ĐẶT VẤN ĐỀ...................................................................................................1 CHƯƠNG I: TỔNG QUAN.............................................................................2 1.1. TỔNG QUAN VỀ CHI Zanthoxylum.....................................................2 1.1.1. Vị trí phân loại chi Zanthoxylum.......................................................2 1.1.2. Đặc điểm thực vật chi Zanthoxylum.................................................2 1.1.3. Phân bố chi Zanthoxylum..................................................................3 1.1.4. Thành phần hóa học của 1 số loài thuộc chi Zanthoxylum...............3 1.1.5. Tác dụng sinh học của chi Zanthoxylum L.......................................8 1.2. TỔNG QUAN VỀ CÂY HOÀNG MỘC LEO.....................................10 1.2.1. Đặc điểm thực vật...........................................................................10 1.2.2. Phân bố và thu hái...........................................................................11 1.2.3. Thành phần hóa học........................................................................11 1.2.4. Tác dụng của cây Hoàng mộc leo...................................................14 CHƯƠNG II. NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU16 2.1. ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU..............................................................16 2.2. NGUYÊN VẬT LIỆU...........................................................................16 2.2.1. Nguyên liệu.....................................................................................16 2.2.2. Dung môi và hóa chất.....................................................................16 2.2.3. Thiết bị nghiên cứu.........................................................................16 2.2.4. Dụng cụ nghiên cứu........................................................................17 2.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU.........................................................17 2.3.1. Chiết xuất........................................................................................17 2.3.2. Phân lập các hợp chất......................................................................17
Trang 1BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ QUỐC PHỊNG
HỌC VIỆN QN Y
NGƠ THỊ NGỌC ÁNH
NGHIÊN CỨU CHIẾT XUẤT, PHÂN LẬP MỘT SỐHỢP CHẤT TỪ CÂY HOÀNG MỘC LEO
(Zanthoxylum scandens Blume)
Trang 2BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ QUỐC PHỊNG
HỌC VIỆN QN Y
NGƠ THỊ NGỌC ÁNH
NGHIÊN CỨU CHIẾT XUẤT, PHÂN LẬP MỘT SỐHỢP CHẤT TỪ CÂY HOÀNG MỘC LEO
(Zanthoxylum scandens Blume)
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ ĐẠI HỌC
Cán bộ hướng dẫn
ThS Nguyễn Văn Liệu
Trang 3LỜI CẢM ƠN
Trong q trình thực hiện khóa luận, em đã nhận được rất nhiều sự giúpđỡ quý báu của các thầy cơ, gia đình và bạn bè để em có thể hồn thành khóaluận này một cách tốt nhất.
Đầu tiên, em xin được bày tỏ lòng biết ơn và gửi lời cảm ơn chân thành
nhất đến ThS Nguyễn Văn Liệu, người thầy ln tận tình hướng dẫn và tạo
mọi điều kiện giúp đỡ em trong suốt quá trình nghiên cứu và thực hiện khóaluận này.
Em cũng xin chân thành cảm ơn TS Nguyễn Văn Thư đã cho em
nhiều ý kiến q báu để hồn thành khóa luận này.
Em xin gửi lời cảm ơn của mình tới Ban Giám đốc Học Viện Quân Y,Viện Đào Tạo Dược đã tạo mọi điều kiện thuận lợi nhất cho em trong suốt 5năm học tập tại trường.
Em cũng xin gửi lời cảm ơn chân thành nhất tới các thầy cô giáo và cáckĩ thuật viên của bộ môn Dược liệu – Dược học cổ truyền nói riêng cũng nhưtồn thể các thầy cô giáo và các kĩ thuật viên của Viện Đào Tạo Dược, HọcViện Quân Y đã luôn chỉ dạy tận tình và tạo mọi điều kiện giúp đỡ em trongsuốt quá trình học tập và nghiên cứu.
Cuối cùng, em xin gửi lời cảm ơn tới gia đình, người thân và bạn bè,những người đã luôn ở bên, động viên và giúp đỡ em vượt qua những khókhăn trong q trình thực hiện khóa luận này.
Em xin trân trọng cảm ơn tất cả những giúp đỡ quý báu này!Hà Nội, ngày 11 tháng 6 năm 2019
Trang 4MỤC LỤC
DANH MỤC CÁC BẢNGDANH MỤC CÁC HÌNH
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT
ĐẶT VẤN ĐỀ 1
CHƯƠNG I: TỔNG QUAN 2
1.1 TỔNG QUAN VỀ CHI Zanthoxylum 2
1.1.1 Vị trí phân loại chi Zanthoxylum .2
1.1.2 Đặc điểm thực vật chi Zanthoxylum .2
