Đang tải... (xem toàn văn)
Nghiên cứu thiết kế, biểu hiện, tinh sạch và đánh giá hoạt tính sinh miễn dịch của kháng nguyên H5 VirusLike Particle từ virus cúm AH5N6 trên cây thuốc lá Nicotiana benthamiana Domin.Nghiên cứu thiết kế, biểu hiện, tinh sạch và đánh giá hoạt tính sinh miễn dịch của kháng nguyên H5 VirusLike Particle từ virus cúm AH5N6 trên cây thuốc lá Nicotiana benthamiana Domin.Nghiên cứu thiết kế, biểu hiện, tinh sạch và đánh giá hoạt tính sinh miễn dịch của kháng nguyên H5 VirusLike Particle từ virus cúm AH5N6 trên cây thuốc lá Nicotiana benthamiana Domin.Nghiên cứu thiết kế, biểu hiện, tinh sạch và đánh giá hoạt tính sinh miễn dịch của kháng nguyên H5 VirusLike Particle từ virus cúm AH5N6 trên cây thuốc lá Nicotiana benthamiana Domin.Nghiên cứu thiết kế, biểu hiện, tinh sạch và đánh giá hoạt tính sinh miễn dịch của kháng nguyên H5 VirusLike Particle từ virus cúm AH5N6 trên cây thuốc lá Nicotiana benthamiana Domin.Nghiên cứu thiết kế, biểu hiện, tinh sạch và đánh giá hoạt tính sinh miễn dịch của kháng nguyên H5 VirusLike Particle từ virus cúm AH5N6 trên cây thuốc lá Nicotiana benthamiana Domin.Nghiên cứu thiết kế, biểu hiện, tinh sạch và đánh giá hoạt tính sinh miễn dịch của kháng nguyên H5 VirusLike Particle từ virus cúm AH5N6 trên cây thuốc lá Nicotiana benthamiana Domin.Nghiên cứu thiết kế, biểu hiện, tinh sạch và đánh giá hoạt tính sinh miễn dịch của kháng nguyên H5 VirusLike Particle từ virus cúm AH5N6 trên cây thuốc lá Nicotiana benthamiana Domin.Nghiên cứu thiết kế, biểu hiện, tinh sạch và đánh giá hoạt tính sinh miễn dịch của kháng nguyên H5 VirusLike Particle từ virus cúm AH5N6 trên cây thuốc lá Nicotiana benthamiana Domin.Nghiên cứu thiết kế, biểu hiện, tinh sạch và đánh giá hoạt tính sinh miễn dịch của kháng nguyên H5 VirusLike Particle từ virus cúm AH5N6 trên cây thuốc lá Nicotiana benthamiana Domin.Nghiên cứu thiết kế, biểu hiện, tinh sạch và đánh giá hoạt tính sinh miễn dịch của kháng nguyên H5 VirusLike Particle từ virus cúm AH5N6 trên cây thuốc lá Nicotiana benthamiana Domin.
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ Trịnh Thái Vy NGHIÊN CỨU THIẾT KẾ, BIỂU HIỆN, TINH SẠCH VÀ ĐÁNH GIÁ HOẠT TÍNH SINH MIỄN DỊCH CỦA KHÁNG NGUYÊN H5 VIRUS-LIKE PARTICLE TỪ VIRUS CÚM A/H5N6 TRÊN CÂY THUỐC LÁ Nicotiana benthamiana Domin LUẬN VĂN THẠC SỸ SINH HỌC THỰC NGHIỆM Hà Nội - 2023 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ Trịnh Thái Vy NGHIÊN CỨU THIẾT KẾ, BIỂU HIỆN, TINH SẠCH VÀ ĐÁNH GIÁ HOẠT TÍNH SINH MIỄN DỊCH CỦA KHÁNG NGUYÊN H5 VIRUSLIKE PARTICLE TỪ VIRUS CÚM A/H5N6 TRÊN CÂY THUỐC LÁ Nicotiana benthamiana Domin Chuyên ngành : Sinh học thực nghiệm Mã số: 8420114 LUẬN VĂN THẠC SỸ NGÀNH SINH HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS.TS Phạm Bích Ngọc Hà Nội - 2023 