lớp mỏng khoai lang ruột tím 4.2.1 Ảnh hưởng BA tới tái sinh chồi từ lớp mỏng tế bào đoạn thân khoai lang tím Thí nghiệm bố trí ni cấy mơi trường MS, 6g agar/l môi trường, 20% nước dừa, 30g đường/ lít mơi trường, pH 5,8 bổ sung chất điều tiết sinh trưởng BA nồng độ khác Mẫu đoạn thân cắt theo chiều dọc tạo thành mẫu lớp mỏng; mẫu lớp mỏng có kích thước (0,5mm x 10mm) Sau tuần quan sát, kết thể qua hình 4.1 bảng 4.1 : Bảng 4.3 Ảnh hưởng BA tới tái sinh chồi từ lớp mỏng đoạn thân khoai lang tím sau tuần Cơng thức Nồng độ BA (mg/l) Tỷ lệ tái sinh chồi (%) Tỉ lệ tạo mơ sẹo (%) Hình thái mơ sẹo CT (Đ/c) 0,0 0% 33,33% + CT 0,5 0% 100% ++ CT 1,0 0% 100% ++ CT 1,5 0% 100% ++ CT 2,0 0% 100% +++ Ghi chú: (+): Mơ sẹo phát triển kém, hóa nâu, chết (++): Mơ sẹo cứng, phát triển bình thường (+++): Mơ sẹo cứng, phát triển tốt 21 Hình ảnh 4.3 Lớp mỏng lTCL đoạn thân khoai lang tím ni cấy môi trưởng bổ sung BA với nồng độ khác sau tuần Qua hình 4.3 cho thấy, sau tuần theo dõi, tất công thức khơng có tái sinh chồi từ lớp mỏng tế bào đoạn thân, mẫu ni cấy hình thành mơ seo Mơ sẹo phát triển tốt, cứng, có màu xanh có tiềm tái sinh chồi từ mơ sẹo Ở công thức đối chứng không bổ sung CĐTST tỉ lệ tạo mô sẹo đạt 33%, trình phát triển, có tượng mơ sẹo bị hóa nâu Ở tất cơng thức có bổ sung BA, tỷ lệ tạo mô sẹo đạt 100%, mô sẹo có hình thái cứng, màu xanh, phát triển mơ sẹo rõ ràng nồng độ BA 2,0 mg/l Mẫu mơ sẹo có hình thành rễ bất định, ít, hình thái rễ ngắn, tập 22 trung vào mẫu cắt gần gốc chồi Theo Jonathan Amponsah cộng (2014), nghiên cứu phát triển mô sẹo tăng lên nồng độ Cytokinin môi trường nuôi cấy tăng lên, hồn tồn hợp lý với phát triển mơ sẹo nồng độ mg/l BA so với nồng độ thấp BA nồng độ mg/l khơng có hiệu việc tái sinh chồi trực tiếp từ lớp mỏng, nhiên callus thu có tiềm phát triển chồi nên sử dụng callus thu để tái sinh chồi 4.2.2 Ảnh hưởng Kinetin tới tái sinh chồi từ lớp mỏng tế bào đoạn thân khoai lang tím Thí nghiệm bố trí ni cấy mơi trường MS, 6g agar/l môi trường, 20% nước dừa, 30g đường/ lít mơi trường, pH 5,8 bổ sung chất điều tiết sinh trưởng Ki nồng độ khác Mẫu đoạn thân cắt theo chiều dọc tạo thành mẫu lớp mỏng; mẫu lớp mỏng có kích thước (0,5mm x 10mm) Sau tuần quan sát, kết thể qua hình bảng 4.2 hình 4.2: Bảng 4.4 Ảnh hưởng Kinetin đến tái sinh chồi từ lớp mỏng đoạn thân khoai lang tím sau tuần Nồng độ Tỷ lệ tái Kinetin sinh chồi (mg/l) (%) (Đ/c) 0,0 0% 33,33% + CT 0,5 0% 53,33% + CT 1,0 0% 80% ++ CT 1,5 0% 80% ++ CT 2,0 0% 86,67% ++ Công thức CT Tỉ lệ tạo mô sẹo (%) Ghi chú: (+): Mô sẹo phát triển kém, hóa nâu, chết (++): Mơ sẹo cứng, phát triển bình thường 23 Hình thái mơ sẹo Hình 4.4 Lớp mỏng lTCL đoạn thân khoai lang tím nuôi cấy môi trưởng bổ sung Kinetin với nồng độ khác sau tuần Qua hình 4.2 bảng 4.2 cho thấy, sau tuần theo dõi tất cơng thức khơng có tái sinh chồi từ lớp mỏng tế bào đoạn thân, mẫu ni cấy hình thành mơ sẹo Ở cơng thức đối chứng không bổ sung CĐTST tỷ lệ tạo mơ sẹo đạt 33,33%, q trình phát triển Tỷ lệ mơ sẹo hình thành nồng độ Ki 2,0 mg/l cao với tỷ lệ 86,67% Mô sẹo nhỏ, phần lớn xuất vết thương Xuất rễ bất định, rễ dài, hình thành rễ xảy hầu hết mẫu lớp mỏng gần gốc chồi Mẫu mô sẹo nồng độ Kinetin 2,0 mg/l cho hình thái mơ sẹo tốt nhất, có màu xanh lục, cứng chất lượng mơ sẹo 24 tốt, tỉ lệ mẫu bị hóa nâu chết thấp so với nồng độ lại Theo nghiên cứu Hà Thị Mỹ Ngân cộng (2020) cho thấy việc hố nâu mẫu thí nghiệm bổ sung Kinetin dẫn tới việc hoại tử mẫu cấy, điều đuợc lý giải hoạt tính cytokinin Kinetin yếu so với BA Kinetin nồng độ mg/l khơng có hiệu việc tái sinh chồi trực tiếp từ lớp mỏng, nhiên callus thu có tiềm phát triển chồi nên sử dụng callus thu để tái sinh chồi 4.2.3 Ảnh hưởng BA IAA tới tái sinh chồi từ lớp mỏng tế bào đoạn thân khoai lang tím IAA Auxin tự nhiên, Auxin có tác dụng tốt tới trình sinh trưởng tế bào, hoạt động tầng phát sinh, hình thành rễ, tượng ưu ngọn, tính hướng thực vật, sinh trưởng tạo khơng hạt (Ngơ Xn Bình, 2009) Dựa kết công bố cộng (2015) dựa vào quan sát hình thái mơ sẹo qua thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng BA tới lớp mỏng đoạn thân, sử dụng nồng độ BA mg/l cho thí nghiệm ảnh hưởng phối hợp chất điều tiết sinh trưởng đến tái sinh chồi từ lớp mỏng đoạn thân khoai lang việc bổ sung thêm chất điều tiết sinh trưởng Auxin, cụ thể IAA Thí nghiệm bố trí ni cấy mơi trường MS, 6g agar/l môi trường, 20% nước dừa, 30g đường/l, BA mg/l môi trường, pH 5,8 bổ sung chất điều tiết sinh trưởng IAA nồng độ khác Mẫu đoạn thân cắt theo chiều dọc tạo thành mẫu lớp mỏng; mẫu lớp mỏng có kích thước (0,5mm x 10mm) Sau tuần quan sát, kết thể qua hình 4.3 bảng 4.3 : 25 Bảng 4.5 Ảnh hưởng BA IAA tới tái sinh chồi từ lớp mỏng đoạn thân khoai lang tím sau tuần Công thức Nồng độ BA (mg/l) Nồng độ IAA (mg/l) Tỷ lệ tái sinh chồi (%) Tỉ lệ tạo mơ sẹo (%) Hình thái mơ sẹo CT1 (Đ/c) 0,0 0% 100% + CT2 0,25 0% 100% + CT3 0,5 0% 100% + Ghi chú: (+): Mô sẹo xanh, cứng, phát triển tốt Hình 4.5 Lớp mỏng lTCL đoạn thân khoai lang tím ni cấy môi trưởng bổ sung BA IAA với nồng độ khác sau tuần Dựa theo bảng 4.5 hình 4.5, sau tuần theo dõi tất cơng thức khơng có tái sinh chồi từ lớp mỏng tế bào đoạn