1.1.3 Phân bố chi Zanthoxylum 3
1.1.4 Thành phần hóa học của 1 số lồi thuộc chi Zanthoxylum .3
1.1.5 Tác dụng sinh học của chi Zanthoxylum L .8
1.2 TỔNG QUAN VỀ CÂY HOÀNG MỘC LEO 10
1.2.1 Đặc điểm thực vật 10
1.2.2 Phân bố và thu hái 11
1.2.3 Thành phần hóa học 11
1.2.4 Tác dụng của cây Hoàng mộc leo 14
CHƯƠNG II NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU162.1 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU 16
2.2 NGUYÊN VẬT LIỆU 16
2.2.1 Ngun liệu 16
2.2.2 Dung mơi và hóa chất 16
2.2.3 Thiết bị nghiên cứu .16
2.2.4 Dụng cụ nghiên cứu 17
2.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .17
2.3.1 Chiết xuất 17
Trang 52.3.3 Xác định cấu trúc của các hợp chất phân lập được .19
2.4 ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU 19
CHƯƠNG III KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 20
3.1 CHIẾT XUẤT, PHÂN LẬP CÁC HỢP CHẤT 20
3.1.1 Chiết xuất 20
3.1.2 Phân lập các hợp chất từ cắn phân đoạn n-hexan 20
3.2 NHẬN DẠNG CHẤT PHÂN LẬP 26
3.2.1 Nhận dạng hợp chất HM-1 26
3.2.2 Nhận dạng hợp chất HM-2 30
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .34TÀI LIỆU THAM KHẢO
Trang 6DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 3.1 Kết quả thu được sau khi tiến hành sắc ký cột phân đoạn n-hexan 22
Bảng 3.2 Dữ liệu phổ 1H- NMR và 13C-NMR của chất HM-1a .28
Trang 7DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình 1.1 CTCT của một số tinh dầu được phân lập từ một sơ lồi thuộc chi
Zanthoxylum 4
Hình 1.2 CTCT của một số alcaloid được phân lập từ một số lồi thuộc chi Zanthoxylum 6
Hình 1.3 CTCT của một số coumarin được phân lập từ một số loài thuộc chi Zanthoxylum 7
Hình 1.4 CTCT của một số flavonoid được phân lập từ một sơ lồi thuộc chi Zanthoxylum 8
Hình 1.5 Hình ảnh cây Hồng mộc leo .10
Hình 1.6 CTCT của một số chất được phân lập từ Z.scandens 13
Hình 3.1 Sắc ký đồ TLC cắn n-hexan, hệ dung mơi n-hexan: aceton (7:1) .21Hình 3.2 Sơ đồ phân lập các chất từ phần cắn n-hexan .22
Hình 3.3 Sắc ký đồ TLC phân đoạn H3 khai triển với các hệ dung mơi .23
Hình 3.4 Sắc ký đồ TLC chất HM-1, hệ dung mơi DCM : EtOAc (30:1) 24
Hình 3.5 Sắc ký đồ TLC phân đoạn H4 khai triển với các hệ dung mơi .24
Hình 3.6 Sắc ký đồ TLC chất HM-2, hệ dung môi n-hexan : EtOAc (3:1) 25
Trang 8DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT
Z.Zanthoxylum
CTCT Công thức cấu tạo
SKLM Sắc ký lớp mỏng
DCM Dicloromethan
EtOAc Ethyl acetat
Rf Hệ số di chuyển
1H-NMR Cộng hưởng từ hạt nhân proton (Proton NuclearMagnetic Resonance
13C-NMR Cộng hưởng từ hạt nhân cacbon 13 (Carbon -13Nuclear Magnetic Resonance)
HSQC Phổ tương tác gần 13C – 1H (Heteronuclear SingleQuantum Correlation)
HMBC Phổ tương tác xa 13C – 1H (Heteronuclear MultipleBond Correlation)
s Tín hiệu đơn (singlet)
d Tín hiệu đơi (doublet)
dd Doublet of doublet
t Tín hiệu ba (triplet)
m Đa tín hiệu (multiplet)
J Hằng số tương tác
δ Độ dịch chuyển hóa học
IC50 Nồng độ ức chế 50%
Trang 9ĐẶT VẤN ĐỀ
Ngày nay, cùng với sự phát triển của ngành tổng hợp hóa dược; cơng tácnghiên cứu, phát triển thảo dược và sản phẩm có nguồn gốc từ thảo dược đang làvấn đề thu hút được sự quan tâm của rất nhiều quốc gia trên thế giới.
Nước ta với diện tích khoảng 330.000 km2, nằm trong vùng khí hậu nhiệtđới gió mùa cận xích đạo nên nhiệt độ hàng năm khá cao (khoảng từ 22 – 35oC).Lượng mưa hàng năm lớn tạo cho nước ta một hệ thực vật đa dạng và phongphú, một tiềm năng to lớn về tài nguyên cây thuốc nói riêng và tài nguyên dượcliệu nói chung Theo số liệu thống kê gần đây của Viện Dược liệu, hệ thực vậtViệt Nam có khoảng 12.000 lồi [10]; đặc biệt tính đến năm 2017, Việt Nam đãghi nhận 5.117 lồi, riêng thuộc nhóm thực vật bậc cao có mạch có tới hơn 5.000lồi có cơng dụng làm thuốc Đây là nguồn tài nguyên thiên nhiên rất quý báucủa đất nước.
Bên cạnh đó, với sự hỗ trợ của nhiều ngành khoa học công nghệ hiện đạivà các kỹ thuật tiên tiến, các nhà khoa học đã và đang phát hiện ra nhiều hợpchất có hoạt tính sinh học trong các loài thảo dược Nhiều hợp chất đã được đưavào ứng dụng một cách có hiệu quả trong rất nhiều lĩnh vực như công nghiệpdược phẩm, hương liệu mỹ phẩm cũng như thực phẩm Tuy nhiên, trên thực tếcó rất nhiều cây thuốc đã được sử dụng để chữa bệnh theo kinh nghiệm dân giannhưng cho đến nay thì vẫn chưa được nghiên cứu một cách đầy đủ.