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đề tài nghiên cứu luận văn cơng trình nghiên cứu dựa tài liệu, số liệu tơi tự tìm hiểu nghiên cứu Chính vậy, kết nghiên cứu đảm bảo trung thực khách quan Đồng thời, kết chưa xuất nghiên cứu Các số liệu, kết nêu luận văn trung thực sai tơi hồn chịu trách nhiệm Hà Nội, ngày 10 tháng 06 năm 2023 Tác giả luận văn Trịnh Thái Vy i LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành luận văn này, nhận nhiều giúp đỡ, hỗ trợ nhiệt tình từ quan, tổ chức cá nhân Trước hết, xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS Phạm Bích Ngọc – người hướng dẫn khoa học trực tiếp dành nhiều thời gian, công sức hướng dẫn q trình thực nghiên cứu khoa học, ln cho lời khuyên vô quý giá kiến thức chun mơn Bên cạnh đó, tơi xin gửi lời cảm ơn đến Th.S Hồ Thị Thương – người đồng nghiệp đưa góp ý, bình luận có giá trị để tơi có tảng kiến thức, hỗ trợ lớn cho trình thực luận văn Tơi xin trân trọng cảm ơn ban Lãnh đạo, phòng Đào tạo, phòng chức năng, thầy cô giáo công tác Học viện Khoa học Công nghệ tạo điều kiện giúp đỡ, truyền đạt kiến thức chuyên sâu chuyên ngành suốt thời gian học tập giúp đỡ để tơi hồn thành luận văn Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới đồng nghiệp phịng Cơng nghệ ADN Ứng dụng - Viện Công nghệ Sinh học - Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam, người tận tình dạy dỗ, bảo, truyền đạt kiến thức quý báu, tạo điều kiện giúp đỡ tơi q trình cơng tác nghiên cứu Tơi kính mong q thầy cơ, người quan tâm đến đề tài, gia đình bạn bè tiếp tục có ý kiến đóng góp, giúp đỡ để đề tài hồn thiện Tơi xin trân trọng cảm ơn! ii MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN i LỜI CẢM ƠN .ii MỤC LỤC iii DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT vi DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ vii DANH MỤC CÁC BẢNG ix MỞ ĐẦU .1 Mục tiêu nghiên cứu Nội dung nghiên cứu Ý nghĩa khoa học thực tiễn đề tài .2 CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU .3 1.1 GIỚI THIỆU VỀ BỆNH CÚM GIA CẦM 1.1.1 Lịch sử hình thành bùng phát dịch bệnh giới 1.1.2 Thực trạng bệnh cúm gia cầm Việt Nam 1.1.3 Đặc điểm dịch tễ bệnh cúm gia cầm 1.2.TỔNG QUAN VỀ TÁC NHÂN GÂY BỆNH CÚM GIA CẦM -VIRUS CÚM A 1.2.1 Cấu trúc đặc trưng virus gây bệnh cúm gia cầm .8 1.2.1.1 Phân loại virus cúm 1.2.1.2 Cấu trúc hạt virus cúm A thành phần hệ gene 1.2.2 Phương thức lây truyền virus cúm A 11 1.2.3 Phân loại chủng cúm A xuất giới 13 1.3 CÁC BIỆN PHÁP PHÒNG DỊCH CÚM GIA CẦM HIỆN NAY 14 1.3.1 Những đóng góp phịng bệnh cúm gia cầm vắc-xin 14 1.3.2 Tiềm sản xuất vắc-xin thực vật từ hạt giả virus (VLP) 16 CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 19 iii 2.1 Đối tượng nghiên cứu 19 2.2 Phương pháp nghiên cứu 19 2.2.1 Phương pháp thu thập thơng tin lựa