thân, mẫu nuôi cấy hình thành mơ sẹo Mơ sẹo phát triển tốt, cứng có màu xanh có tiềm phát triển chồi Tỉ lệ tạo mô sẹo 100% với tất nồng độ Với môi trường bổ sung mg/l BA gần khơng có hình thành rễ bất định, mơi trường có bổ sung thêm 0,5 mg/l IAA cho khả tạo rễ bất định tốt nhất, tỷ lệ tạo rễ cao, rễ dài có phân hóa rễ rõ rệt Theo Jin Hee Kim cộng (2015), việc sử dụng chất điều tiết sinh trưởng BA kết hợp với IAA với vật mẫu sử dụng lóng thân khoai lang cho hình thái mơ sẹo cứng khó bị phá vỡ, 26 hình thái mơ sẹo có tương đồng cao với kết tơi Tỉ lệ hình thành chồi môi trường bổ sung 0,5 mg/L IAA 1,0 mg/L BA, 0.5 mg/L IAA 10,0 mg/L BA 0% tỉ lệ hình thành rễ 20% 25% cho thấy việc kết hợp BA IAA chưa cho thấy tái sinh chồi từ mơ sẹo Khơng có khác nhiều hình thái mơ sẹo cơng thức, ngoại trử việc xuất rễ mô sẹo bổ sung IAA 4.2.4 Ảnh hưởng Kinetin IAA tới tái sinh chồi từ lớp mỏng tế bào đoạn thân khoai lang tím Dựa theo kết nghiên cứu Melissa S Smith cộng (2019) dựa quan sát hình thái mơ sẹo qua thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng Kinetin tới lớp mỏng đoạn thân, sử dụng nồng độ Kinetin mg/l cho thí nghiệm ảnh hưởng phối hợp chất điều tiết sinh trưởng đến tái sinh chồi từ lớp mỏng đoạn thân khoai lang việc bổ sung thêm chất điều tiết sinh trưởng Auxin, cụ thể IAA Thí nghiệm bố trí ni cấy mơi trường MS, 6g agar/l mơi trường, 20% nước dừa, 30g đường/l, Kinetin mg/l môi trường, pH 5,8 bổ sung chất điều tiết sinh trưởng IAA nồng độ khác Mẫu đoạn thân cắt theo chiều dọc tạo thành mẫu lớp mỏng; mẫu lớp mỏng có kích thước (0,5mm x 10mm) Sau tuần quan sát, kết thể qua hình 4.4 bảng 4.4: Bảng 4.6 Ảnh hưởng Kinetin IAA tới tái sinh chồi từ lớp mỏng đoạn thân khoai lang tím sau tuần Cơng thức CT1 (Đ/c) CT2 CT3 Nồng độ Kinetin (mg/l) Nồng độ IAA (mg/l) Tỷ lệ tái sinh chồi (%) Tỉ lệ tạo mô sẹo (%) Hình thái mơ sẹo 0,0 0% 86,67% + 2 0,25 0,5 0% 0% 80% 100% + ++ Ghi chú: (+): Mơ sẹo màu xanh, cứng, phát triển bình thường (++): Mô sẹo xanh, cứng, phát triển tốt 27 Hình 4.6 Lớp mỏng lTCL đoạn thân khoai lang tím ni cấy mơi trưởng bổ sung Kinetin IAA với nồng độ khác sau tuần Dựa theo bảng 4.6 hình 4.6, sau tuần theo dõi tất cơng thức khơng có tái sinh chồi từ lớp mỏng tế bào đoạn thân, mẫu ni cấy hình thành mơ sẹo Mơ sẹo phát triển tốt, cứng có màu xanh có tiềm phát triển chồi Tỉ lệ hình thành mô sẹo nồng độ mg/l 0,5 mg/l IAA cho tỉ lệ hình thành mơ sẹo cao (100%), hình thái mơ sẹo tốt, có tượng mơ sẹo bị hóa nâu Rễ bất định hình thành phát triển tốt, khơng đồng mẫu Theo nghiên cứu F Addae-Frimpomaah, J Amponsah T.K