Cây Hoàng mộc leo (Zanthoxylum scandens Blume) là cây bụi leo, phân
bố chủ yếu ở vùng núi và trung du nước ta Phần rễ, vỏ thân và lá Hoàng mộcleo từ lâu đã được sử dụng trong dân gian để chữa một số bệnh như đau bụng,đau răng, thấp khớp và chấn thương Đặc biệt, một số nghiên cứu trên thế giới,
từ vỏ thân Z.scandens các nhà khoa học đã phân lập được 14 hợp chất có tác
Trang 10leo, em tiến hành đề tài: “Nghiên cứu chiết xuất, phân lập một số hợp chất từ
cây Hoàng mộc leo (Zanthoxylum scandens Blume)” với các mục tiêu sau:
1 Chiết xuất và phân lập được một số hợp chất từ cây Hồng mộc leo.
2 Xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất phân lập được.
CHƯƠNG I: TỔNG QUAN
1.1 TỔNG QUAN VỀ CHI Zanthoxylum
1.1.1 Vị trí phân loại chi Zanthoxylum
Theo hệ thống phân loại thực vật của Takhtajan (2009), chi
Zanthoxylum có vị trí phân loại như sau [40]:
Giới thực vật (Plantae)
Ngành: Ngọc Lan (Magnoliophyta)
Lớp: Ngọc Lan (Magnoliopsida)
Phân lớp: Hoa Hồng (Rosidae)
Bộ: Cam (Rutales)
Họ: Cam (Rutaceae)
Phân họ: Cửu lí hương (Rutoideae)
Trang 111.1.2 Đặc điểm thực vật chi Zanthoxylum
Cây gỗ, cây bụi hoặc dây leo, thường cao 5-15m, cá biệt có cây gỗ lớncao tới 35m, đường kính thân ngang ngực đạt 60cm Nhánh thòng hoặc trảira Thân và cành thường có nhiều gai nhọn hoặc sần sùi, màu xám hoặc màunâu nhạt Lá khơng có lơng hoặc có lơng nhung Lá mọc so le, Lá kép lơngchim lẻ, có cuống, khơng có lá kèm Có 5-15 đơi lá chét, mọc cách hay mọcđối, lá chét có mép nguyên hoặc có răng nhỏ, giữa khe các răng cưa thườngcó tuyến tinh dầu tương đối to.
Cụm hoa mọc ở nách hoặc ở ngọn, cụm hoa có dạng chùm, hình ximhoặc hình chùy (rất ít khi mọc đơn độc) Hoa lưỡng tính hoặc đơn tính, baohoa gồm 2 lớp, có thể phân biệt đài tràng Lá đài rời, tràng gồm 4-5 cánh hoa.Tiền khai hoa van hay vặn Bộ nhị có 4-10 nhị, thường thối hóa ở hoa cái,đỉnh trung đới có 1 điểm đầu Bầu thượng, bộ nhụy gồm 1-5 lá noãn rời, mỗilá nỗn chứa 1-2 nỗn, tiêu giảm hoặc khơng có ở hoa đực, nỗn đính bên, cócuống bầu.Bầu nhẵn, vòi nhụy hợp hoặc rời, hơi cong; núm nhụy dạng đầu Ởhoa đực bầu và nhụy thối hóa.
Quả nang, vỏ quả ngồi có điểm dầu, khi chín vỏ quả trong rời nhau,mỗi mảnh quả có 1-2 hạt, đính trên cuống nỗn phình to, rốn hạt dạng sợingắn, phẳng; hạt hình bầu dục hoặc hình trứng, vỏ hạt trịn, màu nâu, đen,bóng Phơi nhũ nạc, rất ngắn, phơi thẳng hay hơi cong Lá mầm mỏng, dẹt[10,12,46].
1.1.3 Phân bố chi Zanthoxylum
Chi Zanthoxylum là chi lớn nhất thuộc họ Rutaceae với khoảng 250
loài, phân chủ yếu ở các khu vực nhiệt đới trên thế giới, một số ít ở ôn đới.Hầu hết các loài phân bố tập trung ở Nam Mỹ, sau đến vùng Đơng Nam Á cókhoảng trên 20 lồi, chỉ 1 số lồi ở vùng ơn đới ẩm Đơng Á, Bắc Mỹ, cácquần đảo Thái Bình Dương và Australia [3,21].
Trang 124 Zanthoxylum avicennae (Lamk.)DC.5 Zanthoxylum cucullipetalum Guill.6 Zanthoxylum evodiaefolium Guill.7 Zanthoxylum laetum Drake.
8 Zanthoxylum myriacanthum Wall.9 Zanthoxylum nitidum (Roxb.) DC.10 Zanthoxylum rhetsa (Roxb.) DC.11 Zanthoxylum scabrum Guill.
12 Zanthoxylum usitatim Pierre ex Laness.13 Zanthoxylum scandens Blume.
1.1.4 Thành phần hóa học của 1 số loài thuộc chi Zanthoxylum
Chi Zanthoxylum rất đa dạng và phong phú về mặt hoá học đặc biệt là
các alcaloid, tinh dầu, chất béo, steroid, lignan và coumarin.
1.1.4.1 Tinh dầu
Là một chi lớn thuộc họ Cam, với đặc điểm đặc giải phẫu đặc trưng là
túi tiết tinh dầu, các loài Zanthoxylum L được quan tâm nghiên cứu về hóa
học tinh dầu Bộ phận chứa tinh dầu rất đa dạng, chủ yếu tập trung ở quả, cịn
có ở lá và rễ với hàm lượng nhỏ hơn.Tinh dầu trong chi Zanthoxylum thường
chứa các hợp chất nhóm terpenoid là chủ yếu Tinh dầu của nhiều loài
Zanthoxylum (Zanthoxylum acanthopodium, Zanthoxylum armatum,…) có
Trang 13Farnesal α-Farnesen β-Farnesen
Farnesol Metyleugenol Nerolidol
Hình 1.1 CTCT của một số tinh dầu được phân lập từ một sô lồi thuộc
chi Zanthoxylum
1.1.4.2 Alcaloid
Alcaloid là nhóm chất được tìm thấy ở hầu hết các loài Zanthoxylum L.
đã được nghiên cứu Cấu trúc các alcaloid tương đối đa dạng, nhiều cấu trúc ítgặp trong tự nhiên Đặc biệt, đây là nhóm hợp chất có tiềm năng trở thành cácchất dẫn đường trong nghiên cứu phát triển thuốc mới Dựa vào cấu trúc củacác alcaloid đã phân lập, có thể chia thành các nhóm như sau:
a Benzo[c]phenanthridin
Cấu trúc điển hình của alcaloid thường gặp trong rễ và thân của các loài
Zanthoxylum L là benzo[c]phenanthridin Các benzo[c]phenanthridin alcaloid
đã được phân lập gồm nitidin [23,28,31,45,44], dihydronitidin [44], decarin[28,31], norchelerythrin [28,31], chelerythrin [23], avicin [23], oxyavicin[28], 8-methoxydihydrochelerythrin [28], sanguinarin [28].