chọn gen mã hóa protein H5, tối ưu mã biểu 19 2.2.2 Thiết kế cấu trúc vector biểu mang gen mã hóa kháng nguyên H5-VLP, kháng nguyên H5-GCN4pII, kháng nguyên H5-GCN4pII-tp tạo chủng Agrobacterium tumefaciens mang vector tương ứng .19 2.2.2.1 Phương pháp tạo cấu trúc vector biểu mang gen mã hóa kháng nguyên H5-VLP 19 2.2.2.2 Phương pháp tạo cấu trúc vector biểu mang gen mã hóa kháng nguyên H5 dạng trimer pII H5 dạng oligomer pII-tp 21 2.2.2.3 Phương pháp tạo chủng khuẩn Agrobacterium tumefaciens mang vector chuyển gen pCB301 tương ứng 22 2.2.3 Phương pháp biểu tạm thời kháng nguyên tái tổ hợp thực vật agroinfiltration 22 2.2.4 Đánh giá mức độ biểu protein tái tổ hợp phương pháp điện di SDS-PAGE Western blot 23 2.2.5 Tinh kháng nguyên tái tổ hợp H5-VLP , H5-GCN4pII H5GCN4pII-tp .24 2.2.6 Phương pháp đánh giá đặc điểm cấu trúc hoạt tính sinh học protein kháng nguyên tinh H5 tái tổ hợp .24 2.2.6.1 Xác định đặc điểm cấu trúc protein phương pháp Size exclusion chromatography (SEC) 24 2.2.6.2 Đánh giá hoạt tính sinh học kháng nguyên H5 tái tổ hợp phản ứng ngưng kết hồng cầu 25 2.2.7 Phương pháp gây đáp ứng miễn dịch chuột 25 2.2.8 Đánh giá tính sinh miễn dịch tạo kháng thể đặc hiệu chuột phản ứng ELISA gián tiếp 25 2.2.9 Phương pháp xử lý thống kê 26 iv CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 27 3.1 THIẾT KẾ CÁC CẤU TRÚC VECTOR TÁCH DỊNG VÀ VECTOR BIỂU HIỆN MANG GEN MÃ HĨA KHÁNG NGUYÊN H5-VLP, KHÁNG NGUYÊN H5-GCN4PII, H5-GCN4PII-TP VÀ TẠO CHỦNG AGROBACTERIUM TUMEFACIENS MANG VECTOR TƯƠNG ỨNG .27 Tổng hợp nhân tạo gen mã hoá kháng nguyên H5 virus cúm A/H5N6 gây bệnh Việt Nam 27 3.2.1 Tạo chủng Agrobacterium mang vector biểu mã hóa kháng nguyên H5-VLP .27 3.2.2 Tạo chủng Agrobacterium mang vector biểu mã hóa kháng nguyên H5-GCN4pII kháng nguyên H5-GCN4pII-tp .31 3.2.3 3.2 BIỂU HIỆN TẠM THỜI CỦA CÁC KHÁNG NGUYÊN H5 (H5N6) TÁI TỔ HỢP TRÊN CÂY THUỐC LÁ NICOTIANA BENTHAMIANA BẰNG AGROINFILTRATION 36 3 TINH SẠCH PROTEIN TÁI TỔ HỢP H5 TRIMER, OLIGOMER VÀ H5VLP 42 3.3.1 Tinh kháng nguyên H5 dung hợp cấu trúc pII pII-tp sắc kí lực kim loại cố định (IMAC) .42 3.3.2 Tinh kháng nguyên H5-VLP 46 3.4 ĐÁNH GIÁ HOẠT TÍNH SINH MIỄN DỊCH CỦA KHÁNG NGUYÊN TÁI TỔ HỢP H5 TRÊN CHUỘT THÍ NGHIỆM 48 3.4.1 Đánh giá khả kích thích sản sinh kháng thể IgG đặc hiệu phản ứng ELISA Western blot 49 3.4.2 Đánh giá khả kích thích sản sinh kháng thể đặc hiệu phản ứng ức chế ngưng kết hồng cầu (HI) 52 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 53 DANH MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO 54 PHỤ LỤC 61 v DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT Từ viết tắt Nghĩa Tiếng Anh Nghĩa Tiếng Việt A tumefaciens Agrobacterium tumefaciens DAB Diaminobenzidine dNTP Deoxyribo nucleotide triphosphate E coli Escherichia