Tengey (2014) cho thấy với nồng độ cytokinin thấp tới từ BA Kinetin tỉ lệ tạo chồi từ mô sẹo thấp, tăng nồng độ cytokinin lên có tăng sinh chồi rõ rệt từ mô sẹo Nghiên cứu cho thấy phát triển mô sẹo môi trường bổ sung Kinetin tương đối so với mơi trường bổ sung BA Điều lý giải hoạt tính BA mạnh nhiều so với Kinetin (Ngơ Xn Bình, 2009) Như cho việc sử dụng BA đơn lẻ kết hợp với IAA cho khả tạo mô sẹo từ lớp mỏng đoạn thân tốt Kinetin đơn lẻ, kết hợp 4.3 Ảnh hưởng môi trường nuôi cấy tới tái sinh chồi từ lớp mỏng tế bào đoạn thân khoai lang tím Dựa theo thí nghiệm ảnh hưởng chất điều tiết sinh trưởng tới tái sinh chồi từ lớp mỏng đoạn thân khoai lang tím, dựa kết công bố Jin Hee Kim cộng (2015) dựa quan sát hình thái 28 mơ sẹo qua thí nghiệm, sử dụng nồng độ BA mg/l IAA 0,5 mg/l để tiếp tục cho thí nghiệm ảnh hưởng môi trường nuôi cấy đến tái sinh chồi từ lớp mỏng đoạn thân khoai lang tím Thí nghiệm bố trí ni cấy mơi trường có bổ sung 6g agar/l mơi trường, 20% nước dừa, 30g đường/l, BA mg/l IAA 0,5 mg/l môi trường, pH 5,8 thay đổi môi trường MS với tỉ lệ khác Mẫu đoạn thân cắt theo chiều dọc tạo thành mẫu lớp mỏng; mẫu lớp mỏng có kích thước (0,5mm x 10mm) Sau tuần quan sát, kết thể qua hình 4.5 bảng 4.5: Bảng 4.7 Ảnh hưởng môi trường tới tái sinh chồi từ lớp mỏng đoạn thân sau tuần Công thức Nền môi trường Tỷ lệ tạo chồi Tỷ lệ tạo mơ sẹo (%) (%) Hình thái mơ sẹo CT1 (Đ/c) MS 0% 100% ++ CT2 ½MS 0% 100% ++ CT3 ¼MS 0% 20% + Ghi chú: (+): Mơ sẹo phát triển kém, hóa nâu, chết (++): Mơ sẹo cứng, phát triển bình thường Hình 4.7 Lớp mỏng lTCL đoạn thân khoai lang tím ni cấy mơi trường khoáng với nồng độ khác sau tuần 29 Dựa theo bảng 4.5 hình 4.5, sau tuần theo dõi có hình thành mơ sẹo từ mẫu cắt dọc đoạn thân khoai lang tím Nhưng khơng có hình thành chồi từ mơ sẹo Mơ sẹo có màu xanh, xanh tím, cứng phát triển tốt Xuất rễ mơi trường MS ½MS, mơi trường ¼MS khơng xuất rễ Khả tạo rễ môi trường MS cao môi trường ½MS Sau thời gian khoảng tuần theo dõi, 80% mẫu mơ sẹo mơi trường ¼MS 26,67% mẫu mơ sẹo mơi truờng ½MS có tượng hóa nâu Theo nghiên cứu Hà Thị Mỹ Ngân cộng (2020), việc mơ sẹo bị hố nâu hoại tử mẫu cấy thiếu hụt chất dinh duỡng gây Yếu tố gián tiếp giải thích khơng tạo thành rễ mơi truờng ¼MS 30 V KẾT LỤÂN VÀ KIẾN NGHỊ 5.1 Kết luận − Mơi trường thích hợp cho nhân nhanh chồi khoai lang tím là: MS + 1,5 mg/l BA + 30 g/l đường + g/l agar, pH 5,8 Hệ số nhân đạt 3,87 chồi , chiều cao chồi đạt 4,22 cm, chồi sinh trưởng phát triển tốt − Việc sử dụng BA, Kinetin đơn lẻ kết hợp với IAA chưa thành công việc tái sinh chồi từ lớp mỏng đoạn