Trang 14Alcaloid nhóm quinolon thường gặp nhất là skimmianin được phân lập
từ loài Z rhesta DC và Z avicennae (Lamk.) [14,24] Ngồi ra cịn códictamnin từ thân Z.nitidium và γ-fagarin từ lá Z.avicennae [28].
c Quinazolon
Gồm các hợp chất 2-(2,4,6-trimethyl heptenyl)-4-quinozolon, rutaecarpin,evodiamin, dehydroevodiamin, hydroevodiamin được phân lập từ vỏ thân của
loài Z rhesta DC [24].
d Isoquinolin
Thường gặp các alcaloid cấu trúc aporphin, gồm magnoflorin trong Z.avicennae (Lamk.) DC., Z myriacanthum Wall [14,24,44], liriodenin(oxoaporphin) trong Z nitidum (Roxb.) DC [45].
e Alcaloid bậc 4
Gồm có magnoflorin, tembetarin, candicin từ vỏ thân loài Z avicennae
(Lamk.) DC [37] Magnoflorin, tembetarin cũng được phân lập từ vỏ thân
của loài Z myriacanthum Wall [44].
f Alcaloid nhóm berberin
Các chất đã phân lập được là coptisin, berberrubin từ loài Z nitidum
Trang 15
Nitidin: R1=R2=OCH3, R3=R4=H Liriodenin
Chelerythrin R1=R4=H, R2=R3=OCH3
8-Methoxynorchelerythrin R1=R2=R4=OCH3, R3=H
Norchelerythrin R1=R4=H, R2=R3=OCH3
Decarin R1=R4=H, R2=OH, R3=OCH3
Oxynitidin R1=R2=OCH3, R3=H Coptisin
Trang 16Oxyavicin Sanguinarin
Skimmianin R1=H, R2=R3=OCH3 Berberrubin
Dictamnin R1=R2=R3=H
γ-fagarin R1=R2=H, R3=OCH3
Hình 1.2 CTCT của một số alcaloid được phân lập từ một số loài thuộc
chi Zanthoxylum
1.1.4.3 Coumarin
Các hợp chất coumarin thường gặp ở rễ và thân, là yếu tố tạo nên màu
Trang 17Psoralen R1=R2=H MarmesinXanthotoxin R1=H, R2=OCH3
Xanthotoxol R1=H, R2=OHBergapten R1=OCH3, R2=H
Hình 1.3 CTCT của một số coumarin được phân lập từ một số loài thuộc
chi Zanthoxylum
1.1.4.4 Flavonoid
Flavonoid cũng là một nhóm chất thường thấy trong các nghiên cứu vềthành phần hóa học phần trên mặt đất (lá, quả, hạt) các loài thuộc chi này như
arbutin, hesperidin, quercetin trong quả của loài Z piperitum A.P.DC Ngoàira từ vỏ thân loài Z avicennae (Lamk.) DC Các tác giả đã phân lập được hai
flavonoid là hesperidin và diosmin [23].
Trang 18
Hesperidin
Hình 1.4 CTCT của một số flavonoid được phân lập từ một sơ lồi thuộc
chi Zanthoxylum
1.1.4.5 Các nhóm chất khác
Ngồi ra trong chi Zanthoxylum L cịn có các nhóm hợp chất khác là:
sterol, lignan, triterpen, sapogenin, amid,…
Ở Việt Nam, những nghiên cứu về hóa học chi Zanthoxylum L mới
được công bố nhiều khoảng 15 năm trở lại đây Các nghiên cứu chủ yếu tậptrung vào hai thành phần hóa học chính là alcaloid và tinh dầu [9].
1.1.5 Tác dụng sinh học của chi Zanthoxylum L.
Trên thế giới, các loài thuộc chi Zanthoxylum L được nghiên cứu khá
nhiều nhóm tác dụng sinh học khác nhau Chủ yếu các nghiên cứu tập trungvào tác dụng chống viêm, giảm đau, kháng khuẩn và gần đây nhất là tác dụngchống khối u và ung thư
1.1.5.1 Tác dụng chống viêm, giảm đau, kháng khuẩn
Phân đoạn ethyl acetat từ dịch chiết ethanol của loài Z armatum DC.
Trang 19tác dụng giảm đau do formalin ở giai đoạn đầu tiên với liều cao và trong giaiđoạn sau ở mọi liều nghiên cứu Kết quả này cho thấy tác dụng giảm đau khá
mạnh của loài Z armatum DC Cơ chế tác dụng có thể là do liên quan đến tác
dụng chống viêm ngoại vi Tám lignan (eudesmin, horsfieldin, fargesin,kobusin, sesamin, asarinin, planispin A và pinoresinol-di-3,3-dimethylallyl)được xác định là thành phần chính của phân đoạn ethyl acetat Đối chiếu vớicác nghiên cứu khác, có thể nói các lignan đóng vai trị chính trong tác dụngchống viêm [41].
Chất (-)- culantraramin được phân lập từ lá Z avicennae (Lamk.) DC.thu hái tại Ninh Bình – Việt Nam, có hoạt tính kháng vi khuẩn Escherichiacoli và Bacillus subtillis ngay ở nồng độ 25 μg/mL, khơng có tác dụng với vikhuẩn Staphylococcus aureus và Aspergillus niger [30].
1.1.5.2 Tác dụng chống ung thư
Ở Việt Nam, hai hợp chất được phân lập từ loài Z avicennae (Lamk.)