coli ELISA Enzyme-linked immunosorbent assay Hc-Pro Helper component protease His Histidine IgG Immunoglobulin G KDEL ER retrieval signal LB Luria-Bertani medium OD Optical density (mật độ quang) PBS Phosphate-buffered saline PCR SDS-PAGE Protein hỗ trợ Môi trường nuôi khuẩn Luria-Bertani) Polymerase Chain Reaction Sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Phản ứng chuỗi polymerase v/p vòng/phút Vòng/phút VLP Virus like particle Hạt giả virus vi DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ Hình 1.1 Bản đồ chủng virus cúm gia cầm lưu hành Đông Đông Nam Á xuất từ năm 2013 [11] Hình 1.2 Bản đồ tỉnh, thành phố có ổ dịch cúm A/H5N6 Việt Nam vào năm 2020 [12] Hình 1.3 Cấu trúc virus cúm A .10 Hình 1.4 Sự giống mặt di truyền virus H5 nhánh 2.3.4.4 Đông Đông Nam Á [11] .14 Hình 1.5 Hình chụp cấu trúc H5-VLP chủng cúm A/H5N1 kính hiển vi điện tử truyền qua (TEM) [53] 17 Hình 3.1 Sơ đồ cấu trúc vector tách dòng pRTRA_H5_VLP .28 Hình 3.2 Kết thiết kế vector tách dịng pRTRA_H5_VLP 28 Hình 3.3 Kết thiết kế vector biểu pCB301_H5_VLP 29 Hình 3.4 Sơ đồ cấu trúc vector biểu pCB301_H5_VLP 30 Hình 3.5 Kết thiết kế vector tách dòng pRTRA mang gen mã hóa protein H5 dạng trimer oligomer 31 Hình 3.6 Sơ đồ vector tách dòng pRTRA mang gen mã hóa protein H5 dạng trimer oligomer 33 Hình 3.7 Kết thiết kế vector biểu gen mã hóa kháng nguyên H5 cấu trúc dạng trimer (GCN4pII) cấu trúc dạng oligomer (GCN4pII-tp) 34 Hình 3.8 Sơ đồ vector biểu pCB301 mang gen mã hóa protein H5 dạng trimer oligomer 35 Hình Ảnh thuốc sau 5, 6, ngày biến nạp cấu trúc H5 trimer, H5 oligomer H5-VLP .36 Hình 3.10 Đồ thị đường chuẩn protein phương pháp Bradford 38 Hình 3.11 Mức độ biểu kháng nguyên H5 tái tổ hợp dịch chiết từ thuốc sau 5, 6, ngày biến nạp 40 Hình 3.12 Kiểm tra hoạt tính sinh học kháng nguyên H5 tái tổ hợp phản ứng ngưng kết hồng cầu (HA) 41 Hình 3.13 Kết Western Blot điện di SDS-PAGE kiểm tra trình tinh protein H5 trimer (A) H5 oligomer (B) IMAC 43 Hình 3.14 Kết tinh protein H5 trimer (A) H5 oligomer (B) trimer SEC 44 Hình 3.15 Định lượng protein H5 trimer H5 oligomer tinh SEC vii Western Blot 45 Hình 3.16 Đường chuẩn định lượng xây dựng từ protein HA phần mềm .45 Hình 3.17 Dịch chiết thô chứa kháng nguyên H5-VLP trước (A) sau (B) tinh đệm sucrose kết hợp siêu ly tâm .46 Hình 3.18 Biểu kháng nguyên H5-VLP tinh sucrose 47 Hình 3.19 Hình chụp hạt giả virus kháng nguyên H5 thuộc chủng cúm A/H5N6 (A) hạt giả virus kháng nguyên H5 thuộc chủng cúm A/H5N1 (B) [53] 47 Hình 3.20 Hoạt tính ngưng kết hồng cầu kháng nguyên H5 tái tổ hợp bán định lượng mẫu kháng nguyên Western Blot 48 Hình 3.21 Kết đáp ứng kháng thể IgG đặc hiệu huyết chuột tiêm phản ứng ELISA 50 Hình 3.22 Đánh giá đáp ứng kháng thể IgG đặc hiệu chuột tiêm phản ứng Western blot 51 viii