thân khoai lang tím − Các mơ sẹo tạo từ thí nghiệm có tiềm phát sinh chồi 5.2 Kiến nghị Tiếp tục nghiên cứu bố trí thí nghịêm sử dụng yếu tố ảnh huởng tới tái sinh chồi từ lớp mỏng khoai lang tím 31 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt Vũ Thuý Hang, Hà Thị Anh Thu, Vũ Đình Hịa (2016) Xây dựng quy trình tái sinh khoai lang, Ipomoea batatas (L.) Lam., hiệu sử dụng đốt mang mắt ngủ làm mô cấy Vietnam J Agri Sci 2016, 10(14), 1491 -1501 Mai Vũ Duy, Nguyễn Chí Dũng, Võ Thị Huyền Trân (2015) Khảo Sát Ảnh Hưởng Của Benzyladenine (Ba), Ki, Gibberelic Acid (Ga ), Napthalene Acetic Acid (NAA) Đến Sự Tái Sinh Chồi Và Nhân Chồi Khoai Lang Tím Nhật (Ipomoea batatas lam.) Bằng nuôi cấy đỉnh sinh trưởng tóm tắt Journal of Science, 7(3), 1–7 La Việt Hồng, Đinh Thị Ngọc Lý, Phạm Thị Thi (2020) Nghiên Cứu Tạo Hạt Nhân Tạo Từ Đốt Thân Cây Khoai Lang Hồng Long (Ipomoea batatas) Tạp chí Khoa học Công nghệ Nông nghiệp Việt Nam, 12(121), - 11 Lương Thị Ngọc Tú, Trần Đình Hợp, Trần Thị Thanh Phương, Nguyễn Nữ Thanh Linh, Nguyễn Thị Thanh Tâm (2019) Nghiên Cứu Nhân Giống Khoai Lang Nhật Bằng Phương Pháp Ni Cấy Mơ Tế Bào Tạp chí Khoa học Công nghệ Nông nghiệp Việt Nam, 7(104), 54 - 57 Vũ Thị Lan, Nguyễn Thị Nga, Nguyễn Đình Trọng, Phạm Bích Ngọc, Chu Hồng Hà, Lê Trần Bình (2013) Hiệu Quả Của Aba Và Ga Lên Quá Trình Tạo Đa Chồi Từ Mô Sẹo Ở Khoai Lang Ipomoea batatas (L.) Lam Tạp chí Cơng nghệ Sinh học 11(4): 727-734 Nguyễn Thị Thuý Ngọc (2018) Bước đầu nhân in vitro giống khoai lang cao sản HNV1 Ngô Xn Bình (2009) Ni Cấy Mơ Tế Bào Thực Vật Cơ Sở Lý Luận Và Ứng Dụng NXB Khoa học Kỹ thuật Nguyễn Thị Lý Anh, Đinh Thị Phòng (2007) Công nghệ nuôi cấy mô NXB Nông nghiệp Nguyễn Thị Lan, Phạm Tiến Dũng (2006) Giáo trình phương pháp thí nghiệm NXB Nơng nghiệp 10 Trịnh Xn Ngọ, Đinh Thế Lộc (?) Cây có củ kỹ thuật thâm canh (Quyển 1) khoai lang NXB Lao động xã hội 11 Mai Thạch Hồnh, Nguyễn Cơng Vinh (2015) Giống Và Kỹ Thuật Thâm Canh Cây Có Củ NXB Nơng nghiệp Tài liệu nước ngồi: 12 Kassahun Alula, H Zeleke, M Manikandan (2018) In vitro propagation of sweet potato (Ipomoea batatas (L.) Lam) through apical meristem culture Journal of Pharmacognosy and Phytochemistry 2018, 7(1), 2386-2392 13 T Getu, Tileye Feyissa (2012) In vitro regeneration of sweet potato (Ipomoea batatas (L.) Lam.) Convolvulaceae, from leaf and petiole explants Ethiopian Journal of Biological Sciences 2012, 2(11) 14 Berihu Mengs, Meseret Chimdessa, Eyasu Abraha(2018) In vitro propagation of sweet potato (Ipomoea batatas (l.) Lam.) Through lateral bud culture IJIPSR, (07), 1–12 15 Yaser Hassan Dewir1, Abdulhakim A Aldubai, Mafatlal M Kher, Abdullah A Alsadon1, Salah El-Hendawy, and Nasser A Al-Suhaibani (2020) Optimization of media formulation for axillary shoot multiplication of the red-peeled sweet potato (Ipomoea batatas [L.] Lam.) ‘Abees.’ Chilean Journal of Agricultural Research, 80(1), 3–10 32 16 Belachew Beyene et al (2020) Protocol optimization for in vitro propagation of Kulfo, orange flesh sweet potato (Ipomoea batatas) variety using shoot tip culture African Journal of Plant Science, 4(10), 395–401 17 Guillermo E Delgado-Paredes, Consuelo Rojas Idrogo, Jorge Chanamé-Céspedes, Eny I S Floh and Walter Handro (2016) In vitro direct organogenesis in roots of Ipomoea batatas Asian Journal of Plant Science and Research , 6(3), 17–27 18 A.S Abubakar, S.U Yahaya, A.S Shaibu, H Ibrahim, A.K Ibrahim, Z.M Lawan and A.M Isa (2018) In vitro propagation of sweet potato (Ipomoea batatas (L.) Lam.) cultivars Agricultural Science Digest - A Research Journal, 38(01), 17–21 19 Melissa S Smith and ET Blay (2019) Responses of four sweet potato (Ipomoea batatas L.) Accessions to in vitro regeneration and slow growth preservation Agri Res& Tech: Open Access J 2019; 22(4): 556210 20 Jin Hee Kim, Kyung-Min Kim & Byung-Wook Yun (2015) Establishment of a One-Step Plant Regeneration System in Sweet Potato (Ipomoea batatas [L.] Lam.) G.J.B.A.H.S.,Vol.4(2), 48–55 21 Donald Ugent and Linda W Peterson (1983), Archeological remains of potato and sweetpotato tubers from the Casma Valley in Peru, Spanish, Bol.Lima 5(25), 28-44 22 Murashige, T and Skoog, F (1962) A Revised Medium for Rapid Growth and Bio Assays with Tobacco Tissue Cultures Physiol Plantarum 15: 473 – 497 23 Engel F 1970 Exploration of the Chilca Canyon, Peru Curr Anthropol 11:55–58 24 Frederic Engle (1970) Exploration of the Chilca Canyon, Peru Curr Anthropol 11: 55– 58 Tài liệu tham khảo từ hệ thống Internet: 25 Trung tâm liệu thực vật Việt Nam – Convolvulaceae - Họ Khoai lang http://www.botanyvn.com/cnt.asp?param=edir&v=Convolvulaceae&list=familia 26 Diện tích khoai lang trồng nước năm 2019 – Thông tin điện tử Tổng cục Thống kê www.gso.gov.vn 27 Sản lượng khoai lang trồng nước năm 2019 – Thông tin điện tử Tổng cục Thống kê www.gso.gov.vn 33 PHỤ LỤC Thí nghiệm 1: Ảnh hưởng BA đến khả nhân nhanh đỉnh sinh trưởng khoai lang tím Analysis of variance Chieu cao choi Variable N Chieu cao choi 25 R² 0.92 Analysis of variance table S.V SS df Model 13.61 Nong BA 13.61 Error 1.11 20 Total 14.73 24 Adj R² 0.91 CV 8.20 (Partial SS) MS F p-value 3.40 61.22