Trang 201.2 TỔNG QUAN VỀ CÂY HỒNG MỘC LEO
1.2.1 Đặc điểm thực vật
Hồng mộc leo (Zanthoxylum scandens Blume) cịn có tên khác là
Đắng Cay, Hoa Tiêu, Thục Tiêu [1,8].
Hình 1.5 Hình ảnh cây Hồng mộc leo
Cây gỗ nhỏ hoặc cây bụi Cành dài, mảnh, có gai nhỏ, ngắn Lá kép lơngchim gồm 5-13 lá chét mọc cách hay đối, nhẵn, có lơng thưa trên gân chính,kích thước (4-10) x (1,5-4) cm, có thể dài tới 30cm, hình trứng thn, gốc láhình nêm, mũi lá nhọn, cả 2 bề mặt màu đen hoặc đen nâu khi khơ, tuyến dầukhơng nhìn thấy rõ Mép lá ngun, đơi khi hơi có khía, mặt trên bóng.
Cụm hoa dạng chùm, thường mọc ở nách lá, có lơng ngắn, thưa Cuốnghoa ngắn hoặc khơng có, có nhiều lá bắc hình vảy nhỏ Đài nhẵn hay có lơng,gồm 4 lá đài, màu xanh lục, dài 0,5mm Tràng gồm 4 cánh hoa hình trứng,màu xanh hay vàng nhạt Hoa đực có 4 lá đài, dài khoảng 1mm, tràng 4, dàikhoảng 3mm, hoa đực có bộ nhị gồm 4 nhị, kết nối với 1 tuyến dầu tại đỉnh,bao phấn hình trái xoan, dài hơn cánh hoa Bầu thối hóa, hình bán nguyệt,vịi nhụy xẻ 2-4 thùy Hoa cái có tràng như hoa đực, có bộ nhụy gồm 3-4 lánỗn rời nhau, bộ nhụy thối hóa dạng vảy, vịi nhụy rời.
Trang 21ngồi Hạt màu đen, mịn, bóng, hình cầu, hai đầu nhọn, đường kính khoảng 4-5mm [1,8].
1.2.2 Phân bố và thu hái
Trên thế giới: Cây Hoàng mộc leo phân bố ở nhiều nước như Ấn Độ,Trung Quốc, Indonesia, Đài Loan, Nhật Bản, Malaysia, chủ yếu gặp nhiều ởmột số nước ở Đông Nam Á [1].
Ở Việt Nam, cây chủ yếu được trồng ở các tỉnh như Lạng Sơn, NinhBình, Hà Nội, Cao Bằng, Lào Cai, Lai Châu, Tuyên Quang, Lâm Đồng [1].
Mùa hoa vào tháng 3-5, mùa quả vào tháng 7-8 Quả và hạt thu hái vàomùa thu, lá thu hái quanh năm [1].
1.2.3 Thành phần hóa học
Năm 1956, từ vỏ thân của Z.scandens thu hái ở Hồng Kông, Arthur và
cộng sự đã phân lập được 1 flavonoid là hesperidin [18].
Năm 1976, Các nghiên cứu trước đây tiến hành trên mẫu được thu hái ởĐài Loan (Ishii và cộng sự) đã xác định được các alcaloid từ phần gỗ và vỏ
thân của cây Z.scandens, bao gồm: benzo[c]phenanthridin và các amid liên
quan, aporphin, 2-quinolinon, furo [2,3-b]quinolon và phenyl propanoidcuspidiol [27].
Năm 1984, các tác giả tiến hành chiết xuất và phân lập từ vỏ
Z.scandens với DCM và methanol thì thu được 3 alcaloid: norchelerythrin
(Krane và cộng sự), aporphin bậc 4 magnoflorin và furoroquinolin bậc 4 (-)(S)-O-methylbalfourodinium (Guinaudeau và cộng sự) Ngồi ra, cịn cóhesperidin (Okamura và cộng sự) [17].
Năm 1993, nghiên cứu tiến hành trên rễ của cây Z.scandens được lấy ở
Hồng Kông cũng thu được 2-quinolinon (Brader và cộng sự),phenylpropanoid (E)-O-geranyl coniferyl alcohol (Jen và cộng sự) [17].
Trang 22Năm 2002, Q.An Nguyen và cộng sự đã phân lập được 1 este hoàn toànmới là (E)-O-geranyl coniferyl (9Z,12Z)-linoleat [17].
Năm 2003, M J Cheng và cộng sự cũng đã phân lập từ Z.scandens
được 5 benzo[c]phenanthridin: decarin, norchelerythrin, oxynitidin,oxychelerythrin và arnottianamid, 5 furoquinolin: dictamnin, skimmianin, γ-fagarin, (+)- platydesmin và haplopin [22].
Năm 2004, K C Kao cũng đã phân lập được 1 terpenoid: lupeol
Năm 2008, từ vỏ thân Z.scandens thu hái ở Đài Loan, Ming-Jen Cheng
và cộng sự đã phân lập được 1 alcaloid hoàn toàn mới là zanthodion, cùng với19 chất đã biết [22].
Decarin R=OH Oxychelerithrin R1=H, R2=OCH3
Norchelerythrin R=OCH3 Oxynitidin R2=H, R1=OCH3
Dictamin R1=R2=H Vanilin R=CHO
Skimminamin R1=R2=OCH3 Metylvanilin R=COOCH3
Trang 23
(+)-Platydesmin Tetracosyl ferulat
Sesamin β-sitosterol
Stigmasterol * = ∆
Trang 24
(E)-O-geranyl coniferyl(9Z,12Z)-linoleat
Hình 1.6 CTCT của một số chất được phân lập từ Z.scandens
Ở Việt Nam, các mẫu thu hái ở Mai Châu – Hịa Bình, các tác giả cũngđã phân lập và xác định cấu trúc của 1 este hoàn toàn mới (E)-O-geranylconiferyl(9Z,12Z)-linoleat, cùng với 3 alcaloid: norchelerythrin, magnoflorinvà (-)(S)-O-methylbalfourodinium, 1 flavonoid glycosid (hesperidin) và 1phenylpropanoid [17].
1.2.4 Tác dụng của cây Hoàng mộc leo
1.2.4.1 Tác dụng theo y học cổ truyền
Theo y học cổ truyền, hạt Hoàng mộc leo có vị cay, tính ấm, hơi độc,quy kinh phế, vị, thận; có tác dụng trừ hàn thấp, làm ấm bụng, tan khí lạnh,sát trùng, phối hợp với các vị thuốc khác.
- Chữa đau bụng lạnh dạ, thổ tả: hạt Hồng mộc leo 3g sao, tán nhỏ,uống với nước nóng.
- Chữa đau bụng giun: hạt Hồng mộc leo 3g, ơ mai 12g, sắc uống.
Trang 25- Chữa đau mắt, phong hủi, mề đay: lá Hoàng mộc leo nấu nước xôngrửa, tắm [6].
1.2.4.2 Tác dụng dược lý
a Tác dụng kháng khuẩn
- Dịch chiết nước lá Hoàng mộc leo có tác dụng trung bình đối với
chủng vi khuẩn Streptococcus pyogenes, hầu như khơng có tác dụng đối vớichủng Staphylococcus aureus [5].
- Dịch chiết cồn lá Hồng mộc leo có tác dụng trung bình đối với
Staphylococcus aureus, với nồng độ ức chế tối thiểu là 1/2, có tác dụng mạnhđối với Streptococcus pyogenes, với nồng độ diệt khuẩn tối thiểu nhỏ hơn
1/16 [5].
b Tác dụng ức chế sự phát triển của HIV
- Decarin, γ-fagarin và (+) – platydesmin là những thành phần có tác
dụng ức chế sự phát triển HIV có trong vỏ thân cây Z scandens.
+ Decarin cho thấy hoạt tính chống HIV cao nhất trong dịng tế bào H9bị nhiễm bệnh nặng, với giá trị EC50<0,1 μg/mL Nó cũng ức chế sự tăngtrưởng tế bào H9 khơng bị nhiễm với giá trị IC50=22,6 μg/mL [21] So vớibenzo[c] phenanthridin alcaloid norchelerythrin, nhóm 8-OH của benzo[c]phenanthridin alcaloid dường như đóng một vai trò quan trọng trong hoạtđộng chống HIV
Trang 26- Hợp chất skimmianin có khả năng gây độc tế bào in vitro rất mạnh
đối với các dòng tế bào ung thư máu P-388 và ung thư ruột HT-29 (các giá trịIC50<4 µg/mL) [12], gây độc tế bào mạnh đối với các dòng tế bào RAJI,Jurkat (các giá trị IC50 tương ứng là 15,6 và 11,5 µg/mL) và có tác dụng gâyđộc trung bình đối với các dòng tế bào MCF-7, KG-1a, HEP-2, 60 và HL-60/MX1 [42].
Trang 27CHƯƠNG II NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNGPHÁP NGHIÊN CỨU
2.1 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU
Đối tượng nghiên cứu: cây Hồng mộc leo thu hái tại Hà Đơng – HàNội vào tháng 8/2018 Mẫu nghiên cứu đã được xác định tên khoa học là
Zanthoxylum scandens Blume.
2.2 NGUYÊN VẬT LIỆU
2.2.1 Nguyên liệu
Bộ phận nghiên cứu là vỏ thân cây Hoàng mộc leo Phần thân cây saukhi thu hái về được rửa sạch, tước lấy vỏ, sấy khô ở 50˚C rồi xay đến kíchthước thích hợp Bảo quản trong túi nilon đóng kín trong phịng thống mát,khơ ráo, khơng mối mọt.
2.2.2 Dung mơi và hóa chất
- Dung mơi: Ethanol, n-hexan, DCM, Ethylacetat, Aceton, Methanol,
Cloroform đạt tiêu chuẩn phân tích Cloroform (CDCl3) đạt tiêu chuẩn tinhkhiết dùng cho phân tích NMR.
- Thuốc thử hiện màu dùng trong SKLM: dung dịch H2SO4 10%/ Ethanol.
- Các hóa chất, dung mơi, thuốc thử cần thiết khác có trong phịng thínghiệm.
2.2.3 Thiết bị nghiên cứu
Trang 28- Máy xay dược liệu (Trung Quốc).
- Tủ sấy thường Binder – FD5 (China).
- Máy lắc siêu âm Elmasonic (Mỹ).
- Máy cất quay Rotavapor R-200 Buchi B480 (Thụy Sĩ).
- Đèn tử ngoại ở 2 bước sóng 254 nm và 365 nm (Đức).
- Máy hứng bán tự động SF -2120 (Nhật Bản).
- Máy đo phổ cộng hưởng từ hạt nhân Bruker AM 500 FT-NMRspectrometer (Đức).
2.2.4 Dụng cụ nghiên cứu
- Bản mỏng silica gel F254 tráng sẵn trên tấm nhơm.
- Silica gel pha thuận có cỡ hạt là 40-63 µm (Merck).
- Dụng cụ thủy tinh: các loại cột đường kính 1-10cm, dài từ 30-100cm;bình gạn, bình cầu, bình nón, cốc có mỏ các loại, ống nghiệm, pipet chínhxác, đũa thủy tinh, giấy lọc.
2.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.3.1 Chiết xuất
- Dược liệu được sấy khô và xay nhỏ đến kích thước thích hợp Sau
đó được chiết lần lượt với các dung mơi có độ phân cực tăng dần n-hexan,
Trang 29- Dịch lọc được gộp lại, cất thu hồi dung môi dưới áp suất giảm, ởnhiệt độ 50˚C, thu được cắn.
2.3.2 Phân lập các hợp chất
Để tiến hành phân lập các hợp chất thường sử dụng các phương phápsắc ký như: sắc ký lớp mỏng (dùng để khảo sát), sắc ký cột pha thuận, sắc kýcột pha đảo.
2.3.2.1 Sắc ký lớp mỏng
Sắc ký lớp mỏng được sử dụng làm căn cứ lựa chọn hệ dung mơi vàtheo dõi q trình khai triển của cột sắc ký
TLC được thực hiện trên bản mỏng silica gel F254 pha thuận tráng sẵntrên tấm nhôm
Pha động: Sử dụng các hệ dung mơi có độ phân cực khác nhau để khảosát và lựa chọn ra một hệ dung môi tối ưu để khai triển sắc ký cột.
Hiện màu bản mỏng: Sắc ký đồ được quan sát dưới ánh sáng đèn tửngoại ở hai bước sóng 254 và 365 nm hoặc bản mỏng sau khi phun dung dịchH2SO4 10% trong Ethanol và đốt nóng đến khi hiện rõ vết.
2.3.2.2 Sắc ký cột
- Sắc ký cột: sử dụng cột đường kính 1-10cm, dài từ 30-100cm.
Trang 30- Pha động: dung môi rửa giải là hỗn hợp được pha từ các dung môi
như n-hexan, DCM, EtOAc, Aceton,
- Phương pháp nhồi cột
+ Chuẩn bị cột sắc ký: Cột được rửa sạch, sấy khô, nhồi một mẩu bông
nhỏ ở dưới đáy cột sau đó lắp cột thẳng đứng trên giá cố định.
+ Ổn định cột: Silica gel được nạp vào cột bằng phương pháp nhồi cột
ướt: Cân một lượng silica gel vào cốc có mỏ, thêm dung mơi rửa giải vào,khuấy đều Cho hỗn hợp silica gel và dung môi trên vào cột, vừa thêm vừakhuấy đều Thêm dung môi vào và để cho silica gel lắng xuống Đến khilượng silica gel không lắng xuống nữa, tháo dung môi đến khi mức dung môitrong cột cách bề mặt silica gel một khoảng bằng lượng mẫu, khóa van lại.
- Phương pháp nạp mẫu
+ Phương pháp nạp mẫu khơ: Hịa tan cắn hồn tồn bằng dung mơithích hợp trong bình cầu đáy trịn Thêm một lượng tối thiểu silica gel Cấtthu hồi dung môi dưới áp suất giảm tới khi silica gel khô và tơi, lấy ra nghiềnđồng nhất sau đó thêm từ từ lượng mẫu lên cột đã được chuẩn bị sẵn Nhẹnhàng thêm một lớp bông nhằm tránh cho bề mặt không bị ảnh hưởng khithêm dung môi vào.
Trang 31- Khai triển cột: Tiến hành sắc ký với hệ dung môi đã lựa chọn và căncứ vào SKLM để thay đổi độ phân cực của hệ dung môi kịp thời để tiết kiệmđược thời gian và dung mơi.
- Hứng phân đoạn
+ Dịch thu được trong q trình rửa giải được hứng vào bình nón hoặcống nghiệm đã đánh số.Chỉnh van để điều chỉnh tốc độ dòng chảy
+ Dùng SKLM để kiểm tra thành phần dịch hứng và gộp các phân đoạncó Rf giống nhau.Phát hiện chất bằng cách quan sát dưới ánh sáng đèn tửngoại ở hai bước sóng 254 và 365nm hoặc nhúng bản mỏng vào dung dịchH2SO4 10% trong EtOH, đốt nóng bản mỏng đến khi hiện rõ vết.
2.3.3 Xác định cấu trúc của các hợp chất phân lập được
Xác định cấu trúc các hợp chất phân lập được dựa trên:
- Phương pháp hóa lý: Phổ cộng hưởng từ hạt nhân một chiều (1H-NMR, 13C-NMR), hai chiều (HMBC, HSQC).
- So sánh với các dữ liệu thu được từ thực nghiệm với các dữ liệu đãđược công bố.
2.4 ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU
Bộ môn Dược liệu – Dược học cổ truyền, Viện đào tạo Dược, Học ViệnQuân Y.
Trang 33CHƯƠNG III KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
3.1 CHIẾT XUẤT, PHÂN LẬP CÁC HỢP CHẤT
3.1.1 Chiết xuất
Thân cây Hoàng mộc leo sau khi thu hái về, được rửa sạch, tước lấy vỏ,sấy khô ở 50˚C rồi nghiền nhỏ thu được bột thô.
Bột thô vỏ thân cây Hoàng mộc leo (300g) được chiết lần lượt với các
dung mơi có độ phân cực tăng dần n-hexan (1,5L x 3 lần), DCM (1,5L x 3
lần) và EtOAc (1,5L x 3 lần) với sự hỗ trợ của sóng siêu âm ở 30˚C, mỗi lầnchiết 30 phút, lọc qua giấy lọc.
Gộp dịch chiết, cất thu hồi dung môi dưới áp suất giảm ở 500C thu
được cắn n-hexan (1,98g), cắn DCM (2,03g), cắn EtOAc (2,25g).
3.1.2 Phân lập các hợp chất từ cắn phân đoạn n-hexan
3.1.2.1 Khảo sát lựa chọn hệ dung môi rửa giải bằng SKLM
- Dịch chấm sắc ký: Cắn phân đoạn n-hexan được hịa tan trong hỗnhợp dung mơi n-hexan và EtOAc với tỉ lệ 5:1.
- Bản mỏng Silica gel F254 được hoạt hóa ở 1100C trong 1 giờ và đểnguội, bảo quản trong bình hút ẩm.
- Hiện màu bản mỏng: Sắc ký đồ được quan sát dưới ánh sáng đèn tửngoại ở hai bước sóng 254 và 365 nm hoặc bản mỏng sau khi phun dung dịchH2SO4 10% trong Ethanol và đốt nóng bản mỏng đến khi hiện rõ vết.
Trang 34vết, các vết không bị kéo đi Do đó, lựa chọn hệ này làm hệ dung mơi khaitriển trong sắc ký cột.
Hình 3.1 Sắc ký đồ TLC cắn n-hexan, hệ dung môi n-hexan: aceton (7:1)
3.1.2.2 Phân lập bằng phương pháp sắc ký cột
Cắn n-hexan (1,98g) được hịa tan trong hỗn hợp dung mơi n-hexan và
EtOAc theo tỉ lệ 5:1, trộn với một lượng silica gel pha thuận vừa đủ Cất thuhồi dung môi dưới áp suất giảm đến khô kiệt rồi tán đều, thu được bột tơi,mịn Sau đó tiến hành triển khai sắc ký cột với kích thước 5cm x 60cm(đường kính cột x chiều dài cột).
Q trình rửa giải sử dụng hệ dung mơi n-hexan : aceton theo gradient
nồng độ với độ phân cực tăng dần từ tỷ lệ 20:1 đến 0:1 Cuối cùng thu đượccác phân đoạn như Bảng 3.1.
Bảng 3.1 Kết quả thu được sau khi tiến hành sắc ký cột phân đoạn n-hexan
STTBình gộpKí hiệu phân đoạn
1 1 → 4 H1
2 5 → 9 H2
Trang 36Cắn phân đoạn n-hexan (1,98g)
H3(122mg) H1 → H2 H4 (210mg) H5 → H9
HM-1(8mg) HM-2(45mg)
H3.1 H3.2(64mg) H4.2(107mg) H4.1
Silica gel pha thuậnn-hexan : EtOAc (8:1)
Hình 3.2 Sơ đồ phân lập các chất từ phần cắn n-hexan
Silica gel pha thuậnDCM : EtOAc (40:1)
Silica gel pha thuận
n-hexan : aceton (15:1)
Silica gel pha thuận
n-hexan : aceton (12:1)
Sắc ký cột, silica gel pha thuận
Trang 37a Phân đoạn H3
Phân đoạn H3 tiếp tục được tiến hành khảo sát bằng SKLM với hai hệdung môi:
Hệ 1Hệ 2
Hình 3.3 Sắc ký đồ TLC phân đoạn H3 khai triển với các hệ dung môi
Tiến hành trai triển SKLM với các hệ dung môi ở cho thấy hệ 1 chohiệu quả tách tốt hơn, tách được nhiều vết, các vết khơng bị kéo đi Do đó,lựa chọn hệ 1 làm hệ dung môi khai triển trên sắc ký cột.
Phân đoạn H3 sau khi cất thu hồi dung môi thu được cắn có khối lượng122mg Sau đó phân đoạn H3 tiếp tục được tinh chế trên cột có đường kính2,5 cm, chiều dài 60 cm với silica gel pha thuận cỡ hạt 40 – 63 µm, hệ dung
mơi rửa giải là n-hexan và aceton (12:1 → 0:1 ) Dịch rửa giải được hứng vào
các ống nghiệm 10 mL, kiểm tra quá trình sắc ký bằng TLC, gộp các ống
Trang 38nghiệm có các vết giống nhau, cất thu hồi dung môi thu được 2 phân đoạnH3.1và H3.2.
Phân đoạn H3.2 sau khi tiến hành khảo sát bằng SKLM, tiếp tục đượcđưa lên cột sắc ký có đường kính 1 cm, chiều dài 30 cm với silica gel phathuận, hệ dung môi rửa giải là DCM và EtOAc (40:1) Dịch rửa giải đượchứng vào ống nghiệm 5 mL, căn cứ vào sắc ký đồ TLC để gộp các ống có vếtgiống nhau, rồi loại bỏ hết dung môi dưới áp suất giảm, thu được hợp chất
HM-1 (8mg).
Hình 3.4 Sắc ký đồ TLC chất HM-1, hệ dung môi DCM : EtOAc (30:1)
b Phân đoạn H4
Trang 39Hệ 1Hệ 2
Hình 3.5 Sắc ký đồ TLC phân đoạn H4 khai triển với các hệ dung môi
Tiến hành khai triển SKLM với các hệ dung môi ở cho thấy hệ 1 chohiệu quả tách tốt hơn, tách được nhiều vết, các vết không bị kéo đi Do đó,lựa chọn hệ 1 làm hệ dung mơi khai triển trên sắc ký cột.
Phân đoạn H4 sau khi cất thu hồi dung mơi thu được cắn có khối lượng210mg Sau đó phân đoạn này tiếp tục được tiến hành tinh chế trên cột cóđường kính 2,5 cm, chiều dài 60 cm với silica gel pha thuận cỡ hạt 40 – 63
µm, hệ dung mơi rửa giải là n-hexan và aceton (15:1 → 0:1 ) Hứng dịch rửa
giải vào các ống nghiệm 10 mL, kiểm tra quá trình sắc ký bằng TLC, gộp cácống có các vết giống nhau, cất thu hồi dung môi thu được 2 phân đoạn H4.1và H4.2.
Tiếp tục đưa phân đoạn H4.2 lên cột sắc ký có đường kính 1 cm, chiều
Trang 40(8:1) Hứng dịch rửa giải vào ống nghiệm 5 mL, căn cứ vào sắc ký đồ TLC đểgộp các ống có vết giống nhau, rồi loại bỏ hết dung môi dưới áp suất giảm,
thu được hợp chất HM-2 (45mg).